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CRITERIOS DE FUNCIONAMIENTO DE MÉTODOS ANALÍTICOS INDICE 1. DEFINICIONES 2. METODOS ANALITICOS OFICIALES 3. PARAMETROS DE FUNCIONAMIENTO Y OTROS REQUERIMIENTOS PARA LOS METODOS ANALITICOS 4. CRITERIOS DE FUNCIONAMIENTO POR METODOLOGIA 5. VALIDACION DE METODOS 6. TRANSFERENCIA DE METODOS ANALITICOS 7. PRUEBAS DE DESEMPEÑO 8. SISTEMA DE GESTION DE CALIDAD 9. REFERENCIAS Abril 2016 Página 1 1.-DEFINICIONES Analito: Sustancia que debe ser detectada, identificada y/o cuantificada y los derivados de la misma que se formen durante el análisis. Análisis de varianza (ANOVA): Método utilizado para comparar dos o más medias de “n” grupos analizando la varianza de los datos, tanto entre grupos como dentro de ellos. Blanco de reactivo: Es el que se prepara simultáneamente con la muestra; está constituido por el solvente en que se disolvió la muestra y se procede con él en las mismas condiciones que la muestra pero no la contiene a ella. Coeficiente de correlación: Número que mide la intensidad de la asociación lineal entre la variable “x” y la variable “y” y se representa simbólicamente por la “r”. Coeficiente de variación: Es una medida de dispersión relativa y se calcula dividiendo la desviación estándar entre la media aritmética. Simbólicamente se representa por CV. Condiciones de repetibilidad: Condiciones en las que un mismo operador obtiene resultados de ensayos independientes con el mismo método e idénticas muestras de análisis, en el mismo laboratorio y con el mismo equipo. Condiciones de reproducibilidad: Condiciones en las que operadores diferentes obtienen resultados de ensayos independientes con el mismo método e idénticas muestras de ensayo, en laboratorios diferentes y con equipos diferentes. Curva de Calibración: Representación gráfica de la señal que mide en función de la cantidad de analito. Determinación del blanco de la muestra: Procedimiento analítico completo aplicado a una porción de ensayo de una muestra que no contiene el analito. Determinación del blanco de reactivo: Procedimiento analítico completo aplicado sin la porción de ensayo o utilizando una cantidad equivalente de disolvente adecuado en lugar de la porción de ensayo. Especificidad: Capacidad de un método de distinguir entre el analito que se está midiendo y otras sustancias. Esta característica es ante todo una función de la técnica de medición descrita, pero puede variar en función del tipo de compuesto o de la matriz. Estabilidad: Propiedad de una muestra, preparada para su cuantificación, de conservar su integridad fisicoquímica y la concentración del analito, después de almacenarse durante un tiempo determinado bajo condiciones específicas de temperatura. Exactitud: Grado de concordancia entre el resultado del ensayo y un valor de referencia aceptado. Se obtiene determinando la veracidad y la precisión. Falso negativo: Se produce cuando las muestras del método a validar contienen substancias que pueden interferir y dar un resultado positivo y el valor de referencia es negativo. Falso positivo: Se produce cuando las muestras del método a validar contienen substancias que pueden interferir y dar un resultado negativo y el valor de referencia es positivo. Abril 2016 Página 2 Incertidumbre: Parámetro asociado al resultado de una medición que caracteriza la dispersión de los valores que podrían razonablemente ser atribuidos al mensurando. Intervalo de trabajo: Intervalo que se utilizará en el trabajo rutinario, las muestras estarán dentro de los límites de este y debe ser menor al intervalo lineal. Intervalo lineal: Intervalo desde el límite de detección, hasta la máxima concentración en que la respuesta del método se comporta linealmente. Límite de cuantificación: Concentración más baja de un analito que se puede determinar con la precisión aceptable (capacidad de repetición) y la exactitud bajo condiciones indicadas de la prueba. Límite de detección: Contenido más bajo que se puede medir con certeza estadística razonable. Límite máximo de residuo (LMR): Nivel máximo u otra tolerancia máxima de sustancias establecidas en otro ámbito de la legislación comunitaria. Linealidad: Capacidad del método de obtener los resultados de la prueba proporcionales a la concentración del analito. Material de muestra enriquecido o fortificado: Muestra enriquecida con una cantidad conocida del analito que debe detectarse. Material de referencia: Material del que se haya confirmado una o varias propiedades, por medio de un método validado, de manera que pueda utilizarse para calibrar un aparato o comprobar un método de medición. Material de referencia certificado (CRM): material al que se ha asignado un contenido de analito especificado. Media Aritmética: Es una medida de tendencia central que denota el promedio de una serie de datos. Se calcula dividiendo la suma del conjunto de datos entre el total de ellos. Método cuantitativo: Método analítico que determina la cantidad o la fracción de la masa de una sustancia de forma que pueda expresarse como valor numérico de unidades apropiadas. Método de confirmación: Método que proporciona información total o complementaria que permite identificar y, en su caso, cuantificar de manera inequívoca la sustancia al nivel de interés. Métodos de cribado o presuntivo: Métodos utilizados para detectar la presencia de una sustancia, o tipo de sustancias, al nivel de interés. Estos métodos permiten tratar un elevado número de muestras y se utilizan para cribar grandes cantidades de muestras en busca de posibles resultados no conformes. Están diseñados específicamente para evitar resultados falsos conformes. Métodos presuntivos biológicos: Métodos con la capacidad de detectar respuestas celulares a los analitos (ejemplo estrogénico, inhibición del crecimiento bacteriano, efecto celular, efecto hormonal, etc…) estos métodos no son selectivos y pueden cubrir varias clases de químicas de analitos (ejemplo, hormonas, antimicrobianos, etc.) no tienen la capacidad de detectar analitos específicos. Métodos presuntivos bioquímicos: Método con la capacidad de detectar interacciones moleculares (ejemplo antígenos, proteínas, etc…) entre analitos y anticuerpos o proteínas receptoras (ejemplo ELISA, RIA, etc…). El marcado químico del analito o el anticuerpo/receptor permite que la interacción sea monitoreada y medida. Estos métodos son selectivos por familia de analitos que tengan estructuras moleculares semejantes o en ocasiones son específicos para un analito en particular. Métodos presuntivos fisicoquímicos: Métodos que distinguen estructura química y características moleculares de los analitos por separación de moléculas (ejemplo: TLC, GC, HPLC, etc…) y las señales de detección relacionadas a las características moleculares (ejemplo UV/Visible, DAD, fluorescencia, FID, ECD. Abril 2016 Página 3 Los métodos son capaces de distinguir entre estructuras moleculares similares y permite el análisis simultáneo de varios analitos. Muestra blanco: Porción de muestra en la cual el analito no está presente. Muestra enriquecida: Porción representativa del material a evaluar, a la que se le adiciona cantidades conocidas del analito. Nivel de interés: Concentración de una sustancia o un analito en una muestra que es significativa para determinar su conformidad con la normatividad. Nivel de significancia: Se define como la probabilidad de rechazar la hipótesis nula cuando esta es verdadera. Simbólicamente se denota por Ordenada al origen: Es el valor que toma la variable dependiente “y” cuando la variable independiente “x” vale cero y es el punto donde la recta cruza al eje vertical. Parámetros de funcionamiento: Exigencias de una característica de funcionamiento en función de las cuales se puede determinar que un método analítico es adecuado para la finalidad perseguida y ofrece resultados fiables. Patrón interno (SI): Sustancia que se adiciona a la muestra, de propiedades fisicoquímicas lo más próximas posible a las del analito que ha de identificarse, que se añade a cada muestra. Pendiente: Es el grado de inclinación de la regresión lineal. Se simboliza por “m”. Protocolo de validación: Documento que describe el(los) objetivo(s), diseño, metodología, consideraciones estadísticas y organización de un estudio de la validación de un método analítico. Precisión: Grado de concordancia entre resultados de ensayos independientes obtenidos en condiciones estipuladas (predeterminadas). La precisión suele expresarse como imprecisión y calcularse como desviación estándar de los resultados de los ensayos. Cuanto mayor es la desviación estándar menor es la precisión. Recuperación: Porcentaje de la concentración real de una sustancia recuperada durante el procedimiento analítico. Este factor se determina durante la validación si no se dispone de material de referencia certificado. Regresión lineal: Es la recta que mejor se ajuste a los datos. Se obtiene mediante el método de mínimos cuadrados. La recta viene definida con la ecuación y=mx + b donde “y” es la variable dependiente y “x” la variable independiente, “m” la pendiente y “b” la ordenada al origen. Repetibilidad: Proximidad entre los resultados de la medida sucesiva del mismo mensurando realizado en las mismas condiciones de la medida. Repetibilidad (de los resultados de mediciones): Proximidad de la concordancia entre los resultados de las mediciones sucesivas del mismo mensurando, con las mediciones realizadas con la aplicación de la totalidad de las siguientes condiciones (mismo procedimiento de medición, mismo analista, mismo instrumento de medición, mismo lugar, la repetición dentro de un periodo corto de tiempo.) Reproducibilidad: Proximidad entre los resultados obtenidos de un método bajo condiciones distintas de análisis (laboratorio, operadores, equipo, efectos aleatorios, etc.) Abril 2016 Página 4 Reproducibilidad (de los resultados de mediciones): Proximidad de la concordancia entre los resultados de las mediciones del mismo mensurando, con las mismas mediciones realizadas, haciendo variar las condiciones de medición. Revalidación: Consiste en repetir de forma total o parcial su validación, debido a modificaciones en el método, equipos y en la muestra a analizar, para garantizar la obtención de resultados fiables. Robustez: Susceptibilidad de un método analítico a los cambios de las condiciones experimentales, que pueden expresarse en forma de lista de los materiales de la muestra, los analitos, las condiciones de almacenamiento o las condiciones ambientales o de preparación, en las que puede aplicarse el método tal cual o con determinadas modificaciones menores. Deberá indicarse cualquier variación de las condiciones experimentales susceptibles de fluctuación en la práctica (por ejemplo, estabilidad de los reactivos, composición de la muestra, pH o temperatura) que puedan afectar a los resultados analíticos. Sensibilidad: Cambio en la respuesta de un instrumento dividido por el correspondiente cambio del estímulo (señal de entrada). El estímulo puede ser por ejemplo: la cantidad del mensurando presente. La sensibilidad puede depender del valor de estímulo. Aunque esta definición se aplica claramente al instrumento de medición, también puede aplicarse al método analítico en conjunto, tomando en cuenta otros factores como el efecto de los pasos para una concentración. Sesgo: Diferencia entre el resultado del ensayo esperado y un valor de referencia aceptado. SIM: Monitoreo de ion seleccionado. Substancia prohibida: Sustancias, metabolitos o grupos farmacológicos cuya utilización no ha sido autorizada para uso veterinario. Tolerancia: Reproducibilidad de los resultados analíticos obtenidos, por el análisis de la misma muestra bajo diferentes condiciones normales de operación como pueden ser: equipos y columnas. La robustez y la tolerancia son conceptos diferentes, ya que el primero se refiere a la influencia de factores internos del método, mientras que la tolerancia, se refiere a factores externos al método. Validación: Confirmación mediante examen y la provisión de evidencia objetiva de que se han satisfecho requisitos particulares para un uso pretendido y específico. Validación de un método: Proceso de establecer las características de desempeño, sus limitaciones y la identificación de las influencias que pueden modificar esas características y hasta qué punto. Veracidad: Grado de concordancia existente entre el valor medio obtenido de una gran serie de resultados y un valor de referencia aceptado. La veracidad se expresa normalmente como sesgo. Varianza: Es una medida de dispersión de los datos. Se obtiene con los promedios de los cuadrados de las desviaciones de los valores de la variable respecto a su media aritmética. 2.-MÉTODOS ANALÍTICOS OFICIALES Métodos analíticos aptos para determinar la presencia de residuos tóxicos y contaminantes en productos de origen animal, acuícola y pesquero. Para seleccionar el método el laboratorio debe considerar el Límite de Detección (LD) descrito en la tabla 1 de este módulo, tanto para compuestos que tengan Límite Máximo de Residuos (LMR), como para compuestos prohibidos y/o restringidos los cuales se clasifican en el ACUERDO por el que se modifica el diverso por el que se establece la clasificación y prescripción de los productos farmacéuticos veterinarios por el nivel de riesgo de sus ingredientes activos publicado en el DOF. Abril 2016 Página 5 Cuando resulte un compuesto detectado por métodos presuntivos deberá analizarse por metodología confirmatoria en el laboratorio oficial. TABLA 1 METODOS ANALITICOS OFICIALES FAMILIA 1.0 ESTILBENOS LIMITE DE DETECCION (LD) ≤1 µg/kg (ppb) COMPUESTOS DIETILETILBESTROL (DES) MATRICES METODOS / TECNICAS DE LABORATORIO PRESUNTIVO CUALITATIVO PRESUNTIVO CUANTITATIVO HÍGADO, MUSCULO, CRUSTÁCEOS Y PECES. BIOLÓGICOS BIOQUÍMICOS FISICOQUÍMICO S ___ CG-MS/MS CL-MS/MS MUSCULO Y ORINA BIOLÓGICOS BIOQUÍMICOS FISICOQUÍMICO S ___ CG-MS/MS CL-MS/MS HÍGADO MUSCULO, ORINA CRUSTÁCEOS PECES BIOLÓGICOS BIOQUÍMICOS FISICOQUÍMICO S CG CG-MS/MS CL-MS/M S BIOLÓGICOS BIOQUÍMICOS FISICOQUÍMICO S ___ CG-MS/MS CL-MS/MS BIOLÓGICOS BIOQUÍMICOS FISICOQUÍMICO S CLAR CG CG-MS/MS CL-MS/MS BIOLÓGICOS BIOQUÍMICOS FISICOQUÍMICO S CLAR CG-MS/MS CL-MS/MS BIOLÓGICOS BIOQUÍMICOS CG CONFIRMATORIO DIMETILTIURACILO METILTIOURACILO 2.0 ANTITIROIDEOS ≤20 µg/kg (ppb) FENILTIOURACILO PROPILTIOURACILO ACETATO DE MELENGESTROL ETINILESTRADIOL TRENBOLONA (17αTRENBOLONA) 3.0 ESTEROIDES ≤1 µg/kg (ppb) NORTESTOSTERONA (EPINANDROLONA BOLDENONA DEXAMETASONA ESTANOSOLOL (16βHIDROXOESTANOZOLOL) METILTESTOSTERONA 4.0 ACIDO LACTONAS RESORSILICAS HÍGADO ≤1 µg/kg (ppb) ZERANOL y METABOLITO TALERANOL MÚSCULO HÍGADO 5.0 βAGONISTAS ≤0.5 µg/kg (ppb) CLENBUTEROL BROMBUTEROL, CLORBROMBUTEROL MABUTEROL, HIDROXIMETILCLENBUTER OL Y SALBUTAMOL MÚSCULO RIÑÓN ORINA SUERO RETINA PELO LECHE HÍGADO 5.1 β- AGONISTAS ≤0.5 µg/kg (ppb) ZILPATEROL HCL RACTOPAMINA HCL MÚSCULO RIÑÓN ORINA 6.0 NITROFURANOS ≤1.0 µg/kg (ppb) FURALTADONA (AMOZ) MUSCULO FURAZOLIDONA (AOZ) HUEVO CL-MS/MS Abril 2016 Página 6 NITROFURANTOINA (AHD) MIEL NITROFURAZONA (SEM) CRUSTÁCEOS FISICOQUÍMICO S PECES LECHE LIMITE DE FAMILIA 7.0 ANFENICOLES 7.1 ANFENICOLES DETECCION (LD) ≤0.3 µg/kg (ppb) 50% ≤ LMR METODOS / TECNICAS DE LABORATORIO PRESUNTIVO CUALITATIVO PRESUNTIVO CUANTITATIV O COMPUESTOS MATRICES CONFIRMATORIO CLORANFENICOL MUSCULO HUEVO MIEL LECHE CRUSTACEOS PECES BIOLOGICOS BIOQUÍMICOS FISICOQUIMICOS CG CG-MS/MS CL-MS/MS FLORFENICOL TIANFENICOL MUSCULO HUEVO MIEL LECHE CRUSTACEOS PECES BIOLOGICOS BIOQUÍMICOS FISICOQUIMICOS CLAR CG CG-MS/MS CL-MS/MS CLAR-DAD HÍGADO PENICILINA DICLOXCILINA MÚSCULO AMPICILINA 8.0β-LACTÁMICOS 50% ≤ LMR OXACILINA RIÑÓN CLOXACILINA BIOLOGICOS BIOQUÍMICOS FISICOQUIMICOS CLAR CL-MS/MS CG-MS/MS PECES CRUSTACEOS LECHE CLAR-DAD HÍGADO MÚSCULO CL-MS/MS RIÑÓN 9.0 AMINOGLUCOSIDOS 50% ≤ LMR ESTREPTOMICINA DIHIDROESTREPTOMICINA NEOMICINA HUEVO MIEL BIOLOGICOS BIOQUÍMICOS FISICOQUIMICOS CG-MS/MS CLAR PECES CRUSTACEOS LECHE Abril 2016 Página 7 LIMITE DE FAMILIA 10.0 TETRACICLINAS 11.0 MACROLIDOS DETECCIO N (LD) 50% ≤ LMR 50% ≤ LMR METODOS / TECNICAS DE LABORATORIO PRESUNTIVO CUALITATIVO PRESUNTIVO CUANTITATIVO TETRACICLINA HIGADO MUSCULO RIÑON HUEVO MIEL PECES CRUSTACEOS LECHE BIOLOGICOS BIOQUÍMICOS FISICOQUIMICOS CLAR CLAR-DAD CG-MS/MS CL-MS/MS ERITROMICINA HIGADO MUSCULO RIÑON HUEVO MIEL PECES CRUSTACEOS LECHE BIOLOGICOS BIOQUÍMICOS FISICOQUIMICOS CLAR CLAR-DAD CG-MS/MS CL-MS/MS HIGADO MUSCULO CRUSTACEOS PECES BIOLOGICOS BIOQUÍMICOS FISICOQUIMICOS CLAR CLAR-DAD CG-MS/MS CL-MS/MS HIGADO MUSCULO RIÑON HUEVO PECES CRUSTACEOS LECHE BIOLOGICOS BIOQUÍMICOS FISICOQUIMICOS TLCDENSITOMETRI A CLAR CLAR-FLD CL-MS/MS BIOLOGICOS BIOQUÍMICOS FISICOQUIMICOS TLCDENSITOMETRI A CLAR CLAR-FLD CL-MS/MS COMPUESTOS MATRICES CONFIRMATORIO ENROFLOXACINA SARAFLOXACINA 12.0 QUINOLONAS 50% ≤ LMR CIPROFLOXACINA DIFLOXACINA DANAFLOXACINA SULFADIMETOXINA SULFAPIRIDINA SULFADIMETAZINA SULFATIAZOL 13.0 SULFONAMIDAS SULFADOXINA 50% ≤ LMR SULFAMERAZINA SULFACLORPIRIDAZINA SULFADIAZINA SULFISOXAZOL SULFAQUINOXALEINA SULDIMETOXINA SULFAPIRIDINA 13.1 SULFONAMIDAS ≤10 µg/kg SULDIMETAZINA SULFATIAZOL MIEL SULFADOXINA SULFAMERAZINA Abril 2016 Página 8 SULCLORPIRIDAZINA SULFADIAZINA SULFISOXAZOL SULFAQUINOXALEINA LIMITE DE FAMILIA DETECCIO N (LD) METODOS / TECNICAS DE LABORATORIO COMPUESTOS PRESUNTIVO CUALITATIVO PRESUNTIVO CUANTITATIVO BIOLOGICOS BIOQUÍMICOS FISICOQUIMIC OS CLAR CLAR- FLD CL-MS/MS HIGADO MUSCULO BIOLOGICOS BIOQUÍMICOS FISICOQUIMIC OS CG CLAR CLAR-DAD CL-MS/MS MUSCULO HUEVO MIEL LECHE CRUSTACEOS PECES BIOLOGICOS BIOQUÍMICOS FISICOQUIMIC OS CG CLAR CG-MS/MS CL-MS/MS MUSCULO CRUSTACEOS PECES BIOLOGICOS BIOQUÍMICOS FISICOQUIMIC OS CLAR MATRICES CONFIRMATORIO HÍGADO 14.0 ANTIHELMINTICO S MÚSCULO 50% ≤ LMR IVERMECTINA H2B1a RIÑÓN LECHE ALBENDAZOL BENOMILO FENBENDAZOL 15.0 BENCIMIDAZOLE S CAMBENDAZOL 50% ≤ LMR OXFENDAZOL THANBENDAZOL 5 OH THIANBENDAZOL MEBENDAZOL 16.0 IMIDAZOLES 50% ≤ LMR LEVAMISOL DIMETRIDAZOL (2-hidroximetil-1-metil5-nitro-1H-imidazol) (HMNI) 17.0 NITROIMIDAZOLE S ≤3.0 µg/kg (ppb) METRONIDAZOL(HIDROXIMETRONID AZOlL) IPRONIDAZOL (HIDROXIIPRONIDAZOL) CL-MS/MS RONIDAZOL(2-hidroximetil-1-metil-5nitro-1H-imidazol) (HMNI) CLAR-DAD MONENSINA SALINOMICINA NICARBAZINA 18.0 ANTICOCCIDIAN OS 50% ≤ LMR 19.0 CARBAMATOS 50% ≤ LMR ALDICARB OXAMYIL METHOMIL HIGADO MUSCULO RIÑON MUSCULO MIEL BIOLOGICOS BIOQUÍMICOS FISICOQUIMIC OS CL-MS/MS CLAR CLAR CLAR - FLD Abril 2016 Página 9 CL-MS/MS BIOLOGICOS BIOQUÍMICOS FISICOQUIMIC OS FAMILIA LIMITE DE DETECCION (LD) PRESUNTIVO CUALITATIVO PRESUNTIVO CUANTITATIVO COMPUESTOS MATRICES FLUVALINATO CIPERMETRINA DELTAMETRINA PERMETRINA FENVALERATO MUSCULO HUEVO MIEL PECES LECHE BIOLOGICOS BIOQUÍMICOS FISICOQUIMICOS CG HIGADO MUSCULO LECHE BIOLOGICOS BIOQUÍMICOS FISICOQUIMICOS CLAR CONFIRMATORIO CG- ECD CLAR-DAD CG-MS/MS CL-MS/MS 20.0 PIRETROIDES 50% ≤ LMR 21.0 TRANQUILIZANTES 50% ≤ LMR 22.0 ANTIINFLAMATORIOS 50% ≤ LMR FLUNIXIN FENILBUTAZONA OXIFENBUTAZONA HIGADO MUSCULO PLASMA ORINA BIOLOGICOS BIOQUÍMICOS FISICOQUIMICOS CLAR CLAR-DAD CG-MS/MS CL-MS/MS 23.0 FORMAMIDINAS 50% ≤ LMR AMITRAZ MIEL BILOGICOS BIOQUIMICOS FISICOQUIMICOS CG CLAR-DAD CG-MS/MS CLMS/MS ALDRIN GRASA BHC Y METABOLITOS HUEVO DDT Y METABOLITOS MIEL DIELDRIN CRUSTACEOS ENDRIN LECHE HEPTACLORO PECES BILOGICOS BIOQUIMICOS FISICOQUIMICOS CG CG-MS/MS CLMS/MS GRASA BILOGICOS BIOQUIMICOS FISICOQUIMICOS CG CG-MS/MS 24.0 PLAGUICIDAS ORGANOCLORADOS 50% ≤ LMR CARAZOLOL AZAPERONA AZAPEROL CG-MS/MS CL-MS/MS HEPTACLORO EPOXIDO ENDOSULFAN Y METABOLITOS LINDANO METOXICLORO MIREX AROCLOR 1242 AROCLOR 1248 25.0 BIFENILOS POLICLORADOS 50% ≤ LMR AROCLOR 1254 AROCLOR 1260 AROCLOR 1016 Abril 2016 Página 10 AROCLOR 1221 AROCLOR 1232 FAMILIA 26.0 PLAGUICIDAS ORGANOFOSFORADOS LIMITE DE DETECCION (LD) 50% ≤ LMR COMPUESTOS MATRICES COUMAFOS HIGADO DICLORVOS MÚSCULO DIAZINON HUEVO CLORPYRIFOS Y METABOLITOS MIEL METYL CLORPIRIFOS CRUSTACEOS RONNEL Y METABOLITOS LECHE CLORFENVINFOS PECES PRESUNTIVO CUALITATIVO PRESUNTIVO CUANTITATIVO CONFIRMATORIO BILOGICOS BIOQUIMICOS FISICOQUIMICOS ETION MALATION TRITION DI-SYSTON FENTION FENITRITION PARATION Y METABOLITOS CG CG-MS/MS HIGADO RIÑÓN MÚSCULO 50% ≤ LMR ARSENICO MERCURIO CADMIO PLOMO HUEVO ICP-OES ICP-MS AA MIEL CRUSTACEOS 27.0 ELEMENTOS QUÍMICOS LECHE PECES 50% ≤ LMR COBRE MIEL M1 LECHE B1 MUSCULO B2 CRUSTACEOS AA ICP-OES ICP-MS AA AA 28.0 MICOTOXINAS 50% ≤ LMR BIOLOGICOS BIOQUIMICOS FISICOQUIMICOS CLAR-FLD CLAR-DAD CL-MS/MS CLAR Abril 2016 Página 11 G1 G2 29.0 COLORANTES ≤2.0 µg/kg (ppb) VERDE MALAQUITA CRUSTACEOS LEUCOVERDEMALAQUITA PECES CARBADOX MUSCULO OLAQUINDOX HIGADO BIOLOGICOS BIOQUIMICOS FISICOQUIMICOS CL-MS/MS CLAR 30.0 QUINOXALÍNICOS ≤10 µg/kg (ppb) BIOLOGICOS BIOQUIMICOS FISICOQUIMICOS CL-MS/MS CLAR Abreviaturas: AA Espectrometría de Absorción Atómica DAD Detección por red de diodos ECD Detector de captura de electrones CG Cromatografía de gases CLAR Cromatografía de líquidos de alta resolución CL-MS/MS Cromatografía de líquidos acoplado a espectrometría de masas CG-MS/MS Cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas ICP-OES Espectrometría de emisión atómica con plasma acoplado inductivamente ICP-MS Espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente UV Luz ultravioleta VIS Luz visible FL Fluorometría 3.-PARAMETROS DE FUNCIONAMIENTO Y OTROS REQUERIMIENTOS PARA LOS MÉTODOS ANALÍTICOS. Los métodos de análisis para residuos de medicamentos veterinarios y contaminantes en los productos de origen animal, acuícola y pesquero, deben detectar con fiabilidad la presencia de un analito de interés, determinar su concentración e identificar correctamente al analito. Los parámetros de funcionamiento principales de los métodos de análisis utilizados dependen de, si el método tiene como finalidad, detectar, cuantificar o confirmar la presencia de un residuo elegido como objetivo. 3.1 Métodos presuntivos Estos métodos de detección se definen como métodos utilizados para detectar la presencia de un residuo en el nivel de interés. Estos métodos tienen alta capacidad de procesamiento de grandes cantidades de muestras. Están especialmente diseñados para evitar resultados falsos negativos, pero no proporcionan una confirmación inequívoca de la identidad del residuo y se clasifican en biológicos, bioquímicos y fisicoquímicos. 3.2 Métodos confirmatorios Los métodos de confirmación proporcionan una confirmación inequívoca de la identidad del residuo y pueden también confirmar la cantidad presente. Los métodos de confirmación son los más definitivos y con frecuencia están fundamentados en combinaciones de técnicas de cromatografía y espectrometría de masas. Estos métodos, cuando se utilizan para confirmar la identidad de residuos, deberán proporcionar información estructural fiable. Los métodos o combinaciones de métodos que se consideran adecuados para la identificación y confirmación de residuos tóxicos o contaminantes se indican a continuación Abril 2016 Página 12 Cuadro 1.-Métodos de detección adecuados para el análisis de residuos para efectos de confirmación. Técnica de medición Criterio CL o CG acoplado a espectrometría de masas Si se controla un número suficiente de fragmentos iónicos CL-DAD Si el espectro ultravioleta es característico al compuesto de interés. CL– fluorescencia CL-UV/VIS (longitud de onda única) 2-D Cromatografía en capa fina – (espectrometría) Cromatografía de gases con detección por captura de electrones, Detector de nitrógeno y fósforo, Detector fotométrico de flama a Otros sistemas cromatográficos (en diferente) u otras técnicas. Sólo cuando se combina con dos o más técnicas de separación a Sólo cuando se combina con dos o más técnicas de separación a Sólo cuando se combina con dos o más técnicas de separación a Sólo cuando se combina con dos o más técnicas de separación a los que se apliquen fases estacionarias y/o móviles de selectividad Los métodos analíticos utilizados deberán cumplir con los valores normalizados especificados para la veracidad y la precisión enumerados en el cuadro 2, donde CVA se refiere al coeficiente de variación determinado por las porciones de ensayo de matriz en blanco fortificada antes de la extracción y CVL es la variabilidad del laboratorio en general que incluye una estimación del 10% para la variabilidad del procesamiento de la muestra. Cuadro 2.- Criterios funcionales a los que deberían ajustarse los métodos considerados adecuados para utilizarse como métodos de análisis cuantitativos para respaldar a los LMR para residuos de medicamentos veterinarios en los productos de origen animal, acuícola y pesquero. Concentración Coeficiente de variación (CV) Veracidad µg/kg Repetibilidad Repetibilidad Reproducibilidad Reproducibilidad Rango de (dentro del (entre dentro del (entre recobro laboratorio laboratorios, CVL) laboratorio laboratorios, CVL medio % CVA ) % CVA ) )% % % <1 1-10 10-100 100-1000 > 1000 35 30 20 15 10 36 32 22 18 14 53 45 32 23 16 54 46 34 25 19 50-120 60-120 70-120 70-110 70-110 4.-CRITERIOS DE FUNCIONAMIENTO POR METODOLOGÍA 4.1 ESPECTROMETRIA DE MASAS La separación se realizará mediante columnas que cumplan con las características de detección del compuesto de interés. Tiempo de retención mínimo aceptable debe ser el doble del tiempo de retención correspondiente al tiempo de retención del volumen vacío de la columna (tiempo muerto). Relación entre tiempo de retención cromatografica del analito y el del patrón interno, corresponderá al de la solución de calibración con un margen de tolerancia de 0,5% para CG y 2,5% para LC. Abril 2016 Página 13 La detección se llevara a cabo por: Barrido completo, SIM (control de iones específicos, técnicas MSMS como el control de la reacción seleccionada SRM. o Barrido completo: Obligatoria la presencia de todos los iones de diagnóstico medidos (ion molecular, aductos del ion molecular, iones fragmentados característicos y los iones isotópicos) con una intensidad relativa mayor al 10% en el espectro de referencia del patrón de calibración; mínimo de 4 iones. o SIM: cuando la determinación con técnicas de espectrometría de masas se lleva a cabo por fragmentografía, el ion molecular será preferiblemente uno de los iones seleccionados (ion molecular, iones fragmentados característicos y sus iones isotópicos) los iones de diagnóstico seleccionados no deberán proceder exclusivamente de la misma parte de la molécula, la relación señal ruido para cada ion de diagnóstico será ≥ 3:1. Por lo general, se requiere un mínimo de cuatro puntos de identificación para cumplir con los criterios funcionales aceptados para los métodos reglamentarios. Se considera que los métodos fundamentados en la espectrometría de masas de alta resolución dan una fiabilidad mayor por medio de mediciones de masa más precisas que la que puede obtenerse utilizando técnicas de espectrometría de masas de baja resolución. Se considera que se deberá asignar un punto de identificación a cada fragmento iónico estructuralmente importante detectado por medio de un método de espectrometría de masas de baja resolución. Cuando se utiliza un instrumento en serie de baja resolución, tal como un espectrómetro de masas de “triple cuadrupolo”, los fragmentos secundarios se detectan a partir de un fragmento primario aislado en la primera fase del espectrómetro. El hecho de que estos fragmentos estructuralmente importantes se produzcan a partir de la fragmentación de un fragmento principal (ión original o precursor) relacionado con la molécula proporciona un nivel de confianza mayor, y a cada ión secundario o derivado (ion producto) se le asigna un valor de 1.5 puntos de identificación. El conjunto de un ión precursor y de dos iones derivados proporciona los 4 puntos de identificación necesarios cuando se utilizan instrumentos de MS/MS de baja resolución en un método de confirmación. Los requisitos funcionales del método para los métodos de confirmación fundamentados en CG/MS y CL/MS de baja resolución. Cuadro 3.-Relación entre tipo de fracciones de masa y puntos de identificación obtenidos Técnica de MS Espectrometría de masas de baja resolución LR Ion precursor LR-MS Productos de transición LRMS HRMS Ion precursor HR MSn Productos de transición HR MSn Puntos de identificación obtenido por ion 1,0 1,0 1,5 2,0 2,0 2,5 Cuadro 4.- Ejemplos de número de puntos de identificación obtenidos de diversas técnicas y combinaciones de técnicas Técnica CG-MS (EI + CI) CG-MS-MS Numero de iones (N) 2EI + 2 CI 1 ion precursor y 2 de segunda generación Puntos de identificación (n) 4 4 Abril 2016 Página 14 CL-MS-MS CG-MS-MS CL-MS-MS CL-MS-MS-MS HRMS 1 ion precursor y 2 de segunda generación 2 iones precursores cada uno con 1 de segunda generación 2 iones precursores cada uno con 1 de segunda generación 1 ion precursor 1 segunda generación y 2 de tercera generación N 4 5 5 5 2n 4.1.1Interpretación de los datos del espectro de masas. Deben identificarse las intensidades relativas de los iones de diagnóstico de los pares de iones de precursor/producto comparando sus espectros o integrando las señales de cada traza de masa. Cuadro 5.-Tolerancias máximas permitidas de intensidades relativas de iones en diversas técnicas de espectrometría de masas Intensidad relativa(% del pico base) CG-MS(intensidad relativa) >50% 20% a 50% 10% a 20% ≤10 % ±10% ±15% ±20% ±50% CG-MS, CG-MS/MS CL-MS, CL-MS/MS (intensidad relativa) ±20% ±25% ±30% ±50% 4.2 CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS Si se dispone de material adecuado, se empleara un patrón interno el cual es afín al analito utilizado, con un tiempo de retención cercano a este. El analito deberá eluir en el tiempo de retención típico del patrón de calibración correspondiente. La relación entre el tiempo de retención del analito y el del patrón interno, es decir, el tiempo relativo de retención del analito, corresponderá a la del patrón de calibración en la matriz apropiada con un margen de ± 2.5 %. Detección UV/VIS por barrido completo, los márgenes de absorción en el espectro del analito presentaran las mismas longitudes de onda que los del patrón de calibración, dentro de un margen determinado por la resolución del sistema de detección. Para la detección de arreglo de diodos (DAD), suele ser de ± 2 nm. El espectro del analito por encima de los 220 nm, para aquellas partes de ambos espectros con una absorbancia relativa ≥ 10 % no deberán diferir visualmente del espectro del patrón de calibración. Este criterio se satisface, en primer lugar, cuando se presentan máximos iguales y en segundo lugar, cuando en ninguno de los puntos observados la diferencia entre ambos espectros es superior a 10 % de la absorbancia del patrón de calibración. Detección UV/VIS longitud de onda única, no es apropiada como método de confirmación, el máximo del pico más próximo en el cromatograma deberá estar separado del pico del analito designado por al menos una anchura del pico medida a la mitad de la altura máxima oscilara entre 90 y un 110 % de la anchura original, y los tiempos de retención serán idénticos, con una tolerancia del 5%. Abril 2016 Página 15 Detección fluorimétrica, se aplica a las moléculas que presentan fluorescencia natural y a las que presentan después de transformación o derivatización. La selección de las longitudes de onda de excitación y de emisión en combinación con las condiciones cromatográficas se harán de tal manera que se minimice la aparición de componentes de interferencia en extractos de muestra blanco. El máximo del pico más próximo en el cromatograma estará separado del pico del analito designado por al menos una anchura del pico, medida al 10% de la altura máxima del pico del analito 2D TLC combinada con UV/VIS por barrido completo; Los valores RF del analito deben coincidir con los valores de RF de los patrones con un margen de ±5%; el aspecto visual del aspecto del analito no se distinguirá del patrón; en manchas de un mismo color el centro de la mancha más cercana estará separada del centro de la mancha del analito por una distancia de al menos la mitad de la suma de los diámetros de ambas manchas. 4.3 CROMATOGRAFÍA DE GASES Si se dispone de material adecuado, se empleará un patrón interno. De preferencia, se trata de una sustancia afín, con un tiempo de retención cercano al del analito. El analito deberá eluir en el tiempo de retención típico del patrón de calibración correspondiente en las mismas condiciones La relación entre tiempo de retención del analito y del patrón interno es decir el tiempo relativo de retención del analito, corresponderá a la del patrón de calibración con un margen de ± 0,5%. El máximo del pico más próximo en el cromatograma estará separado del pico del analito designado por al menos una anchura del pico, medida al 10% de la altura máxima del pico del analito. Esta técnica no es apropiada como método de confirmación. 4.4 ABSORCIÓN ATÓMICA (AA) Los patrones de calibración se prepararan en una sola matriz lo más idéntica posible a la muestra que debe medirse. AA de flama: optimización de los parámetros experimentales: comprobarse la composición de gases y flujos, para evitar interferencias por la absorción de fondo; utilizar corrector de fuente de radiación continua. AA cámara de grafito: optimizar condiciones de pre-tratamiento y atomización (temperatura y tiempo); trabajar en condiciones isotérmicas de atomización; cuantificar mediante curva de calibración basada en la medición de soluciones patrón, acuosas. 4.5 ESPECTROMETRÍA DE EMISIÓN ATÓMICA CON PLASMA ACOPLADO INDUCTIVAMENTE (ICP-OES) Se debe digerir completamente la muestra para descomponer las matrices orgánicas. Calibrar el instrumento con al menos cuatro concentraciones de las soluciones de calibración Seleccionar las longitudes de onda adecuadas para las mediciones de los analitos o de la línea de emisión más sensible (sin interferencias). En cada corrida de muestras, el material de referencia, el fortificado y el material blanco, se trataran del mismo modo que las muestras de análisis. Al menos cada 15 muestras, comprobar posibles desviaciones con la introducción del patrón. Excluir las interferencias con la correcta elección de las masas analíticas, lo que incluye la confirmación de las relaciones isotópicas. Abril 2016 Página 16 4.5.1 ESPECTROMETRÍA DE EMISIÓN ATÓMICA CON PLASMA ACOPLADO INDUCTIVAMENTE (ICP-MS) En la Técnica de ICP-MS, corregir la desviación instrumental por una estandarización interna múltiple que cubre el mismo ámbito de masas que los elementos por determinar (m/z < 80). Debe descomponerse completamente la materia orgánica de las muestras antes de proceder a mediciones por ICP-MS. Las mayores interferencias proceden de combinaciones de iones moleculares de argón (gas plasma), hidrógeno, carbono, nitrógeno y oxígeno y la matriz de la muestra. Para evitar interferencias es preciso proceder a la digestión completa, las mediciones del fondo, la correcta elección de las masas analíticas que a veces se asocian con una menor abundancia y la disolución de los ácidos empleados para la disolución, por ejemplo el ácido nítrico. Para determinar los elementos deben excluirse las interferencias mediante la correcta elección de las masas analíticas específicas, lo que incluye la confirmación de las relaciones de isótopos. Se comprobará la respuesta instrumental para cada medición, teniendo en cuenta los factores por medio de patrones internos. 5.-VALIDACION DE MÉTODOS ANALÍTICOS La validación demostrará que el método analítico cumple con los criterios relativos a los parámetros de funcionamiento aplicables. Cuadro 6.- Parámetros de funcionamiento que deben cumplirse por método: Veracidad Linealidad / Selectivi Aplicab (Curvas recuperaci Límite Intervalo Preci dad/ Estabil ilidad de ón de lineal sión Especifi idad Robust calibración (compone cuantific cidad ez ) nte de la ación exactitud) + + + Sensibilidad Límite de detecció n Métod os cualitat ivos Métod os cuantit ativos P - C - - - - - - + + + P + + + + - + + + + C + + + + + + + + + P=Presuntivo C= Confirmatorio + Parámetros obligatorios. Abril 2016 Página 17 5.1 PARÁMETROS GENERALES DE FUNCIONAMIENTO Especificidad (selectividad) Linealidad (curvas de calibración) Intervalo lineal Sensibilidad (limites teóricos y prácticos de detección y cuantificación) Exactitud (veracidad o sesgo); recuperación Precisión (repetibilidad y reproducibilidad) Robustez Incertidumbre Estabilidad de los analitos en matriz y solución. 5.2VALIDACION DE METODOS ANALITICOS BIOLOGICOS ENSAYOS INMUNOENZIMATICOS (ELISA) LÍMITE DE DETECCIÓN Se refiere a la cantidad más pequeña del analito en una muestra, que puede ser detectada con un nivel de confianza determinado, pero no necesariamente cuantificada con un valor exacto. Es comúnmente expresado como concentración del analito. En algunos casos el límite de detección está referenciado en el inserto del kit, en caso de no tenerlo deberá ser establecido de acuerdo al tipo de prueba. PUNTO DE CORTE Es importante determinar el punto de corte; para su determinación se puede utilizar el método siguiente: 1. Seleccionar un lote de 20 muestras blanco, diferentes. 2. Analice cada una de las 20 muestras seleccionada grafique la concentración obtenida en cada muestra, asegurándose que no se presente respuesta al (los) analito(s) de interés. 3. Posteriormente fortificar las mismas 20 muestras blanco con el analito de interés en el caso de sustancias autorizadas a una concentración igual al 0,5 el LMR; no debe existir un porcentaje mayor de 5% de falsos negativos (mayor a 1 muestra), entre la respuesta más baja de las muestras blanco fortificadas y la respuesta más alta de las muestras blanco. 4. Si la concentración de fortificación está entre el 50 y 90% del LMR, se deben de probar al menos 40 muestras y no debe existir un porcentaje mayor del 5% de falsos negativos (mayor a 2 muestras). 5. Si la concentración de fortificación está entre el 90 y 100% del LMR, se deben de probar al menos 60 muestras y no debe existir un porcentaje mayor del 5% de falsos negativos (mayor a 3 muestras). 6. Para el caso de sustancias prohibidas o restringidas fortificar 20 muestras blanco con el analito de interés a una concentración tan bajo como sea posible, siempre y cuando no exista un porcentaje mayor del 5% de falsos negativos (mayor a 1 muestra). Esta concentración será considerada como el Límite de detección “LD”; y deberá ser menor o igual al LD descrito para cada compuesto en la TABLA 1 “Métodos Analíticos Oficiales” de este documento. 7. El punto de corte será la concentración más baja de las muestras fortificadas. Abril 2016 Página 18 ESPECIFICIDAD/SELECTIVIDAD En los métodos analíticos, es importante el poder de distinción entre el analito y sustancias afines (isómeros, metabolitos, productos de degradación, sustancias endógenas, constituyentes de la matriz, entre otros), para su determinación se deberá seguir el procedimiento siguiente: 1.- Seleccionar una gama de compuestos químicos o biológicos relacionados (metabolitos, derivados, especies, entre otros.) u otras sustancias que puedan encontrarse en las muestras con el analito de interés. 2.- Fortificar mínimo 20 muestras blanco con una gama de sustancias afines al analito de interés, en el caso de sustancias autorizadas a una concentración 10 veces mayor al LMR; para las sustancias prohibidas o restringidas a una concentración 10 veces mayor al LD (determinado con base al punto 6 de “Punto de corte”) 3.- Realizar el análisis y determine la concentración verificando posibles interferencias con el analito. Esto tomando como valor de referencia el punto de corte previamente determinado. En caso de existir interferencia con algún(os) analito(s) afín(es), se deberá dejar constancia escrita de este hallazgo en el informe de validación. REPETIBILIDAD 1.- A partir de muestras blanco, en el caso de sustancias autorizadas, fortificar 3 muestras por cada nivel de concentración (0, 1.0 y 1.5 veces el LMR.). El analista deberá realizar 3 réplicas de cada nivel en dos días diferentes. Para las substancias prohibidas, fortificar 3 muestras por cada nivel de concentración (0, 0.5 y 1 veces el límite de detección LD (determinado con base al punto 6 de “Punto de corte”). El analista deberá realizar 3 réplicas de cada nivel en dos días diferentes. 2.- Analizar las muestras de acuerdo al método establecido. 3.- Obtener los datos de concentración de cada muestra analizada. 4.- Referenciarlos con el punto de corte establecido. Criterios de aceptación A) Los resultados de las muestras fortificadas deberán ser mayor al punto de corte y las muestras blanco igual o menor al punto de corte. B) La precisión en condiciones de repetibilidad no deberá dar un resultado falso negativo mayor al 5% en relación al punto de corte (mayor a 1 muestra) del total de muestras analizadas en condiciones de repetibilidad. Abril 2016 Página 19 REPRODUCIBILIDAD Realizar el mismo procedimiento utilizado en la evaluación de la repetibilidad, considerando 2 analistas diferentes. Adicionalmente realizar la evaluación de los resultados obtenidos, utilizando un análisis de varianza (ANOVA). Cálculos para un análisis de varianza (ANOVA). Variabilidad Cálculos para un análisis de Anova Suma de cuadrados Grados de libertad Promedio de los cuadrados F calculada Entre grupos V1 = k-1 Dentro de los grupos V2 = k(n-1) Buscar en la tabla de distribución F de Fisher F= (v1, v2,) Donde v1 son los grados de libertad del numerador. v2 son los grados de libertad del denominador. = 0.05 Criterios de aceptación A) El valor de F calculada debe ser menor o igual que F crítica del valor de tablas. ROBUSTEZ La variabilidad inherente del método generalmente anula el efecto de pequeños cambios en las condiciones de operación y del medioambiente. El estudio de cada cambio es dejado a la experticia y discreción del laboratorio primario. Se deja a discreción el estudio del efecto de pequeños cambios en el medioambiente sobre el método de ensayo (Ej. Temperatura de incubación, tiempo de lectura, etc.). Se determinaran que variables inherentes al método pueden sufrir pequeños cambios (no mayores al 10% del valor central) y se determinaran una serie de combinaciones, la importancia de esos cambios pueden evaluarse utilizando el Método Youden (ver tabla 9). Esta serie de cambios deberán ser plasmados en el protocolo de validación. Para ello se analizarán 8 muestras blanco y 8 muestras fortificadas al nivel de interés.(LD) Se analizaran bajo las condiciones variantes previamente establecidas y se determinará su valor de concentración. Abril 2016 Página 20 Criterio de aceptación: El valor de las 8 muestras blanco deberá ser menor al punto de corte para considerar que no le afecta la combinación de factores establecidos. El valor de las 8 muestras fortificadas al nivel de interés LD, deberá ser mayor al punto de corte para considerar que no le afecta la combinación de factores establecidos. 1. Los factores seleccionados para la prueba de robustez no deben influir significativamente en los resultados de la medición. 2. La Desviación Estándar de las diferencias debe ser menor o igual a la desviación estándar de la reproducibilidad Srob ≤ Smet ESTABILIDAD Estabilidad del analito en matriz: 1. Para esta prueba, utilizar una cantidad suficiente de muestra blanco de la matriz a analizar (10 muestras) perfectamente homogenizada y fortificar a 3 diferentes niveles de concentración (0, 1 y 1.5 veces el LMR) Para las substancias prohibidas, fortificar 3 muestras por cada nivel de concentración (0, 0.5 y 1 veces el LD determinado con base al punto 6 de “Punto de corte”). 2. Alícuotas de esta muestra deben tomarse y analizarse de acuerdo al método de análisis en los tiempos y condiciones de almacenamiento establecidos en la siguiente tabla. Cuadro7. Condiciones de estabilidad sugeridas. Temperaturas de almacenamiento y tiempos de análisis -20ºC +/- 3°C 5ºC +/- 3°C (refrigeración) 22º C +/- 3°C (ambiente) (congelación) 10 alícuotas (para cada 10 alícuotas (para cada 10 alícuotas (para cada día) día) día) Nota: En caso de que el laboratorio no cuente con equipo para almacenar las muestras a las temperaturas indicadas, se deberá realizar la estabilidad a la condición de temperatura de trabajo del laboratorio. El periodo de estabilidad de la solución quedará justificado solo para la temperatura retada. Se sugiere analizar en los días 0, 15, 30, 45, 60 y 90 para las temperaturas de congelación, refrigeración y para temperatura ambiente únicamente al día cero. Calcular la concentración detectada a cada muestra. Tome como referencia el análisis inicial de la muestra de 22°C +/- 3°C como tiempo cero. Criterio de aceptación: El valor de los blancos fortificados en los niveles de interés durante los periodos y condiciones de la prueba deberá ser mayor al punto de corte y el valor de los blancos, menor al punto de corte. Abril 2016 Página 21 Estabilidad de la solución: 1.-Para esta prueba, preparar una solución del o los analitos a retar a 3 diferentes niveles de concentración (0, 1 y 1.5 veces el LMR.) Para las substancias prohibidas, preparar una solución del o los analitos a retar a 3 nivel de concentración (0, 0.5 y 1 veces el nivel de LD) 2.- Distribuya en alícuotas y almacene a las condiciones que desee evaluar. Analizarse de acuerdo al método de análisis en los tiempos y condiciones de almacenamiento establecidos en el cuadro 7 Calcular la concentración detectada a cada muestra. Tome como referencia el análisis inicial de la muestra de 22°C +/3°C como tiempo cero. Criterio de aceptación: El valor de los blancos fortificados en los niveles de interés durante los periodos y condiciones de la prueba deberá ser mayor al punto de corte y el valor de los blancos, menor al punto de corte. 5.3VALIDACION DE METODOS ANALITICOS QUIMICOS ESPECIFICIDAD Capacidad de distinguir entre el analito y sustancias afines (isómeros, metabolitos, productos de degradación, sustancias endógenas, constituyentes de la matriz). 1. Analizar un número apropiado de muestras blanco n ≥ 20 (de ser posible muestras de diferentes lotes) y verificar posibles interferencias. Después del análisis estudie si: Dicha presencia puede conducir a una falsa identificación. La identificación del analito se ve dificultada por la presencia de una o más interferencias. La cuantificación sufre una influencia apreciable. Examinar los efectos de las interferencias. Si la presencia de la interferencia aumenta o inhibe la detección o cuantificación de los analitos se requiere de optimizar más el método. Criterio de aceptación: La respuesta del método únicamente debe ser debida al analito de interés. CURVAS DE CALIBRACIÓN (LINEALIDAD) Cuando se utilizan curvas para la cuantificación es necesario: 1. Preparar 3 curvas de calibración, enriqueciendo muestras blanco para cada una de ellas al menos 5 niveles de concentración incluyendo el cero, de acuerdo al intervalo de trabajo indicado en el método de referencia teniendo en cuenta que las concentraciones deben incluir al nivel de interés. 2. Obtener la fórmula matemática de la curva, haciendo una regresión lineal del modo y=mx + b (o la que mejor se ajuste dependiendo del modelo matemático). Utilizando el método de mínimos cuadrados, obtener la bondad de ajuste de los datos a la curva y el coeficiente de correlación (r). 3. Describir los márgenes de aceptabilidad de los parámetros de la curva. Criterio de aceptación: 1. Para esta etapa el coeficiente de correlación (r) debe tener un valor igual o superior al que indica el documento de referencia del método a validar. 2. El intervalo de confianza para la pendiente no debe incluir el valor de cero. Abril 2016 Página 22 INTERVALO LINEAL Para cualquier método cuantitativo, es necesario determinar el intervalo de concentraciones de analito o los valores apropiados sobre los cuales el método debe ser aplicado. En el extremo inferior del intervalo de concentración los factores limitantes son los valores de los límites de detección y/o cuantificación. En el extremo superior del intervalo de concentración las limitaciones serán impuestas por diversos efectos en función de la respuesta del instrumento. Dentro del intervalo de trabajo debe existir un rango de respuesta lineal. Dentro de este intervalo lineal de respuesta habrá una relación lineal a la concentración del analito. La extensión de este intervalo puede establecerse durante la evaluación del intervalo de trabajo. Para Identificar el intervalo lineal 1.- Fortificar muestras blanco a las concentraciones correspondientes a la curva de calibración y agregar 3 concentraciones mayores al punto más alto de la curva de calibración en proporciones equidistantes. 2.- Graficar la señal contra la concentración y realizar una inspección visual de la línea formada. 3.- Obtener la fórmula matemática de la curva, haciendo una regresión lineal del modo: y = mx+b, o la que mejor se ajuste dependiendo del modelo matemático. Utilizando el método de mínimos cuadrados, obtener la bondad del ajuste de los datos a la curva (coeficiente de correlación r). Criterio de aceptación: Criterio 1. 1. Para esta etapa el coeficiente de correlación (r) debe tener un valor igual o superior al que indica el documento de referencia del método a validar. 2. El intervalo de confianza para la pendiente no debe incluir el valor de cero. Una pendiente de cero indica que no hay relación lineal entre “x” y “y”. Criterio 2. 1. Cuando no se cumpla el criterio del coeficiente de correlación, se tomará como intervalo lineal el valor del punto de corte de la pendiente o la concentración a la cual se obtiene la correlación requerida. SENSIBILIDAD:( LIMITE DE DETECCIÓN Y DE CUANTIFICACIÓN TEÓRICO BASADOS EN LOS BLANCOS) 1.2.3.4.5.- Realizar la extracción de al menos 7 muestras blanco. Procesar las muestras conforme al método analítico y leer en el equipo. Calcular la media aritmética y desviación estándar (s). Calcular el límite de detección teórico como X (promedio de la señal de los blancos) + 3s. Calcular el límite de cuantificación teórico como X (promedio de la señal de los blancos) + 10s. LÍMITE DE DETECCIÓN PRÁCTICO 1. Preparar una curva de calibración con muestras blanco fortificadas a las concentraciones indicadas en el método de referencia. 2. Preparar una disolución al 50% de la concentración más baja con la que se construye la curva de calibración (utilizando el estándar correspondiente al analito del método). 3. Si existe respuesta preparar diluciones hasta perder la señal en el equipo. 4. Realizar la conversión de la última señal detectada a concentración, extrapolando el valor de la señal en la ecuación de regresión de la curva de calibración. Abril 2016 Página 23 5. Preparar 7 disoluciones utilizando muestras blanco a la concentración última detectada por el equipo. 6. El límite de detección será la última concentración detectada por el equipo. Criterio de aceptación. Para la curva de calibración: 1. El coeficiente de correlación (r) no debe ser menor que el valor indicado el protocolo. 2. El intervalo de confianza para la pendiente no debe incluir el valor de cero. Una pendiente de cero indica que no hay relación lineal entre “x” y “y”. Para las muestras utilizadas en la evaluación del límite de detección: 1. El límite de detección del método corresponde al contenido más bajo que se puede detectar analíticamente con certeza estadística razonable aunque no necesariamente cuantificable. LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN PRÁCTICO 1.- Tomar como base una concentración cercana (superior) al límite de detección práctico y fortificar 7 muestras blanco. 2.- Analizar la muestra de acuerdo al método analítico, realizar la lectura en el equipo, cuantificar la concentración del analito y verificar que se encuentre en un nivel aceptable de recuperación y coeficiente de variación, si no fuera así, deberá incrementarse la concentración. 3.- El límite de cuantificación del método, corresponderá al valor promedio obtenido correspondiente a la concentración que se encuentre en un nivel aceptable de recuperación y coeficiente de variación del método. Criterio de aceptación. Para la curva de calibración: 1. El coeficiente de correlación (r) no debe ser menor que el valor indicado el protocolo. 2. El intervalo de confianza para la pendiente no debe incluir el valor de cero. Una pendiente de cero indica que no hay relación lineal entre “x” y “y”. Para las muestras utilizadas en la evaluación del límite de cuantificación: 1. El límite de cuantificación del método corresponde al contenido promedio que se puede cuantificar analíticamente con certeza estadística razonable y que se encuentren en un nivel aceptable de recuperación y dentro del coeficiente de variación del método. VERACIDAD Componente de la exactitud, la veracidad solo se puede establecer mediante material de referencia certificado (MRC); este se utilizará siempre que se pueda, el procedimiento detallado se describe en la Norma ISO 57254 (2); se presenta un ejemplo: 1.Analice 7 muestras idénticas del MRC siguiendo las instrucciones del método de ensayo. 2.Determine la concentración en cada una de las muestras. 3.Calcule la media, desviación estándar y coeficiente de variación para estas concentraciones. 4.Calcule la veracidad utilizando la siguiente fórmula Veracidad = |(x – XMRC)| / XMRC Donde: x = Concentración media detectada XMRC = Concentración certificada del material de referencia Criterio de aceptación. Abril 2016 Página 24 1. La veracidad obtenida debe estar dentro del intervalo de la incertidumbre declarada por el Material de Referencia Certificado. Cuando no se dispone de material de referencia certificado (MRC), se acepta una valoración de la veracidad de las mediciones mediante recuperación de adiciones de cantidades conocidas de uno o varios analitos a una matriz en blanco. Para calcular el % de la recuperación utilice la siguiente fórmula: % de recuperación = (xR * 100)/ Xref Donde: XR = Concentración media recuperada Xref = Concentración de referencia Criterio de aceptación. 1. El % de recobro debe estar dentro del intervalo de la veracidad y precisión de la cuadro 5. RECUPERACIÓN Cuando no se dispone de CRM, debe determinarse la recuperación mediante experimentos con matriz en blanco enriquecida, por ejemplo mediante el procedimiento siguiente: 1. Seleccione 21 muestras de un material en blanco y enriquezca cada 7 con concentraciones equivalentesa 0.5, 1.0 y 1.5veces el límite máximo de residuos para sustancias autorizadas; para sustancias prohibidas o restringidas con concentraciones equivalentes a 1.0, 1.5 y 2.0 veces el límite de cuantificación práctico obtenido. 2. Analice las muestras y calcule la concentración en cada muestra. 3. Mediante la siguiente ecuación, calcule la recuperación para cada muestra. 4. Calcule la recuperación media y el CV de los resultados a cada nivel. 5. Para calcular el % de la recuperación utilice la siguiente fórmula: % de recuperación = (xR * 100 ) / Xref Donde: XR = Concentración media recuperada Xref = Concentración de referencia Criterio de aceptación. 1.- % de recobro debe estar dentro del intervalo de la veracidad y precisión del cuadro 8. REPETIBILIDAD Para el análisis de la repetibilidad, el conjunto de matrices a utilizar deben ser idénticas y analizadas en las mismas condiciones de trabajo por un solo analista. 1. Trabaje una serie de 21 muestras de un material en blanco y enriquezca cada 7 con concentraciones equivalentes a 0.5, 1.0 y 1.5 veces el límite máximo de residuos para sustancias autorizadas; para sustancias prohibidas o restringidas con concentraciones equivalentes a 1.0, 1.5 y 2.0 veces el límite de cuantificación práctico obtenido. 2. Analice las muestras. 3. Calcule la concentración detectada en cada muestra. 4. Determine la concentración media, la desviación estándar y el coeficiente de variación (%) de las muestras enriquecidas. 5. Repita estos pasos al menos otras dos veces. 6. Calcule las concentraciones medias generales y los CV de las muestras enriquecidas. Abril 2016 Página 25 7. Para calcular el % de la recuperación utilice la siguiente fórmula: % de recuperación = (xR * 100 ) / Xref Donde: XR = Concentración media recuperada Xref = Concentración de referencia Criterio de aceptación. 1.- % de recobro debe estar dentro del intervalo de la veracidad y precisión del cuadro 8. REPRODUCIBILIDAD El análisis de la reproducibilidad deberá realizarse en el mismo laboratorio y en condiciones estipuladas, como por ejemplo diferentes analistas y en diferentes días. 1. Trabaje una serie de 21 muestras de un material en blanco y enriquezca cada 7 con concentraciones equivalentes a 0.5, 1.0 y 1.5 veces el límite máximo de residuos para sustancias autorizadas; para sustancias prohibidas o restringidas con concentraciones equivalentes a 1.0, 1.5 y 2.0 veces el límite de cuantificación práctico obtenido. 2. Repita estos pasos al menos otras dos veces con operadores diferentes 3. Nota: se pueden utilizar los resultados obtenidos de una de las series del analista en la prueba de repetibilidad. 4. Analice las muestras. 5. Calcule la concentración detectada en cada muestra. 6. Determine la concentración media, la desviación estándar y el coeficiente de variación de las muestras enriquecidas. 7. Para calcular el % de la recuperación utilice la siguiente fórmula: % de recuperación = (xR * 100 ) / Xref Donde: XR = Concentración media recuperada Xref = Concentración de referencia Criterio de aceptación. 1.- % de recobro debe estar dentro del intervalo de la veracidad y precisión siguiente: Cuadro 8. Abril 2016 Página 26 ESTABILIDAD DEL ANALITO EN MATRIZ Y SOLUCIÓN El objetivo de esta prueba es la validación de la estabilidad del analito en solución o de los constituyentes de la matriz en la muestra, así como del patrón en la solución. El control de las condiciones de almacenamiento debe formar parte del sistema habitual del laboratorio. Si no se conoce ese particular a continuación se da un ejemplo de cómo determinar la estabilidad: Estabilidad del analito en solución: 1.2.- Prepare nuevas soluciones stock del analito y dilúyalas para obtener la concentración seleccionada de trabajo. Vierta los volúmenes en recipientes apropiados (aproximadamente 40 muestras), etiquételos y almacénelos a las temperaturas de acuerdo al cuadro7 “Temperaturas de almacenamiento” Nota: En caso de que el laboratorio no cuente con equipo para almacenar las muestras a las temperaturas indicadas, se deberá realizar la estabilidad a la condición de temperatura de trabajo del laboratorio. El periodo de estabilidad de la solución quedará justificado solo para la temperatura retada. 3.- Mida el contenido del analito en la solución recién preparada. La respuesta, señal o concentración obtenida se tomará como tiempo cero. 4.- Definir en el protocolo de validación los periodos de tiempo de almacenamiento en los que se retará la estabilidad. El tiempo de almacenamiento puede ser de 1 a 4 semanas o más si es necesario, es decir hasta que se observen los primeros signos de degradación, durante la identificación y cuantificación. Debe registrarse el tiempo máximo y las condiciones óptimas de almacenamiento. 5.- En cada tiempo establecido, tomar una de las muestras almacenadas y medir el contenido del analito. Se debe calcular las diferencias absolutas de la respuesta, señal o concentración del analito en cada periodo de prueba y se comparará el valor obtenido en el tiempo cero. |Dtx|=|xi–Xt0 | |Dtx|= Diferencias Absolutas xi = Concentración al tiempo i Xt0 = Concentración al tiempo cero Criterio de aceptación. 1.- Las diferencias absolutas no deben ser mayor al valor de referencia establecido en el protocolo. Los valores de referencia puede ser el equivalente al % de recobro o cualquier otra referencia bibliográfica. Estabilidad del analito en matriz: 1. Utilice muestras reales siempre que sea posible. Cuando no disponga de ellas utilice matriz enriquecida con el analito. 2. Si dispone de muestras reales, determine la concentración mientras esté fresca; tome otras muestras después de 1, 2, 4 y 20 semanas y determine las concentraciones. El tejido debe almacenarse a las temperaturas de acuerdo al cuadro7. 3. Si no dispone de material real, tome material blanco y homogeneícelo; divida el material en 10muestras; enriquezca cada muestra con el analito preparado de preferencia en una solución acuosa, y analice una muestra inmediatamente; almacene las muestras en las condiciones de trabajo seleccionadas. Abril 2016 Página 27 4. En cada tiempo establecido, tomar una de las muestras almacenadas y medir el contenido del analito. Se debe calcular las diferencias absolutas de la respuesta, señal o concentración del analito en cada periodo de prueba y se comparará el valor obtenido en el tiempo cero. |Dtx|= |xi – Xt0 | |Dtx|= Diferencias Absolutas xi= Concentración al tiempo i Xt0= Concentración al tiempo cero Criterio de aceptación. 1.- Las diferencias absolutas no deben ser mayor al valor de referencia establecido en el protocolo. Los valores de referencia puede ser el equivalente al % de recobro o cualquier otra referencia bibliográfica. ROBUSTEZ El método de análisis debe probarse en diversas condiciones experimentales, diferentes especies, matrices o condiciones de muestreo. Los cambios introducidos deben ser importantes y la evaluación de esos cambios puede realizarse utilizando el enfoque de Youden El laboratorio utilizará la introducción deliberada de variaciones menores razonables y la observación de sus consecuencias. Deben realizarse estudios previos a la investigación seleccionando factores del pre-tratamiento, limpieza y análisis de la muestra que pueden influir en los resultados de la medición. Entre estos factores se encuentra el operador, la procedencia, la edad de los reactivos, disolventes, patrones y extractos de la muestra, velocidad de calentamiento, temperatura, pH, y muchos otros factores que puedan darse en el laboratorio. 1. Identifique posibles factores que puedan influir en los resultados 2. Varíe ligeramente cada factor 3. Realice una prueba de robustez según el método de Youden (pueden emplearse otros métodos), este método es un diseño factorial, fraccional. 4. Si se observa que un factor influye significativamente en los resultados de la medición, proceda a otros experimentos para determinar los límites de aceptabilidad de dicho factor. 5. Los factores que influyen significativamente en los resultados deben quedar claramente en el protocolo del método. La idea de base no es estudiar una alteración a la vez, sino introducir diversas variaciones simultáneamente. Por ejemplo, imaginemos que A, B, C. D, E, F, G son los valores nominales de siete factores distintos que podrían influir en los resultados si sus valores nominales se cambian ligeramente. Demos a sus valores alternativos las minúsculas correspondientes a, b, c, d, e, f, g. Esto nos da 2' o 128 combinaciones diferentes. Puede tomarse un subconjunto de ocho de dichas combinaciones, con una mezcla equilibrada de mayúsculas y de minúsculas. Debe procederse a ocho determinaciones, utilizando una combinación de los factores elegidos (A-G). En el cuadro se presentan los resultados de las determinaciones (S-Z). Abril 2016 Página 28 Tabla 9. Configuración del experimento para estudios de robustez (cambios menores) Combinación de determinaciones Valor del factor F 1 1 3 4 5 6 7 8 Aja A A A A a a a a B/b C/c D/d E/e F/f B C D E F B c D e f b C d E f b c d e F B C d e F B c d E f b C D e f b c D E F G/g G g g G g G G g Resultado observado S T U V W X Y Z Criterio de aceptación. 3. Los factores seleccionados para la prueba de robustez no deben influir significativamente en los resultados de la medición. 4. La Desviación Estándar de las diferencias debe ser menor o igual a la desviación estándar de la reproducibilidad Srob ≤ Smet ESTIMACIÓN DE LA INCERTIDUMBRE DE LA MEDICIÓN En algunos casos la naturaleza del método de ensayo puede excluir el cálculo riguroso, metrológicamente y estadísticamente válido, de la incertidumbre de la medición. En estos casos el laboratorio debe, por lo menos, tratar de identificar todos los componentes de la incertidumbre y hacer una estimación razonable. Una estimación razonable se debe basar en el conocimiento del desempeño del método y en el alcance de la medición. El grado con el que los factores contribuyen a la incertidumbre total de las mediciones, difiere considerablemente según los ensayos (y tipo de ensayos). El laboratorio debe tener en cuenta estos factores al desarrollar los métodos y los procedimientos de ensayo, en la formación y la calificación del personal, así como en la selección y la calibración de los equipos utilizados. De acuerdo a lo establecido en la NMX-EC17025-IMNC, ISO/IEC17025. Requisitos generales para la competencia de laboratorios de ensayo y calibración. 6.- TRANSFERENCIA DE METODOS ANALITICOS PRESUNTIVOS (ELISAS) Los métodos presuntivos validados en el laboratorio oficial (originador) son sujetos a ser transferidos a un segundo laboratorio (receptor). El laboratorio receptor puede desarrollar un protocolo de transferencia que contenga los siguientes elementos: Abril 2016 Página 29 El laboratorio receptor debe contar con el procedimiento del método presuntivo del laboratorio originador. El laboratorio receptor debe contar con un reporte de la validación del laboratorio originador. El laboratorio receptor debe contar con los equipos y condiciones operacionales criticas iguales o equivalentes en desempeño al laboratorio originador (ejemplo: lectores, cromatografos, medio ambiente, etc.) El laboratorio receptor debe contar con personal técnico con habilidades probadas para desarrollar la metodología. Capacitación del laboratorio receptor en las instalaciones del laboratorio originador en la metodología a transferir. El laboratorio receptor debe realizar únicamente los parámetros de repetibilidad, reproducibilidad y robustez. Análisis de muestras control positivas y negativas en diferentes ocasiones para demostrar la capacidad de realizar pruebas satisfactorias en base al procedimiento presuntivo validado. Al cumplirse los requisitos el laboratorio receptor podrá utilizar el método transferido bajo los mismos criterios establecidos durante la validación inicial por el laboratorio originador, los cuales incluyen nivel de interés, matrices de prueba, criterios de aceptación de corridas, puntos de cortes, entre otros. 7.- PRUEBA DE DESEMPEÑO El laboratorio oficial será el responsable de verificar de forma presencial el proceso analítico de los métodos presuntivos (ELISAS) transferidos, así como los métodos validados por el laboratorio, previo a su autorización. Adicionalmente el laboratorio aprobado debe participar en los ensayos de aptitud organizados por el laboratorio oficial, así como en el programa de ensayos de muestras por duplicado, que serán enviadas tanto al laboratorio oficial como a los laboratorios aprobados. 8.-SISTEMA DE GESTIÓN DE LA CALIDAD Un sistema de gestión de calidad basado en la norma NMX-EC-17025-IMNC-ISO/IEC 17025, es un componente esencial de los laboratorios que realizan el análisis de residuos. A través del sistema de gestión de la calidad se realiza la supervisión de los factores relacionados con el procesamiento de muestras realizado por el laboratorio para asegurar la confiabilidad de los resultados. El uso de un sistema acreditado de gestión de calidad es invaluable para respaldar la toma de decisiones de las autoridades encargadas del control de residuos, mejorando la fiabilidad de los resultados analíticos y proporcionando datos de calidad para los programas de control de residuos, a fin de demostrar la inocuidad de los alimentos para los consumidores, productores y autoridades competentes respecto a los residuos de medicamentos veterinarios en los productos de origen animal, acuícola y pesquero. Los factores que determinan la confiabilidad de los ensayos realizados por un laboratorio incluyen elementos provenientes de: a) b) c) d) e) f) g) los factores humanos. las instalaciones y condiciones ambientales. los métodos de ensayo y calibración, y de la validación de los métodos. los equipos. la trazabilidad de las mediciones. muestreo la manipulación del elemento de ensayo. Abril 2016 Página 30 9.-REFERENCIAS (1) (2) NMX-EC-17025-IMNC / ISO/IEC 17025 .Requisitos generales para la competencia de laboratorios de ensayo y calibración. ISO 5725:1994 Exactitud (veracidad y precisión) de los métodos de medición y resultados. Part1principios generales y definiciones. Parte 2 Métodos básicos para la determinación de la repetibilidad y reproducibilidad de los métodos de medición. Parte 4: Métodos básicos para la determinación de la veracidad de un método de medición. (3) WJ Youden; Steiner EH; Manual Estadístico de la AOAC, Asociación Oficial de Químicos AnalíticosAOAC-1 DC,Washington1975,p.35ff. (4) ISO11843:1997capacidaddedeteccion.Part1 Términos y definiciones, Parte 2Metodologíade la calibración lineal. (5) CAC/GL 71-2009. Directrices para el diseño y la implementación de programas nacionales reglamentarios de aseguramiento de inocuidad alimentaria relacionados con el uso de medicamentos veterinarios en los animales destinados a la producción de alimentos. (6) UK NRL Guidelines for screening test validation (7) DECISIÓN DE LA COMISIÓN (2002/657/CE) ►C1 de 14 de agosto de 2002 ◄ Por la que se aplica la Directiva 96/23/CE del Consejo en cuanto al funcionamiento de los métodos analíticos y la interpretación de los resultados. (8) Guía para la implementación de la decisión 2002/657/EC. (9) Community Reference Laboratories Residues (CRLS) 20/1/2010.Guidelines for the validation of screening methods for residues of veterinary medicines (initial validation and transfer). Abril 2016 Página 31
