PCR multiplex alelo especifica - Blog de Química Biológica Patológica
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Química Biológica Patológica Fibrosis Cística Diagnóstico Molecular Tema:18 (3) Dra. Silvia Varas [email protected] • Estrategias: ∆F-508 - 57% G542X - 3.94% Mut.med. por PCR W1282X - 3.07% E.R N1303K - 1.75% Mut.med. por PCR 1717 1GA - 0.87% Mut.med.por PCR R553X - 0.43% E.R G551D - 0.43% E.R Estrategias de Laboratorio Molecular I PCR + Digestión con Enzima de Restricción PCR con primer modificados + Digestión con Enzima de Restricción PCR con primers alelo específicos (PCR alelo especifica): 1 Fragmento Multiplex alelo especifica (MAS): 2 o mas fragmentos Estrategias para caracterización de mutaciones en FC: 1- PCR-RFLP (amplification + endonuclease restriction) 2- Mutagénesis Dirigida (Mutation mediated for PCR + Amplification + endonuclease restriction) Detección ∆F508 Método Mutagénesis mediada por PCR Nomenclatura Hebras de ADN ! Cadena Codificante, Informativa, sens o cadena (+) Secuencia publicada en Gene Bank! 5’ 3’ 3’ 5’ Cadena Molde, no-codificante, no-informativa, antisentido (anti sens) o cadena (-) Human cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene, exon 10. ORIGIN 1 cactgtagct gtactacctt ccatctcctc aacctattcc aactatctga atcatgtgcc 61 cttctctgtg aacctctatc ataatacttg tcacactgta ttgtaattgt ctcttttact 121 ttcccttgta tcttttgtgc atagcagagt acctgaaaca ggaagtattt taaatatttt 181 gaatcaaatg agttaataga atctttacaa ataagaatat acacttctgc ttaggatgat 241 aattggaggc aagtgaatcc tgagcgtgat ttgataatga cctaataatg atgggtttta 301 tttccagact tcacttctaa tgatgattat gggagaactg gagccttcag agggtaaaat 361 taagcacagt ggaagaattt cattctgttc tcagttttcc tggattatgc ctggcaccat 421 taaagaaaat atcatctttg gtgtttccta tgatgaatat agatacagaa gcgtcatcaa 481 agcatgccaa ctagaagagg taagaaacta tgtgaaaact ttttgattat gcatatgaac 541 ccttcacact acccaaatta tatatttggc tccatattca atcggttagt ctacatatat 601 ttatgtttcc tctatgggta agctactgtg aatggatcaa ttaataaaac acatgaccta 661 tgctttaaga agcttgcaaa cacatgaaat aaatgcaatt tattttttaa ataatgggtt 721 catttgatca caataaatgc attttatgaa atggtgagaa ttttgttcac tcattagtga 781 gacaaacgtc tcaatggtta tttatatggc atgcatatag tgatatgtgg t Human cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene, exon 10. g ORIGIN 1 cactgtagct gtactacctt ccatctcctc aacctattcc aactatctga atcatgtgcc 61 cttctctgtg aacctctatc ataatacttg tcacactgta ttgtaattgt ctcttttact 121 ttcccttgta tcttttgtgc atagcagagt acctgaaaca ggaagtattt taaatatttt 181 gaatcaaatg agttaataga atctttacaa ataagaatat acacttctgc ttaggatgat 241 aattggaggc aagtgaatcc tgagcgtgat ttgataatga cctaataatg atgggtttta 301 tttccagact tcacttctaa tgatgattat gggagaactg gagccttcag agggtaaaat 361 taagcacagt ggaagaattt cattctgttc tcagttttcc tggattatgc ctggcaccat 421 taaagaaaat atcatctttg gtgtttccta tgatgaatat agatacagaa gcgtcatcaa 481 agcatgccaa ctagaagagg taagaaacta tgtgaaaact ttttgattat gcatatgaac 541 ccttcacact acccaaatta tatatttggc tccatattca atcggttagt ctacatatat 601 ttatgtttcc tctatgggta agctactgtg aatggatcaa ttaataaaac acatgaccta 661 tgctttaaga agcttgcaaa cacatgaaat aaatgcaatt tattttttaa ataatgggtt 721 catttgatca caataaatgc attttatgaa atggtgagaa ttttgttcac tcattagtga 781 gacaaacgtc tcaatggtta tttatatggc atgcatatag tgatatgtgg t Enzima restricción MboI: 5’- GATC -3’ 3’- CTAG -5’ Secuencia del exón 10 próxima al codón 508 Normal: 5' ACCATTAAAGAAAATATCATCTTTG ∆F508: 5' ACCATTAAAGAAAATATCAT TG Primer S: 5' ACCATTAAAGAAAATATGAT Primer AS: 5' TGCAAGCTTCTTAAAGCATA Productos de amplificación y corte con Mbo I Normal (262 pb) 17 pb ▼ 201pb ▼ 44 pb 5’ACCATTAAAGAAAATATGATCTT................. AATGGATC........... GCA 3' Mutado (259 pb) 215 pb ▼ 44 pb 5' ACCAATTAAAGAAAATATGATTG.................... AATGGATC............ GC 3' MboI (-) MboI (-) MboI (-) MboI (-) MboI (-) MboI (+) FAMILIA 1 FAMILIA 2 Familia 3 Alelo N Alelo M 201 pb 215 pb Gel 12% de productos de PCR digeridos con MboI M 100pb G542X Estrategias: ∆F-508 - 57% G542X - 3.94% W1282X - 3.07% Mut.med. por PCR E.R N1303K - 1.75% Mut.med. por PCR 1717 1GA - 0.87% Mut.med.por PCR R553X - 0.43% E.R G551D - 0.43% E.R Modelo de Informe: Análisis de Mutaciones en el gen CFTR Metodología: Amplificación por PCR a partir de ADN purificado de leucocitos. Mutagénesis dirigida mediada por PCR,Hibridización con sondas alelo especificas PACIENTE Inocente Gómez Culpable Gómez MUTACIONES ANALIZADAS ∆F-508 G542X W1282X -/-/-/-/-/-/- Interpretación de los Resultados: +/-: Heterocigota para la mutación -/-: No presenta la mutación +/+: Homocigota para la mutación N1303K -/-/+ PCR multiplex alelo especifica (MAS-PCR): es la amplificación en un único tubo de múltiples fragmentos de un determinado gen. Esta estrategia involucra la elección de los pares de primers que deberán dar lugar a fragmentos de diferente tamaño y que deberán ser fácilmente resueltos en una única línea de un gel. Los primers usados son alelo-específicos. Esta técnica se ha usado con éxito en el diagnostico de enfermedades como la distrofia muscular de Duchenne, Lesch-Nyhan, βtalasemia y screenning de 4 de las comunes mutaciones para fibrosis cística (∆F508, G542X, G551D y N1303K). Primers CF-W1468-N CF-508 RP ∆F 508 Secuencia 5’-GGC ACC ATT AAA GAA AAT ATC ATC TT -3’ 5’-TAG TGT GAA GGG TTC ATA TGC ATA AT-3’ 5’-GGC ACC ATT AAA GAA AAT ATC ATT GG-3’ Tipo F1– 139 pb R1 F2—136 pb 5’IVS-11 5’-CAA CTG TGG TTA AAG CAA TAG TGT-3’ G551D-N G551D-M 5’-GAA ATT CTT GCT CGT TGA C-3’ 5’-GAA ATT CTT GCT CGT TGA T-3’ R2--202 pb R3 G542X-N G542X-M 5’-GTG TGA TTC CAC CTT CTC C-3’ 5’-GTC TGA TTC CAC CTT CTC A-3’ R4--174 pb R5 5’IVS-21 N1303K-N N1303K-M 5’-AAG AAT GAT ACA AAG CAG ACA TG-3’ 5’-CAC TGT TCA TAG GGA TCC AAG-3’ 5’-CAC TGT TCA TAG GGA TCC AAC-3’ F4 R6—240 pb R7 F3 Constituyentes Master Mix Master 1 (Normal): F1 +R1 F3 + R2 F3 + R4 F4 + R6 Total: 7primers Master 2 (Mutadas): F2 + R1 →∆F508 F3 + R3 →G551D F3 + R5 →G543X F4 + R7 →N1303K Total: 7primers N M N 1 2 3 M 4 N 5 M 6 N 7 M 8 N M 9 10 Los tamaños de los productos de amplificación son: N1303K (240pb), G551D (202pb), G542X (174pb) y ∆F508 (136pb), WT (139). En los extremos Marquer de Peso Molecular (φX174 digerido con Hae III). En las líneas 2,4, 6, 8 y 10 se usan los primers con las secuencias normales. Líneas 1 y 2: Paciente 1 con primers N y M Líneas 3 y 4: Paciente 2 con primers N y M Líneas 5 y 6: Paciente 3 con primers N y M Líneas 7 y 8: Paciente 4 con primers N y M Líneas 9 y 10: Paciente 5 con primers N y M Basado en los datos brindados por esta publicación, realice el informe de las mutaciones analizadas de los pacientes 1 al 5. TP: ∆F508 y G542X Primers Secuencia Tipo CF-W1468-N 5’-GGC ACC ATT AAA GAA AAT ATC ATC TT -3’ F1 CF-508 RP 5’-TAG TGT GAA GGG TTC ATA TGC ATA AT-3’ R1 ∆F 508 5’-GGC ACC ATT AAA GAA AAT ATC ATT GG-3’ F2 5’IVS-11 5’-CAA CTG TGG TTA AAG CAA TAG TGT-3’ F3 G542X-N 5’-GTG TGA TTC CAC CTT CTC C-3’ R3 G542X-M 5’-GTC TGA TTC CAC CTT CTC A-3’ R4
