Secretaría de Educación Pública Subsecretaria de Educación Media Superior Unidad de Educación Media Superior Tecnológica industrial y de servicios Centro de Bachillerato Tecnológico industrial y de servicio No.198 “Tinción de Gram” SUBMODULO: Identifica Microorganismos con base en Técnicas Bacteriológicas DOCENTE: IBQ. Magaly Carranza Jacobo EQUIPO: no. 6 INTEGRANTES: Ayala García Karla Celia Ledesma Gómez Nadia Sanjuana Ortega Cruz Miriam Paulina Rodríguez Chimal Evelyn Zarate Cervantes Daniela Michelle 1 Secretaría de Educación Pública Subsecretaria de Educación Media Superior Unidad de Educación Media Superior Tecnológica industrial y de servicios Centro de Bachillerato Tecnológico industrial y de servicio No.198 Manual de Prácticas Identifica microorganismos con base en técnicas Bacteriológicas Elaboro: IBQ. Guadalupe Isela Sánchez Adame IBQ. Magaly Carranza Jacobo 2 Secretaría de Educación Pública Subsecretaria de Educación Media Superior Unidad de Educación Media Superior Tecnológica industrial y de servicios Centro de Bachillerato Tecnológico industrial y de servicio No.198 Competencias Genéricas que constituyen el Perfil del Egresado del Sistema Nacional de Bachillerato Piensa crítica y reflexivamente 5. Desarrolla innovaciones y propone soluciones a problemas a partir de métodos establecidos. Atributos: ❖ Sigue instrucciones y procedimientos de manera reflexiva, comprendiendo como cada uno de sus pasos contribuye al alcance de un objetivo. ❖ Ordena información de acuerdo a categorías, jerarquías y relaciones. ❖ Identifica los sistemas y reglas o principios medulares que subyacen a una serie de fenómenos. ❖ Construye hipótesis y diseña y aplica modelos para probar su validez. ❖ Sintetiza evidencias obtenidas mediante la experimentación para producir conclusiones y formular nuevas preguntas. Trabaja en forma colaborativa 8. Participa y colabora de manera efectiva en equipos diversos. Atributos: ❖ Propone maneras de solucionar un problema o desarrollar un proyecto en equipo, definiendo un curso de acción con pasos específicos. ❖ Aporta puntos de vista con apertura y considera los de otras personas de manera reflexiva. ❖ Asume una actitud constructiva, congruente con los conocimientos y habilidades con los que cuenta dentro de distintos equipos de trabajo. 3 Secretaría de Educación Pública Subsecretaria de Educación Media Superior Unidad de Educación Media Superior Tecnológica industrial y de servicios Centro de Bachillerato Tecnológico industrial y de servicio No.198 Competencias profesionales Identifica Bacterias Identifica Bacilos Ácido Alcohol Resistentes Realiza Antibiograma 4 Secretaría de Educación Pública Subsecretaria de Educación Media Superior Unidad de Educación Media Superior Tecnológica industrial y de servicios Centro de Bachillerato Tecnológico industrial y de servicio No.198 Contenido Práctica No. 7 Tinción de Gram ............................................................................. 6 Competencia profesional ....................................................................................... 6 Material .................................................................................................................. 6 Introducción: .......................................................................................................... 6 Desarrollo: ............................................................................................................. 7 Reporte de lo observado: ..................................................................................... 11 Cuestionario: ........................................................................................................ 12 Conclusiones: ...................................................................................................... 14 Perspectiva: ......................................................................................................... 14 Bibliografía: .......................................................................................................... 15 5 Secretaría de Educación Pública Subsecretaria de Educación Media Superior Unidad de Educación Media Superior Tecnológica industrial y de servicios Centro de Bachillerato Tecnológico industrial y de servicio No.198 Práctica No. 7 Tinción de Gram Competencia profesional: Realiza la técnica de tinción de Gram para clasificar las bacterias. Material: Cultivo bacteriano de 24 horas Asa bacteriológica Portaobjetos Colorante cristal violeta o violeta de genciana Solución de yodo-lugol o yodo gram Alcohol-acetona (1:1) Colorante safranina Microscopio Aceite de inmersión Introducción: Esta coloración, ideada por Hans Christian Gram a fines del siglo XIX, permite dividir a las especies bacterianas en dos grandes grupos: aquellas que toman el colorante básico, cristal violeta (gram positivas) y aquellas que son decoloradas por el alcoholacetona (gram negativas). El procedimiento clásico de la coloración de Gram incluye la fijación del material, ya sea por calor en la llama del mechero o por acción del alcohol. 6 Secretaría de Educación Pública Subsecretaria de Educación Media Superior Unidad de Educación Media Superior Tecnológica industrial y de servicios Centro de Bachillerato Tecnológico industrial y de servicio No.198 Desarrollo: 1. Sobre un portaobjetos limpio y seco, se coloca una gota de solución salina fisiológica o una gota de agua. 2. Se esteriliza el filamento del asa de siembra a la llama del mechero y se deja enfriar. Se toma una pequeña cantidad de un cultivo bacteriano y se suspende en la gota de agua o solución salina del portaobjetos. También puede ser utilizada una aguja de inoculación estéril para tomar la muestra bacteriana. 7 Secretaría de Educación Pública Subsecretaria de Educación Media Superior Unidad de Educación Media Superior Tecnológica industrial y de servicios Centro de Bachillerato Tecnológico industrial y de servicio No.198 3. Se deja secar al aire y luego se fija a la llama del mechero, pasándolo de 4 a 5 veces sobre esta; teniendo cuidado de no calentar demasiado pues el portaobjetos puede romperse, ya que no es de vidrio pyrex. 4. También se puede realizar el frotis del material directo de las muestras clínicas (exudados faríngeos, heridas, etc.). Se hace rodar el hisopo con que se tomó la muestra sobre el portaobjetos limpio y se fija con calor para proceder a la tinción: a) Cubrir el frotis bacteriano con cristal violeta durante 1 minuto. Enjuagar con agua. 8 Secretaría de Educación Pública Subsecretaria de Educación Media Superior Unidad de Educación Media Superior Tecnológica industrial y de servicios Centro de Bachillerato Tecnológico industrial y de servicio No.198 b) Aplicar el yodo gram o lugol y dejarlo reaccionar durante 1 minuto. Escurrir. c) Ahora, decolorar con solución de alcohol-acetona, agregando gota a gota en el portaobjetos inclinado sobre el fregadero o tarja, hasta que deje de salir colorante, 5-15 segundos. Enjuagar. d) Finalmente cubrir el frotis son la solución de safranina y dejarla actuar durante 30 segundos. Lavar el exceso de colorante y dejar secar al aire. 9 Secretaría de Educación Pública Subsecretaria de Educación Media Superior Unidad de Educación Media Superior Tecnológica industrial y de servicios Centro de Bachillerato Tecnológico industrial y de servicio No.198 e) Coloca aceite de inmersión al frotis seco y teñido para observarlo al microscopio, con el objetivo 100X. f) Realiza esquemas de lo observado e indica la forma, agrupación y característica tintorial de los microorganismos observados. 10 Secretaría de Educación Pública Subsecretaria de Educación Media Superior Unidad de Educación Media Superior Tecnológica industrial y de servicios Centro de Bachillerato Tecnológico industrial y de servicio No.198 Reporte de lo observado: Forma Exudado faríngeo Coprocultivo Urocultivo Exudado faríngeo Agrupación Bacilos Bacilos Cocos Bacilos Estreptobacilos Estafilococos Coprocultivo 11 Característica tintorial Gram + Gram Gram - Urocultivo Secretaría de Educación Pública Subsecretaria de Educación Media Superior Unidad de Educación Media Superior Tecnológica industrial y de servicios Centro de Bachillerato Tecnológico industrial y de servicio No.198 Cuestionario: 1. ¿Por qué es necesario fijar el frotis antes de teñirlo? R= Para poder aplicar los métodos de tinción que permiten la observación al microscopio de las bacterias sin que la muestra sea arrastrada en los lavados. Además, la fijación hace que las bacterias queden inactivadas y adheridas al vidrio alterando lo menos posible la morfología y las posibles agrupaciones de células que pudiera haber. 2. ¿Puede una bacteria Gram positiva teñirse de Gram negativa? ¿Por qué? R= En algunas ocasiones, cuando son cultivos viejos de bacterias Gram positivas y llegan a perder capas de peptidoglicano, (siendo éste el principal componente que permite diferenciarlas con la pared de las Gram negativas) por lo que su pared llega a teñirse como Gram negativos 3. ¿Qué otras técnicas de tinción son utilizadas comúnmente en el laboratorio de bacteriología? ¿En qué casos se utilizan? Ziehl-Neelsen: Se emplea para poder distinguir aquellos microorganismos cuya coloración resiste la acción de alcoholes y ácidos suaves (ácido-alcohol resistentes) de otros que no resisten la decoloración (no ácido-alcohol resistentes). Tinción de Wright: Es una técnica que se emplea generalmente para la diferenciación de elementos celulares de la sangre y es clasifi cada como una tinción policromática, dado que puede teñir compuestos ácidos o básicos presentes en una célula. Tinción negativa: Un método sencillo de tinción para bacterias, que además es un claro caso de cromofobia y que por lo tanto funciona aun cuando los métodos de tinción positiva fallan. 12 Secretaría de Educación Pública Subsecretaria de Educación Media Superior Unidad de Educación Media Superior Tecnológica industrial y de servicios Centro de Bachillerato Tecnológico industrial y de servicio No.198 Tinción indirecta: Se denomina de este modo a las tinciones que hacen uso de un mordiente. Un mordiente habitual es el ácido tánico. Tinción directa: Hablamos de tinción directa cuando el colorante interacciona directamente con el sustrato, sin otro tratamiento previo. Tinción rodamina-auramina: Los ácidos micólicos de las paredes celulares de las micobacterias poseen afinidad para los fluorocromos auramina y rodamina. Estos colorantes se fijan a las bacterias, que aparecen de color amarillo o naranja brillante contra un fondo verdoso. El permanganato de potasio, empleado como contraste, evita la fluorescencia inespecífica. Todos los microorganismos ácido-alcohol resistentes, incluyendo los esporozoarios parásitos, se tiñen con estos colorantes. Tinción naranja de acridina: El fluorocromo naranja de acridina se une al ácido nucleico ya sea en su forma nativa o desnaturalizada. En algunas preparaciones de naranja de acridina, el color de la fluorescencia puede variar, dependiendo del pH y de la concentración. El naranja de acridina ha sido empleado como colorante vital, que da una fluorescencia verde si el microorganismo está vivo y roja si está muerto. 4.- ¿En que se basa la tinción de Gram? ¿De qué color se tiñen las bacterias Gram (+) y Gram (-)? La técnica se basa en aplicar una serie de colorantes a una muestra de cualquier origen, que contenga bacterias no identificadas. Los colorantes tiñen la pared de las bacterias y, tras unos minutos, se realiza un lavado del colorante. Después de eso puede que el colorante permanezca en la pared bacteriana o que se haya ido. Las bacterias Gram (+) se tiñen de color morado a purpura Las bacterias Gram (-) se tiñen de color rosa a rojo 13 Secretaría de Educación Pública Subsecretaria de Educación Media Superior Unidad de Educación Media Superior Tecnológica industrial y de servicios Centro de Bachillerato Tecnológico industrial y de servicio No.198 Conclusiones: En esta práctica obtuvimos un nuevo conocimiento referente a un tema ya visto en clase (Tinción de Gram). Aprendimos en que aspectos se basaba la tinción y en base a una breve explicación dada por el docente, de manera autónoma nosotros aplicamos esos procedimientos captado. Así mismo, volvimos a poner en práctica el manejo y uso del microscopio, ya que este nos permitía ver las bacterias que fueron teñidas. Por último, gracias a esta tinción en el microscopio identificamos las bacterias claramente, logramos a preciar su forma (cocos, bacilos, espirilos, etc.) de igual manera logramos ver de qué color se tiño su pared celular, la cual nos permitía clasificarlas en Gram (+) o Gram (-). Perspectiva: Consideramos que aprender a realizar una tinción de Gram, con el procedimiento adecuado es de suma importancia, en el área que deseamos enfocarnos, ya que gracias a que la técnica tiñe las bacterias esto nos da la posibilidad de determinar el tipo de antibiótico, así como su eficacia para contrarrestar dicha bacteria dependiendo si es Gram positiva o negativa. 14 Secretaría de Educación Pública Subsecretaria de Educación Media Superior Unidad de Educación Media Superior Tecnológica industrial y de servicios Centro de Bachillerato Tecnológico industrial y de servicio No.198 Bibliografía: ❖Brock. (1999). Biología de los microorganismos. 8aEdición. Ed. PRENTICE HALL. 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