INFORME FINAL Laboratorio CULTIVOS CELULARES Línea celular Código: 32120173 Nombre: BBSSPA- hMSC-UC#8 Biorecurso Línea de Células Madre Mesenquimales Humanas (hMSC) derivadas de cordón umbilical. 37ºC, se añaden 3-4 ml de medio específico para hMSC hasta cubrirlos por completo. Durante la primera semana de cultivo, van apareciendo células adheridas de los explantes, que dejaremos expandir. Cuando el número de células es el adecuado, se eliminan los explantes y se procede a la tripsinización para homogeneizar el cultivo, continuando con la expansión y la caracterización de esta línea. El cultivo de las células obtenidas se ha ido congelando en crioviales utilizando el sistema Mr Frosty, en un ultracongelador de -80ºC. Tras 24 horas, los crioviales han sido almacenados en contenedores de nitrógeno en fase gaseosa a -196ºC. Origen del soporte celular utilizado para la derivación Ninguno. No es necesario. Datos de la muestra de origen Tejido de origen: Secciones de cordón umbilical humano, excedente de un parto, cedido al BBSSPA. Sexo: 46, XY. Anomalías genéticas: Sin anomalías genéticas y ni antecedentes de interés conocidos. Medio de cultivo utilizado Las células madre mesenquimales fueron derivadas en DMEM Advanced/10%FBS/LGlutamine/pen-strep-anfotB/plasmocín. Formato de entrega Edad: 0 (neonato). Biorecurso: Crioviales de hMSC congelados a -196ºC. Suspensión celular con un historial de pase máximo: Pase 10. Número de células congeladas: 1x10 células viables/vial. Lugar procedencia: Banco de Cordón Umbilical. Málaga. Viabilidad >95%. Datos sobre la generación La muestra de cordón umbilical es troceada en fragmentos de 1 cm de grosor y los fragmentos obtenidos se lavan durante 15 min con una solución de PBS y antibiótico. Con ayuda de material quirúrgico se diseccionan cada uno de los trozos para extraer las estructuras endoteliales (arterias y venas). Estas son seccionadas transversalmente y divididas en fragmentos de 2x2 mm. Los explantes son depositados en flask de cultivo T25 cell+ sin medio de cultivo para que se adhieran a la superficie. Tras 30-45 minutos a 6 Caracterización Morfológica Y Fenotípica De La Línea La línea celular en cultivo muestra células con un gran ratio núcleo/citoplasma, que crecen adheridas en monocapa, con morfología fibroblastoide. La caracterización morfológica: Se realizó a pase 2. La caracterización fenotípica: Se realizó a pase 2. Biobanco del Sistema Sanitario de Andalucía | NODO COORDINADOR Parque Tecnológico Ciencias de la Salud. Centro de investigación Biomédica Avda. del Conocimiento s/n · 18100 Armilla, Granada, España Tel.: 958 894 672 · Fax: 958 894 652 · [email protected] La velocidad de crecimiento del cultivo: Ha sido óptima, con un double-time de 4,6 días, haciendo subcultivo 1:3. Foto Cariotipo Foto Para la caracterización fenotípica se realizó una extensión celular sobre portaobjetos que fue teñida inmunohistoquímicamente por vimentina y citoqueratina. Caracterización microbiológica Vimentina: Positiva 100 %. - Kit: Venor GeM (Minerva Biolabs). PCR (Kit 16S rRNA Gene. Cat. Nº. MP-70114. Maxim Biocth, Inc.) Citoqueratina: Positiva 5 %. Foto Determinación de la presencia de micoplasma realizada con 2 Kits: - Kit: Sigma LookOut Mycoplasma PCR Detection kit. Testándose como: Doblemente Negativo. Marcadores por Citometría Análisis Citogenética Método Nº de pases Resultados Porce ntaje CD73 Citometría P7 + 99.4 CD90 Citometría P7 + 86.1 CD105 Citometría P7 + 87.8 CD14 Citometría P7 - 1.6 CD20 Citometría P7 - 1.6 CD34 Citometría P7 - 1.6 CD45 Citometría P7 - 1.6 La línea BBSSPA-hMSC-UC#8 tiene un cariotipo normal como se determina en análisis de citogenética convencional mediante bandeo G. Biobanco del Sistema Sanitario de Andalucía | NODO COORDINADOR Parque Tecnológico Ciencias de la Salud. Centro de investigación Biomédica Avda. del Conocimiento s/n · 18100 Armilla, Granada, España Tel.: 958 894 672 · Fax: 958 894 652 · [email protected] Plots de la citometría: Biobanco del Sistema Sanitario de Andalucía | NODO COORDINADOR Parque Tecnológico Ciencias de la Salud. Centro de investigación Biomédica Avda. del Conocimiento s/n · 18100 Armilla, Granada, España Tel.: 958 894 672 · Fax: 958 894 652 · [email protected] Capacidad de Diferenciación: Diferenciación condrogénica: Las células de la línea BBSSPA- hMSC-UC#8 se diferencian a condrocitos cuando se las cultiva con su correspondiente medio de diferenciación específico. Tinción con oil red. Huella Genética Tinción con azul alcián. Diferenciación osteogénica: Las células de la línea BBSSPA- hMSC-UC#8 se diferencian a osteocitos cuando se las cultiva con su correspondiente medio de diferenciación específico. El objetivo de esta técnica es el detectar y poder comprobar que las líneas celulares existentes se corresponden genotípicamente con los tejidos o cultivos celulares primarios de los que proceden. Realizamos PCR múltiple para la identificación mediante la amplificación de 5 regiones de microsatélites diferentes. Se trata de STRs (trinucleotidos y tetranuclaotidos) que varían en número de copias en función del individuo. Estos productos varían entre las 100-300 bp; concretamente se trata de 4 locis ligados al cromosoma X (GATA31E08, DXS6789, GATA175D03 y DXS7132) y un loci ligado al cromosoma Y (DYS390). Resultado: Coincidente. Almacenamiento Las células son suministradas criopreservadas en hielo seco. Cuando las reciba, es recomendable antes de ser utilizadas su almacenamiento en nitrógeno líquido. Tinción con alizarin red. Descongelación Diferenciación adipogénica: Las células de la línea BBSSPA- hMSC-UC#8 se diferencian a adipocitos cuando se las cultiva con su correspondiente medio de diferenciación específico. - Transferir a un baño a 37ºC, impidiendo que el agua penetre por el tapón o que el vial se hunda. - Rápidamente, esterilizar el vial con etanol al 70% y transferir a la cabina de flujo laminar. Añadir 10 ml de medio completo atemperado a un tubo de 15 ml. Justo antes de terminar Biobanco del Sistema Sanitario de Andalucía | NODO COORDINADOR Parque Tecnológico Ciencias de la Salud. Centro de investigación Biomédica Avda. del Conocimiento s/n · 18100 Armilla, Granada, España Tel.: 958 894 672 · Fax: 958 894 652 · [email protected] de descongelarse (se vea una pequeña bolita de hielo), suavemente, transferir el contenido del criovial al tubo de 15 ml conteniendo el medio de cultivo, y centrifugamos a 300 g durante 5 min. - Descartar el sobrenadante y resuspender el botón celular en medio de cultivo fresco atemperado, sembrando las células en el recipiente destinado para el cultivo. expuestas del laboratorio desinfectantes apropiados. con los - El personal de laboratorio debe tener entrenamiento específico en el manejo de agentes patógenos. - El acceso al laboratorio debe ser restringido cuando se esté realizando algún trabajo. - Se tomarán precauciones extremas con instrumentos punzocortantes contaminados. Siembra y Subcultivo - Recomendamos sembrar a una densidad de 2 1.000-2.000 células/cm . - Para su manipulación se utilizarán cabinas de trabajo de bioseguridad nivel 2. Conclusiones - El medio de cultivo debe ser reemplazado al siguiente día después de su siembra, y cada 3-4 días desde entonces. - Las células han de ser subcultivadas cuando estas hayan alcanzado un 90 % de confluencia de la superficie utilizada para su cultivo. La línea celular caracterizada presenta todas las características definidas por la “Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee” de la “International Society for Cellular Therapy (ISCT)”, para definirla como una línea de Células Madre Mesenquimales humana. PRECAUCIONES El uso de esta línea debe ser únicamente para investigación. No debe ser utilizada en análisis clínicos o veterinarios, trasplantes o procedimiento de diagnóstico in vitro. Normas de bioseguridad al utilizar esta línea celular El usuario de esta línea celular ha de trabajar con nivel de bioseguridad tipo 2 como mínimo. Este nivel incluye el seguimiento de los siguientes puntos. - Se requiere la utilización de guantes de plástico. - Los materiales contaminados se desecharán en recipientes especiales para residuos. - Los procedimientos de descontaminación incluirán lavarse las manos con jabón antibacteriano y lavar todas las superficies Biobanco del Sistema Sanitario de Andalucía | NODO COORDINADOR Parque Tecnológico Ciencias de la Salud. Centro de investigación Biomédica Avda. del Conocimiento s/n · 18100 Armilla, Granada, España Tel.: 958 894 672 · Fax: 958 894 652 · [email protected]