Subido por Ayrton Raphael Villanueva Mallcu

AguilarUscangaMaGuadalupe

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UNIDAD DE INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO DE ALIMENTOS
Maestría en Ciencias en Ingeniería Bioquímica
3er Congreso Nacional de Investigación del Cambio Climático en México
Aislamiento y Selección
de Levaduras para la Producción de Etanol durante
la Fermentación Espontánea de Jugo de Sorgo Dulce
Presenta:
Dra. Ma. Guadalupe Aguilar Uscanga
Colaboradores:
Díaz‐Nava L.E., Partida‐Sedas G.,
Uribe‐Gómez S., Rebolledo‐García R.E.,
Gómez‐Rodríguez J., Montes‐García N.
Sitúan a los biocombustibles líquidos
como una alternativa energética renovable
Fuente alternativa de energía por contribuir a la
reducción del efecto invernadero
Almodares et al ., 2008
Bioetanol, alcohol derivado de materiales
biológicos, actualmente empleado directamente
como combustible o como un añadido a la gasolina
en distintas concentraciones.
Número de octanos
y promueve una mejor
combustión
Emisiones
contaminantes
El bioetanol constituye alrededor del 90% del
biocombustible producido a escala mundial.
Almodares et al ., 2008 ; SAGARPA, 2011
2 ADP
Glucosa
2 ATP
2 Piruvato
Glicolisis
2 NAD+
2 NADH + H+
2 CO2
2 Piruvato
2 Acetaldehído
Piruvato
Descarboxilasa
Alcohol
Deshidrogenasa
2 Etanol
Y P/S = 0.51 g/g
Bioquímica 3ª Edición. (2002) C.K. Mathews, K.E. van Holde, K.G. Ahern. Pearson Educación S.A.
Diferentes materias primas ricas en:
• Azúcares (caña de azúcar, remolacha azucarera, sorgo dulce)
•Almidones (trigo, maíz, cebada, yuca)
•Celulosa (desechos agrícolas, forestales y municipales)
Bueno et al. , 2009
Familia Gramíneas
Altura aprox. De 1 a 3 metros
(dependiendo subespecie)
Cultivo Comparable con la Caña de
Azúcar
Alto contenido de azúcares
Cosechar varias veces al año
Más resistentes a la sequía, salinidad
e inundaciones
Almodares et al. 2009
Sorgo
Uso
Sorgo grano
Alimento para humanos
y animales domésticos
Sorgo forrajero
Forraje para Ganado
Sorgo Dulce
(Jugo)
Producción de etanol,
azúcar, jarabes
Sorgo de alta biomasa
Biomasa lignocelulósica
para la producción de
etanol
Sacarosa
Glucosa
Fructosa
6-21%
9-33 %
53-85%
Tallo rico en azúcares fermentables
(16-23%)
Tiene un periodo corto de crecimiento
de alrededor 4-5 meses
Crece en zonas templadas
Toda la planta se puede utilizar
(grano, tallo y jugo de biomasa
lignocelulósica)
Composición de azúcares
simples en el jugo de
sorgo dulce
Bueno et al. 2009 ; Mamma et al., 1996 y Phowchinda et al., 1997
Material Biológico
Medio de Cultivo
Bacterias
Hongos
Levaduras
Fuente de Carbono
Fuente de Nitrógeno
P,S,K,Mg
Condiciones Ambientales
Modo de Operación
Temperatura
pH
Aireación
Agitación
Lote
Lote Alimentado
Continuos
Y P/S
 Productividad

 Productos Secundarios
Inhibición por Sustrato (altas concentraciones de azúcar)
Inhibe el crecimiento celular y la actividad fermentativa
Incremento de la presión osmótica , disminuye la producción de Etanol
[ Glucosa ] 160 g/L
Ortiz Zamora, 2006;Martin et al, 2008; Ortiz Muñiz, 2010
Son capaces de utilizar una gran variedad
de sustratos (glucosa, fructosa, sacarosa)
Son mas resistentes al etanol y presentan
mayores rendimientos.
Ricas en esteroles, por lo que mantienen
por más tiempo su actividad fermentativa
Menos probable la contaminación por
bacterias acido lácticas
Kyyper, 2006
Fácil propagación
Acido Tolerantes
Genéticamente estables
Tolerantes a Etanol
Resistentes a compuestos Tóxicos
Osmotolerantes
Capaz de utilizar varios sustratos
Termotolerantes
Resistentes a bajos pH
Actividad killer
Deficiencia Respiratoria
Panchal, 1990 y Hutter y Oliver, 1998
Osmotolerancia
Capacidad que tienen las levaduras para crecer en un
medio con altas concentraciones de azúcares
[ Azúcares ] 250 g/L
Vel. De Producción de Etanol
Reed et al. 1998; Walker, 1998
Aislamiento y Selección
Levaduras Aisladas de Melaza de Caña de Azúcar
Salcedo, 2008
Ortiz-Zamora, 2006
Criterios de Selección
 Velocidad de Crecimiento
Osmotolerancia
Tolerancia Etanol
Producción de Etanol
Osmotolerancia
Tolerancia Etanol
Producción de Etanol
Actividad Killer
9 Cepas
5 Cepas
[ Etanol ] 5-10 % v/v
[ glucosa ] 24 % p/v
[ Etanol ] 5-7 % v/v
[ glucosa ] >20% p/v
Aislamiento e Identificación
Fuente de
Aislamiento
Método de Identificación de
Levaduras
Microorganismos
Referencia
Cacao
Amplificación de las regiones
ITS1-5.8S-ITS2
•Saccharomyces spp.
•Pichia spp.
•Candida spp.
Modad en curso
Agave
Amplificación de las regiones
ITS1-5.8S-ITS2
•Saccharomyces cerevisiae
Segura et al. 2010
Vinos austriacos
Secuenciación de la región D1/D2 del
gen 26 S rRNA
•Saccharomyces cerevisiae
•Saccharomyces bayanus
Lopandic et al. 2008
Cerveza de sorgo
Secuenciación de la región D1/D2 del
gen 26 S rRNA
•Saccharomyces
cereviseiae
•Kluyveromyces maxianus
Maoura et al. 2005
Taxonomía convencional
•Schizosaccharomyces pombe
•Saccharomyces cerevisiae
•Kluyveromyces maxianus
Fundora et al. 2005
Caña de azúcar
Producción de etanol a partir de jugo de
sorgo dulce
Microorganismo usado en la
Fermentación
Rendimiento de Etanol
(g/g )
Eficiencia
(%)
Referencia
Saccharomyces cerevisiae CFTR 01 y
SG
0.39-0.48
76-94
Ratnavathi et
al. 2010
Saccharomyces cerevisiae
0.42-0.45
82-90
Balint Sipos et
al. 2009
Saccharomyces cerevisiae TISTR
5048
0.42-0.48
82-94
Laopaiboon et
al. 2007
Saccharomyces cerevisiae (Nanyang)
0.43-0.46
84-91
Liu et al. 2008
Rendimiento Teórico
Y P/S = 0.51 g/g
• Fermentaciones alcohólicas espontáneas no se deben a una única cepa de
levadura, sino que es el resultado de la acción combinada de diversas especies de
estas.
•Se sabe que es mas efectivo el uso de cultivos autóctonos de levaduras ya que se
encuentran adaptadas a las condiciones climáticas de la zona y a la materia prima a
fermentar
•Debido a la problemática que existe en el proceso de fermentación alcohólica : la
inhibición por sustrato; aislar y seleccionar levaduras procedentes de la
fermentación del jugo de sorgo dulce que contrarresten estos efectos, permitirá
optimizar e impulsar a una mejora progresiva en el rendimiento y productividad del
proceso.
Aislar y Seleccionar Cepas de Levaduras
Productoras de Etanol Durante la Fermentación
Espontánea del Jugo de Sorgo Dulce
Caracterizar el jugo, obtenido a partir de las diferentes
variedades de sorgo dulce
Aislar cepas de levaduras productoras de etanol durante la
fermentación espontánea de jugo de sorgo dulce
Seleccionar las cepas de levaduras que presenten
osmotolerancia para la producción de etanol
21 variedades de Sorgo dulce de
ALTA y BAJA densidad
poblacional
•Volumen de jugo
•pH
•°Brix
•Azúcares totales
1ml
Diferentes
variedades de
sorgo dulce
1ml
1ml
1ml 1ml
36 h
30°C
250 rpm
1x 10 -4 mL
1x 10 -5 mL
Componente
g/L
Extracto de Levadura
10
Glucosa
20
Agar
25
Antibiótico
0.1
9 ml H2O
Medio Cultivo Sintético
de Aislamiento
Selección Primaria
Etanol Y P/S > 0.35 g/g
Eficiencia 70%
Osmotolerantes ( 100,150, 200, g/L )
Glucosa
Selección Secundaria
Componente
g/L
Extracto de Levadura
1
Glucosa
50
KH2PO4 (fosfato monobásico)
5
(NH4)2SO4 (sulfato de amoniaco)
2
MgSO4·7H2O (sulfato de
magnesio)
0.6
Medio Cultivo Sintético
Caracterización
Tratamiento
Variedades de
Sorgo dulce
Volumen de Jugo
(mL) Alta Densidad
Azúcares
totales (g/L)
Volumen de Jugo
(mL) Baja Densidad
Azúcares
totales
(g/L)
T2
RB- CAÑERO
378.3
27.3
303.3
26.9
T3
ETANOL-1
926.7
87.2
686.7
85.1
T4
ETANOL-2
933.3
96.7
730.0
66.2
T5
DALE
893.3
138.5
620.0
78.8
T9
SBA-25
610.0
81.2
546.7
48.3
T10
SBA-22
390.0
51.0
240.0
31.7
T11
SBA-25XURJA
670.0
79.4
660.0
56.6
T12
SBA-25XSUREÑO
800.0
61.4
593.3
27.2
T13
SBA-25XTAN-1
686.7
92.3
495.0
41.9
T14
SBA-25XCAÑERO
566.7
24.5
450.0
15.4
T15
SBA-25XDALE
596.7
73.8
765.0
39.0
T16
SBA-25XTOPPER
793.3
74.9
576.7
41.6
T17
SBA-25XTHEIS
770.0
56.8
615.0
63.5
T19
SBA-22XTAN-1
970.0
85.6
536.7
105.6
T20
SBA-22XDALE
725.0
89.4
590.0
81.8
T21
SBA-22XCAÑERO
766.7
32.7
466.7
29.8
T22
SBA-22XTAN-2
760.0
57.3
570.0
50.5
T23
SBA-22XDULCE
560.0
47.6
373.5
30.5
T24
SBA-22XSUREÑO
695.0
20.9
405.0
67.7
T25
NORTEÑO
390.0
25.7
480.0
13.4
T26
HUASTECO
575.0
47.6
470.0
56.0
21 Variedades De
Alta Densidad
Azúcares Totales 50-140 g/L
Volumen 600-900 mL
pH 5.45-5.55
AISLAMIENTO
Fermentación Espontánea
De Jugo De Sorgo Dulce
60 CEPAS
[Etanol] 6 g/L
a partir de 20g/L de glucosa
SELECCIÓN
60 CEPAS
22 CEPAS
Etanol Y P/S > 0.35 g/g
Eficiencia 70%
SELECCIÓN
0.6
Y P/S (g/g)
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
S1
S2
S5
S6
S8
S11 S16 S17 S18 S19 S23 S26 S27 S30 S35 S41 S42 S43 S44 S49 S51 S64
CEPAS PRODUCTORAS DE ETANOL
Etanol Y P/S = 0.35-0.38 g/g
6 CEPAS
Etanol Y P/S = 0.4 g/g
OSMOTOLERANCIA
% Conversión de Glucosa
CEPA
% Conversión de Glucosa
CEPA
100g/L
150 g/L
200 g/L
100g/L
150 g/L
200 g/L
S1
74.28
52.62
32.85
S26
71.49
49.65
32.41
S2
95.49
49.76
32.20
S27
74.20
50.18
30.02
S5
75.31
52.46
31.09
S30
74.01
50.19
32.56
S6
70.61
53.92
31.47
S35
71.37
49.81
31.90
S8
73.25
53.26
29.50
S41
75.87
51.27
33.45
S11
71.64
51.47
29.67
S42
76.04
52.53
36.36
S16
74.14
51.14
34.94
S43
72.10
51.22
32.33
S17
72.93
49.98
31.51
S44
71.51
50.62
29.97
S18
75.55
54.41
33.03
S49
27.47
18.77
21.65
S19
73.09
53.06
29.50
S51
24.35
29.27
17.31
S23
38.51
46.92
16.29
S64
54.77
35.13
22.08
18 CEPAS
OSMOTOLERANCIA
1.2
1.2
1
1
0.8
0.8
QP (g/Lh)
QP (g/Lh)
Efecto de la concentración inicial de glucosa sobre la productividad de etanol
0.6
0.4
0.6
0.4
0.2
0.2
0
0
S1
S2
S5
S6
S8 S11 S16 S17 S18
CEPAS PRODUCTORAS DE ETANOL
S19
S23
S26
S27
S30
S35
S41
S42
S43
S44
S49
S51
S64
CEPAS PRODUCTORAS DE ETANOL
Glucosa (g/L): 100 (), 150 (), 200 ()
QP (g/Lh) ≈ 0.8 g/g
[GLUCOSA]
QP
Ortiz-Zamora et al. (2007)
•El jugo de las variedades de alta densidad de sorgo dulce evaluado, contiene altas
concentraciones de azúcares fermentables (50-140 g/L), pH que se encuentran entre los
5.45-5.55 los cuales favorecen el proceso de fermentación alcohólica además de poseer
una gran fuente de cepas con potencial para utilizarse en la producción de bioetanol
•60 cepas se aislaron ,de las cuales 22 de ellas obtuvieron rendimientos por arriba del
0.35 g/g en cuanto a la producción de etanol
•Se evaluó la osmotolerancia en las 22 cepas seleccionadas a diferentes concentraciones
de glucosa, 18 cepas presentaron características osmotolerantes hasta los 200 g/L de
sustrato inicial, lo cual resulta de gran interés para la producción biotecnológica de
bioetanol, sin embargo se deben realizar otros trabajos para el mejoramiento del proceso.
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