DISEÑO DE PRIMERS: Buscamos el gen que queremos subclonar en el vector. Este gen que deseamos lo encontramos buscando en NCBI. El gen en cuestión es PHF5A-Homo Sapiens. Debemos tener en cuenta que: Nm, secuencia del transcrito. Xm, secuencia de transcrito no validada. Np, secuencia para proteína. Xp, secuencia para proteína no validada, Ahora observamos el apartado de características y las que se presentan son las más importantes: Como de largo es el gen Donde empieza la secuencia codificante, CDDS Tener en cuenta que los exones e intrones no tienen porque coincidir con la secuencia codificante Lo siguiente es localizar la secuencia codificante del gen: 1 agttcccgaa gcttccggtg gccggcttag ttaggagcta tggctaaaca tcatcctgat 61 ttgatctttt gccgcaagca ggctggtgtt gccatcggaa gactgtgtga aaaatgtgat 121 ggcaagtgtg tgatttgtga ctcctatgtg cgtccctgca ctctggtgcg catatgtgat 181 gagtgtaact atggatctta ccaggggcgc tgtgtgatct gtggaggacc tggggtctct 241 gatgcctatt attgtaagga gtgcaccatc caggagaagg acagagatgg ctgcccaaag 301 attgtcaatc tggggagctc taagacagac ctcttctatg aacgcaaaaa atacggcttc 361 aagaagaggt gattggtggg tggccccttc ctccccccaa catcagtctg ctgcagctgc 421 cagaaaacat gcctactact accagcagaa agggagcaga gcccagagca tcaccaggag 481 tgcctgctag tgtactggca gcttgccacc ccctcctctc ccttcaccca gacacgtggt 541 agggatggaa aaggattctt cacagagcac tctggcacac catatcggag aaaacttgat 601 agattagtta atggtttttc ttgaattcga gaagcaaaga tctgttctcc atattggtat 661 gttctccctc aaccaagatc ttctaaaaag aaataatatt ttagtcttct gcttgaggaa 721 ctgactgtga agcgacgccc agtgaaaaac atgttcttgc agcagctctg gtggcagctg 781 tccttgagga acctttggtg tgtggtggga agctatcaga acaagaaatg taggcatttc 841 ccgttttttt tggggggggg gtgggggggc agggctctgc cctcttgaaa ggcatttact 901 tgtttaacac ttgtccagct acagtggggt acagtagctg gctattcaca ggcatcatca 961 tagcccacta gtctcatatt attttccttt tgagaaattg gaaactcttt ctgttgctat 1021 tatattaata aagttggtgt ttattttctg gta En color azul aparece la secuencia codificante (40-372). Desde aquí podemos diseñar un prototipo de primer reverse teniendo en cuenta las secuencias consenso de las enzimas de restricción. Las secuencias consenso de las enzimas de restricción se encuentran en NEB England biolabs. Buscamos EcoRI y HindIII: De la primera aparecen dos opciones, una es high eficiency, pero solo escogeremos la normal EcoRI. “Esta es la secuencia de corte.” 5´…GAATTC…3´ 5´…AAGCTT…3´ 3´…GTTAAG…5´ 3´…TTCGAA…5´ El lugar de restricción se coloca al final de la molécula. Para permitir que corte por ahí y obtener la secuencia final en su totalidad incluido el gen de interés. Para saber cuantos nucleótidos hay que añadir, se realiza una búsqueda dentro de la misma págin0061 que se denomina: “Cleavage closet o the End of DNA Fragments”. Se determina que cuantas más cruces tenga, mejor será por lo que para nuestras dos enzimas: RNAm del gen PHF5A-Homo Sapiens: Hphf5A-EcoRI_40-Forward: cccccGAATTCatggctaaacatcatcctgatttg 1 agttcccgaa gcttccggtg gccggcttag ttaggagcta tggctaaaca tcatcctgat 61 ttgatctttt gccgcaagca ggctggtgtt gccatcggaa gactgtgtga aaaatgtgat 121 ggcaagtgtg tgatttgtga ctcctatgtg cgtccctgca ctctggtgcg catatgtgat 181 gagtgtaact atggatctta ccaggggcgc tgtgtgatct gtggaggacc tggggtctct 241 gatgcctatt attgtaagga gtgcaccatc caggagaagg acagagatgg ctgcccaaag 301 attgtcaatc tggggagctc taagacagac ctcttctatg aacgcaaaaa atacggcttc 361 aagaagaggt g Hphf5A-EcoRI_40-Reverse: cccAAGCTTaatcacctcttcttgaagcc c acctcttctt 163 gaagccgtat tttttgcgtt catagaagag gtctgtctta gagctcccca gattgacaat 103 ctttgggcag ccatctctgt ccttctcctg gatggtgcac tccttacaat aataggcatc 142 agagacccca ggtcctccac agatcacaca gcgcccctgg taagatccat agttacactc 181 atcacatatg cgcaccagag tgcagggacg cacataggag tcacaaatca cacacttgcc 121 atcacatttt tcacacagtc ttccgatggc aacaccagcc tgcttgcggc aaaagatcaa 16 atcaggatga tgtttagcca tagctcctaa ctaagccggc caccggaagc ttcgggaact 1 Para el forward: - La tm complete es de 63,1ºC La tm real es de 53,6ºC Esta es la reverse completa pero para sacar la real quitamos los nucleótidos iniciales: Le quitamos una g para que de 55 que está dentro del margen. Por ultimo miramos el self dimer, que al ser inferior a 50 no nos afecta porque va a hibridar y será lineal, por lo tanto no nos molesta. Para el reverse: - Tm completa es 60,9ºC Tm real es 52.4ºC No nos afecta ya que la tm es de 60,9ºC. Quantitative PCR Qpcr (rt-pcr) - - Determinar el nivel de expresión a nivel de transcrito RNAm. En relación a un gen denominado house-keeping (B-actina, GAPDH, Caspasa-3 y Ytubulina). Lo priemro de todo es revisar la bibliografía y buscamos en ncbi BLAST y dentro a primer BLAST. Vamos a buscar primers para RT-PCR de p53. Una vez buscada la secuencia de primers reverse y forward, la copiadmos en la tabla. Debe ser de una longitud de 90-300bp. - Menos de 5ºC de diferencia de Tm entre primers. Una Tm similar entre los stets de primers. - Variante 1: - - - - Tenemos que fijarnos donde empieza y acaba el forward y el reverse. Donde nos caería dentro del transcrito mRNA. Es importante la purificación para que no haya DNA o RNA contaminante. Se deben mirar los exones y de ahí miramos donde cae el primer, debe caer en un intrón y saber el tamaño del mismo para quedar convencido de que esta bien hecho la PCR. Debemos alinear el transcrito con un BLASTn que alinea ese transcrito con el genoma buscando alineamientos de cada uno de los exones y dará las coordenadas donde empieza y termina. Tenemos dos opciones, una que se monten los primers encima de los exones juntos unidos. El otro es que no se monten los primers pero separados por un intrón de un tamaño o rango determinado y mínimo de 1kb. Queremos que los primers sean específicos. Total RNA, RT reverse trasncriptase y retrotrasnscirbe el mensajero.
