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Identificación y cuantificación por HPLC de los ácidos orgánicos
mayoritarios en frutas
Article · January 1990
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ROMERO Rodriguez
Jesús Simal-Lozano
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Anales ae Bromatologia, XLll-2 (1990)
r
IDENTIFICACION Y CUANTIFICACION POR HPLC DE LOS ACIDOS
ORGANICOS MAYORITARIOS EN FRUTAS
HPLC METHOD FOR IDENTIFICATION AND QUANTITATIVE ANALYSIS
OF THE MAJOR ORGANIC ACIDS IN FRUITS
Por
M. A.
RoMERO RODRÍGUEZ, M. V. GoNZÁLEZ R oDRÍGUEZ, M. A. LAGE-YUSTY,
LÓPEZ HERNÁNDEZ, P. PASEIRO LOSADA y
SJMAL LOZANO
J.
J.
Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología. Area de Nutrición
y Bromatología. Facultad de Farmacia. Universidad de Santiago de Compostela.
E-15706 Santiago de Compostela
RESUMEN
Se propone la identificación y cuantificación de los ácidos orgánicos mayoritarios en distintas
frutas, mediante un método de cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa, usando
un detector UV /VIS de ).. variable ().. = 214 nm).
Para el cálculo de la precisión se han elegido dos frutas distintas: el BÁBACO (Carica pentagonia) y el KIWI (Actinidia chinensis var. hayward), obteniendo los siguientes valores de Cv%:
1,2, 1,0 y 2,6 para el quínico, málico y cítrico en el bábaco y valores de 1,7, 4,9 y 1,8 para estos
mismos ácidos en el kiwi.
PALABRAS CLAVE:
Acidos or gáni cos, H PLC, bábaco, kiwi.
SUMMARY
A reverse phase HPLC method for identification and quantitative analysis of major organic
acid in different fruits is proposed using a variable-wavelength UV detector ( = 214 nm}.
Two fruits: BÁBACO (Carica pentagonia) and KIWI (Actil;idia chinensis var. hayward) were
chosen for evaluating the precisión of this method. Cv% values were: 1.2; 1.0 and 1.7; 4.9
and 1.8 for those in KIWI.
KEY WORDS:
Organic acids, HPLC, bábaco. kiwi.
INTRODUCCION
En las frutas, en general, los ácidos orgánicos mayoritarios son el málico y el cítrico,
predominando uno u otro según su origen. Además están presentes otros ácidos orgánicos minoritarios, clasificándose los más importantes en dos grupos: ácidos intermediarios del ciclo del ácido cítrico (ácido succínico, ácido pirúvico, ácido fumárico, ácido
isocítrico, ácido láctico, ácido oxálico, etc.) y ácidos fenólicos (ácido quínico, ácido clorogénico, ácido siquímico ... ), pudiendo enontrarse también otros como galacturónico
y glucurónico.
Anal. Bromatol. XLII-2 ( 1990), 299-306
300
M. A. ROMERO, M. V. GONZÁLEZ, M. A. LAGE-YUSTY, J. LÓPEZ, P. PASEIRO y J. SIMAL
Para realizar el presente trabajo se han elegido dos frutas cultivadas en Galicia: el
BÁBACO (Carica pentagonia), del que están apareciendo las primeras producciones, y
el KIWI (Actinidia chinensis var. hayward), del que existe una producción importante.
Entre los métodos cromatográficos de determinación de ácidos orgánicos hay trabajos que aplican la cromatografía de gases, previa derivatización de la muestra, RYAN
y col. (1973), HEATHERBELL (1975). Actualmente es más frecuente la determinación
de estos ácidos orgánicos por HPLC, destacando los estudios de POLO y col. (1986) y
LÓPEZ HERNÁNDEZ y col. (1989), que proponen un método en fase reversa, previa
purificación de la muestra a través de resinas de intercambio iónico. YASEK (1985)
propone un método similar a los anteriores, pero utilizando dos columnas en serie,
una C18 unida a una Polypore H. En 1987 TUSSEAU y col. eligen como tratamiento
previo de la muestra su paso a través de cartuchos de Sep-Pack C 18 y para el análisis
cromatográfico utilizan una columna de fase reversa C 18 . Otros autores como ScHNEIDER y col. (1987), proponen el uso de una columna con resina fuertemente catiónica.
LEE y col. (1987) hacen un estudio sobre la retención de los ácidos en distintas fases
estacionarias.
PARTE EXPERIMENTAL
Se describe un método analítico por cromatografía líquida de alta resolución en
fase reversa. Modificación del método puesto a punto por LÓPEZ HERNÁNDEZ, SIMAL
LOZANO y ROMERO RODRÍGUEZ (1989).
Muestras
Para la aplicación de este método se han elegido dos !rutas: el BÁBACO (Carica pentagonia) y el KIWI (Actinidia chinensis var. hayward), suministradas por la empresa
KIWI, S. A.
De cada muestra se toman un número representativo de frutos (tres bábacos y 10
kiwis), se pelan y se homogeniza la muestra. Si la determinación no se hace de forma
inmediata, se puede conservar la muestra mediante liofilización.
Aparatos
Cromatógrafo de líquidos: Spectra-Physics equipado con una bomba SP8700XR,
bucle de inyección de 10 ul, Rheodyne.
Detector UV /VIS: Spectra-Physics SP8440XR.
-
Integrador: Spectra-Physics SP4290.
Columna: Spherisorb ODS 2, 250 X 4,6 mm, tamaño de partícula cmco um.
Precolumna: RP 18 NEWGUARD (Brownlee Labs.) 15 X 3,2 mm, 7 microm.
Reactivos
-
Fase móvil: agua de grado HPLC llevada a pH 2,2 con S0 4 H 2 •
Solución patrón de ácidos orgánicos en concentraciones similares a las de las
muestras, para lo cual se utilizan: ácido quínico (The British Drug Houses Ltd.),
Anal. Bromatol. XLII-2 (1990), 299-306
IDENTIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN POR HPLC DE LOS ÁCIDOS ORGÁNICOS...
301
ácido málico (Merck), ácido cítrico (Merck). Debido a que las concentraciones
relativas de estos ácidos en el bábaco y en el kiwi son diferentes se ha preparado
un patrón para evaluar el contenido en ácidos de cada fruta:
l.
Patrón de ácidos orgánicos para el bábaco:
29,6 mg/100 ml.
Acido quínico...
Acido málico
72,8 mg/100 ml.
Acido cítrico .. .
22,8 mg/100 ml.
2.
Patrón de ácidos orgánicos para el kiwi :
Acido quínico...
Acido málico
Acido cítrico
81,7 mg/100 ml.
21,8 mg/100 ml.
89,2 mg/100 ml.
Agua de grado HPLC.
Condiciones de trabajo
-
El valor de longitud de onda seleccionada es 214 nm.
-
El valor del flujo de la fase móvil es 0,3 ml/min.
Preparación de la muestra
En el momento del análisis se pesa exactamente, en un vaso de precipitados, entre
0,5 y 1 g de muestra liofilizada (o entre 3 y 8 g de muestra fresca) y se le añaden
aproximadamente 50 ml de agua, se mantiene en agitación mecánica durante quince
minutos. Se trasvasa el contenido a un matraz aforado de 100 ml y se enrasa con agua.
La solución resultante se filtra a través de papel (Whatman 542) y una alícuota del
filtrado se pasa a través de una membrana de 0,4 ¡.tm y se inyecta en el cromatógrafo.
De cada muestra se realizan tres inyecciones.
Cálculos
La cuantificación se realiza en función del FR (factor de respuesta) calculado para
cada ácido en el patrón :
FR
Siendo FR = factor de respuesta.
Cv = concentración del ácido en el patrón.
Ap = área del ácido en el patrón.
El FR se multiplica por el valor del área correspondiente a cada ácido en el cromatograma problema, obteniéndose el valor de la concentración. Si es necesario se corrige
este valor mediante el correspondiente factor de dilución.
Anal. Bromatol. XLII-2 (1990), 299-306
302
M. A. ROMERO, M. V. GONZÁLEZ, M. A. LAGE-YUSTY,
J. LÓPEZ,
P. PASEIRO
y J.
SIMAL
RESULTADOS Y DISCUSION
Se ha comprobado que manteniendo la muestra en agitación durante quince minutos se completa la disolución de los ácidos orgánicos, para ello de una misma
muestra se han pesado cantidades iguales y cada una se ha mantenido en agitación con 50 ml de agua durante quince, treinta, sesenta minutos y doce horas
(tabla l).
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Fig. 1.-Cromatograma patrón de ácidos orgánicos: l. Acido quínico; 2. Acido málico;
3. Acido cítrico.
La identificación de los ácidos orgánicos se realiza por comparación de los tiempos de retención obtenidos en un cromatagrama de un patrón y un cromatograma de las muestras. Los ácidos orgánicos mayoritarios encontrados en el análisis
1
de estas frutas son el quínico, málico y cítrico. Predominando el málico en el
bábaco mientras que en el kiwi es el cítrico el que aparece en mayor concentración.
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Fig. 2.-Cromatograma de una muestra de BÁBACO: l. Acido quínico; 2. Acido málico;
3. Acido cítrico.
También se identifica la vitamina C que aparece en los cromatogramas con
un tiempo de retención aproximadamente de catorce minutos, y que no se ha
evaluado por trabajar con muestras liofilizadas en las que ha disminuido su
contenido. La identificación de los picos que aparecen a tiempos de retención
inferiores no se ha podido conseguir, observando que pueden ser ácido glucurónico, galacturónico u oxálico.
Anal. Bromatol. XLII-2 (1990), 299-306
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M. A. ROMERO, M.
V.
GONZÁLEZ, M. A. LAGE-YUSTY, J. LÓPEZ, P. PASEIRO y J. SIMAL
Las figuras 1, 2 y 3 se corresponden con el cromatograma patrón, la muestra
de bábaco y la muestra de kiwi.
Se estudia la precisión del método, para lo cual se repite el proceso completo
seis veces para una misma muestra. Los valores de Cv % obtenidos son 1,2; 1,0
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Fig. 3.-Cromatograrna de una muestra de KIWI: l. Acido quínico; 2. Acido málico;
3. Acido cítrico.
y 2,6 para el ácido quínico, málico y cítrico en el análisis del bábaco (tabla II)
y valores de 1,7; 4,9 y 1,8 para los ácidos antes citados en el análisis del kiwi
(tabla III).
Este procedimiento mejora el propuesto por LÓPEZ y col. (1989) al supnmtr
el paso de purificación a través de resinas de intercambio aniónico y trabajar
directamente con la disolución acuosa de la muestra (fresca o liofilizada).
Anal. Bromatol. XLII-2 ( 1990), 299-306
j
305
IDENTIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN POR HPLC DE LOS ÁCIDOS ORGÁNICOS...
Tabla 1
Ensayos del tiempo de disolución
TIEMPO AGITACIÓN
(minutos)
Acmo QUÍNICO
(mg/ 100 g) *
Acmo MÁLICO
(mg/ 100 g) *
Acmo CÍTRICO
(mg/100 g) *
15
30
60
720
743
738
634
740
119
109
92
108
1112
1113
971
1178
• Expresados en mg/ 100 g de muestra fresca.
Tabla 11
Precisión de la determinación de ácidos orgánicos en bábaco
Número
de ensayo
Acmo QUÍNICO
(mg/ 100 g) ''
Acmo MÁLico
(mg/ 100 g) *
Acmo CÍTRico
(mg/ 100 g) •
1
2
3
4
S
6
2S1
251
2S4
248
247
246
4S3
4SO
460
4S3
459
461
162
154
161
164
164
1S6
2SO
3,0
1,2
456
4,6
1,0
160
4,2
2,6
X ...
Sn-1
Cv%
• Expresados en mg/ 100 g de materia fresca.
Tabla 111
Precisión de la determinación de ácidos orgánicos en kiwi
Número
de ensayo
Acmo QUÍNICO
(mg/ 100 g) •
Acmo MÁLico
(mg/ 100 g) •
Acmo CÍTRico
(mg/ 100 g) *
1
2
3
4
S
6
718
741
722
723
740
709
108
108
121
110
113
106
1092
1102
1086
1077
1098
1048
726
12,6
1,7
111
S,4
4,9
1084
19,7
1,8
X ...
S -1
.
...
Cv% .........
...
Expresados en mg/ 100 g de materia fresca .
Anal. Bromatol. XLII-2 (1990), 299-306
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M. A. ROMERO, M. V. GONZÁLEZ, M. A. LAGE-YUSTY,
J.
LÓPEZ, P. PASEIRO y
J.
SIMAL
BIBLIOGRAFIA
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HEATHERBELL, D. A. (1975): ]. Sci. Fd. Agríe., 26, 815-820.
LEE, D. P. y LORD, A. D. (1987): LC-GC., 5 (3), 261-262, 264-266.
LóPEZ HERNÁNDEZ, M. J.; SrMAL LozANO,
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J.
y RoMERO RoDRÍGUEZ, M. A. (1989): Anal. Bro-
PoLO M. C.; BARAHONA, F. y CÁCERES, l. (1986): Connaissance Vigne Vin, 20 (3), 175-187.
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J. J.
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A. (1973): ]. Agr. Food Chem., 21, l.
ScHNEIDER, A.; GERBI, V. y REDOGLIA, M. (1987): Am. ]. Enol. Vitic., 38, 2.
TusSEAU, D. y BENOIT, C. (1987): ]. Chromatogr., 395, 323-333.
YASEK, E. (1985): ETS Laboratory, California, USA.
Recibido el 3 de mayo de 1990.
Aceptado el 14 de junio de 1990.
Anal. Bromatol. XLII-2 (1990), 299-306