Práctico Diagnóstico de Toxoplasmosis por técnicas inmunológicas

Departamento de Inmunobiología
Facultad de Medicina
Universidad de la República
UTI "Biología Tisular" 2009
Práctico
Diagnóstico de Toxoplasmosis
por técnicas inmunológicas
Distribución de los grupos:
La actividad práctica se realizará en la semana del lunes 11/05 al jueves 14/05 en un horario
diferente al del curso teórico, viniendo los del primer turno de mañana, los de segundo turno
luego del mediodía y los del tercer turno a partir de las 16:30, en las siguiente forma, de
acuerdo a los subgrupos:
Horario
9-12
13-16
16:30-19:30
Lunes 11
A1y2
B1y2
C1
Martes 12
A3y4
B3y4
C2
Miércoles 13
A5y6
B5y6
C3
Jueves 14
A7y8
B7y8
C4
TOXOPLASMOSIS
La toxoplasmosis es una zoonosis ampliamente distribuida en el mundo, que
afecta a la mayoría de los animales de sangre caliente incluyendo al hombre,
siendo el gato y otros felinos los hospederos definitivos y completos por realizarse
únicamente en ellos la reproducción tanto sexual como asexual.
Se caracteriza por ser una infección común, cosmopolita y ubicua que solo en
raras ocasiones se manifiesta como una enfermedad clínica.
Es causada por Toxoplasma gondii, parásito intracelular obligado que presenta un
ciclo de vida complejo.
Ciclo de vida de T. gondii
Este parásito presenta varias formas evolutivas. Los taquizoitos, es decir, los
trofozoitos de T. gondii, los cuales se pueden encontrar en forma de
pseudoquistes o formas libres con división por endogenia; los bradizoitos, formas
presentes en el interior de los quistes con división más lenta; y los ooquistes,
forma de eliminación en gatos.
El hombre puede infectarse directamente al ingerir ooquistes de tierra
contaminada con heces de gato, indirectamente al ingerir carne mal cocida que
contenga bradizoitos o taquizoitos y congénitamente cuando una mujer
embarazada es infectada por primera vez. También existen otras vías de
transmisión como ser el caso de transplantes y donación de sangre.
Las lesiones causadas por la infección con T. gondii están asociadas con la
destrucción de células por el avance de los taquizoitos de célula en célula, dando
origen a focos necróticos, en los diferentes tejidos. En general la infección es
asintomática u oligosintomática, benigna y autorresolutiva en la mayoría de los
huéspedes definitivos e intermediarios inmunocompetentes. La enfermedad
puede llegar a ser fatal en individuos inmunodeprimidos (HIV, transplantes) y
provocar encefalitis, meningoencefalitis, procesos en masa del SNC, neumonitis y
miocarditis, entre otros padecimientos. Cuando ocurre en la mujer embarazada
existe el riesgo de transmisión al feto con diferentes consecuencias.
En estudios realizados en Estados Unidos, se demostró que la forma más común
de contagio a adultos se realiza principalmente por el consumo de carne mal
cocida. De todos modos, un estudio en Centro América demostró que más del 50%
de niños se encuentran infectados a la edad de 10 años por la ingestión de
ooquistes de suelos contaminados con heces de gato.
La prevalencia en nuestro país es de un 50 a 60 % de la población. Cabe destacar
que un tercio de la población mundial se encuentra infectada, teniendo algunos
países más del 80% de la población comprometida.
Toxoplasmosis congénita:
T. gondii cruza la placenta en madres que sufren una infección primaria durante el
embarazo, pudiendo causar una infección diseminada en el feto con
consecuencias más o menos graves dependiendo del periodo de gestación
(producción de abortos y partos prematuros, infecciones perinatales con
microcefalia-hidrocefalia, lesiones cerebrales, retardo mental o muerte fetal). Por
dicho motivo es rutina obstétrica realizar un estudio de toxoplasmosis en el
embarazo. Las mujeres infectadas antes de la concepción no suelen transmitir la
toxoplasmosis al feto. Cuanto más precoz ocurra la infección durante el embarazo,
mayor el riesgo de severidad de la afección fetal. El riesgo de infección
transplacentaria aumenta desde el 15% hasta el 30 y el 60% cuando la madre se
contagia durante el primero, el segundo o el tercer trimestre del embarazo,
respectivamente.
DIAGNÓSTICO DE LA TOXOPLASMOSIS
Los procedimientos más comúnmente utilizados para el diagnóstico de la
toxoplasmosis incluyen métodos directos, los cuales evidencian la presencia del
parásito en muestras de fluidos o tejidos, principalmente durante la fase aguda de la
infección. Estos son la PCR, los cultivos celulares, la inoculación en ratón, coloraciones
de frotis o cortes, así como también el xenodiagnóstico, utilizado en etapas
experimentales. Los métodos indirectos que evidencian la presencia del parásito
detectando la presencia de anticuerpos específicos contra el mismo, involucrando
pruebas serológicas.
PRUEBAS SEROLÓGICAS:
Dentro de las pruebas serológicas se incluyen: Sabin-Feldman,
Hemoaglutinación directa e indirecta, Aglutinación en látex, ensayo
inmunoenzimático (ELISA), fijación de complemento, inmunofluorescencia indirecta
(IFI) y radioinmunoensayo directo e indirecto.
Las diferentes técnicas serológicas difieren en el tipo de antígeno que emplean
(parásitos enteros, porciones solubles citoplasmáticas o de membrana, productos de
secreción-excreción),
y
presentan
diferente
sensibilidad,
especificidad,
reproducibilidad, valor predictivo y valor clínico (también diferente según el isotipo de
Ig considerado).
La reacción de Sabín-Feldman tiene alta sensibilidad y especificidad pero
requiere una infraestructura compleja. La IFI presenta igual sensibilidad y especificidad
que la anterior pero requiere equipo de microscopía adecuado y experiencia del
operador. Además permite diferenciar anticuerpos IgM e IgG. La hemoaglutinación
indirecta (HAI) es sensible y específica para laboratorios de rutina pero para
diagnóstico individual debe complementarse con otras técnicas, con títulos similares a
los de IFI en la población inmune.
ELISA y aglutinación en látex: ver más abajo.
En el curso de la infección por T. gondii…
Los títulos de IgM aparecen tempranamente después de la infección y decrecen
rápidamente por lo que se utiliza para la detección de la enfermedad en su estado
agudo.
En cambio, los títulos de IgG permanecen bajos durante las primeras semanas y
posteriormente se incrementan significativamente.
Para estudiar si una infección es reciente o es crónica se estudian:
- IgM versus IgG
- Avidez de IgG
En algunos individuos, el título de IgM se mantiene a lo largo de la infección y
de allí que se considere un mejor marcador de etapas aguda/crónica, al índice de
avidez de las IgG, (ver más abajo).
El diagnóstico de la enfermedad depende de si se trata de un paciente
inmunocompetente o inmunodeprimido. Para el primer caso, la toxoplasmosis
ganglionar implica características clínicas observables más una serología con un perfil
de agudo. Para el diagnóstico de toxoplasmosis ocular, implica un examen
oftalmológico, con una serología y PCR positivas junto con la presencia de IgA en
humor acuoso. Para el caso de inmunodeprimidos, se analiza la presencia de
toxoplasmosis cerebral, junto con imagenología y métodos directos de análisis en
sangre y líquido cefalorraquídeo.
Para el caso de diagnóstico de infección aguda en la gestante, implica el análisis
de seroconversión, presencia de IgM o IgA específica, junto con un aumento de IgG
específica de baja avidez. Para el diagnóstico de infección fetal, se analizan signos
ecográficos junto con análisis de líquido de amniocentesis en inoculaciones en ratones,
PCR y cultivo celular del mismo. Para el caso del diagnóstico de infección en el recién
nacido, se aplican métodos directos en sangre de placenta y cordón umbilical, junto
con la búsqueda de anticuerpos específicos IgM e IgA.
ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay)
El principio general de esta técnica se basa en la unión del antígeno a un
anticuerpo marcado con una enzima, interacción que ocurre dentro de la placa de
polivinilo. La transformación del sustrato por la enzima es proporcional a la
concentración de anticuerpo o antígeno desconocido presente en la solución
problema. De esta manera, los anticuerpos específicos pueden ser estimados
cuantitativamente y en poco tiempo.
Ag + Ac ↔ AgAc
Cuanto mayor sea la afinidad del Ac por el Ag, mayor sensibilidad tendrá el ensayo.
Tipos de ELISA:
ELISA directo: cuando los anticuerpos conjugados a la enzima son dirigidos
directamente contra el antígeno unido a la placa.
ELISA indirecto: cuando los anticuerpos conjugados son dirigidos contra
inmunoglobulinas humanas o de animales que sufren la enfermedad en cuestión.
ELISA sándwich (doble determinante): Cuando se utilizan dos anticuerpos específicos
que reconocen un mismo antígeno, uno de ellos marcado radiactivamente o unido a
una enzima. Este tipo de ensayo es particularmente útil para la captura de antígenos
circulantes (solubles).
Este ensayo se inicia con la adsorción de las proteínas (antígeno) a una superficie
inerte, generalmente una placa de polivinilo de 96 pocillos. Luego se agrega una
solución de una proteína no específica, generalmente leche descremada, gelatina o
seroalbúmina bovina, para bloquear la superficie evitando que otras proteínas se unan
a ella. En un tercer paso se añade el suero problema que contiene los anticuerpos que
reconocen al antígeno de manera específica (en el caso que la muestra sea positiva).
Seguido a ello se agrega un anticuerpo secundario que reconocerá al anticuerpo
primario unido al antígeno. Este anticuerpo secundario está conjugado a una enzima
que cataliza una reacción colorimétrica. Finalmente se añade el sustrato de la enzima y
se registra la densidad óptica.
Ventajas:
- Método altamente sensible y específico
- cuantitativo
- permite diferenciar IgM, IgG, y la medida del índice de avidez de los anticuerpos
- sencillo, rápido, automatizable
AGLUTINACION EN LATEX
El antígeno parasitario se halla adsorbido sobre partículas de látex, que se aglutinan en
presencia de anticuerpos específicos.
Ventajas:
1. Es un método sencillo, rápido y barato (no requiere instrumental)
2. Utiliza poca cantidad de muestra, sin tratamiento especial
3. Muy utilizado en medicina para el diagnóstico masivo
Limitaciones:
1. Sensibilidad media (comparado con ELISA)
2. Es un método semi-cuantitativo
3. Lectura puede ser subjetiva (importante la interpretación de resultados por la
misma persona)
Detección de IgG e IgM+IgG: reacciones de aglutinación con y sin 2-mercaptoetanol
En muchos casos es útil conocer si el paciente posee anticuerpos de tipo IgM o
IgG mediante una técnica de aglutinación porque eso puede facilitar el seguimiento del
paciente o determinar un tratamiento. Para ello, se ha desarrollado la técnica de
aglutinación en ausencia y en presencia de 2-ME. Cuando se realiza la titulación del
suero del paciente por aglutinación en ausencia de 2-ME y se informa un título, en
realidad se está informando una actividad aglutinante que es la suma de la actividad
aglutinante de la IgM y de la IgG. Si se realiza la técnica en presencia de 2mercaptoetanol, este produce una reducción suave / parcial de las IgM. Como la IgM
monomérica resultante no es aglutinante, el título que se obtiene al realizar la técnica
de aglutinación en presencia de 2-ME corresponderá exclusivamente a la actividad
aglutinante de la IgG. De este modo, la realización de la aglutinación en presencia y
ausencia de 2-ME permitirá determinar la presencia de IgG e IgM contra el Ag
sensibilizante. En el caso de toxoplasmosis es importante determinar la presencia de
IgM porque es indicio de infección activa. La caída en el título del suero por
aglutinación en ausencia vs. presencia de 2-ME es indicio de la presencia de IgM
específica para el parásito.
OBJETIVOS de la PRÁCTICA:
Primera aproximación a técnicas de uso rutinario en un laboratorio de inmunología:
ELISA y aglutinación sobre partículas de látex
Marco Teórico: Diagnóstico de la Toxoplasmosis
Discusión de la aplicación y comparación de las técnicas para el diagnóstico de
Toxoplasma gondii.
TÉCNICA DE ELISA:
1) Sensibilización: Sembrar 100 ul/pocillo de una solución de 5 ug/ml en PBS.
Incubar a Temperatura Ambiente (TA) toda la noche.
2) 2 lavados con PBS-Tween 0,1%
3) Bloqueo: Sembrar 200 ul de PBS – gelatina (1%) por pocillo, incubar durante 1
hora a 37 ºC
4) 3 lavados con PBS-Tween 0,1%
5) Incubación con los sueros: 8 diluciones seriadas al medio partiendo de una
dilución propuesta de los sueros problema 1, 2 y 3 en PTG (0.5% gelatina-PBS
+ 0.1% Tween) – ver diagrama de la placa. Sembrar 100 ul/ pocillo e incubar
45 min a 37 ºC.
6) 3 lavados con PBS-Tween 0,1%
7) Incubación con el suero policlonal anti-Ig de conejo producido en cabra y
conjugado a peroxidasa - dilución 1/1000 en PTG, sembrar 100 µL por pocillo
e incubar 45 min a 37 ºC
8) 5 lavados con PBS-Tween 0,1%
9) Revelado: Sembrar 100ul/pocillo de la solución de revelado, e incubar durante
30 min a TA en la oscuridad.
Solución de revelado: 3mg de ABTS (ácido 2'2-azino-bis-[3-etilbenzotiazol-6sulfónico) + 10ml de buffer citrato 0.1 M pH 5 + 8.3ul de H2O2 al 24%. Medir la
densidad óptica a 405 nm.
NOTA: los pasos 1 al 4 fueron realizados previo al práctico.
Suero
Suero
Suero
Pb 1
Pb 2
Pb3
Suero Suero
Pb 1
Pb2
Suero
Suero
Suero
Suero
Pb3
Pb1
Pb2
Pb3
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
BCO
Sin
diluir
Sin
diluir
Sin
diluir
BCO
Sin
diluir
Sin
diluir
Sin
diluir
BCO
Sin
diluir
Sin
diluir
Sin
diluir
B
s/Ag
1/2
1/2
1/2 s/Ag
1/2
1/2
1/2 s/Ag
1/2
1/2
1/2
C
1/2
1/2
1/2
1/2
1/2
1/2
1/2
1/2
1/2
D
1/2
1/2
1/2
1/2
1/2
1/2
1/2
1/2
1/2
1/2
1/2
1/2
1/2
1/2
1/2
1/2
1/2
1/2
F
1/2
1/2
1/2
1/2
1/2
1/2
1/2
1/2
1/2
G
1/2
1/2
1/2
1/2
1/2
1/2
1/2
1/2
1/2
1/2
1/2
1/2 s/
1/2
1/2
1/2 s/
1/2
1/2
1/2
E
H
s/
suero
suero
MESA 1
suero
MESA 2
MESA 3
Graficar DO vs. Dilución de anticuerpos (título)
TÉCNICA AGLUTINACIÓN EN LÁTEX:
Preparación de las partículas de látex: Unidad de Biotecnología, Polo Tecnológico de la
Facultad de Química. El antígeno de T. gondii fue adsorbido a las partículas de látex y
luego se saturó con seroalbúmina bovina
1. Sueros: se realizan 4 diluciones seriadas al medio en PBS partiendo de la muestra
provista por el docente. Las diluciones se hacen sobre la placa oscura. El volumen final
de cada dilución es de 50 μl. Se utiliza PBS como blanco.
2. Mezclar con 35 μl de látex en cada una de las diluciones, comenzando de la más
diluida a la más concentrada, incluyendo el blanco
3. Agitar durante 5 minutos
4. El título se define como el inverso de la última dilución en que se observa
aglutinación.
Llenar la siguiente tabla, especificando la ausencia o presencia de aglutinación para
cada suero y cada dilución, y determinar el título de anticuerpos anti-T. gondii para
cada caso.
Dilución de
partida
Dilución 1
Dilución 2
Dilución 3
Título
Suero
problema 1
Suero
problema 2
Suero
problema 3
Comparar la sensibilidad de las técnicas, teniendo en cuenta las diluciones de partida
de cada muestra.
Anexo
Técnicas inmunológicas aplicadas al diagnóstico de enfermedades
Método de Sabin-Feldman
Este método consiste en analizar la pérdida en la capacidad de tinción de los
taquizoitos libres con azul de metileno básico, en presencia de anticuerpos específicos
contra ellos y un factor accesorio, presente en el suero normal de todas las personas.
El título del suero está dado por la máxima dilución en la que permanecen sin
colorearse más del 50% de los toxoplasmas.
Inmunofluorescencia
Cuando se marca el propio anticuerpo o el anticuerpo antiinmunogloblulina
utilizado para detectarlo con un pigmento fluorescente, la técnica se conoce como
inmunofluorescencia. El pigmento fluorescente puede unirse de forma covalente y
directa al anticuerpo específico pero en general, el anticuerpo unido se detecta
mediante una inmunoglobulina fluorescente. El primer caso se conoce como
Inmunofluorescencia directa mientras que el segundo, Inmunofluorescencia indirecta.
Los pigmentos escogidos en inmunofluorescencia se excitan mediante luz de
una longitud de onda y emiten en una longitud de onda distinta en el espectro visible.
Los pigmentos más comunes son la fluoresceína y el Texas Red.
Para el caso de diagnóstico de toxoplasmosis, las ventajas que presenta esta
técnica con respecto a Sabin-Feldman es su sencillez, no se requieren toxoplasmas
vivos, no se necesita factor accesorio y se pueden discriminar IgG de IgM.
Inmunohistoquímica
Un método alternativo a la inmunofluorescencia para detectar antígenos en
secciones de tejidos es la inmunohistoquímica, en la cual el anticuerpo específico se
conjuga químicamente con una enzima. Esta convierte el sustrato incoloro en un
producto coloreado in situ. El anticuerpo se une de forma estable a su antígeno, lo cual
permite la eliminación del anticuerpo no unido mediante lavados. La deposición
localizada del producto coloreado donde el anticuerpo se ha unido puede observarse
con un microscopio óptico.
Este método es un análogo del ELISA y generalmente utiliza las mismas enzimas
conjugadas. La diferencia principal se encuentra en la detección, ya que los productos
coloreados son insolubles y precipitan en el lugar donde se forman.
Western blot y Dot blot
Es una técnica inmunoenzimática que se utiliza para la detección de proteínas
de una muestra.
El método consta de distintas fases:
- separación mediante electroforesis en gel de poliacrilamida
- transferencia de las proteínas mediante aplicación de un campo eléctrico a una
membrana de nitrocelulosa
- saturación de todos los lugares de unión de proteínas de la membrana no ocupados
para evitar la unión no específica de anticuerpos
- adición de un anticuerpo primario contra las proteínas que se quieren detectar
- adición de un anticuerpo secundario conjugado con una enzima, que reconoce al
anticuerpo primario
- revelado
Hay otros métodos de transferir o aplicar proteínas sobre la membrana, aparte
del electroblotting. El más sencillo es aplicarlas directamente en forma de una
pequeña gota de una solución concentrada sobre la membrana. La absorción de la
gota provoca la adhesión de la proteína a la membrana, quedando en forma de una
mancha o 'dot' (es el caso del dot blot). El resto del procedimiento es el mismo que el
descrito para el western blot.
Citometría de flujo
La citometría de flujo es un método analítico que permite la medición rápida de
ciertas características físicas y químicas de células o partículas suspendidas en líquido
que producen una señal de forma individual al interferir con una fuente de luz. Una de
las características analíticas más importantes de los citómetros de flujo es su capacidad
de medir múltiples parámetros celulares, como el tamaño, forma y complejidad y, por
supuesto, cualquier componente celular o función que pueda ser marcada con un
fluorocromo. En este sentido, si previamente a su análisis se coloca a las células en
presencia de anticuerpos monoclonales marcados con moléculas fluorescentes, se
pueden evaluar que células poseen los antígenos complementarios a los anticuerpos
monoclonales usados.
Las aplicaciones más relevantes de la citometría de flujo en la práctica médica
se relacionan con la hematología e inmunología clínicas, midiendo parámetros como
número y clasificación de células sanguíneas. Esta técnica es empleada también en el
conteo de subpoblaciones de linfocitos en pacientes con el virus de la
inmunodeficiencia humana, así como la caracterización de leucemias agudas y
síndromes linfoproliferativos crónicos, entre otros padecimientos.