TÉCNICAS DE ANÁLISIS DE MATERIAS GRASAS MSc. Alejandra Terevinto Curso EMA 2013 Técnicas de Análisis de Grasas Técnicas de Composición Técnicas de Calidad Técnicas de Extracción Preparación de la muestra • La validación del análisis de grasas de un alimento depende de un correcto muestreo y conservación de la muestra previo al análisis. • La preparación de la muestra depende del tipo de alimento y de la naturaleza de los lípidos. • Se deben eliminar las impurezas y el agua que pueda contener. Para ello, se la deja durante un tiempo en estufa a 50°C hasta que se clarifique si es líquida, y para que funda completamente si es sólida. Recién entonces se filtra con papel a 50°C una o m ás veces. • La muestra debe mantenerse en lugar fresco, en oscuridad y sin corriente de aire. • Los granos deben ser molidos previamente. Muestreo En la industria: • Aplicable a grasas vegetales y animales, y aceites crudos y refinados de origen vegetal o marino. • Para que la muestra sea representativa del total, cuando es un tanque de aceite líquido se debe sacar la muestra con un largo muestreador de fondo con agitación permanente. • Cuando la muestra es sólida se utiliza un muestreador de tubo para sacar a diferentes profundidades. Si es posible la muestra se funde para poder homogeneizarla. En el laboratorio: • Las muestras líquidas deben homogeneizarse agitando previamente. • Las muestras sólidas deben fundirse previamente para luego seguir con los criterios de muestreo correspondientes a una muestra líquida. Análisis de Composición • Los métodos han sido estandarizados según normas IUPAC, AOCS, ISO. – Índice de Iodo – Índice de Saponificación – Puntos de fusión – Clases lípídicas – Cromatografía de gases Indice de Iodo • • Son los gramos de iodo absorbidos por 100 gramos de grasa o aceite. Constituye una medida del grado de insaturación de una grasa. Determinación -Pesar aprox. 0,5 g de grasa o aceite filtrados en un frasco con tapón de vidrio de 500 ml y disolverlos en 10 ml de cloroformo. -Pipetear 25 ml del reactivo de Hanus y añadirlos al matraz. -Dejar en reposo exactamente 30 min en la oscuridad, con agitación ocasional. -El exceso de reactivo añadido no debe ser inferior al 60 %. Transcurridos los 30 min agregar 10 ml de una solución de KI al 15 % y 100 ml de agua destilada recientemente hervida y enfriada, arrastrando con ella cualquier resto de iodo del tapón o cuello del frasco. -Titular el iodo con una solución de S2O3Na2 0,1 N, con agitación constante, hasta que se atenúe el color amarillo de la solución. -Añadir aprox. 1 ml de una solución al 1% de almidón soluble y continuar la titulación hasta que desaparezca el color azul casi completamente. Cerrar bien el frasco, agitar violentamente para que el yodo remanente en la fase inferior pase a la capa acuosa, y completar la titulación. -Simultáneamente con la muestra problema realizar dos determinaciones en blanco, dejando caer el reactivo de Hanus de la pipeta exactamente durante el mismo tiempo que en la muestra problema. -Los duplicados no deben diferir en más de dos unidades. -La solución de almidón debe calentarse y dejar 1 min cuando rompe el hervor. Indice de Saponificación • • • • Permite determinar la cantidad total de ácidos grasos libres y combinados en el aceite. A partir de dicho valor se puede estimar su peso molecular medio. Se define como los mg de KOH requeridos para saponificar 1g de grasa o aceite. Esta técnica es aplicable a grasas y aceites vegetales y animales. • Procedimiento: -Pesar 2g de muestra fundida en un matraz de 250ml. -Agregar 25ml de solución alcohólica de KOH y algunas piedras de ebullición -Colocar el condensador de agua y dejar hervir suavemente la muestra a reflujo durante 60min. -Detener la ebullición y estando aun caliente agregar 0.5-1.0ml de fenolftaleína y titular con HCl 0.5N hasta viraje del indicador. -Preparar un blanco con las mismas cantidades pero sin hervir a reflujo y valorarlo. I.S.= (56,1 x N x (G0 - G))/m Donde: N = normalidad del HCl G = gasto de HCl en la muetra G0 = gasto de HCl en el blanco m = masa de muestra en gramos PMmedio = (3 x 56,108)/I.S Determinación del punto de fusión • Se realiza en un capilar cerrado (temperatura a la cual la muestra se vuelve completamente clara y líquida) y en un capilar abierto (temperatura a la cual una columna de grasa comienza a subir por el capilar) • Procedimiento: -fundir la muestra de grasa y sumergir la punta de 2 capilares hasta que la grasa ascienda 1cm. -sellar la punta de uno de los capilares con calor -colocar los capilares en un vaso de bohemia con agua y hielo durante 1hora -fijar los capilares a un termómetro con una banda elástica, colocarlos en un baño de agua y calentar con agitación -anotar las temperaturas correspondientes a los puntos de fusión en el capilar abierto y en el cerrado. Clases lípidicas por TLC • Placas de silica gel • Se usan mezclas de solventes de distinta polaridad dentro de una cuba de desarrollo como por ej: hexano:éter:ácido acético (80:20:2) Cromatografía de gases • Procedimiento: -preparación de los ésteres metílicos de ácidos grasos (FAMEs) -inyección de la muestra en el inyector, donde se vaporiza -separación de los FAMEs en la columna -detección de los FAMEs en el detector (FID: de ionización de llama, TCD: conductividad térmica, ECD: captura electrónica) • Fase móvil: gas • Fase estacionaria: líquido • Gas portador: gas inerte (H2, He, N2) • T horno: 140-240ºC • Resultado: área de picos = cantidad de ácido graso Inyector Cromatograma Cromatograma de ácidos grasos de la leche Aceites de oliva y de palma Aceite de almendra de palma Análisis de Calidad • Los métodos han sido estandarizados según normas IUPAC, AOCS, ISO – Índice de acidez – Índice de peróxidos – Índice de anisidina – Valor de TBA – Dienos y trienos conjugados Indice de Acidez • • Corresponde a los mg de KOH necesarios para neutralizar los ácidos grasos libres de 1g de grasa. La acidez de una grasa es una medida de la extensión de la hidrólisis que libera ácidos grasos. Procedimiento: -Neutralizar la mezcla solvente, agregando unas gotas de fenolftaleína como indicador, y gota a gota, la solución etanólica de KOH hasta un color rosado que permanezca 10 seg. -Pesar la muestra fundida en un erlenmeyer de 250ml. -Agregar 150ml del solvente neutralizado a la muestra y titular con agitación, con la solución alcohólica de KOH 0,1N y fenolftaleína como indicador hasta un color rosado que permanezca al menos 10 seg. VA = (56,1 x N x G)/m %A = (N x G x M)/(10 x m) Donde: N= normalidad de la solución de KOH G= gasto de KOH en ml m= masa de la muestra en gramos M= peso molecular del ácido correspondiente 56,1= peso molecular de KOH Indice de Peróxidos (PV) • • • • Es una medida del deterioro oxidativo del aceite. Los hidroperóxidos son los productos primarios de oxidación Determina todas las sustancias que oxidan el KI en las condiciones descritas. Se expresan como mEq de O2 activo por kg de muestra. Procedimiento: -Pesar la muestra fundida en un erlenmeyer de 250ml. -Agregar 10ml de cloroformo y disolver rápidamente con agitación. -Agregar 15ml de ácido acético glacial y 1ml de solución saturada de KI y tapar. -Agitar durante 1min y dejar 5min en la oscuridad a temperatura entre 15 y 25ºC. -Agregar 75ml de agua destilada, valorar el yodo liberado con la solución de tiosulfato correspondiente usando almidón como indicador. -Realizar un blanco simultáneamente sin incluir la muestra. P.V. = (N x G x 1000)/m Donde: G = gasto de tiosulfato en ml N = normalidad del tiosulfato m = masa de la muestra en gramos Indice de anisidina • Se utiliza para determinar los niveles de aldehídos en grasas animales y aceites vegetales. • Los aldehídos son productos de la descomposición de los ácidos grasos peroxidados. • Sirve para calcular el valor total de oxidación junto con el PV. TOTOX = 2PV + anisidina Valor de TBA •Indica el grado de oxidación del alimento •Depende de: la composición en ácidos grasos, el grado de insaturación, la presencia de prooxidantes y antioxidantes, de oxígeno, de la temperatura y la exposición a la luz. •El MDA es un producto secundario de la oxidación •El resultado se expresa como mg MDA/kg muestra 535nm Dienos y trienos conjugados • Son compuestos que durante la oxidación cambian la posición de los dobles enlaces • Los dienos conjugados son hidrocarburos con 2 dobles enlaces separados por un enlace sencillo y absorben a 234nm • Los trienos conjugados absorben a 268nm Técnicas de extracción de lípidos • Se basan en la extracción de los lípidos de una muestra vegetal o animal mediante el uso de solventes orgánicos (éter de petróleo, etil éter, cloroformo, metanol, etc.) • Elección del solvente: tienen que tener un alto poder de disolución de lípidos y ninguno para proteínas, AA, y CHO. Deben evaporarse rápido y no dejar residuos, tener un bajo punto de ebullición, no ser inflamable, ni tóxico. • Las técnicas de extracción pueden ser: sólido–líquido o líquido-líquido. • La técnica más importante consiste en generar dos fases no miscibles, que pueden ser una acuosa y una orgánica. • En la fase acuosa estarán en mayor proporción las sustancias iónicas y los compuestos orgánicos polares, mientras que en la fase orgánica estarán en mayor proporción los compuestos orgánicos no polares. Técnicas de extracción de lípidos • • • • Técnica de Folch (cloroformo-metanol) Técnica de Bligh & Dyer (Folch modificado) Método de Radin (hexano-isopropanol) Método de Soxhlet Técnica de Folch (1957) • • Se aplica a muestras con importantes cantidades de agua (aprox. 80%) por ejemplo tejidos animales y vegetales Proporciones C:M:W (8: 4: 3) • Procedimiento: -pesar la muestra, agregarle la mezcla cloroformo:metanol (2:1) y homogeneizar -filtrar la muestra con vacío y trasvasar a una ampolla de decantación -agregar NaCl2 para lograr la separación de fases y agitar durante 1min -dejar reposar durante toda la noche a la oscuridad -recuperar la fase inferior conteniendo cloroformo y los lípidos en balones previamente pesados -evaporar el cloroformo en un rotavapor, luego en estufa, dejar enfriar y pesar -calcular el % de lípidos de la muestra Técnica de Bligh & Dyer (1959) • Se aplica a muestras con importantes cantidades de agua (aprox. 80%) por ejemplo tejidos animales y vegetales • Es más rápida que la de Folch y gasta menos solvente • Proporciones C:M:W (8: 3,2: 1,6) • Se pierden más lípidos Método de Radin • Alternativa a la técnica de Folch, ya que los solventes son menos tóxicos. • Homogeneizar la muestra con la mezcla de hexano-isopropanol (3:2) y luego agitar en agitador magnético a temperatura ambiente durante 1 hora y media. • Filtrar a un balón de vidrio previamente pesado y rotaevaporar. Soxhlet •Técnica inventada en 1879 por Franz Von Soxhlet •Método de referencia para extracciones sólido-líquido •Se aplica a muestras con un bajo contenido de agua (raciones) •Es útil para extraer el aceite de semillas oleaginosas (girasol, maíz, etc) y es ideal para desgrasar alimentos de raciones. •Ventajas: permite utilizar el mismo disolvente (éter de petróleo o éter dietílico) realizando repetidas extracciones en un proceso continuo y automático. •Desventajas: larga duración, grandes volúmenes de solvente, se potencian las reacciones de autooxidación, solvente altamente inflamable Aparato de Soxhlet Cartucho de papel donde se coloca la muestra Plancha Procedimiento: -Pesar el cartucho de papel vacío, colocar la muestra seca y molida adentro y volver a pesar. -Colocar el cartucho con la muestra en el cuerpo del Soxhlet. -Pesar el balón, armar el sistema, y volcar el éter de petróleo por la parte superior -El solvente se calienta, comienza la ebullición y los vapores condensan en el refrigerante, cayendo en el cuerpo del Soxhlet -Cuando el nivel de solvente llega a la curva del sifón se produce una sifonada, pasando todo lo del cuerpo del soxhlet al matraz, donde se reinicia la ebullición del solvente, quedando el aceite en el matraz. -Dejar el sistema a reflujo por 2-6 horas hasta que el disolvente en el cuerpo del Soxhlet esté transparente. -Quitar el balón y evaporar el solvente con un rotavapor, luego colocar en estufa y en desecador para enfriar -Pesar el balón con los lípidos y calcular el porcentaje de grasa en la muestra problema Extracto etéreo • La mayor parte del extracto etéreo son TAG, pero pueden aparecer pequeñas cantidades de vitaminas liposolubles, carotenos, ceras, resinas y esteroles. • Por lo general, los alimentos vegetales contienen pequeñas cantidades de extracto etéreo (1-5%) • Excepciones: semillas de soja, girasol y algodón (18-30%) y algunos alimentos de origen animal (15-25%) Bibliografía consultada • Azadmard-Damirchi, S., & Dutta, P.C. 2009. A single step solid-phase extraction method for complete separation of sterol oxidation products in food lipids. Journal of Chromatography A, 1216: 36-42. • Belitz, H.D., Grosch, W., & Schieberle, P. 2009. Lipids. Food Chemistry, 158-247. • Belitz, H.D., Grosch, W., & Schieberle, P. 2009. Edible fats and oils. Food Chemistry,640-669. • Carrapiso, A.I., & García, C. 2000. Development in lipid analysis: some new extraction techniques and in situ transesterification. Lipids, 35(11): 11671177. • Min, D.B., & Ellefson, W.C. 2010. Fat Analysis. Food Science Texts Series, 117-132. • Virot, M., Tomao, V., Colnagui, G., Visinoni, F., & Chemat, F. 2007. New microwave-integrated Soxhlet extraction. An advantageous tool for the extraction of lipids from food products. Journal of Chromatography A, 1174: 138-144. Muchas gracias…
