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UNIDAD DE INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO DE ALIMENTOS MaestríaenCienciasenIngenieríaBioquímica 3erCongresoNacionaldeInvestigacióndelCambioClimáticoenMéxico Aislamiento y Selección de Levaduras para la Producción de Etanol durante la Fermentación Espontánea de Jugo de Sorgo Dulce Presenta: Dra. Ma. Guadalupe Aguilar Uscanga Colaboradores: Díaz‐Nava L.E., Partida‐Sedas G., Uribe‐Gómez S., Rebolledo‐García R.E., Gómez‐Rodríguez J., Montes‐García N. Sitúan a los biocombustibles líquidos como una alternativa energética renovable Fuente alternativa de energía por contribuir a la reducción del efecto invernadero Almodares et al ., 2008 Bioetanol, alcohol derivado de materiales biológicos, actualmente empleado directamente como combustible o como un añadido a la gasolina en distintas concentraciones. Número de octanos y promueve una mejor combustión Emisiones contaminantes El bioetanol constituye alrededor del 90% del biocombustible producido a escala mundial. Almodares et al ., 2008 ; SAGARPA, 2011 2 ADP Glucosa 2 ATP 2 Piruvato Glicolisis 2 NAD+ 2 NADH + H+ 2 CO2 2 Piruvato 2 Acetaldehído Piruvato Descarboxilasa Alcohol Deshidrogenasa 2 Etanol Y P/S = 0.51 g/g Bioquímica 3ª Edición. (2002) C.K. Mathews, K.E. van Holde, K.G. Ahern. Pearson Educación S.A. Diferentes materias primas ricas en: • Azúcares (caña de azúcar, remolacha azucarera, sorgo dulce) •Almidones (trigo, maíz, cebada, yuca) •Celulosa (desechos agrícolas, forestales y municipales) Bueno et al. , 2009 Familia Gramíneas Altura aprox. De 1 a 3 metros (dependiendo subespecie) Cultivo Comparable con la Caña de Azúcar Alto contenido de azúcares Cosechar varias veces al año Más resistentes a la sequía, salinidad e inundaciones Almodares et al. 2009 Sorgo Uso Sorgo grano Alimento para humanos y animales domésticos Sorgo forrajero Forraje para Ganado Sorgo Dulce (Jugo) Producción de etanol, azúcar, jarabes Sorgo de alta biomasa Biomasa lignocelulósica para la producción de etanol Sacarosa Glucosa Fructosa 6-21% 9-33 % 53-85% Tallo rico en azúcares fermentables (16-23%) Tiene un periodo corto de crecimiento de alrededor 4-5 meses Crece en zonas templadas Toda la planta se puede utilizar (grano, tallo y jugo de biomasa lignocelulósica) Composición de azúcares simples en el jugo de sorgo dulce Bueno et al. 2009 ; Mamma et al., 1996 y Phowchinda et al., 1997 Material Biológico Medio de Cultivo Bacterias Hongos Levaduras Fuente de Carbono Fuente de Nitrógeno P,S,K,Mg Condiciones Ambientales Modo de Operación Temperatura pH Aireación Agitación Lote Lote Alimentado Continuos Y P/S Productividad Productos Secundarios Inhibición por Sustrato (altas concentraciones de azúcar) Inhibe el crecimiento celular y la actividad fermentativa Incremento de la presión osmótica , disminuye la producción de Etanol [ Glucosa ] 160 g/L Ortiz Zamora, 2006;Martin et al, 2008; Ortiz Muñiz, 2010 Son capaces de utilizar una gran variedad de sustratos (glucosa, fructosa, sacarosa) Son mas resistentes al etanol y presentan mayores rendimientos. Ricas en esteroles, por lo que mantienen por más tiempo su actividad fermentativa Menos probable la contaminación por bacterias acido lácticas Kyyper, 2006 Fácil propagación Acido Tolerantes Genéticamente estables Tolerantes a Etanol Resistentes a compuestos Tóxicos Osmotolerantes Capaz de utilizar varios sustratos Termotolerantes Resistentes a bajos pH Actividad killer Deficiencia Respiratoria Panchal, 1990 y Hutter y Oliver, 1998 Osmotolerancia Capacidad que tienen las levaduras para crecer en un medio con altas concentraciones de azúcares [ Azúcares ] 250 g/L Vel. De Producción de Etanol Reed et al. 1998; Walker, 1998 Aislamiento y Selección Levaduras Aisladas de Melaza de Caña de Azúcar Salcedo, 2008 Ortiz-Zamora, 2006 Criterios de Selección Velocidad de Crecimiento Osmotolerancia Tolerancia Etanol Producción de Etanol Osmotolerancia Tolerancia Etanol Producción de Etanol Actividad Killer 9 Cepas 5 Cepas [ Etanol ] 5-10 % v/v [ glucosa ] 24 % p/v [ Etanol ] 5-7 % v/v [ glucosa ] >20% p/v Aislamiento e Identificación Fuente de Aislamiento Método de Identificación de Levaduras Microorganismos Referencia Cacao Amplificación de las regiones ITS1-5.8S-ITS2 •Saccharomyces spp. •Pichia spp. •Candida spp. Modad en curso Agave Amplificación de las regiones ITS1-5.8S-ITS2 •Saccharomyces cerevisiae Segura et al. 2010 Vinos austriacos Secuenciación de la región D1/D2 del gen 26 S rRNA •Saccharomyces cerevisiae •Saccharomyces bayanus Lopandic et al. 2008 Cerveza de sorgo Secuenciación de la región D1/D2 del gen 26 S rRNA •Saccharomyces cereviseiae •Kluyveromyces maxianus Maoura et al. 2005 Taxonomía convencional •Schizosaccharomyces pombe •Saccharomyces cerevisiae •Kluyveromyces maxianus Fundora et al. 2005 Caña de azúcar Producción de etanol a partir de jugo de sorgo dulce Microorganismo usado en la Fermentación Rendimiento de Etanol (g/g ) Eficiencia (%) Referencia Saccharomyces cerevisiae CFTR 01 y SG 0.39-0.48 76-94 Ratnavathi et al. 2010 Saccharomyces cerevisiae 0.42-0.45 82-90 Balint Sipos et al. 2009 Saccharomyces cerevisiae TISTR 5048 0.42-0.48 82-94 Laopaiboon et al. 2007 Saccharomyces cerevisiae (Nanyang) 0.43-0.46 84-91 Liu et al. 2008 Rendimiento Teórico Y P/S = 0.51 g/g • Fermentaciones alcohólicas espontáneas no se deben a una única cepa de levadura, sino que es el resultado de la acción combinada de diversas especies de estas. •Se sabe que es mas efectivo el uso de cultivos autóctonos de levaduras ya que se encuentran adaptadas a las condiciones climáticas de la zona y a la materia prima a fermentar •Debido a la problemática que existe en el proceso de fermentación alcohólica : la inhibición por sustrato; aislar y seleccionar levaduras procedentes de la fermentación del jugo de sorgo dulce que contrarresten estos efectos, permitirá optimizar e impulsar a una mejora progresiva en el rendimiento y productividad del proceso. Aislar y Seleccionar Cepas de Levaduras Productoras de Etanol Durante la Fermentación Espontánea del Jugo de Sorgo Dulce Caracterizar el jugo, obtenido a partir de las diferentes variedades de sorgo dulce Aislar cepas de levaduras productoras de etanol durante la fermentación espontánea de jugo de sorgo dulce Seleccionar las cepas de levaduras que presenten osmotolerancia para la producción de etanol 21 variedades de Sorgo dulce de ALTA y BAJA densidad poblacional •Volumen de jugo •pH •°Brix •Azúcares totales 1ml Diferentes variedades de sorgo dulce 1ml 1ml 1ml 1ml 36 h 30°C 250 rpm 1x 10 -4 mL 1x 10 -5 mL Componente g/L Extracto de Levadura 10 Glucosa 20 Agar 25 Antibiótico 0.1 9 ml H2O Medio Cultivo Sintético de Aislamiento Selección Primaria Etanol Y P/S > 0.35 g/g Eficiencia 70% Osmotolerantes ( 100,150, 200, g/L ) Glucosa Selección Secundaria Componente g/L Extracto de Levadura 1 Glucosa 50 KH2PO4 (fosfato monobásico) 5 (NH4)2SO4 (sulfato de amoniaco) 2 MgSO4·7H2O (sulfato de magnesio) 0.6 Medio Cultivo Sintético Caracterización Tratamiento Variedades de Sorgo dulce Volumen de Jugo (mL) Alta Densidad Azúcares totales (g/L) Volumen de Jugo (mL) Baja Densidad Azúcares totales (g/L) T2 RB- CAÑERO 378.3 27.3 303.3 26.9 T3 ETANOL-1 926.7 87.2 686.7 85.1 T4 ETANOL-2 933.3 96.7 730.0 66.2 T5 DALE 893.3 138.5 620.0 78.8 T9 SBA-25 610.0 81.2 546.7 48.3 T10 SBA-22 390.0 51.0 240.0 31.7 T11 SBA-25XURJA 670.0 79.4 660.0 56.6 T12 SBA-25XSUREÑO 800.0 61.4 593.3 27.2 T13 SBA-25XTAN-1 686.7 92.3 495.0 41.9 T14 SBA-25XCAÑERO 566.7 24.5 450.0 15.4 T15 SBA-25XDALE 596.7 73.8 765.0 39.0 T16 SBA-25XTOPPER 793.3 74.9 576.7 41.6 T17 SBA-25XTHEIS 770.0 56.8 615.0 63.5 T19 SBA-22XTAN-1 970.0 85.6 536.7 105.6 T20 SBA-22XDALE 725.0 89.4 590.0 81.8 T21 SBA-22XCAÑERO 766.7 32.7 466.7 29.8 T22 SBA-22XTAN-2 760.0 57.3 570.0 50.5 T23 SBA-22XDULCE 560.0 47.6 373.5 30.5 T24 SBA-22XSUREÑO 695.0 20.9 405.0 67.7 T25 NORTEÑO 390.0 25.7 480.0 13.4 T26 HUASTECO 575.0 47.6 470.0 56.0 21 Variedades De Alta Densidad Azúcares Totales 50-140 g/L Volumen 600-900 mL pH 5.45-5.55 AISLAMIENTO Fermentación Espontánea De Jugo De Sorgo Dulce 60 CEPAS [Etanol] 6 g/L a partir de 20g/L de glucosa SELECCIÓN 60 CEPAS 22 CEPAS Etanol Y P/S > 0.35 g/g Eficiencia 70% SELECCIÓN 0.6 Y P/S (g/g) 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 S1 S2 S5 S6 S8 S11 S16 S17 S18 S19 S23 S26 S27 S30 S35 S41 S42 S43 S44 S49 S51 S64 CEPAS PRODUCTORAS DE ETANOL Etanol Y P/S = 0.35-0.38 g/g 6 CEPAS Etanol Y P/S = 0.4 g/g OSMOTOLERANCIA % Conversión de Glucosa CEPA % Conversión de Glucosa CEPA 100g/L 150 g/L 200 g/L 100g/L 150 g/L 200 g/L S1 74.28 52.62 32.85 S26 71.49 49.65 32.41 S2 95.49 49.76 32.20 S27 74.20 50.18 30.02 S5 75.31 52.46 31.09 S30 74.01 50.19 32.56 S6 70.61 53.92 31.47 S35 71.37 49.81 31.90 S8 73.25 53.26 29.50 S41 75.87 51.27 33.45 S11 71.64 51.47 29.67 S42 76.04 52.53 36.36 S16 74.14 51.14 34.94 S43 72.10 51.22 32.33 S17 72.93 49.98 31.51 S44 71.51 50.62 29.97 S18 75.55 54.41 33.03 S49 27.47 18.77 21.65 S19 73.09 53.06 29.50 S51 24.35 29.27 17.31 S23 38.51 46.92 16.29 S64 54.77 35.13 22.08 18 CEPAS OSMOTOLERANCIA 1.2 1.2 1 1 0.8 0.8 QP (g/Lh) QP (g/Lh) Efecto de la concentración inicial de glucosa sobre la productividad de etanol 0.6 0.4 0.6 0.4 0.2 0.2 0 0 S1 S2 S5 S6 S8 S11 S16 S17 S18 CEPAS PRODUCTORAS DE ETANOL S19 S23 S26 S27 S30 S35 S41 S42 S43 S44 S49 S51 S64 CEPAS PRODUCTORAS DE ETANOL Glucosa (g/L): 100 (), 150 (), 200 () QP (g/Lh) ≈ 0.8 g/g [GLUCOSA] QP Ortiz-Zamora et al. (2007) •El jugo de las variedades de alta densidad de sorgo dulce evaluado, contiene altas concentraciones de azúcares fermentables (50-140 g/L), pH que se encuentran entre los 5.45-5.55 los cuales favorecen el proceso de fermentación alcohólica además de poseer una gran fuente de cepas con potencial para utilizarse en la producción de bioetanol •60 cepas se aislaron ,de las cuales 22 de ellas obtuvieron rendimientos por arriba del 0.35 g/g en cuanto a la producción de etanol •Se evaluó la osmotolerancia en las 22 cepas seleccionadas a diferentes concentraciones de glucosa, 18 cepas presentaron características osmotolerantes hasta los 200 g/L de sustrato inicial, lo cual resulta de gran interés para la producción biotecnológica de bioetanol, sin embargo se deben realizar otros trabajos para el mejoramiento del proceso.
