4.3.2 Detección molecular de las urediniosporas de P. kuehnii

4.3.2 Detección molecular de las urediniosporas de P. kuehnii impactadas en las cintas
Melinex mediante PCR en punto final
La detección de las urediniosporas de P. kuehnii se realiza mediante el análisis molecular
de las cintas muestreadas. La cinta correspondiente a cada día (TEH) o semana (TPE) es
procesada para la extracción del ADN de las urediniosporas y su detección mediante la prueba de
reacción en cadena de la polimerasa (PCR en punto final), la cual permite identificar la presencia
de P. kuehnii en la muestra utilizando oligonucleótidos específicos (Glynn et al., 2010).
Para la detección con la prueba de PCR en punto final las cintas, tanto de la TEH como de
la TPE impactadas con las esporas de hongos colectadas del aire y seleccionadas para detección
molecular, son removidas y cortadas en secciones de 24 mm, representando períodos de 12 horas
de exposición. Cada sección de la cinta es colocada dentro de un tubo Eppendorf de 1.5 ml para la
extracción de ADN y su posterior análisis en PCR en punto final.
Nota: Todo el material utilizado para llevar a cabo la extracción y detección por PCR del
ADN debe estar estéril.
4.3.2.1 Rompimiento de urediniosporas y extracción del ADN
El método utilizado para la extracción del ADN de las urediniosporas impactadas en la cinta
de celofán de la trampa de esporas tipo
Hirst, es tomado de Lee y Taylor (1990) y
Williams et al., (2001) y Calderón (2002a,
b), y modificado para la detección de P.
kuehnii utilizando el Kit DNeasy Plant Mini
(Qiagen GmbH Hilden, Germany)(Fig. 6).
El procedimiento para la extracción
de ADN de P. kuehnii se describe a
continuación (Tabla 7, diagrama de flujo
4):
Fig 6. Kit Dneasy Plant Mini (Qiagen GmbH Hilden,
Germany)
Tabla 7. Rompimiento de urediniosporas y extracción de ADN
1
Cortar las cintas en piezas de 7 mm de ancho x 24
mm de largo y colocarlas dentro de tubos Eppendorf
de 1.5 ml con 0.2 g de perlas de vidrio de 400 a 455
μm de diámetro (Jencons-PLS, Leighton Buzzard,
UK) estériles y lavadas con ácido clorhídrico, las
cuales son utilizadas para remover las partículas
impactadas sobre la cinta de celofán Melinex para
romper la pared de las esporas.
2
Adicionar a cada tubo 400 μl de amortiguador AP1 y
agitarlo en el equipo FastPrep (Thermo Savant
Instruments, Holbrook, Nueva York, EUA) por dos
períodos de 40 seg a una velocidad de 6 m/s.
3
Colocar los tubos en hielo por 2 min entre ambos
periodos.
4
Adicionar a cada tubo 4 μl de RNAsa (100 mg/ml),
agitar vigorosamente en el vórtex e incubar por 10
min a 65°C, mezclando suavemente por inversión de
2 a 3 veces.
5
Adicionar 130 µl del amortiguador AP2 e incubar por
5 min en hielo.
6
Transferir 450 μl del lisado a la columna QIAshreder
sostenida en un tubo colector de 2 ml.
7
Centrifugar los tubos a 14000 rpm por 2 min.
8
Transferir el sobrenadante a un tubo Eppendorf 1.5
ml teniendo la precaución de no llevarse la pastilla
formada en el fondo del tubo colector.
9
Adicionar al tubo 1.5 volúmenes del amortiguador
AP3/E, mezclando rápidamente con ayuda de una
micropipeta.
10
Transferir 650 μl de la mezcla anterior a la columna
DNeasy mini sostenida en un tubo colector de 2 ml y
centrifugar durante 1 min a 9000 rpm.
11
Desechar el filtrado obtenido, repitiendo este paso
hasta acabar el volumen.
12
Cambiar el tubo colector y adicionar 500 μl del
amortiguador AW, centrifugar por 1 min a 9000 rpm.
13
Colocar la columna en un nuevo tubo Eppendorf de
1.5 ml adicionándole a la membrana 100 μl de agua
Mili Q; dejar incubar por 5 min a temperatura
ambiente y centrifugar por 1 min a 9000 rpm para
obtener la elución.
14
Determinar la concentración de ADN final,
comparando con diferentes concentraciones del fago
λ (20, 40 y 60 ng) mediante electroforesis en gel de
agarosa al 0.8% (GIBCO BRL®, US) o cuantificar el
ADN en un NanoDrop (Thermo scientific) para
determinar la calidad y la concentración de la
muestra de ADN.
15
Almacenar la suspensión de ADN a 4 °C hasta su
uso para PCR.
4.3.2.2 Amplificación de ADN y detección molecular
4.3.2.2.1 PCR en punto final
La detección de ADN se lleva a cabo con oligonucleótidos específicos de P. kuehnii,
utilizando los oligonucleótido PK1F (PK1F-aagagtgcacttaattgtggctc) y PK1R (PK1Rcaggtaacaccttccttgatgtg) que generan un producto de 527 pb (Glynn et al., 2010).
Las reacciones de PCR en punto final se realizan en un termociclador marca Mastercycler
Eppendorf. La prueba de PCR se lleva a cabo en un volumen total de 50 μl conteniendo 2.5 mM
MgCl2, 0.25 mM dNTPs, 0.5 μM de cada oligonucleótido PK1F y PK1R y 2.5 unidades de Taq DNA
Polimerasa (Applied Biosystems), 1X de buffer y 5 μl de ADN muestra. Las condiciones del ciclo
son 94°C por 5 min, seguidos por 35 ciclos de temperatura de desnaturalización de 94 °C por 30
seg, temperatura de apareamiento de 56°C por 30 seg, temperatura de polimerización de 72°C por
30 seg y una extensión final de 72°C por 7 min. Los productos de PCR son visualizados en geles
de agarosa al 2% y el ADN teñido con bromuro de etidio.
En la Fig. 7 se muestra la curva estándar de sensibilidad para la detección del ADN de
urediniosporas de P. kuehnii colectadas de hojas de caña de azúcar de cultivos infectados, donde
fue posible detectar hasta una urediniospora.
Fig. 7. Curva estándar de sensibilidad para la detección del ADN de urediniosporas de P. kuehnii
colectadas de hojas de caña de azúcar de cultivos infectados. 1) Marcador molecular de 100 pb 2)
600 urediniosporas 3) 60 urediniosporas 4) 6 urediniosporas 5) 1 urediniospora 6) control
negativo.
En la figura 8 se muestra la detección del ADN de urediniosporas de P. kuehnii colectadas
de hojas de caña de azúcar de cultivos infectados en diversas localidades del Municipio de Othón
P. Blanco en Quintana Roo en marzo de 2011.
Figura 8. Muestras de urediniosporas de P. kuehnii colectadas de cultivos infectados. 1) Marcador
molecular 100 pb 2) Testigo positivo 3) Testigo negativo 4) Sabinos, 5) Álvaro Obregón, 6)
Rovirosa, 7) Palmar, 8) Sac-Xan, 9) Sarabia, 10) Allende, 11) Ramonal. Se observa que el hongo
es detectado en todas las zonas evaluadas.
En la figura 9 se muestra la detección de ADN de muestras colectadas del aire con la TPE
de julio y agosto de 2011, en diversas zonas del Municipio Othón P. Blanco en Quintana Roo. Las
cintas fueron revisadas al microscopio y aquellas que presentaron más de una urediniosporas
fueron utilizadas para realizar la detección molecular con PCR en punto final.
1. Marcador de 100 pb,
Figura 9. Muestras
de urediniosporas de P. kuehnii colectadas del aire de cultivos infectados. 1)
2. Tes go nega vo extracción
Marcador 3.molecular
pb, 2) Testigo negativo extracción, 3) Testigo negativo PCR, 4) Testigo
Tes go nega100
vo PCR
4. Tes
go posi
vo de 5-12/jul/2011,
Uredinosporas
positivo, 5)
Juan
Sarabia
6) Palmar 13-20/Sept/2011) 7) Cacao 26-02/Ago/2011, 8)
5. Juan
Sarabia ( 5-12/07/11),
Juan Sarabia
19-27/jul/2011,
9) Testigo negativo.
6. Palmar (13-20/09/11),
7. Cacao (26-02/08/11),
8. Juan Sarabia (19-27/07/11),
9. Tes go nega vo
4.4 Almacenamiento
Los portaobjetos con las muestras colectadas del aire son guardados en cajas las cuales
son rotuladas con la fecha y localidad de donde son las muestras. Las muestras son almacenadas
como referencia de cada zona monitoreada.
Después de que el ADN purificado es utilizado para la detección por PCR de P. kuehnii,
éste es almacenado a -80 C para conformar una genoteca de esta roya.
V. GLOSARIO
Elución: Separación, mediante un fluido, de una sustancia retenida en una fase estacionaria.
Extracción de ADN: Aislamiento de ADN genómico puro el cual puede ser utilizado para diversas
aplicaciones moleculares como la Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
FastPrep: Equipo utilizado para el rompimiento de la pared de las esporas.
Monitoreo aerobiológico: Captura continua de partículas de origen biológico presentes en
atmósfera.
la
Partículas. Cualquier material, excepto agua no combinada, que existe en estado sólido o
líquido en la atmósfera o en una corriente de gas en condiciones normales.
Partículas de origen biológico en la atmósfera. Microorganismos como esporas de hongos,
bacterias, virus, algas, amibas, insectos, así como fragmentos, metabolitos, toxinas,
proteínas, etc. derivados de éstos.
Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR): Consta de una serie de pasos de calentamiento y
enfriamiento que permite la amplificación del ADN. El ADN es degradado (se separan los
dos filamentos de la doble hélice) y los iniciadores (primers) se adhieren a los filamentos
separados; después se forman los filamentos complementarios (dímeros) a partir de los
iniciadores, con la adición de deoxinucleótidosdetrifosfato (dNTPs) y ADN polimerasa
termoestable. Con calentamientos sucesivos se degradan estos nuevos dímeros y el
proceso se repite durante varios ciclos.
Roya anaranjada: (roya: lat. Rubea, rubia) Uredinnales. Enfermedad destructiva de plantas
causadas por Pucinia kuehnii. A partir del año 2000 pasó a formar parte de las
enfermedades de alta importancia económica en el cultivo de la caña de azúcar.
Urediniospora: (lat. uredo, genit. uredinis, roya, tizon anublo, roña, quemadura > uro, quemar + gr.
sporá, espora): espora binucleada, unicelular, sésil o pedicelada, que se forma en los
uredinios o uredosoros de los hongos Uredinales o royas, llamados así por el color
herrumboso de estas esporas; éstas son las principales estructuras de propagación de estos
hongos fitoparásitos.
VI. REFERENCIAS
CABI.
2010. En línea en: http://www.cabi.org/cpc/?compid=1&dsid=45818&loadmodule=
datasheet&page=868&site=
CABI. 2011. Crop Protection Compendium. Global Module 7th. Edition. CAB International. UK
Calderón C., Ward E., Freeman J. y McCartney H.A. (2002a). Detection of airborne fungal spores
sampled by rotating-arm and Hirst-type spore traps using polymerase chain reaction
assays. J. Aerosol Sci. 33:283–296.
Calderón C., Ward E., Freeman J., Foster J.S. y McCartney H.A. (2002b). Detection of airborne
inoculum of Leptosphaeria maculans and Pyrenopeziza brassicae in oilseed rape crops by
polymerase chain reaction (PCR) assays. Plant Pathol. 51:303-310.
Dixon L. y Castlebury L. 2012. Systematic Mycology and Microbiology Laboratory, ARS, USDA. .
Invasive Fungi. Orange rust of sugarcane - Puccinia kuehnii. Retrieved April 13, 2012.
Galán C., Cariñanos P., Alcázar P., y Domínguez E. 2007. Manual de gestión y Calidad de la red
Española de Aerobiología. Servicio de publicaciones. Universidad de Córdoba. 61 p.
Glynn N.C., Dixon L.J., Castlebury L.A., Szabo L.J. y Comstock C.J. 2010. PCR assays for the
sugarcane rust pathogens Puccinia kuehnii and P. melanocephala and detection of a SNP
associated with geographical distribution in P. kuehnii. Plant Pathol. 59:703 -711.
Hsieh W.H, Lee Ch.S. y Chan S.I. 1977. Rust Disease of sugarcane in Taiwan: the causal organism
Puccinia melanocephala Sydow. Taiwan Sugar: 24:416-420.
Hsieh W.H, Fang J.G. 1983. The uredospore production of Puccinia melanocephala and Puccinia
kuehnii in sugarcanes. Plant Prot Bull. (Taiwan) 25:239-244.
Infante D., Martínez E., González E. y González N. 2009. Puccinia kuehnii (Krüger) Bulter y
Puccinia melanocephala H. Sydow & P. Sydow, en el cultivo de la caña de azúcar. Rev.
Protec. Veg. 24:22-28.
Lee S.B. y Taylor J.W. 1990. Isolation of DNA from fungal mycelia and single spores. En: Innis
M.A., Gelfand D.H., Sninsky J.J. y White T.J. (Eds.) PCR Protocols. A Guide to Methods
and Applications (pp. 282–287) Academic Press, San Diego, USA.
Ovalle W., Orozc, H., Quemé J., Melgar M., García S. 2008. La roya anaranjadada en Guatemala y
estrategias para su manejo. Centro Guatemalteco de Investigación y Capacitación de la
Caña de Azúcar. Km. 92.5 Carretera a Santa Lucía Cotzumalguapa, Escuintla, Guatemala.
http://www.pestalert.org/oprDetail.cfm?oprID=270
Purdy L.H. y Dean J.L. 1983. Rust, an old disease with new importance in Sugarcane. Sugar y
Azúcar. 78:30-32.
Ryan C.C. y Egan B.T. 1989. Roya. Capítulo XIII Diseases of Sugarcane. 387p.
SIAP.
2009.
Sistema
de
información
Agrícola
y
Pesquera.
En
línea
http://www.siap.gob.mx/index.php?option=com_wrapper&view=wrapper&Itemid=350
en:
SINAVEF 2011. Reporte Epidemiológico 006, del Sistema Nacional de Vigilancia
Epidemiológica Fitosanitaria contra roya anaranjada de la caña de azúcar. Sistema
Nacional de Vigilancia Epidemiológica Fitosanitaria, Centro Nacional de Referencia
Fitosanitaria, Dirección General de Sanidad Vegetal, Servicio Nacional de Sanidad Inocuidad y
Calidad
Agroalimentaria -SAGARPA, Universidad Autónoma de San Luis Potosí.
SINAVEF. 2012. Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiológica fitosanitaria. En línea en:
http://portal.sinavef.gob.mx/EpidemiologiaFitosanitariaRoyaAnaranjada.html
Sweet J.B., Pope S.J. y Thomas, J.E. 1992. Resistance to Sclerotinia sclerotiorum in linseed,
oilseed rape and sunflower cultivars, and its role in integrated control. Brighton Crop
Protection Conference – Pests and Diseases, 117–125.
USDA, 2012. Orange rust of sugar cane. Diagnostic fact sheet. En línea en: http://nt.arsgrin.gov/taxadescriptions/factsheets/index.cfm?thisapp=Pucciniakuehnii&printtype=
Williams R.H., Ward E. y McCartney H.A., 2001. Methods for integrated air sampling and DNA
analysis for detection of airborne fungal spores. Appl. Environ. Microb. 67: 2453–2459.
ANEXO
Sección A) Cuantificación de urediniosporas
Para la cuantificación de urediniosporas se utiliza una hoja de registro en la que se indica el
número de urediniosporas identificadas y contadas en el microscopio por hora, durante las 24h del
día. Las hojas se utilizan tanto para el registro de las urediniosporas contadas en toda la laminilla
(más de 4 transectos), como las contadas en solo 4 transectos o barridos horizontales.
Día:
Mes:
Año:
Localidad:
Taxón: Urediniosporas de Puccinia kuehnii.
H/T
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
SUMA
1
2
3
4
>5
Figura 1. Hoja de registro de cuantificación de urediniosporas
Sección B) Cálculo del factor de corrección
La concentración de las urediniosporas colectadas del aire debe expresarse como una media diaria
por metro cúbico de aire, para lo cual se aplica una fórmula para realizar el cálculo del factor de
corrección y expresar los resultados como partículas/m 3 es decir, urediniosporas/m 3. Se utiliza un
Microscopio óptico a 40 x 10 aumentos.
Un primer paso es realizar una medida del campo de visión con el microscopio
a utilizar a 40x10 aumentos.
Ejemplo caso práctico:
Pm3= Superficie analizada/ Superficie total muestreada
Considerando un diámetro del campo de visión de 0.45 mm:
Volumen de succión: 10 l/min = 600 l/hora = 14400 l/día = 14,4 m3
Área de 1 barrido horizontal= 48 mm x 0,45 mm = 21,6 mm2
Superficie analizada = 21,6 x 4 barridos = 86,4 mm2
Superficie total muestreada = 48 mm largo x 14 mm ancho = 672 mm2
N = número de esporas en los cuatro barridos.
Pm3 =
672 mm2
86.4 mm2 x (1/14.4) x N
Pm3 = 7.7 x 0.0694 x N
Fig. 2. Cálculo del factor de corrección
Sección C) Base de datos aerobiológicos de las urediniosporas colectadas del aire con la
TPE y la TEH
Hoja de datos semanales de la TPE estandarizadas para la posterior incorporación de los datos
resultantes en la Base de datos informatizada (en programa de Excel) (Fig. 3).
ESTADO:
MUNICIPIO:
RESPONSABLE:
Tipo de trampa:
Esporas/m3
TPE
Semana
1
LOCALIDAD:
FECHA: del
Semana
2
/
Semana
3
al
Semana
4
/
/2012
Semana
5
Semana
6
Semana
7
Roya naranja
Figura 3. Hojas de datos semanales de la TPE
Hoja de datos semanales de la TEH estandarizadas para la posterior incorporación de los datos
resultantes en la Base de datos informatizada (en programa de Excel) (Fig. 4).
ESTADO:
RESPONSABLE:
Tipo de trampa:
MUNICIPIO:
TEH
FECHA: del
LOCALIDAD:
/
al
/
/2012
Esporas/m3
Lunes
Martes
Miércoles
Roya
naranja
Figura 4. Hoja de datos semanales de la TEH
Jueves
Viernes
Sábado
Domingo
Media
semanal