Práctico de Laboratorio

Curso de Biología Molecular y Bioquímica
Maestría en Bioinformática
ACTIVIDAD PRÁCTICA
OBJETIVO:
Clonar la proteína TcPop2 de Trypanosoma cruzi.

Búsqueda de la secuencia del gen que codifica para la proteína Pop2 identificada en levadura.
La búsqueda de la secuencia codificante de Pop2, se realizó en la base de datos GenBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Si ingresamos “Pop2” en el menú de búsqueda y
seleccionando en la base de datos de proteínas, tenemos como resultado todos los genes anotados
como Pop2 (Caf1) en distintos organismos.
Al seleccionar la primer entrada, correspondiente a la secuencia de levadura, nos dirige a una entrada
de la base de datos que nos provee de información diversa acerca de la proteína en este organismo. Esta
información está ordenada en campos específicos de anotación de acuerdo al formato de archivo por
defecto en este sitio que es el de tipo genbank. A partir de aquí podemos obtener la secuencia proteica
en formato FASTA, el cual nos da menos información que el anterior, pero que es más adecuado al
momento de trabajar únicamente con la secuencia aminoacídica. Una vez que contamos con esta
secuencia podemos realizar la búsqueda de proteínas homológas mediante el uso del algoritmo BLAST.
Esta herramienta se encuentra disponible online en el enlace:
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http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
Desde el cual se puede comparar la secuencia de interés con todas las existentes en el genbank. Dado
que el algoritmo es de tipo heurístico no nos asegura el mejor alineamiento, sino que nos reporta una
lista de alineamientos locales entre nuestra secuencia (“querry”) y las similares en la base (“hits”). Esto
es compensado con la velocidad de búsqueda la cual es muy superior a la de los algoritmos de tipo
programación dinámica que tendrían tiempos de ejecución incompatibles con el tamaño de las bases de
datos actuales.
Debido a que bajamos la secuencia aminoacídica, lo que se emplea frecuentemente en la búsqueda de
homólogos (ya que ésta se encuentra más conservada que la nucleotidica), se realizará un blastp
seleccionando “protein blast”.
Este algoritmo tiene varios parámetros que se pueden modificar que van a afectar el resultado de la
búsqueda.
Al reducir los parámetros de la búsqueda, de manera que: En nuestro caso debido a que queremos
obtener la secuencia homóloga específicamente de Trypanosoma cruzi podemos acotar la búsqueda a
este organismo. Por otra parte, buscaremos en la base nonredundant (nr) que contiene la totalidad de
las secuencias subidas a esta base de datos.
Como resultado obtenemos una lista de alineamientos entre nuestra proteína y el hit en particular en
donde cada uno posee asociado un “expected-value” relacionado con la probabilidad de obtener ese
resultado por azar. Cuanto menor sea este valor, el resultado es más significativo.
De esta forma tendremos como resultado a la proteína Tc00.1047053511827.60 en el genoma de la
cepa no CL Brener non Esmeraldo-like con un e-value muy significativo.
Ya que el genoma de T. cruzi se encuentra completamente secuenciado podemos asegurar que esta
secuencia es la que tiene la mayor homología con la secuencia de Pop2 de levadura y por lo tanto
correspondería al gen ortólogo en este organismo.
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
Diseño de primers para amplificar la región codificante del gen que codifica para Pop2
Para amplificar el gen correspondiente al homologo de Pop2 en T. cruzi recién identificado en la
base de datos es necesario diseñar cebadores específicos. Para esto necesitamos contar con la
secuencia nucleotidica del gen. La misma la podemos obtener haciendo click sobre el link “CDS” que
nos llevará a la entrada correspondiente a la secuencia codificante de la proteína que estamos
analizando.
En esta nueva vista podemos acceder a la secuencia en formato FASTA de la misma manera que en
la parte anterior, para ser utilizada posteriormente.
A partir de la secuencia codificante del gen TcPop2 se diseñan los siguientes primers utilizando el
algoritmo primer3plus. Conisderando como requisito obligatorio que los mismos abarquen toda la
región codificante de dicho gen incluyendo el codón de inicio de la traducción y el codón stop:
atgtcaaacacatgggattttatggacggtctttttgtggcaaatttgtcgtttccattctctctctctctctctttttttttttt
tgtttctgcctgcctgttggctggtccgaggggggcccacgaagaagaagacgagacacagacacacaagacggagagagagacat
acgtggaaggagggagtgaaataggaaaaaaaaagacaaaaaacaataataataaaaaaggggacatgatgcagtacggtaacgct
ttagcgcagtacgggacgtaccagcagcgttatccggttgctgttagccaaggcgggattgctgccattccttcccttagtaaatc
cccaatgattcgcgacgtgtgggaggagaatttagaggaagagttcaacatcatacgatccctgatcaaagactacccttatgtgt
caatggacaccgagtttcccggagttgtagcgaagcctgtgggcaattttaaggcaacacacgagttttattaccagacacttcgt
tgtaatgtcaatttgctcaaaatgattcagctagggattacactactcaatgaaaagggggaggtaccggaaaactgctgcacctg
gcagtttaacttccgtttttgcctcacagaggatgtgtacgcacaggatagtattcagttactccgccatggcggcattgactttg
actactttgcgcagtatggggttgaggtgacgcactttgcggagctcctcatctcgagcgggctcgtgctgaacagcgacattcgc
tggcttgccttccatgcaggctacgactttggttatttgatgaaggtggtctgcggcaaggacctgccggagaaggaggatgactt
cctgcagatcttccactccctgttcccgtgcgtgtacgacatcaagtacctcctgcgcgccaccgacctctcgcactcgttgggtt
tagaccacctctcggagagccttcgggtgcgccggttcggcatggcgcaccaggccggcagcgactccctcctcaccggccactgc
tacttcaaactgctccgcgactgcttcggcagcaacccgcccgtggcaagcaacggcgtgctctacggcctgtgcgaagacgcgtc
ctcagccgccacgcccagcagcacgacgataccgggcggcagcgcacacgcgttcgcttcgtttaccgccagcaaaaacaccacat
tcccgtccacgccgctcaacaactcggtgaagggccacaac
De esta manera, se mandaron a sintetizar los siguientes primers:
Pop2F:
5´ ATGTCAAACACATGGGATTTTATG 3´ Tm 59.9ºC
Met
Pop2R:
5´ TTAGTTGTGGCCCTTCACC 3´ Tm 58.2ºC
Stop
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Si bien es recomendable que el Tm no sea inferior a 50ºC, muchas veces nos vemos obligados a
seleccionar primers con propiedades que no son las óptimas (formación de dímeros, horquillas, Tm
bajas) de manera de tener amplificado el gen completo, y son el resto de las condiciones experimentales
del PCR las que tenemos que modificar (concentración de primers, concentración de MgCl2,
concentración de ADN) para lograr obtener el producto amplificado de interés.
A dichos primers se le adicionaron, secuencias específicas en los extremos 5’, de manera de permitir el
clonado en los vectores de expresión.
Debido que T. cruzi a pesar de ser un organismo eucariota no presenta intrones, la obtención del inserto
a clonar se realiza simplemente mediante la amplificación por PCR a partir de ADN génomico.

Amplificación del gen de TcPop2 por PCR
Se realizara un PCR para clonar TcPop2 a partir de ADN genómico de la cepa Dm28
Buffer STR 10 X
2µL
DNA Polymerase (Stratagene)
2µL
Primers Forward/Reverse
0.5µL (c/u)
ADN genómico
3 µL
Agua
12 µL
STR 10x: Buffer Tris-HCl 100mM pH 9
KCl 500mM
15mM de MgCl
1% Tritonx-100
2mM de cada dNTP
ADN pol: Unidades/ uL
Concentración de los primers: 10uM
Concentración de ADN genómico: 34ng/uL
Las reacciones se deben armar en frío, para aumentar la especificidad de la reacción, luego se pasan
rápidamente al temociclador en donde se realiza el siguiente programa de temperaturas:
56 ºC
Por 30 ciclos
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
Digestión del producto de PCR clonado en Topo y análisis por electroforesis
Los resultados de las digestiones con enzimas de restricción, nos permiten verificar que nuestro inserto
fue clonado en el vector. Según el mapa de restricción del vector Topo 2.1, podemos liberar el inserto
mediante una digestión con EcoRI.
EcoRI
Buffer EcoRI
H2O
Topo 2.1 TcPop2
Topo 2.1 TcPop2
2µL
4µL
c.s.p. 40µL
15µL
Topo 2.1 TcPop2
---------------------4µL
c.s.p. 40µL
6µL
Para analizar los productos obtenidos a partir de las digestiones, al igual que para verificar si mediante el
PCR tuvimos el producto del tamaño esperado, realizaremos una electroforesis de agarosa 1% (1 g de
agarosa cada 100 mL de Buffer). Dicha electroforesis, se realizará en presencia de Bromuro de Etidio que
permite visualizar las moléculas de ADN bajo la luz UV, al intercalarse entre bases del ADN.
Mediante esta técnica los fragmentos de ADN migran de forma paralela a un campo eléctrico a través de
una malla de un polímero de agarosa, que opone cierta resistencia en relación al tamaño de las
moléculas. Esto hace que fragmentos de un tamaño mayor, tengan una movilidad electroforética menor
que fragmentos de menor tamaño.
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Para poder atribuir los tamaños de los productos, además de nuestras muestras debemos incluir un
marcador de peso molecular, que consiste en una serie de fragmentos de tamaño conocido (por
ejemplo 1 Kb Ladder).