Puccinia kuehnii

DIRECCIÓN GENERAL DE SANIDAD VEGETAL
CENTRO NACIONAL DE REFERENCIA FITOSANITARIA
MANUAL DE DIAGNÓSTICO PARA LA IDENTIFICACIÓN MICROSCÓPICA Y LA
DETECCIÓN MOLECULAR DE Puccinia kuehnii E.J. Butler, CAUSANTE DE
ROYA ANARANJADA EN CULTIVOS DE CAÑA DE AZÚCAR
Nombre
Elabora(n):
Cargo
Dra. María del Carmen Calderón Ezquerro
Investigadora Científica
M. en C. Hilda Adriana Guerrero Parra
Técnica
M. en C. Erika Arroyo Vázquez
Técnica
Firma
Revisa:
Autorizan:
Datos de Control
Revisión:
Fecha de elaboración:
Laboratorio:
No. de Páginas:
Dirección General de Sanidad Vegetal
Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria
MANUAL DE DIAGNÓSTICO PARA LA IDENTIFICACIÓN
MICROSCÓPICA Y LA DETECCIÓN MOLECULAR DE Puccinia kuehnii
E.J. Butler, CAUSANTE DE ROYA ANARANJADA EN CULTIVOS DE
CAÑA DE AZÚCAR
INDICE
I.
II.
2
I. Antecedentes
1.1 Posición taxonómica
1.2 Estatus de la plaga en México
1.3 Origen y distribución
1.3.1 Origen de P. kuehnii
1.3.2 Distribución mundial actual
III.
1.3.3 Distribución en México
1.4 Rango de hospedantes
1.5 Síntomas y signos
1.6 Epidemiología
1.7 Transmisión y diseminación
II. Importancia
2.1 Significancia fitosanitaria
2.2 Importancia del monitoreo aerobiológico
III. Objetivo
3.1 De la actividad
3.2 Del manual
IV. Protocolo de diagnóstico
4.1 Envío/recepción de muestra
4.1.1 Trampa pasiva de esporas (TPE)
4.1.2 Trampa de esporas tipo Hirst (TEH)
4.2 Recepción y procesamiento del material
4.2.1 Retiro de la cinta de celofán Melinex del portaobjetos de la TPE
4.2.2 Retiro de la cinta de celofán Melinex del tambor de la TEH
4.3 Análisis de las cintas de celofán Melinex con aeropartículas impactadas en la TEH y TPE
4.3.1 Montaje permanente de las cintas Melinex y cuantificación de urediniosporas de P.
kuehnii
4.3.1.1 Montaje permanente de laminillas
4.3.1.2 Método para el conteo de urediniosporas
4.3.1.2.1 Identificación de urediniosporas
4.3.1.2.2 Cuantificación de urediniosporas
4.3.1.2.3 Expresión de los resultados
4.3.1.2.4 Base de datos aerobiológicos
4.3.2 Detección molecular de las urediniosporas de P. kuehnii impactadas en las cintas
Melinex mediante PCR en punto final
4.3.2.1 Rompimiento de urediniosporas y extracción del ADN
4.3.2.2 Amplificación de ADN y análisis
4.3.2.2.1 PCR en punto final
4.4 Almacenamiento
V. Glosario
1
1
1
1
1
1
2
2
3
3
3
4
4
4
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5
5
6
6
6
6
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7
8
11
11
VI. Referencias
Anexo
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29
11
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14
16
16
17
18
18
24
24
25
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ÍNDICE DE FIGURAS
Fig. 1. Portaobjeto desmontado de la TPE y colocado en la caja para transportar y
almacenar las laminillas
Fig. 2. Tambor con cinta de celofán Melinex de la TEH en protatambor
Fig. 3. Regla de metacrilato con cinta de celofán Melinex.
Fig. 4. Urediniosporas de P. kuehnii tomadas al microscopio óptico
Fig. 5. Urediniosporas de P. melanocephala tomadas al microscopio óptico
Fig. 6 Kit Dneasy Plant Mini (Qiagen GmbH Hilden, Germany)
Fig. 7. Curva estándar de sensibilidad para la detección del ADN de urediniosporas de P.
kuehnii colectadas de hojas de caña de azúcar de cultivos infectados
Fig. 8. Muestras de urediniosporas de P. kuehnii colectadas de cultivos infectados
Fig. 9. Muestras de urediniosporas de P. kuehnii colectadas del aire de cultivos
infectados
6
6
9
15
16
18
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25
25
ÍNDICE DE FIGURAS DE ANEXO
Fig. 1. Hoja de registro de cuantificación de urediniosporas
29
Fig. 2. Cálculo de factor de corrección
Fig. 3. Hoja de datos semanales de la TPE
Fig. 4. Hoja de datos semanales de la TEH
29
30
30
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Posición taxonómica de Puccinia kuehnii
Tabla 2. Principales hospedantes de P. kuehnii (USDA, 2012)
Tabla 3. Retiro de la cinta de celofán Melinex del portaobjetos de la TPE
Tabla 4. Retiro de la cinta de celofán Melinex del tambor de la TEH
Tabla 5. Montaje permanente de laminillas
Tabla 6.Características principales para diferenciar a Puccinia kuehnii de melanocephala
Tabla 7. Rompimiento de urediniosporas y extracción de ADN
1
2
7
8
11
15
19
DIAGRAMAS DE FLUJO
Diagrama de flujo 1. Retiro de la cinta de celofán Melinex del portaobjetos de la TPE
Diagrama de flujo 2. Retiro de la cinta de celofán Melinex del tambor de la TEH
Diagrama de flujo 3. Montaje permanente de cinta de celofán Melinex en laminillas
Diagrama de flujo 4. Rompimiento de esporas y extracción de ADN
7
10
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I. ANTECEDENTES
1.1 Posición Taxonómica:
La posición taxonómica del hongo causante de la roya anaranjada (Puccinia kuehnii) se
presenta en la tabla 1:
Tabla 1. Posición taxonómica de Puccinia kuehnii
Reino: Fungi
Phylum: Basidiomycota
Clase: Urediniomycetes
Orden: Uredinales
Familia: Pucciniaceae
Género: Puccinia
Especie: kuehnii
Puccinia kuehnii (W.Krüger) E.J. Butler 1914
(CABI, 2011)
1.2 Estatus de la plaga en México:
Presente, sólo en algunas áreas y sujeta a control oficial (SINAVEF, 2011)
1.3 Origen y distribución
1.3.1 Origen de P. kuehnii
Existe poca información acerca de la introducción del patógeno en las zonas donde está
presente. Se asume que P. kuehnii puede ser originaria de las zonas de donde Saccharum es
nativo, lo cual incluye a países como Papua Nueva Guinea (centro de diversidad de S. officinarum
y S. robustum), India y el sur de Asia (considerado el centro de origen para S. spontaneum (CABI,
2011).
1.3.2 Distribución mundial actual
Asia: China, Indonesia, Nepal, Pakistán, Filipinas, Singapur, Sri Lanka, Taiwán y Vietnam.
África: Isla Mauricio, Mozambique y Sudáfrica.
América: México, EUA, Costa Rica, Guatemala, Nicaragua, Panamá y Brasil.
Oceanía: Islas Samoa, Australia, Islas Cook, Islas Fiji, Polinesia Francesa y Nueva Caledonia
(CABI, 2011).
1.3.3 Distribución en México
Durante el periodo del 15 de diciembre de 2011 al 15 de enero de 2012, se realizaron
actividades de vigilancia para roya anaranjada de la caña de azúcar (P. kuehnii) en los estados de
Chiapas, Quintana Roo, Veracruz, Morelos, Puebla, San Luis Potosí, Tamaulipas, Nayarit y
Sinaloa, con acciones de exploración y parcelas centinela. Al respecto, dicha plaga se ha
detectado en los municipios de Villa Comaltitlán, Tuzatán, Huehuetán, Mazatán, Huixtán y Efraín A.
Gutiérrez, en el estado de Chiapas; Othón P. Blanco en Quintana Roo; Úrsulo Galván, Tlalixcoyan,
Paso de Ovejas, Pueblo Viejo, Pánuco, El Higo en Veracruz; y San Vicente Tancuayalab en San
Luis Potosí. En este periodo, se reportan dos sospechosos en los municipios de Puente Nacional y
Actopan, Veracruz, donde se tomaron muestras para el diagnóstico en el laboratorio del Centro
Nacional de Referencia Fitosanitaria. En total son 14 municipios en cuatro estados donde se ha
detectado roya anaranjada (SINAVEF, 2012).
1.4 Rango de hospedantes
Los principales hospedantes de P. kuehnii se presentan en la Tabla 2.
Tabla 2. Principales hospedantes de P. kuehnii (USDA, 2012)
Nombre científico
Nombre común
Saccharum officinarum L., S. rufipilum Steud.
Caña de azúcar,
cañaduz, cañamiel
S. arundinaceum Retz.
S. barberi Jeswiet.
S. edule Hassk.
S. narenga (Nees ex Steud.) Wall. ex Hack.
S. spontaneum L.
Sclerostachya fusca (Roxb.) A. Camus.
1.5 Síntomas y signos
Caña silvestre
caña
dulce,
Los síntomas asociados a P. kuehnii, son puntos minúsculos de color amarillo que se
agrandan y desarrollan halos de color amarillo-verdoso pálido. Sin embargo, el color de la lesión en
el estado de madurez cambia de color anaranjado a anaranjado parduzco o al amarillo parduzco.
Las pústulas aparecen principalmente en la superficie inferior de la hoja, tienden a estar
agrupadas y son generalmente más numerosas en la mitad inferior de las hojas que en el ápice
(Ryan y Egan, 1989). El diagnóstico de P. kuehnii, mediante síntomas, signos y características
morfométricas no dan certeza a su identificación. De esta manera, sólo es posible señalar
características consistentes a las de la roya anaranjada, por lo que para lograr un diagnostico
preciso se requiere del análisis molecular mediante la prueba de PCR, con el fin de determinar la
especie (CABI, 2011).
1.6 Epidemiología
La roya anaranjada aparece en verano y otoño y se ve favorecida por las condiciones
templadas húmedas. La producción de urediniosporas continúa por más de 23 días después de la
formación de los uredinios. El número total de urediniosporas producidas por uredinio para P.
kuehnii es de 4.7 x 103. La severidad de la roya se incrementa de forma exponencial con el tiempo
y éste es el motivo por el que aparecen de manera repentina durante condiciones ambientales
favorables. La germinación de las esporas ocurre dentro del intervalo de 17-34°C de temperatura,
pero la óptima es de 18°C y 97% de humedad relativa. El proceso de infección requiere de
humedad, que puede provenir de la lluvia o el rocío. La infección puede presentarse
aproximadamente en cuatro horas en condiciones idóneas para su desarrollo. La dispersión de las
urediniosporas a las hojas superiores y campos adyacentes se ve favorecida por un ambiente seco
y por el viento (Infante et al., 2009).
1.7 Transmisión y/o diseminación
La dispersión de la enfermedad se da de forma natural, principalmente por el acarreo de
las urediniosporas por el viento a distancias de hasta 2000 km (CABI, 2010). Otra vía es que las
urediniosporas vayan adheridas a la ropa o zapatos de gente procedente de zonas infectadas con
la roya anaranjada. No hay reportes de que se transmita por semilla o insectos. Las fases más
vulnerables de la planta, se extienden a mitad del periodo entre el crecimiento y la madurez. La
enfermedad raramente se presenta en caña joven (CABI, 2011).
II. IMPORTANCIA
2.1 Significancia fitosanitaria
La roya anaranjada producida por P. kuehnii había sido registrada por largo tiempo como
una enfermedad de menor importancia en los países donde se encontraba presente. Sin embargo,
en el año 2000 esta roya devastó la variedad Q124, la cual representaba el 45% del cultivo de caña
de azúcar en Australia, causando pérdidas por 150 millones de dólares. Se cree que esto se debió
a la aparición de una nueva variedad del hongo o que llegó del exterior.
P. kuehnii representa un inminente peligro para la agroindustria azucarera mexicana, por la
alta probabilidad de que un brote explosivo del patógeno pueda causar pérdidas catastróficas.
Reportes en la literatura mencionan que la variedad CP 72- 2086, segunda variedad
comercial cultivada en México, fue probada en condiciones naturales, mostrando susceptibilidad a
la roya anaranjada, así como la variedad Mex. 79-431, la cual presentó síntomas de la enfermedad,
por lo que es necesario determinar y vigilar constantemente los estados de la República Mexicana
en los que se siembra caña de azúcar, así como la superficie cultivada (Ovalle et al., 2008). Las
pérdidas económicas en México en caña de azúcar, por ser un cultivo de importancia económica
del país, podrían representar cerca de 18,212,734 de pesos en 48,764,224 de toneladas (SIAP,
2009).
2.2 Importancia del monitoreo aerobiológico
La detección temprana y la diagnosis de patógenos de plantas pueden predecir con mayor
exactitud la presencia de enfermedades, lo cual coadyuva a una mejor planeación en la toma de
decisiones para la aplicación de plaguicidas. Por lo tanto, es de primordial importancia contar con
estrategias de control basadas en monitoreos ambientales y en la valoración de riesgo de
enfermedades (Sweet et al., 1992).
Para llevar a cabo la vigilancia aerobiológica de plagas, se realizan pruebas piloto para el
seguimiento de la dispersión de la roya anaranjada de la caña de azúcar (P. kuehnii) mediante el
establecimiento, tanto de redes (utilizando trampas de esporas del aire) como del análisis de
mapas de riesgo del hongo causante de la enfermedad y del modelo Hysplit que modela el
proceso aerobiológico.
En este manual se presenta el sistema de diagnóstico para la identificación y detección de
las esporas colectadas del aire, mediante los muestreos aerobiológicos realizados durante la
vigilancia epidemiológica de la roya anaranjada de la caña de azúcar.
III. OBJETIVO
3.1 De la actividad
Determinar la presencia en el aire de las urediniosporas de P. kuehnii mediante la
vigilancia aerobiológica y el seguimiento fitosanitario en cultivos de caña de azúcar en riesgo de
infección.
3.2 Del manual
Describir los procedimientos y métodos para la identificación morfológica y detección
molecular de las urediniosporas colectadas del aire de cultivos de caña de azúcar mediante
muestreos aerobiológicos.