Determinación del efecto de la maduración de la lechosa (Carica

Determinación del efecto de la maduración de la lechosa
(Carica Papaya L.) sobre la concentración de la Papaína
Gutiérrez M., Geraldine S.; Velásquez S., Virginia E. y Ferrer, José R.
Universidad Rafael Urdaneta. Facultad de Ingeniería. Escuela de Ingeniería Química.
Maracaibo.
Venezuela.
E-mail:
[email protected]
y
[email protected]
Resumen
La papaína es una enzima proteolítica que ayuda a digerir las proteínas de los
alimentos, que bien merece ser estudiada por la serie de beneficios que aporta a la salud
y a la industria en sí. Este trabajo fue de Tipo Correlacional con Diseño Experimental,
basado en Observación Directa y Documental. Se estudio el efecto de la maduración de
la lechosa sobre la concentración de papaína, extrayendo esta directamente de la pulpa
de la lechosa (Carica Papaya L.) de la Variedad Red Lady, a partir de cada uno de sus 6
estados de maduración, definidos por la consistencia del fruto y el color de la cáscara
del mismo; se les realizaron pruebas físico-químicas a las muestras, midiendo pH,
Sólidos Solubles, Contenido de Cenizas y Humedad. Se purificó la papaína por
precipitación de la sal en dos pasos, se refinó por diálisis donde se utiliza una membrana
de diálisis que permite que las impurezas de las muestran fluyan hacia el exterior a
través de sus microporos; y por ultimo se cuantificó por el método Nº 971.16 de la
A.O.A.C, concluyendo así que a medida que la maduración del fruto transcurre hay
menos concentración de papaína en la pulpa.
Palabras claves: Lechosa, Papaína, Concentración, Maduración.
Abstract
Papain is a proteolytic enzyme that helps to digest food proteins, and it deserves to
be studied because of its benefits to health and industry as well. This kind of research
was Correlacional and its design was Experimental, based on Direct and Documentary
Observation. The effect of Papaya ripening over Papain concentration was studied by
extracting papain directly from papaya (Carica Papaya L.) Red Lady Variety pulp, from
each of its 6 ripening states, defined by its consistency and skin color; some physical-
chemical tests were made to the samples, measuring pH, Soluble Solids, Ash Contents
and Humidity. Papain was purified by two-step salt precipitation, refined by dialysis
where a dialysis membrane was used to make flow impurities to the outside by its pores;
and finally papain was quantified by Nº 971.16 method recommended by A.O.A.C.,
concluding that as the fruit ripening passes there is less papain concentration on the
pulp.
Key Words: Papaya, Papain, Concentration, Ripening.
Introducción
La lechosa también llamada papaya es apetecible por su suave y agradable sabor y
por tener propiedades nutritivas, digestivas y medicinales.
La papaya es solicitada por consumidores que tienen preferencias por frutas
tropicales. Además de ser agradable, posee altos nutrientes, vitaminas, minerales y
proteínas que le hacen sobresalir entre otras frutas por sus características medicinales,
principalmente en el tratamiento de enfermedades gástricas. Su valor nutritivo es alto
100grs de pulpa suministran los requerimientos mínimos diarios de vitamina C y la
mitad de vitamina A, posee vitaminas de complejo B (B1, B6, B12). También las flores
poseen propiedades febrífugas y pectorales cuando es consumida en infusiones. Su
aprovechamiento es total, hojas, frutas y tallos, poseen alcaloides calpainas y la enzima
papaína utilizada ampliamente en la medicina. La calpaina que se encuentra en las hojas
en concentración hasta de 0.4% es usada en tratamientos de disentería y tuberculosis. La
papaína que se encuentra en los tejidos de la planta posee la cualidad de disolver y
digerir los albuminoides y por tal motivo es usada en medicinas para el control de
insuficiencias gástricas, en la digestión de tejidos putrefactos, en heridas gangrenosas y
para estudios citológicos en la determinación de cáncer estomacal.
En la industria textil se usa la papaína para suavizar la lana y la seda; en la industria
de pieles para la batiente de cueros; en la industria del caucho para el envejecimiento
artificial del látex, también es usada para la fabricación de chicles y en las industrias
cerveceras para mejorar las maltas. Se emplea para ablandar carnes mediante la
inyección a la res antes de su sacrificio o en la cocción.
El procedimiento habitual para obtener la papaína, consiste en secar el zumo lechoso
que exuda la corteza de la papaya verde, pero en el día a día, el consumo de lechosa se
realiza cuando la misma se encuentra en su máximo estado de maduración. Lo que se
desea estudiar es qué sucede con la papaína cuando la lechosa llega a su máximo estado
de maduración.
Ya que el aprovechamiento de la lechosa es total según la teoría, es necesario saber
que sucede con la concentración de papaína en cada parte del fruto, y en una de sus
partes más utilizadas como lo es la pulpa a diferentes estados de maduración, para así
conocer mas a fondo, en que momento es de mejor aprovechamiento el consumo de la
misma. Por consiguiente, en este trabajo se plantea como objetivo general : Determinar
el efecto de la maduración en la lechosa (Carica papaya L.) sobre la concentración de
Papaína.
Metodología Experimental
Fase I: Estudio de los diferentes métodos para la extracción y la purificación de
papaína a partir de lechosa (Carica Papaya L.)
Se analizarán diferentes métodos para la obtención de papaína a partir de lechosa en
todos sus estados de maduración.
La papaína a partir de lechosas verdes regularmente se obtiene por purificación del
zumo lechoso (látex) coagulado, proveniente de ligeras incisiones longitudinales que se
practican en la superficie de los frutos; mientras que a partir de lechosas maduras, donde
no se puede extraer látex, se debe tomar pulpa y concha de la fruta para su posterior
purificación.
Algunos procedimientos descritos para Purificar papaína a partir de lechosa son:
Método de la precipitación de la sal en dos pasos, Método de extracción en un sistema
acuoso de dos fases. Para la Refinación se realizará la descripción del procedimiento de
diálisis, mientras que para la Cuantificación se describirán los métodos de Biuret,
Bradford, Lowry y el procedimiento Nº 971.16 de la A.O.A.C.
Fase II: Selección del método experimental más apropiado para la cuantificación de
la papaína.
Luego de haber estudiado los diferentes métodos experimentales para la obtención,
purificación y cuantificación de la enzima, con las respectivas ventajas y desventajas de
cada procedimiento, se logrará escoger el método experimental más apropiado para esta
investigación.
Fase III: Caracterización de las propiedades físico-químicas de las muestras de
lechosa.
Previo a la caracterización se realizará la toma de muestras de la enzima a partir de
lechosas (Carica Papaya L.) verdes y maduras de la Variedad Red Lady facilitadas por
el Centro Frutícola del Estado Zulia, ubicado en el Municipio Mara.
De estas lechosas se retirararán tanto la cáscara como las semillas para así obtener
solo la pulpa de las frutas.
Las mismas se clasificararán según el estado de maduración y serán almacenadas a 4
o
C en envases previamente esterilizados y etiquetados.
Se analizarán las muestras por duplicado, separando las mismas en muestras A y
muestras B para cada estado de maduración.
Para cada muestra se realizarán los siguientes análisis por duplicado:
Determinación de pH
Se colocaron las muestras en vasos precipitados y se midió el pH con un pHmetro
(HANNA Instruments, USA) previamente calibrado.
Determinación de sólidos solubles
La determinación de sólidos solubles se realizó utilizando un refractómetro portátil
(Bausch & Lomb, USA), que expresa los resultados en °Brix, colocando parte de las
muestras sobre el lente de dicho equipo y leyendo el valor en la escala.
Determinación de % de Humedad

Se pesaron 1-2 grs. de muestra en crisoles previamente secados y pesados.

Se colocaron en la estufa a 105-110 ºC por 5 horas hasta obtener peso constante.

Se enfriaron las muestras en un desecador y se pesaron al alcanzar la
temperatura ambiente.

Se calculó el % de Materia Seca con la siguiente ecuación:
%MS 

peso.muestra. sec a, g
 100
peso.de.muestra. parcialmen te. sec a, g
Se calculó el % de Contenido de Humedad por diferencia: %Humedad = 100 %MS
Determinación de Contenido de Ceniza

Se colocaron los crisoles limpios en un horno de incineración a 550ºC durante 1
hora.

Luego se trasladaron los crisoles al desecador y se enfriaron a la temperatura del
laboratorio.

Se pesaron 1-2 grs. de muestra en los crisoles y se colaron de nuevo en el horno
incinerador a 550ºC durante 5 horas.

Se trasladaron los crisoles a una estufa a 105ºC y se dejaron por una hora.

Se colocaron de nuevo en el desecador hasta alcanzar la temperatura ambiente y
se anotó el peso.

Por último, se obtuvo el % de Cenizas mediante la siguiente ecuación:
%CEN 
peso.de.ceniza , g
 100
peso.de.muestra. parcialmen te. sec a, g
Fase IV : Cuantificación de la concentración de papaína en la lechosa a diferentes
estados de maduración.
Primero la papaína se debió purificar, y refinar para posteriormente cuantificarla.
Entonces la obtención de la Papaína a partir de las muestras de las pulpas de
lechosas se realizó, por duplicado, de la siguiente manera:
Purificación de la Papaína
Método de la precipitación de la sal en dos pasos
 Se generó una suspensión agregando a la muestra Cistina 40mM en relación 3:1 y
el pH fue regulado a 5.6 con NaOH 6M.
 La muestra se agitó en una plancha de agitación magnética por 15 min. a 4 oC.
 Se filtró la mezcla y el pH del filtrado se ajustó a 9 con NaOH 6M.
 El material insoluble se retiró por centrifugación a 4oC por 30 min.
 Se ajustó con agua, y se le agregó (NH4)2SO4 45% para precipitar.
 Se agitó lentamente por 30 min. a 4oC.
 Se disolvió con Cistina 20mM y se sometió de nuevo a centrifugación a las
mismas condiciones anteriores.
 Las muestras se mantuvieron a 4oC y se agregó NaCl 10%.
 Se agitó lentamente por 30 min. a 4oC.
 Y por último, se separa el precipitado de papaína por centrifugación a las mismas
condiciones.
Refinación de la Papaína
Se implemento el proceso de diálisis a nivel de laboratorio, con el uso de un equipo
compuesto de una plancha de agitación, un cilindro de vidrio, una membrana de diálisis
de 29mm de diámetro, un magneto y un soporte universal (Figura 2).
Se observó como la membrana de diálisis estuvo en contacto continuo con el agua,
permitiendo que las impurezas de la muestra fluyeran hacia el exterior a través de sus
microporos, debido al gradiente de concentración. El proceso tuvo lugar por 12 horas
aproximadamente, con lo que se buscaba eliminar las impurezas y residuos desechables
y así obtener pura papaína.
Cada refinado de las muestras se mantuvo almacenado a 4ºC, para la posterior lectura
en el espectrofotómetro.
Cuantificación de la Papaína
Para cuantificar esta enzima, se realizó una curva patrón o curva de calibración de
Absorbancia versus Concentración de la Papaína. Para realizar esta curva se llevaron a
cabo los siguientes pasos correspondientes al método Nº 971.16 de la A.O.A.C:
 Se pesó correctamente 100 mg. de Papaína de referencia estándar y se colocó en
un balón aforado de 100mL de volumen y se adicionó solución buffer hasta
disolver.
 Se etiquetaron 6 matraces de 100 ml como S1, S2 y S3 por duplicado para
solución estándar de papaína comercial. Otros 3 matraces correspondieron a los
blancos etiquetados como S1B, S2B y S3B. A cada uno de los matraces
volumétricos de vidrio tapados de 100ml, se le pipetearon 25 ml de Sustrato de
Caseína.
 Se adicionaron 5, 2.5 y 0 ml de Solución Buffer respectivamente a los matraces
S1, S2 y S3 y también a sus respectivos blancos S1B, S2B y S3B.
 Se ubicaron todos los matraces en un baño de agua a 40 ºC dejando pasar 10
minutos hasta alcanzar la temperatura del baño.
 Dentro de cada matraz duplicado S1, se pipetearon 5 ml de la solución estándar
de papaína seguido con agitación simultánea para mezclar, se taparon y ubicaron
en un baño. Dentro de dos matraces etiquetados S2, se pipetearon 7.5 ml de
solución estándar de papaína y se procedió de la manera anterior. Y finalmente
se adicionaron 10 ml de la solución estándar a los dos matraces S3.
 Luego de exactamente 60 minutos se adicionan 15 ml de TCA (Ácido
Tricloroacético) al 30% a todos los matraces y se mezclaron vigorosamente.
 Se prepararon los blancos pipeteando respectivamente 5 ml a S1B, 7.5 ml a S2B, y
10 ml a S3B de solución estándar de papaína.
 Todos los matraces se reubicaron en un baño a 40 ºC y se permitió que el
precipitado coagulara completamente. Se filtró a través de papel filtro hasta
obtener un filtrado totalmente transparente.
 Finalmente se leyó la absorbancia de los filtrados a 280nm versus el blanco
respectivo para realizar la grafica correspondiente.
Luego de obtener la curva patrón se procedió a medir cada muestra previamente
almacenada a 4ºC en un Espectrofotómetro UV visible, en donde se observaron los
valores de absorbancia a 280nm para luego ir a la curva (Gráfico Nº1) y obtener el valor
de concentración de papaína correspondiente.
Fase V: Comparación las concentraciones de papaína en relación a los diferentes
estados de maduración de la lechosa.
Para llevar a cabo la última fase de la investigación se elaboró un cuadro
comparativo y una gráfica en donde se incluyeron los estados de maduración de la
lechosa con respecto a su índice de madurez y los resultados obtenidos a partir de los
procedimientos experimentales realizados para cada muestra, en los cuales, se pudo
observar la tendencia de la concentración de papaína con respecto a el estado de
maduración de la lechosa.
Se implemento el proceso de diálisis a nivel de laboratorio, con el uso de un equipo
compuesto de una plancha de agitación, un cilindro de vidrio, una membrana de diálisis
de 29mm de diámetro, un magneto y un soporte universal.
Se observó como la membrana de diálisis estuvo en contacto continuo con el agua,
permitiendo que las impurezas de la muestra fluyeran hacia el exterior a través de sus
microporos, debido al gradiente de concentración. El proceso tuvo lugar por 12 horas
aproximadamente, con lo que se buscaba eliminar las impurezas y residuos desechables
y así obtener pura papaína.
Cada refinado de las muestras se mantuvo almacenado a 4ºC, para la posterior lectura
en el espectrofotómetro
Análisis de resultados
Fase I: Estudio de los diferentes métodos para la extracción y la purificación de
papaína a partir de lechosa (Carica Papaya L.)
Los estudios realizados sobre cada método experimental para la obtención de
papaína a partir de lechosas en la presente de investigación fueron avalados por
aquellos ya realizados en otros trabajos anteriores, con diferentes frutas o en otras
variedades del fruto de lechosa, lo cual indica que dichos métodos proveen
resultados confiables y precisos.
Fase II: Selección del método experimental más apropiado para la cuantificación
de la papaína.
El método experimental seleccionado para la cuantificación de la papaína es
confiable ya que depende de la absorbancia cuyo valor es medido por el
espectrofotómetro y su grado de precisión es bastante alto, por lo tanto es
recomendable para posteriores estudio.
Fase III: Caracterización de las propiedades físico-químicas de las muestras de
lechosa.
Fuente: Gutiérrez y Velásquez (2009).
Tabla 4: Resultados de Análisis Físico-Químicos.
El símbolo Χ se refiere a la media de los valores obtenidos y el símbolo σ se
refiere a la desviación estándar de los mismos.
Haciendo referencia al pH obtenido para cada muestra no se encuentran
diferencias significativas entre las mismas expresadas en desviación estándar. Se
observa un pH ligeramente ácido, en cada muestra lo que lleva a concluir que para la
pulpa de la lechosa (Carica Papaya L.) de la Variedad Red Lady posee un pH ácido
y la Papaína puede tener actividad proteolítica a su pH óptimo de actividad.
Para los Sólidos Solubles, expresados en grados ºBrix, se observa un aumento a
medida que la fruta va madurando. Los ºBrix miden el cociente total de sacarosa
disuelta en un líquido, lo que quiere decir que mientras más madura la fruta, más
contenido de azucares contiene en su pulpa.
Para el % de Humedad en la pulpa, se observan números bastante altos, que van
aumentando a medida que la fruta madura; lo que indica que las muestras están
conformadas por agua casi en su totalidad, lo que nos deja un pequeño porcentaje de
compuesto de proteínas y enzimas entre las cuales se encuentra la papaína.
El % de Contenido de Cenizas se midió con referencia al producto en seco y se
refiere al residuo sólido que persiste tras una combustión total. Los porcentajes
resultaron ser bastante bajos y regulares con respecto a los estados de maduración.
Fase IV: Cuantificación la concentración de papaína en la lechosa en diferentes
estados de maduración.
La curva de calibración que se muestra a continuación fue construida con los
valores de absorbancia medida en laboratorio y las diferentes concentraciones de
papaína comercial, es decir, se presenta la relación entre la absorbancia, que es la
cantidad de luz que absorbe una muestra, y la concentración en términos de gramos
por litro. Se observa un comportamiento lineal.
Curva de Calibración
0,8
Y= 136.66x+ 0.016
2
R = 0.9954
0,6
0,5
0,4
0,3
a
Absorbancia
0,7
0,2
0,1
0
0
1
2
3
Concentración (g/l)
4
5
6
Grafica 1: Curva de Calibración.
Fuente: Gutiérrez y Velásquez (2009).
Fase V: Comparación las concentraciones de papaína en relación a los diferentes
estados de maduración de la lechosa.
Concentración (g/l)
Estados
de Muestra Muestra
Χ
σ
2.50
2.55
0.25
2.21
2.18
2.20
0.02
3
1.82
1.80
1.81
0.01
4
1.22
1.31
1.27
0.05
5
0.71
0.92
0.82
0.11
6
0.20
0.25
0.23
0.25
Maduración
A
B
1
2.60
2
Tabla 5: Resultados de Concentración de Papaína.
Fuente: Gutiérrez y Velásquez (2009).
Con respecto a la Concentración de Papaína no se muestran diferencias
significativas entre las muestras A y B para cada estado. Lo que si queda claro es
una tendencia descendente para los valores de concentración con respecto a la
maduración de la lechosa, donde se puede decir que mientras más cercana a su
máximo estado de maduración, la lechosa contiene menos cantidad de papaína, más
se aclara el punto de que si esta presente la enzima Papaína en las pulpas de
Lechosas (Carica papaya L.) de la Variedad Red Lady, aunque en pocas
concentraciones.
Concentración de Papaína vs. Estado de Maduración
3
2,5
2
Concentración 1,5
Muestra A
1
Muestra B
0,5
0
1
2
3
4
5
6
Estados de Maduración
Grafica 2: Concentración de Papaína vs. Estado de Maduración.
Fuente: Gutiérrez y Velásquez (2009).
Para la Gráfica 2 se observa, al igual que en el cuadro anterior, una tendencia
descendente con respecto a la concentración para cada estado de maduración. Lo
que quiere decir, que mientras la lechosa se encuentra verde, contiene una cantidad
considerable de papaína, la cual disminuye a medida que el fruto madura, pero no
desaparece.
En las muestras analizadas se tomaron aproximadamente 60 grs. de pulpa de cada
estado de maduración de las lechosas, y se obtuvieron resultados de concentración
de papaína en un aproximado de 0.23 g/l para las lechosas maduras en estado 6, lo
que representa un 0.375% de la totalidad de la pulpa estudiada. También se
determino que, comparado con el Estado 1, en el Estado 6 hubo una disminución del
90.98% en la concentración de papaína, lo que quiere decir que se perdió gran
cantidad de la enzima pero la misma no desapareció. Tomando en cuenta que en el
Estado 6 es en donde la fruta es consumida normalmente, se puede decir, que si
brinda los beneficios a la salud por los cuales es tan conocida.
Añez e Iriarte (2008) obtuvieron resultados similares a los de la presente
investigación al concluir que a mayor tiempo de almacenamiento de las muestras de
látex, menor era la cantidad de papaína pura que obtenían y de actividad Proteolítica
de la misma. Ellos explican que por el hecho de que la recolección no se hizo
directamente de la planta sino mediante cortes longitudinales al fruto a nivel de
laboratorio, se aceleró el proceso de maduración de las lechosas y se perdió parte de
la enzima. Debido a dichos resultados, se puede decir, que en general para una
lechosa, referido a su pulpa y látex, mientras mayor sea su estado de maduración,
menor va a ser su concentración de papaína.
Cabe destacar que industrialmente se extrae la papaína directamente del látex de
lechosa verde, y de acuerdo a estos resultados se debe hacer inferencia en el porque
no extraerla de lechosas maduras. Sin embargo, lo más debido seria hacer una
evaluación económica acerca de si de extraer papaína de lechosas maduras es más
ventajoso que solamente comercializarlas en fruterías y supermercados como se
hace en la actualidad.
Conclusiones
 La concentración de Papaína disminuye en la pulpa de la lechosa de acuerdo al
estado de maduración del fruto. Comparado con el Estado de maduración 1, en
el Estado 6 hubo una disminución del 90.98% en la concentración de papaína, lo
que quiere decir que se perdió gran cantidad de la enzima, pero la misma no
desapareció.
 En cuanto al estudio de los Sólidos Solubles y el % Humedad estos aumentan a
medida que transcurren los estados de maduración, lo que quiere decir que la
lechosa va adquiriendo mas porcentaje de azucares y agua y perdiendo
porcentaje en otros nutrientes a medida que madura.
 El pH de las muestras se mantuvo ligeramente ácido con valores en un rango de
entre 5 y 7 aproximadamente; por lo tanto la lechosa mantiene un ambiente
propicio para que la Papaína no se degrade a medida que el fruto va madurando.
 Los métodos utilizados para la purificación, refinación y cuantificación de la
papaína permiten inferir que los resultados son confiables, ya que son métodos
avalados por instituciones de químicos e ingenieros químicos, además de haber
sido utilizados en otros trabajos anteriores para la determinación de la papaína
en lechosa.
 Se puede concluir que la ingesta de pulpa de lechosa si es beneficiosa para el ser
humano, ya que además de suplir los requerimientos mínimos diarios de
vitaminas A, C y de complejo B; se demuestra que la fruta en su máximo estado
de maduración (Estado 6, donde es completamente amarilla o naranja y de
consistencia blanda), posee una cantidad considerable de Papaína que, de ser
consumida, actuaría en el organismo positivamente.
Recomendaciones
 Realizar un estudio de purificación alternativo, con un método diferente para
comparar resultados en cuanto a pureza o calidad del producto.
 Almacenar las muestras de la pulpa de la lechosa aproximadamente a 4ºC para
no alterar las propiedades de la misma.
 Cuantificar la Papaína a través de otro método experimental.
 Hacer una comparación de las concentraciones de la Papaína en la pulpa vs.
látex de la fruta, para los primeros estados de maduración.
 Utilizar la pulpa de la fruta sin agregarle agua para no alterar las
concentraciones.
 Estudiar otra variedad de lechosa (Carica Papaya L.) para estudiar si hay alguna
variación en el efecto de la maduración sobre la concentración de papaína; en lo
que se refiere a las concentraciones como tal.
 Calcular la actividad Proteolítica de la Papaína para cada estado de maduración
de la lechosa, para conocer el comportamiento de dicha actividad con respecto
al tiempo.
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