desarrollo morfológico de las estructuras - CICIMAR-IPN

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
CENTRO INTERDISCIPLINARIO DE CIENCIAS MARINAS
“DESARROLLO MORFOLÓGICO DE LAS
ESTRUCTURAS INVOLUCRADAS EN LA
PRIMERA ALIMENTACIÓN EXÓGENA Y
EVALUACIÓN DE LA EFICIENCIA
ALIMENTICIA DE LAS LARVAS DEL
HUACHINANGO DEL PACÍFICO
LUTJANUS PERU (NICHOLS & MURPHY,
1922).”
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
DOCTORADO EN CIENCIAS MARINAS
PRESENTA
OSCAR IRAM ZAVALA LEAL
LA PAZ, B.C.S., JUNIO DE 2011.
SIP-1" BIS
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
SECRETARIA DE INVESTIGACiÓN Y POSGRADO
ACTA DE REVISIÓN DE TESIS
En la Ciudad de
Mayo
del
La Paz, 8.C.S.,
siendo las
12:00
horas del dia
20
del mes de
2011 se reunieron los miembros de la Comisión Revisora de Tesis designada
por el Colegio de Profesores de Estudios de Posgrado e Investigación de
_ CCI
:;:I.:;"M
'"A"R' -_ _ __
para examinar la tesis titulada:
"DESARROLLO MORFOLOGICO DELAS ESTRUCTURAS INVOLUCRADAS EN LA PRIMERA
ALIMENTACiÓN EXOGENA y EVALUACiÓN DE LA EFICIENCIA ALIMENTICIA DE LAS LARVAS
DEL HUACHINANGO DEL PAciFICO Luljanus peru (Nichol. & Morphy, 19221"
Presentada por el alumno:
Aspirante de:
DOCTORADO EN CIENCIAS MARINAS
Después de interca mbiar opiniones los miembros de la Comisión manifestaron APROBAR LA
DEFENSA DE LA TESIS , en virtud de que satisface lOS requisitos señalados por las disposiciones
reglamentarias vigentes.
LA COMISION REVISORA
Directores de Tesis
AS
DR.
RENA~
Di rector a de Tesis
OIrect r de Tesis
DR. DAVID ALfARO SlQUEIROS aELTRONES
DRA. LAURA SÁNCHEZ VElASCO
VER LÓPEZ VlllEGAS
0.""
~c.UTlVo
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PRESIDENTE DEL COLEGIO DE PRO
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DR. RAFAEL CERVAN
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UARTE
IPN
CICIMAR
DIRECCION
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
SECRETARíA DE INVESTIGACiÓN Y POS GRADO
CARTA CESiÓN DE DERECHOS
el dla 01
En la Ciudad de La Paz, e.c.s.,
el (la) que suscribe
Programa de
del mes
Junio
del año
2011
aJumno(a) del
M e. OSCAR 'RAM ZAVALA LEAL
--
DOCTORADO EN CIE NCIAS MAR INAS
con número de registro
-­
6071224
adscrito al
CENTRO INTERDISCIPttNARIO DE CIENCIAS MARIN AS
manifiesta que es autor (a) intelectual del presente trabajo de tesis, bajo la dirección de:
OR A. Sl l VIE DUMAS
V
DR. REN ATO PE ~A M A RTfNe""Z~_ _
y cede los derechos del trabajo titulado:
"DESARROllO MORFOLÓGICO DE LAS ESTRUCTURAS INV OLU CRADAS EN LA PRIMERA ALIMENTACiÓN
- ---"'=
EXóGENA y EVALUACIÓN DE LA eFICIENCIA ALIMENTI CIA DE LAS LARVAS DEL HUACHINANGO DEl PAc iFI CO
Lutjonus peru (Nichols & MO!]lhy, 1922)"
al Instituto Po litécnico Naciona l, para su difusión con fines académicos y de investigacIón
Los usuarios de la informac ión no deben reprod ucIr el contenido textual, grsficas o datos del trabaío
sin el permiso expreso del autor y/o director del trabajo .
sigu iente di rección :
t:ste, puede ser obtenido escri biendo a la
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Si el permiso se otorga , el usuario
mismo _
deber¡~
- blackla rvae@ hotmail.co
dar el agradecimiento correspo ndIente y citar la fuente del
~'"''' t.VALALEAL RECONOCIMIENTO
El presente trabajo fue desarrollado gracias al apoyo otorgado al proyecto SEPCONACYT: “Cultivo del huachinango Lutjanus peru: inducción al desove y
condiciones ambientales en la primera alimentación de las larvas”.
DEDICATORIA
El presente trabajo lo dedico de manera general a toda mi familia, que de una
manera u otra siempre me han apoyado y alentado para seguir luchando y
haciendo lo que he querido en mi vida.
A la memoria de dos seres muy queridos que me brindaron siempre una
amistad incondicional y jamás me mostraron una cara triste, por lo contrario
siempre tratando de animar a los demás sin importar su estado de ánimo, a mis
tíos: Emilio y Armando Zavala López
A mis padres, hermanos y sobrinos que desde siempre han estado conmigo,
que tantos consejos me dan y me alientan; siendo parte fundamental de mi
forma de ser y pensar, por quienes puedo hacer lo que hago y hago todo lo que
puedo. “ASNF”
AGRADECIMIENTOS
- Al instituto Politécnico Nacional y al Centro Interdisciplinario de Ciencias
Marinas por su invaluable formación tanto profesional como personal.
- Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) y al Programa de
Formación de Investigadores (PIFI) del Instituto Politécnico Nacional, por las
becas otorgadas para el apoyo de mis estudios de postgrado.
- Al comité revisor de mi tesis: Dra. Silvie Dumas; Dr. Renato Peña; Dra. Laura
Sánchez; Dr. David Siqueiros; Dr. Oliver López, por sus acertados comentarios
y revisiones.
- Al personal que labora o laboró a mi paso por la Unidad Piloto de Maricultivos
del CICIMAR, formando un excelente grupo de trabajo: Dra. Silvie Dumas, M.
en C. Dora Esther Hernández, M. en C. Mauricio Contreras, Dr. Renato Peña,
Biol. Laura Flores, Dr. Juan Pablo Alcántar, M. en C. Elín Pérez, M. en C. Ivette
Moguel por su apoyo durante el desarrollo de este trabajo, pero sobre todo por
su invaluable y entrañable amistad.
- Al personal de apoyo técnico del CICIMAR: Martín Cuevas (El Conejo), Ciro
Arista (El Carebu), Manuel Zamarrón (El Borrego) y Efraín Flores (El Ministro)
quienes son parte fundamental para el trabajo en campo, siendo nuestras
manos derechas.
- A todos mis amigos y amigas que de alguna manera contribuyeron en el
desarrollo de este trabajo, los cuales no los enlisto por que me llevaría mucho
tiempo.
- Finalmente quiero agradecer a mis compañeros del fútbol, cuya actividad fue
parte primordial para eliminar el estrés, durante el curso del programa.
¡¡¡De antemano mil gracias a todos!!!
ÍNDICE GENERAL
RESUMEN ---------------------------------------------------------------------------------------
iv
ABSTRACT -------------------------------------------------------------------------------------
v
RELACIÓN DE FIGURAS --------------------------------------------------------------------
vii
RELACIÓN DE TABLAS ---------------------------------------------------------------------
ix
GLOSARIO --------------------------------------------------------------------------------------
x
I. INTRODUCCIÓN ------------------------------------------------------------------------------
1
II. ANTECEDENTES ----------------------------------------------------------------------------
3
2.1 Desarrollo de los sistemas involucrados en la alimentación exógena ----------
3
2.1.1 Órganos sensoriales ---------------------------------------------------------------------
4
2.1.2 Aparato bucal ------------------------------------------------------------------------------
5
2.1.3 Sistema digestivo y órganos accesorios --------------------------------------------
6
2.2 Factores que afectan la alimentación en larvas -------------------------------------
7
2.3 Estudios sobre el huachinango del Pacifico ------------------------------------------
11
III. JUSTIFICACIÓN ----------------------------------------------------------------------------
12
IV. OBJETIVOS ----------------------------------------------------------------------------------
12
V. HIPÓTESIS -----------------------------------------------------------------------------------
13
VI. MATERIALES Y MÉTODOS ------------------------------------------------------------
14
6.1 Inducción al desove -----------------------------------------------------------------------
14
6.2 Desarrollo de órganos y sistemas involucrados en la alimentación ------------
14
6.2.1 Órganos sensoriales y sistema digestivo ------------------------------------------
14
6.2.2 Aparato bucal -----------------------------------------------------------------------------
16
6.3 Eficiencia en la alimentación exógena ------------------------------------------------
17
i
6.3.1 Temperatura de incubación -----------------------------------------------------------
18
6.3.2 Efecto de la intensidad de luz, tipo de presa y color del tanque --------------
19
6.3.3 Talla de la presa y densidad ----------------------------------------------------------
19
6.3.4 Temperatura del agua y salinidad ---------------------------------------------------
19
6.4.5 Concentración de microalga y densidad de presa --------------------------------
19
VII. RESULTADOS ----------------------------------------------------------------------------
21
7.1 Aspectos generales -----------------------------------------------------------------------
21
7.2 Desarrollo de órganos y sistemas involucrados en la alimentación -------------
25
7.2.1 Desarrollo de órganos sensoriales --------------------------------------------------
25
7.2.1.1 Retina ------------------------------------------------------------------------------------
25
7.2.1.2 Neuromastos ---------------------------------------------------------------------------
32
7.2.1.3 Oído interno -----------------------------------------------------------------------------
34
7.2.1.4 Órgano olfativo -------------------------------------------------------------------------
36
7.2.2 Desarrollo del aparato bucal ----------------------------------------------------------
37
7.2.3 Sistema digestivo ------------------------------------------------------------------------
40
7.3 Eficiencia en la alimentación exógena -------------------------------------------------
51
7.3.1 Temperatura de incubación ------------------------------------------------------------
51
7.3.2 Efecto de la intensidad de luz, tipo de presa y color del tanque --------------
52
7.3.3 Talla de la presa y densidad ----------------------------------------------------------
53
7.3.4 Temperatura del agua y salinidad ---------------------------------------------------
54
7.3.5 Concentración de microalga y densidad de presa -------------------------------
55
VIII. DISCUSIÓN ---------------------------------------------------------------------------------
56
8.1 Aspectos generales del desarrollo -----------------------------------------------------
56
ii
8.2 Desarrollo estructural ---------------------------------------------------------------------
57
8.2.1 Eclosión ------------------------------------------------------------------------------------
58
8.2.2 Periodo de alimentación endógena -------------------------------------------------
60
8.2.3 Primera alimentación exógena -------------------------------------------------------
63
8.3 Eficiencia en la alimentación exógena ------------------------------------------------
66
IX. SUMARIO Y CONCLUSIONES ---------------------------------------------------------
69
9.1 Eclosión ---------------------------------------------------------------------------------------
69
9.2 Periodo de alimentación endógena ----------------------------------------------------
69
9.3 Primera alimentación exógena ----------------------------------------------------------
70
X. RECOMENDACIONES --------------------------------------------------------------------
72
XI. LITERATURA CITADA -------------------------------------------------------------------
73
XII. ANEXO I -------------------------------------------------------------------------------------
89
iii
RESUMEN
El huachinango del Pacífico Lutjanus peru es considerado de gran
importancia comercial, y durante los últimos años se ha intentado someter a
cultivo. Pese a su importancia es una especie de la cual se conoce poco sobre
su desarrollo. Este trabajo tiene como objetivo describir el desarrollo
morfológico de las estructuras necesarias para iniciar la alimentación exógena
de las larvas del huachinango del Pacífico Lutjanus peru durante el desarrollo
inicial, así como evaluar la eficiencia alimenticia durante los primeros días de la
alimentación exógena bajo condiciones de cultivo. Las larvas fueron obtenidas
tras la inducción al desove de reproductores silvestres. Los huevos fueron
incubados en tolvas cónicas de 100L de capacidad a 25-26.5ºC. En la primera
parte de este trabajo se describe el desarrollo de los órganos sensoriales,
aparato bucal y sistema digestivo. Para ello se tomaron muestras de las larvas
al momento de la eclosión y a las 6, 12, 18, 24, 36, 48, 70 (primera
alimentación) y 93 horas después de la eclosión (hde). Se muestrearon
alrededor de 50 larvas para realizar histología convencional (hematoxilinaeosina), 50 para microscopia electrónica de barrido (MEB) y 50 para
microscopia electrónica de transmisión (MET). Para la descripción del aparato
bucal se utilizó el método propuesto por Potthoff (1984) modificado para larvas.
Se observó que las larvas eclosionan con una talla de 2.45 mm (Longitud Total)
y un grado de desarrollo incipiente, la boca aún está cerrada. No hay pigmento
en los ojos, las estructuras sensoriales que presentan son neuromastos libres y
el oído medio. Seis horas después de la eclosión se observan las lamelas de
las placas olfativas. Al momento de la primera alimentación presentan una talla
de 3.72±0.19 mm y un ancho de boca de 0.22±0.02 mm. Están presentes
estructuras como el cartílago de Meckels, cuadrado, hioideo, hiomandibular e
interhial. El ojo está diferenciado y funcional. Presenta conos sencillos como
únicas células fotorreceptoras. El tubo digestivo presenta una regionalización:
cavidad buco-faríngea, esófago e intestinos anterior y posterior. Ambos
intestinos presentan un epitelio columnar, pliegues en la mucosa y
microvellosidades en la zona apical. Los enterocitos presentan características
ultraestructurales de células diferenciadas. Las glándulas accesorias ya se han
diferenciado. El páncreas esta conectado al intestino anterior mediante el
conducto de Wirsung. Estan diferenciados los islotes de Langerhans y se
encuentran rodeados por células pancreáticas exocrinas que sintetizan
gránulos de zimógeno denotando funcionalidad. En el hígado se observan
algunos sinusoides y canículos biliares. Los hepatocitos presentan en posición
supranuclear, inclusiones aparentemente de reserva como glucógeno y
lipoproteínas. En la segunda parte se desarrollaron 5 experimentos en los
cuales se evaluaron la incidencia alimenticia (porcentaje de larvas con alimento
en el tracto digestivo) e intensidad alimenticia (número de presas por larva) al
momento de la primera alimentación. Estos experimentos se realizaron en
acuarios cuadrados de 10-L de capacidad. Se probaron, Exp. 1) la temperatura
de incubación (26, 28 y 30ºC), Exp. 2) la intensidad de luz (2000, 2500 y 3000
lux), tipo de presa (nauplios de copépodos y mezcla entre nauplios de
copépodos y neonatos de rotíferos 1:1) y color del tanque (blanco y negro),
Exp. 3) talla de la presa (46±8μm; estadio I-III y 72±12μm; estadio IV-VI) y
densidad (5, 10 y 15 nauplios ml-1), Exp. 4) temperatura del agua (25 y 28ºC) y
salinidad (25, 30 y 35 ups), Exp. 5) la concentración de microalgas (0, 3x105 y
iv
1x106 células ml-1) y densidad de presa (10 y 15 nauplios ml-1). De manera
general, en todos los experimentos realizados no se observaron diferencias
significativas en la intensidad alimenticia para ningún factor (p>0.05). No se
encontraron diferencias significativas para la incidencia alimenticia (p>0.05), en
los Exp. 1 y 5. En el Exp. 2 se presentaron diferencias significativas (p<0.05)
para el tipo de presa y la intensidad de luz. Se presentó también una
interacción significativa (p<0.05). A 3000 lux no hubo diferencias significativas
entre el tipo de presa mientras que, a 2000 y 2500 lux, fue significativamente
mayor (p<0.05) con los nauplios de copépodos. Sin embargo, es importante
mencionar que con 3000 lux no hubo consumo de rotíferos en el tratamiento de
dieta mixta. En el Exp. 3, la incidencia alimenticia fue mayor con nauplios en
estadio I-III a densidades de 10 y 15 nauplios ml-1. En el Exp. 4, la temperatura
del agua fue el único factor que mostró diferencias significativas (p<0.05)
alcanzando una mayor incidencia alimenticia las larvas alimentadas a 25 ºC.
Finalmente se concluye que las larvas de Lutjanus peru pueden recibir
alimentación viva desde las 70 hde (día 3), cuando la boca está abierta y
articulada. El tubo digestivo diferenciado en esófago, intestino anterior y
posterior. Y el ojo pigmentado. Dado que la mayor incidencia alimenticia se
presentó con nauplios de copépodos en estadio I-III, con 3000 lux a 25º C, se
recomienda el uso de estas condiciones en el cultivo larval del huachinango.
ABSTRACT
Pacific red snapper Lutjanus peru is considered a species of great commercial
importance, which in recent years has been tried to bring into cultivation.
Despite its importance is a species which at present little is known about its
development. This work to describe the morphological development of the
necessary structures to initiate exogenous feeding larvae of the Pacific red
snapper during the initial development and to evaluate feed efficiency during the
first days of exogenous feeding under culture conditions. The larvae were
obtained after the induction of spawning of wild broodstock. The eggs were
incubated in a conical tank with 100L capacity at 25-26.5 ° C. In the first part of
this work we describe the development of the sense organs, mouthparts and
digestive system. To describe the development of these structures was
collected larvae at hatching and at 6, 12, 18, 24, 36, 48, 70 (first feeding) and
93 hours after hatching (hah). We sampled about 50 larvae for conventional
histology (hematoxylin-eosin), 50 for electron microscopy (SEM) and 50 for
transmission electron microscopy (TEM). To describe the mouthparts
development we employed, the method proposed by Potthoff (1984) modified
for larvae. The larvae hatch with a size of 2.45 mm (total length) and few
structural developments, it mouth still closed. There is no pigment in the eyes,
showing sensory structures are free neuromasts and inner ear. A few hours
after hatching were observed lamellae of the olfactory plates. At the time of first
feeding they have a size of 3.72 ± 0.19 mm and a width of mouth 0.22 ± 0.02
mm. Structures such as Meckels cartilage, square, hyoid, interhial and
hyomandibular are present. The eye is differentiated and functional. It features
v
simple and unique cone photoreceptor cells. The gastrointestinal tract presents
a regionalization: oro-pharyngeal cavity, esophagus, foregut and hindgut. Both
intestines have a columnar epithelium and folds in the mucosa with apical
microvilli. The ultrastructural characteristics of enterocytes were similar at
differentiated cells. The accessory glands have been differentiated. The
pancreas is connected to the foregut through the pancreatic duct. Islets of
Langerhans are differentiated and surrounded by exocrine pancreatic cells that
synthesize zymogen granules denoting functionality. In the liver sinusoids and
there are some bile canaliculli. The hepatocytes presented in supranuclear
position, inclusions appear as glycogen reserve and lipoproteins. In the second
part of this work, we realized 5 experiments in which we evaluated the feeding
incidence (percentage of larvae with food in the digestive tract) and feeding
intensity (number of prey per larva) at first feeding. These experiments were
conducted in aquaria (10-L capacity). Were tested, Exp 1) the incubation
temperature (26, 28 and 30 º C), Exp 2) light intensity (2000, 2500 and 3000
lux), type of prey (nauplii of copepods and a mix of copepod nauplii and rotifer
neonates 1:1) and tank color (white and black), Exp 3) size of prey (46 ± 8μm,
stage I-III and 72 ± 12μm, stage IV-VI) and density (5, 10 and 15 nauplii ml-1),
Exp 4) water temperature (25 and 28 º C) and salinity (25, 30 and 35 gL-1), Exp
5) the microalgae concentration (0, 3x105 and 1x106 cells ml-1) and prey density
(10 and 15 nauplii ml-1). Generally in all the experiments, no significant
differences were observed in the feeding intensity for any factor (p> 0.05). No
significant differences were found for feeding incidence (p> 0.05), in Exp 1 and
5. In Exp 2 significant differences were observed (p <0.05) for prey type and
light intensity. Also showed a significant interaction (p <0.05). At 3000 lux, there
was no significant difference between the type of prey while 2000 and 2500 lux,
was significantly higher (p <0.05) with copepod nauplii. However, it is important
to mention that with 3000 lux, there was no consumption of rotifers in the
treatment of mixed diet. In Exp 3, the feeding incidence was higher with nauplii
stage I-III at densities of 10 and 15 nauplii ml-1. In Exp 4, the water temperature
was the only factor that showed significant differences (p <0.05) reaching a
higher incidence feed the larvae fed at 25 °C. Finally we conclude that the
larvae of Lutjanus peru can receive live feed from the 70 hde (day 3), when the
mouth is open and articulate. The digestive tract is differentiated in the
esophagus, foregut and hindgut. The eye is pigmented. Since higher feeding
incidence was presented with copepod nauplii stage I-III, at light intensity of
3000 lux and water temperature of 25 ºC, we recommend using these
conditions in the larval rearing of the Pacific red snapper.
vi
RELACION DE FIGURAS
Figura 1.- Larvas de huachinango del Pacífico Lutjanus peru al momento de la
eclosión -------------------------------------------------------------------------------------------22
Figura 2.- Morfología externa de larvas de huachinango del Pacífico Lutjanus
peru ------------------------------------------------------------------------------------------------24
Figura 3.- Musculatura de lavas del huachinango del Pacífico Lutjanus peru a
las 70 hde ----------------------------------------------------------------------------------------24
Figura 4.- Ojo al momento de la eclosión en larvas del huachinango del Pacífico
Lutjanus peru ------------------------------------------------------------------------------------25
Figura 5.- Retina en larvas del huachinango del Pacífico Lutjanus peru entre las
18 y 36 horas después de la eclosión --------------------------------------------------------------27
Figura 6.- Retina en larvas del huachinango del Pacífico Lutjanus peru entre las
48 y 70 horas después de la eclosión ----------------------------------------------------29
Figura 7.- Retina de larvas del huachinango del Pacífico Lutjanus peru a las 93
horas después de la eclosión ---------------------------------------------------------------30
Figura 8.- Ultraestructura de los conos en la retina del huachinango del Pacífico
Lutjanus peru a las 93 horas después de la eclosión --------------------------------31
Figura 9.- Neuromastos libres en larvas del huachinango del Pacífico Lutjanus
peru al momento de la eclosión ------------------------------------------------------------32
Figura 10.- Neuromastos libres en larvas del huachinango del Pacífico Lutjanus
peru a las 18 horas después de la eclosión ---------------------------------------------33
Figura 11.- Oído interno en larvas del huachinango del Pacífico Lutjanus peru al
momento de la eclosión ----------------------------------------------------------------------34
Figura 12.- Oído interno en larvas del huachinango del Pacífico Lutjanus peru a
las 24 horas después de la eclosión ------------------------------------------------------35
Figura 13.- Órgano olfativo en larvas del huachinango del Pacífico Lutjanus
peru hasta el momento de la primera alimentación ----------------------------------36
Figura 14.- Ilustración del desarrollo de estructuras que componen el aparato
bucal en larvas del huachinango del Pacífico Lutjanus peru ----------------------38
Figura 15.- Estructura del cartílago en larvas del huachinango del Pacífico
Lutjanus peru al momento de la primera alimentación -------------------------------39
Figura 16.- Larvas del huachinango del Pacifico Lutjanus peru al momento de la
eclosión ---------------------------------------------------------------------------------------41
vii
Figura 17.- Ultraestructura de la región media del tracto digestivo de larvas del
huachinango del Pacífico Lutjanus peru al momento de la eclosión -------------41
Figura 18.- Estructura del hígado en larvas del huachinango del Pacífico
Lutjanus peru a las 18 horas después de la eclosión -------------------------------42
Figura 19.- Morfología de larvas del huachinango del Pacífico Lutjanus peru a
las 48 horas después de la eclosión ------------------------------------------------------44
Figura 20.- Ultraestructura del intestino en larvas del huachinango del Pacífico
Lutjanus peru a 48 horas después de la eclosión -------------------------------------46
Figura 21.- Estructura del páncreas e hígado en larvas del huachinango del
Pacífico Lutjanus peru a las 48 horas después de la eclosión --------------------47
Figura 22.- Tubo digestivo en larvas del huachinango del Pacífico Lutjanus peru
después de la primera alimentación ------------------------------------------------------49
Figura 23.- Eficiencia alimenticia en larvas del huachinango del Pacífico
Lutjanus peru incubadas a diferentes temperaturas ----------------------------------51
Figura 24.- Eficiencia alimenticia en larvas del huachinango del Pacífico
Lutjanus peru alimentadas bajo diferentes condiciones de luz y tipo de presa ---------------------------------------------------------------------------------------------------------52
Figura 25.- Eficiencia alimenticia en larvas del huachinango del Pacífico
Lutjanus peru alimentadas con nauplios de copépodos de diferentes estadios y
densidad ------------------------------------------------------------------------------------------53
Figura 26.- Eficiencia alimenticia en larvas del huachinango del Pacífico
Lutjanus peru alimentadas a diferentes temperaturas y salinidades -------------54
Figura 27.- Eficiencia alimenticia en larvas del huachinango del Pacífico
Lutjanus peru alimentadas a diferentes concentraciones de microalga y
densidades de presa --------------------------------------------------------------------------55
viii
RELACIÓN DE TABLAS
Tabla 1. Técnica de transparentación y tinción para larvas de peces marinos-16
Tabla 2. Longitud total de las larvas del huachinango del Pacífico Lutjanus peru
a cada tiempo de muestreo -----------------------------------------------------------------21
ix
GLOSARIO
Bastones: Células fotorreceptoras. Son las responsables de la percepción de
la intensidad de la luz (Leeson et al., 1990).
Conos: Células fotoreceptoras, codifican para diferentes longitudes de onda,
son las responsables de la percepción del color (Leeson et al.,
1990).
Eclosión: Proceso en el cual se rompe el corion que cubre el huevo y emerge
el eleuteroembrión o larva vitelina (Balon, 1975).
Enterocitos: Término que reciben las células epiteliales de la mucosa que
reviste a ambos intestinos del tubo digestivo debido a su función de
absorción de nutrientes (Stroband & Dabrowski, 1979).
Eficiencia alimenticia: Término que se emplea para evaluar la alimentación,
implica la determinación de la incidencia e intensidad alimenticia
(Yin & Blaxter, 1987).
Glóbulo de aceite: Lisosomas modificados que adquieren forma esférica y que
se forman al fusionarse las vesículas de vitelo, muchas especies
presenta uno o más glóbulo en o cerca de la masa vitelina. Sirve
inicialmente como una estructura de flotación o equilibrio y que al
consumirse es utilizado como recurso potencial de energía (Carrillo
& Zanuy, 1993).
Hepatocitos: Células que componen al hígado (Leeson et al., 1990).
Incidencia alimenticia: Proporción de larvas que presentan alimento en el
tubo digestivo (Yin & Blaxter, 1987).
Intensidad alimenticia: Cantidad de presas presentes en el tubo digestivo de
las larvas (Yin & Blaxter, 1987).
Nauplio: La forma larval más simple de los crustáceos, se presenta en algunos
miembros de todas las clases incluidos copépodos y artemias
(Tucker, 1998).
Neonato: Estadio de un organismo recién nacido (en este caso para rotíferos)
Ontogenia: comprende una serie de cambios morfofisiológicos que se dan
durante el ciclo de vida de los animales (Balon, 1984).
Reservas vitelinas: Reservas nutritivas del huevo, involucra tanto al saco de
vitelo como al glóbulo de aceite (Heming & Buddington, 1988).
x
Sincitio: Masa citoplasmática poseedora de muchos núcleos y rodeada de una
membrana, p. ej. periblasto en los teleósteos (Heming &
Buddington, 1988).
Vitelo: Sustancia nutritiva del embrión al iniciarse el desarrollo, que se
encuentra
acumulado
en
la
célula
sexual
femenina;
sus
componentes principales son: proteínas, fosfolípidos y en menor
grado grasas neutras (Balinsky, 1978).
xi
I. INTRODUCCIÓN
El huachinango del Pacífico Lutjanus peru (Nichols & Muyphy, 1922) es
una especie de gran interés comercial, considerada con gran potencial de
cultivo (Avilés-Quevedo et al., 1996). Sin embargo, pese a su importancia, es
una especie de la cual se conoce poco. En la última década se han realizado
trabajos dirigidos al cultivo de esta especie. Se ha logrado alcanzar la
maduración gonádica mediante un régimen foto-térmico (Dumas et al., 2004) y
la maduración final y posterior desove mediante el uso de hormonas (Dumas et
al., 2004; Pelcastre-Campos, 2006). En cuanto a la crianza larvaria, se ha
logrado producir juveniles pero en cantidades muy bajas (Duncan et al., 2002;
Dumas, COM. PERS.). Estos autores reportan altas mortalidades en los
primeros días de cultivo que han asociado principalmente a la alimentación. De
manera general, se han observado grandes variaciones en la eficiencia
alimenticia y por ende en la supervivencia durante los primeros días de cultivo
(Zavala-Leal, 2007; Dumas, COM. PERS).
Las variaciones en la eficiencia alimenticia pueden ser atribuidas al
estado nutricional de las larvas al inicio de la alimentación exógena, al
desarrollo morfo-fisiológico que presentan las larvas al momento de iniciar la
alimentación exógena (Yúfera & Darias, 2007) y a otros factores tanto bióticos
como abióticos (Zavala-Leal, 2007). Dentro de los bióticos, se ha observado
que diferentes características de las presas juegan un papel importante, como
lo son, la densidad de presa y su distribución (Guldbransend, 1991), el tamaño
(Ware, 1973; Seiffert et al., 2001), la movilidad y el color (Utne-Palm, 1999).
Otros factores bióticos que intervienen en la detección y consumo de presas
son el tamaño del depredador (Bermudes & Ritar, 1999), así como el tamaño
de su boca (Blaxter & Straines, 1970). Dentro de los factores abióticos, los que
más se han reportado son la intensidad de luz (Hunter, 1981; Gutherie, 1986),
el color del tanque (Nass et al., 1996; Peña et al., 2005), turbidez ocasionada
por la adición de microalgas (Shaw et al., 2006), la salinidad y temperatura
(Wintzer & Motta, 2004; Fielder et al., 2005).
Las larvas de peces marinos son de los vertebrados más pequeños de
vida libre con alimentación activa (Wieser, 1995). Numerosas especies de
1
peces marinos con huevos pelágicos presentan una ontogenia indirecta que se
caracteriza por presentar cinco periodos: 1) embrionario, 2) larvario, 3) juvenil,
4) adulto, y 5) senectud (Balon, 1975). Al momento de la eclosión, están
pobremente diferenciados. Suelen ser pequeños con una escasa pigmentación,
un sistema visual no funcional, al igual que su sistema digestivo, el cual solo
está compuesto por un tubo digestivo poco desarrollado sin apertura oral y
anal. El hecho de no presentar sistemas funcionales al momento de la eclosión
implica que durante un periodo de tiempo relativamente corto se lleven a cabo
procesos complejos y altamente dinámicos de diferenciación de órganos,
morfogénesis y crecimiento (Sala et al., 2005). Durante el primer periodo de su
ontogenia, los embriones son dependientes del suministro de nutrientes y
energía de origen maternal
y almacenado en las reservas vitelinas
(alimentación endógena) (Balon, 1975; Kamler, 1992; 2002). Durante este
periodo los procesos
dominantes son el crecimiento, la diferenciación de
tejidos y cambios anatómicos y funcionales de las estructuras (Kamler, 2002).
La utilización del vitelo en el periodo embrionario permite el desarrollo de los
primeros órganos y/o sistemas que los peces necesitan para sobrevivir en el
siguiente periodo de desarrollo, el periodo larval.
El desarrollo en la ontogenia inicial presenta diferentes patrones de
crecimiento entre especies o poblaciones; además, depende de factores
bióticos y abióticos. La temperatura es uno de los factores ambientales más
importantes; se considera que existen temperaturas óptimas de desarrollo, sin
embargo, es más factible considerar que existe un intervalo de temperatura
óptimo en el cual el desarrollo se efectúa de manera normal y con un nivel
similar de eficiencia en la utilización del vitelo (Kamler et al., 1998). De manera
general, la tasa de desarrollo ontogénico es lenta a temperaturas bajas y se
incrementa con el aumento de temperatura (Kamler, 2002). Por otra parte,
dentro de los factores bióticos, uno de los más relevantes es la talla del huevo
(Kamler, 2002), el cual depende de la nutrición de los reproductores, su edad y
nivel de estrés (Jobling, 1998; Morehead et al., 2001), así como el número de
desoves en la temporada reproductiva en desovadores parciales. No obstante,
estos factores no se presentan por separado y es necesario analizar su
interacción.
2
Con base en lo anterior, es evidente la necesidad de hacer investigación
básica sobre el desarrollo larval, no con la finalidad de resolver de manera
inmediata la situación del cultivo, sino de poder generar conocimientos que
posteriormente puedan ser aplicados. En el presente trabajo se abordarán dos
aspectos principales: 1) el desarrollo inicial, en donde se describirá la
morfología de los principales sistemas involucrados en la alimentación exógena
de las larvas; y 2) la primera alimentación, en donde se evaluará el efecto de
diferentes factores ambientales como el tipo de presa, densidad de presa,
intensidad de luz, color del tanque, concentración de microalga, temperatura y
salinidad
sobre
la
eficiencia
alimenticia
bajo
condiciones
de
cultivo
experimental.
II. ANTECEDENTES
2.1 Desarrollo de los sistemas involucrados en la alimentación en larvas
El inicio de la alimentación exógena es un momento crucial en el
desarrollo de las larvas de peces marinos (Yúfera & Darias, 2007). Este
momento es asociado con altas mortalidades tanto en cultivo como en el
ambiente natural. Las mortalidades tempranas en larvas son atribuidas
principalmente a la falta de alimento o a un bajo consumo, y por otro lado a la
pobre calidad nutricional del mismo (Yúfera & Darias, 2007). Antes de la
primera alimentación exógena, el embrión se alimenta de las reservas vitelinas
las cuales son aprovechadas en mayor o menor magnitud dependiendo de la
especie o las condiciones en donde se desarrolle. Aunque el consumo de vitelo
depende de diversos factores dentro de los más importantes resaltan la
cantidad y calidad de vitelo y la temperatura (Heming y Buddington, 1988; Polo
et al., 1991; Hardy & Litvak, 2004).
Para iniciar la alimentación exógena, las larvas deben presentar órganos
sensoriales que les permitiera llevar a cabo con éxito la localización de la presa
o del alimento que se les proporcione; la boca, la aleta caudal y los músculos
deben presentar un desarrollo suficiente para permitir la captura y ingestión de
presas; y finalmente, el sistema digestivo debe presentar un cierto grado de
3
desarrollo anatómico y fisiológico para que se dé la digestión y absorción del
alimento.
2.1.1 Órganos sensoriales
Los
órganos
sensoriales
son
órganos
provistos
de
células
especializadas que reciben estímulos del exterior y transmiten un impulso a
través de vías nerviosas hacia el sistema nervioso central para ser procesado,
traducido y generar una respuesta, que permite una comunicación entre
ambiente e individuo. De manera general, los órganos sensoriales están
compuestos por células receptoras y células de soporte. Las células receptoras
son células nerviosas modificadas caracterizadas por poseer una sensibilidad
diferencial. Las células receptoras se clasifican de acuerdo al tipo de estímulo
que perciben. Existen las foto-receptoras, mecano-receptoras, quimioreceptoras, audio-receptoras, termo-receptoras (Eckert et al., 1990), aunque en
algunas especies es posible encontrar electro-receptoras (Bennett, 1971).
En los peces, los principales órganos sensoriales son los ojos, las
papilas gustativas, el oído interno, la línea lateral y las placas olfativas. En
especies con ontogenia indirecta, se ha observado que al momento de la
eclosión los únicos receptores sensoriales presentes son mecano-receptores
(neuromastos libres), quimio-receptores (placas olfativas) y audio-receptores
(oído interno) (Matsuoka, 2001). En diferentes especies, los neuromastos libres
se observan a lo largo de todo el cuerpo (Matsuoka, 2001; Mukai, 2006) y
permiten a las larvas responder a los estímulos mecánicos como el movimiento
del agua. En la sardina Sardinops melanostictus, las placas olfativas son
localizadas en el extremo anterior de la boca y se reubican en la parte dorsal
de la boca al momento de su apertura permaneciendo sin cambios aparentes
desde la primera alimentación hasta alcanzar tallas de 18-20 mm de longitud
estándar (Matsuoka, 2001). El oído medio presenta una vesícula auditiva de
forma oval que contiene dos otolitos, el Lapilus y Sagitta. El epitelio sensorial
llamado macula se sitúa en posición ventral de la vesícula auditiva bajo de los
otolitos. Sin embargo, y pese a su aparición temprana en el desarrollo, aún se
4
desconoce su funcionalidad en los primeros días de vida de las larvas (Blaxter,
1986; Matsuoka, 2001).
En cuanto al desarrollo del ojo se ha observado que al momento de la
eclosión esta indiferenciado (Kawamura et al., 2003; Peña, 2005; Peña &
Dumas 2007). Peña (2005) reporta que en la cabrilla arenera Paralabrax
maculatofasciatus al momento de la eclosión, la retina está formada por células
indiferenciadas con un arreglo concéntrico sin estratificación. Al día 1 después
de la eclosión, la retina ya presenta cierta estratificación observándose cinco
capas desde el exterior hacia el interior (capa nuclear externa, capa plexiforme
externa, capa nuclear interna, capa plexiforme interna y capa ganglionar). La
capa nuclear externa está formada por segmentos nucleares de los conos aun
en desarrollo. Para el día 2, se observa la capa epitelial pigmentada rodeando
la capa nuclear externa de la retina y los conos sencillos ya bien formados. Al
momento de la apertura de la boca, los ojos están pigmentados y la retina
consta de conos simples mientras que los bastones aparecen después en el
transcurso del desarrollo (Peña & Dumas, 2007; Yúfera & Darias, 2007).
2.1.2 Aparato bucal
En los pocos estudios que existen sobre el desarrollo de las estructuras
bucales en la etapa larval, se ha observado que la diferenciación de nuevas
estructuras coincide con cambios bien definidos en las proporciones cefálicas
(Hunt von Herbing, 2001). Cambios a nivel estructural y funcional como el
movimiento en la mandíbula son los primeros fenómenos que ocurren,
facilitando la transición de una alimentación endógena a una exógena. Las
estructuras implicadas en la alimentación exógena durante este periodo
incluyen el cartílago de Meckel, hiomandibular-symplecticum, cartílago hioideo,
cuadrado e interhial, las cuales a este momento son cartilaginosas (Hunt von
Herbing, 2001). En Gadus morhua y Pseudopleuronectes americanus al
momento de la eclosión, las estructuras del aparato bucal son simples, pocas
en número y no articuladas, y aunque la boca está formada, no está abierta. Se
ha reportado que una vez que la boca es abierta y articulada, su movimiento es
controlado por un simple mecanismo referido al acoplamiento hioideo, el cual
5
resulta de la contracción de los músculos mandibulares (geniohideos y
esternohioideos) para abrir la boca (Otten, 1982; Liem, 1991; Hunt von Herbing
et al., 1996). Posteriormente, con el crecimiento de la región cefálica se
presenta el segundo mecanismo que corresponde a un acoplamiento opercular,
el cual se da por la contracción de músculos en el opérculo los cuales
transmiten una fuerza a lo largo de un ligamento a la mandíbula inferior (Hunt
von Herbing, 1996; Liem, 1997).
2.1.3 Sistema digestivo y órganos accesorios
La ontogenia del sistema digestivo presenta un patrón similar en
diferentes especies (Yúfera & Darias, 2007) pero con ciertas variaciones,
principalmente en la secuencia de la aparición de las diferentes estructuras. En
la mayoría de las larvas de peces marinos, al momento de la eclosión, el tracto
digestivo es un tubo recto simple localizado sobre el saco de vitelo, con un
epitelio formado por una capa simple de células columnares (Govoni et al.,
1986; Gisbert et al., 2004;
Santamaría et al., 2004; Falk-Petersen, 2005;
Ostaszewska, 2005: Peña 2005; Yúfera & Darias, 2007). Al momento de la
apertura de la boca, la parte posterior de este tubo esta flexionado para abrirse
en la zona caudal. Además, se distingue la cavidad bucal (sin dientes), el
esófago con un epitelio escamoso estratificado y el intestino con un epitelio
columnar simple (Yúfera & Darias, 2007). Pocos días después de la apertura
bucal pueden identificarse las regiones anterior, media y posterior del intestino,
con la aparición de un esfínter pilórico y una constricción correspondiente a lo
que será la válvula íleo-rectal. En algunas especies como la dorada Sparus
aurata (Sarasquete et al., 1995; Calzada et al., 1997), eglefino Melanogrammus
aeglefinus (Hamlin et al., 2000), jurel aleta amarilla Seriola lalandi (Chen et al.,
2006) y lenguado de California Paralichthys californicus (Gisbert et al., 2004),
las células caliciformes están ausentes o son escasas al momento de la
apertura de la boca y aparecen algunos días después. Aunque en otras
especies como el lenguado senegalés Solea senegalensis (Ribeiro et al.,
1999), lenguado común Solea solea (Boulhic & Gabaudan, 1992), platija de
verano Paralichthys dentatus (Bisbal & Bengtson, 1995), lenguado cola amarilla
6
Pleuronectes ferruginea (Baglole et al., 1997) y percuda o pez payaso
Amphiprion percula (Gordon & Hecht, 2002), dichas células se presentan desde
la primera alimentación, cuya principal función es secretar mucina para
mantener húmedo el epitelio de recubrimiento del sistema digestivo.
Al momento de la eclosión, los órganos complementarios en la función
digestiva como el hígado y páncreas están ausentes e inician su diferenciación
a partir de dos grupos de células esféricas de núcleo basofílico y citoplasma
ligeramente eosinofílico, entre el primer y segundo día (Gisbert et al., 2004). En
Paralichthys californicus, el hígado está en posición ventral al tubo digestivo en
desarrollo y puede ser identificado como una masa de tejido blanquecina no
lobulada. Histológicamente, se observa como un tejido compacto de
hepatocitos poliédricos basofílicos con núcleos localizados en el centro y un
citoplasma reducido. Conforme la larva crece, el hígado sigue su diferenciación
y al día 5 después de la eclosión, los hepatocitos se presentan en un arreglo
alrededor de los sinusoides hepáticos y aparece el conducto biliar con un
epitelio cuboidal simple (Gisbert et al., 2004). Entre el día 1 y 2 después de la
eclosión, el páncreas es extrahepático y las regiones exógenas y endógenas
son visibles. Se detectan diversos grupos de células pancreáticas basofílicas
(páncreas exócrino) que contienen gránulos de zimógeno acidófilos. Al día tres
después de la eclosión, las células pancreáticas exógenas son arregladas en
un hacino y los conductos pancreáticos son claramente distinguibles. El
páncreas endocrino está diferenciado y las células endocrinas dispuestas
alrededor de muchos tubos capilares son agrupadas en islotes de Langerhans
(Gisbert et al., 2004; Abol-Munafi et al., 2006).
2.2 Factores que afectan la alimentación en larvas
La presencia de las estructuras anatómica y fisiológicamente necesarias
para iniciar la alimentación exógena no asegura el éxito ya que este es
fuertemente influenciado por factores bióticos y abióticos. Dentro de los
factores bióticos se ha mencionado que los más importantes son la talla y
densidad de la presa, la turbidez generada en condiciones de cultivo por la
adición de microalgas (técnica de agua verde) y la talla del depredador. La talla
7
o tamaño de la presa ha sido considerada como uno de los principales factores
limitantes para el éxito en la primera alimentación en larvas de peces marinos
en cultivo (Hunter, 1981; Pascual & Yúfera, 1987; Planas & Cunha, 1999). En la
larvicultura se emplean con mayor frecuencia para la alimentación temprana,
dos grupos del zooplancton, uno que es el braquiópodo Artemia sp. y el otro los
rotíferos como Brachionus plicatilis y B. rotundiformis (Gulbrandsen, 1991; Polo
et al., 1992; Fernández-Díaz et al., 1994; Planas & Cunha, 1999; Khemis et al.,
2003; Alves et al., 2006). Sin embargo, en algunas especies no han resultado
satisfactorios como primer alimento debido a su tamaño (Treece & Davis,
2000). Recientemente, se reporta en la literatura el uso de copépodos que para
varias especies, son en su estadio naupliar más pequeños que las presas
anteriormente mencionadas. Treece & Davis (2000) observaron que al ofrecer
como alimento una mezcla de plancton, los nauplios de copépodos son
preferentemente consumidos sobre los rotíferos. En Sparus aurata, se ha
reportado la preferencia de presas pequeñas al inicio de la alimentación
exógena (Helps, 1982) tanto en experimentos a pequeña escala como en
cultivo extensivo (Kentouri et al., 1984). La densidad de las presas es otro de
los principales factores que influyen sobre la eficiencia (Hunter, 1976; Houde &
Schekter, 1978; Ina et al., 1979; Hunter, 1980; Gulbrandsen, 1991; Duray et al.,
1996; Laurel et al., 2001). Por otro lado, se ha reportado que una alta densidad
de presa reduce el tiempo de búsqueda de esta, lo cual incrementa la tasa de
encuentro entre depredador-presa (Hart, 1997). Peña et al. (2005) estudiaron el
efecto de la densidad de presa en la primera alimentación en larvas de
Paralabrax maculatofasciatus y encontraron que a mayor densidad de presa,
mayor fue el número de larvas que ingieren el alimento. Sin embargo, en
Theragra chalcogramma no se observaron diferencia en el número de larvas
que comieron cuando la densidad de presa fue proporcionada en un amplio
rango (8 y 50 presas/ml) (Paul, 1983). El tamaño del depredador y de su boca
(Blaxter & Straines, 1970; Bermudes & Ritar, 1999) así como el uso de
microalgas en el cultivo (Skifstevik et al., 2003) son otros factores bióticos que
intervienen en la eficiencia alimenticia. En diferentes especies se ha observado
que la temperatura del agua afecta la talla que alcanzan las larvas a la eclosión
y al final de la alimentación endógena (Pittman, et al., 1989; Blaxter, 1992;
Bermudes & Ritar, 1999; Morehead & Hart, 2003). Blaxter (1969) sugirió que
8
una temperatura de incubación óptima producirá larvas más grandes, las
cuales serán más fuertes y mejores nadadoras lo que podría incrementar su
supervivencia en periodos críticos como la primera alimentación (Bermudes &
Ritar, 1999). En cuanto al uso de agua verde, se ha observado en algunos
casos un incremento en la supervivencia (Naas et al., 1992). Se ha reportado
que las larvas de Rhombosolea tapirina criadas en agua verde, consumen un
mayor número de presas que en agua clara (Shaw et al., 2006). Sin embargo,
en otros casos, la eficiencia alimenticia, el crecimiento y supervivencia de las
larvas no es afectada o bien disminuye con el incremento en la concentración
de microalgas (Breitburg, 1988; Gulbrandsen et al., 1996; Cobcroft et al., 2001;
van der Meeren et al., 2007). Miner & Stein (1993) observaron que una alta
intensidad luminosa en la superficie del agua junto con el uso de agua verde,
aumenta la visibilidad de la presa mientras que a bajas intensidades de luz, el
uso de agua verde puede afectar la visibilidad y consecuentemente disminuir la
eficiencia en la alimentación.
En cuanto a los factores abióticos, la intensidad de luz, color del tanque,
temperatura y salinidad muestran un mayor efecto sobre la alimentación
exógena durante los primeros días. Las larvas de peces son consideradas
depredadoras visuales (Hunter, 1981; Gutherie, 1986). Diversos trabajos se
han encaminado a estudiar el efecto de la intensidad de la luz sobre la
eficiencia alimenticia, crecimiento y supervivencia, demostrando que esta
influye de manera directa en la detección de las presas (Vinyard & O`Brien,
1976; Paul, 1983; Utne-Palm, 1997; Downing & Litvak, 1999; Cook & Rust,
2002; Peña et al., 2004). Huse (1994) evaluó la intensidad de luz sobre la
incidencia alimenticia en la primera alimentación de diferentes especies y
encontró valores muy diferentes entre especies: bacalao, Gadus morhua (1
lux),
lenguado, Pleuronectes platessa
(87 lux) y rodaballo (Scophthalmus
maximus) (860 lux). Además, estos valores se relacionan con una distribución
vertical diferente entre especies. Recientemente, Peña et al. (2004) estudiaron
el efecto de la intensidad de luz (100, 400 y 700 lux) en la primera alimentación
de larvas de cabrilla arenera (Paralabrax maculatofasciatus). Concluyeron que
el número de larvas con alimento en el tracto digestivo aumenta conforme a la
intensidad de luz. No obstante la intensidad de luz no es el único factor que
9
afecta la detección de presas. Factores como el color de las paredes del
tanque de cultivo, la turbidez, entre otros afectan también su eficiencia de
alimentación (Tamazouzt, et al., 2000; Peña et al., 2004; 2005; Shaw et al
2006). El color del tanque afecta la iluminación debido a que modifica el
contraste con la presa (Nass et al., 1996). Los colores mayormente probados
son el blanco, gris y negro y se ha reportado que afectan la eficiencia
alimenticia, el crecimiento y supervivencia (Downing & Litvak, 1999; Peña et al.,
2005). Nass et al (1996) recomiendan el uso de tanques con paredes color
negro debido a que la iluminación es mayor y las larvas no tienden a
acumularse a lo largo de las paredes, resultando en un menor daño por
abrasión. En algunas especies como Scophthalmus maximus (Howell, 1979) y
Coryphaena hippurus (Ostrowski, 1989), este color de tanque resulta en un
mayor crecimiento y supervivencia mientras que en Melanogrammus aeglefinus
la supervivencia es mayor en tanques con paredes blancas (Downing & Litvak,
1999). En otras especies como Paralabrax maculatofasciatus se observó que el
color del tanque no tiene un efecto significativo sobre la eficiencia alimenticia al
momento de la primera alimentación (Peña et al., 2004).
Otros factores abióticos que pueden afectar la eficiencia de las larvas
para alimentarse son la temperatura y la salinidad. Ambos factores afectan en
mayor o menor medida la fisiología de las larvas y la física del agua en la cual
nadan (Hunt von Herbing, 2002; Fielder et al., 2005). En Melanogrammus
aeglefinus y Amphiprion melanopus se ha observado que a mayor temperatura,
las larvas presentan una mayor velocidad de nado (Hunt von Herbing &
Keating, 2003; Green & Fisher, 2004) lo cual podría ser una ventaja para la
larva al momento de atacar a su presa. Sin embargo, Hochachka & Somero
(2001) mencionan que un decremento o incremento de la temperatura fuera del
rango óptimo puede resultar en una reducción en la tasa metabólica, lo que
puede afectar el desempeño de la larva al momento de alimentarse. Por otro
lado, los cambios en la viscosidad del agua tienen un impacto significativo en el
nado sobre todo en larvas pequeñas, afectando la velocidad absoluta de nado,
distancia recorrida y duración de nado (Fuiman & Batty, 1997; Hunt von
Herbing & Keating, 2003) disminuyendo así su capacidad de alimentación.
10
2.3 Estudios sobre el huachinango del Pacífico
Como se ha mencionado con anterioridad, se han realizado trabajos
dirigidos al cultivo de esta especie. Se ha logrado alcanzar la maduración
gonádica en organismos mantenidos en cautiverio mediante la aplicación de un
régimen foto-térmico (Dumas et al., 2004) y la maduración final y posterior
desove mediante la aplicación de hormonas (Dumas et al., 2004; PelcastreCampos, 2006). En cuanto a la crianza larvaria, se ha logrado producir
juveniles, sin embargo, en cantidades muy bajas (Duncan et al., 2002; Dumas
COM. PERS). Estos autores reportan altas mortalidades en los primeros días
de cultivo y las han asociado al poco éxito en la primera alimentación exógena
en la cual proporcionaron como primera presa neonatos de rotíferos
Brachionus plicatilis y B. rotundiformis. Debido a esos resultados y con la
finalidad de conocer más sobre el efecto de factores ambientales sobre la
primera alimentación exógena, Zavala-Leal (2007) evaluó el efecto de la
intensidad de luz, tipo y densidad de presa sobre la eficiencia alimenticia y
encontró que al momento de la primera alimentación (alrededor de 72 horas
después de la eclosión) las larvas no consumen los neonatos de B.
rotundiformis. Mientras que con los nauplios de copépodos Euterpina acutifrons
la incidencia alimenticia se incrementa con el aumento en la intensidad de luz.
11
III. JUSTIFICACIÓN
El huachinango del Pacífico Lutjanus peru es una especia de
importancia comercial, que recientemente ha generado grandes expectativas
para su cultivo tanto en el sector público como privado. Pese a su importancia,
es una especie de la cual aún se tiene poco conocimiento sobre su desarrollo.
Es por ello que el presente trabajo plantea realizar investigación básica
mediante la descripción del desarrollo de los sistemas y estructuras
involucrados en la captura, ingestión y digestión al inicio de la alimentación
exógena de esta especie, que pueda servir como base para posteriores
estudios, en los que se realicen descripciones ya sean morfológicas o de
comportamiento como en la taxonomía, ecología y/o acuacultura.
IV. OBJETIVOS
4.1 Objetivo General:
El presente trabajo tiene como objetivo describir la organogénesis de las
principales estructuras desarrolladas desde la eclosión hasta el inicio de la
alimentación exógena de las larvas de Lutjanus peru (Nichols & Murphy, 1922),
así como evaluar la eficiencia alimenticia bajo condiciones de cultivo
experimental.
4.2 Objetivos Específicos:
Describir a nivel morfológico, histológico y ultraestructural, el desarrollo
de los órganos sensoriales, aparato bucal y el sistema digestivo en el desarrollo
inicial de Lutjanus peru.
Evaluar el efecto de la intensidad de luz, color del tanque, tipo, tamaño y
densidad de presa, salinidad y temperatura sobre la eficiencia alimenticia al
momento de la primera alimentación exógena bajo condiciones de cultivo
experimental.
12
V. HIPÓTESIS
Partiendo de la premisa que al igual que en otras especies de ontogenia
indirecta, el desarrollo de las larvas de huachinango al momento de la eclosión
y primera alimentación será limitado en cuanto a estructuras y funcionamiento,
se espera encontrar pocos órganos sensoriales y quizá rudimentarios. Debido a
que al término de la alimentación endógena deben ingerir el alimento, al igual
que en otras especies el aparato bucal se desarrollará y estará constituido de
estructuras cartilaginosas. El sistema digestivo será poco diferenciado, sin
embargo, presentará cierta regionalización que le permita digerir el alimento y
absorber los nutrientes. De la misma forma, como se ha observado en otras
especies el bajo grado de desarrollo al inicio de la alimentación exógena
(locomoción, agudeza y sensibilidad visual, etc.), limitará el desempeño en la
alimentación. Por lo que se espera que la eficiencia alimenticia sea afectada de
manera significativa por factores como el color del tanque, la salinidad, la
turbidez ocasionada por la adición de microalgas y la temperatura. De manera
más específica, en cuanto a la intensidad de luz, tipo y densidad de presa;
cuyos factores ya han sido evaluados sin alcanzar el pico máximo en la
eficiencia alimenticia (Zavala-Leal, 2007) es factible suponer que la mayor
eficiencia alimenticia se logrará en tratamientos donde se empleen altas
intensidades de luz, presas de tamaño pequeño y altas densidades de las
mismas.
13
VI. MATERIALES Y MÉTODOS
6.1 Inducción al desove
Se recolectaron reproductores silvestres de la región de la Ribera,
municipio de Los Cabos, BCS, México. A su llegada al laboratorio, los
organismos que presentaron oocitos de un diámetro ≥ 400µm, característico del
estadio de vitelogénesis avanzada, se indujeron a la maduración final y el
desove mediante la aplicación del factor de liberación de la hormona
luteinizante (LHRH-a) (Pelcastre-Campos, 2006). La fecundación de los huevos
se realizó en seco en un recipiente de plástico. Después de 10 minutos, se
enjuagaron los huevos con agua de mar filtrada (0.1 μm) y se depositaron en
tolvas cónicas de 100L de capacidad con circulación continua de agua filtrada
(filtro mecánico de 1 μm e luz ultravioleta) a temperatura de 25-26.5 °C y bajo
un fotoperiodo de 13:11 horas (luz: oscuridad). Diariamente se retiraron los
huevos muertos mediante sifonado con un tubo de vidrio y manguera de
polietileno de 2mm de diámetro.
6.2. Desarrollo de órganos y sistemas involucrados en la alimentación.
6.2.1 Órganos sensoriales y sistema digestivo
Para describir el desarrollo de estas estructuras se tomaron muestras de
las larvas al momento de la eclosión y a las 6, 12, 18, 24, 36, 48, 70 y 93 horas
después de la eclosión (hde). Se recolectaron larvas para su estudio
histológico: 50 larvas para la microscopia óptica (MO), 50 para microscopia
electrónica de barrido (MEB) y 50 para microscopia electrónica de transmisión
(MET). Las larvas se anestesiaron con 2-fenoxietanol 400 ppm y se enjuagaron
con agua destilada.
Las larvas que se emplearon para la MO, se fijaron con formol al 4%
saturado con borato de sodio. Alrededor de 4 semanas después se cambiaron
de formol a alcohol al 70%. Posteriormente se deshidrataron en alcohol en un
orden creciente (70% hasta el 100%). Después de la deshidratación se
incluyeron en parafina y se realizaron cortes sagitales finos de 1 a 0.5 µm de
14
espesor con un micrótomo de rotación. Los cortes fueron teñidos mediante la
técnica de hematoxilina-eosina (H-E). Se analizaron las muestras con un
microscopio óptico a diferentes aumentos.
Las
muestras
para
la
microscopia
electrónica
se
fijaron
con
glutaraldehído 2.5% en PBS de Sörensen. Para la técnica de MEB, se
deshidrataron las muestras con etanol en gradiente y se secaron en un
desecador a punto crítico (Samdri-PVT-3B, Tousimis Research Corporation,
Rockville, MD). Posteriormente, las larvas se montaron en placas metálicas y
fueron disectadas. Se recubrieron las muestras con paladio (Desk II, Denton
Vaccum, NY) y se observaron al microscopio electrónico de barrido (Hitachi S3000N, High Tecnologies American, Inc. CA).
Para la MET, dos horas después de la fijación, se enjuagaron las
muestras tres veces con una solución de cacodilato de sodio y se refrigeran a 4
ºC en esta misma solución. Alrededor de 4 semanas después, se cambio la
solución de cacodilato de sodio para evitar la formación de cristales de sal.
Después de 9 semanas de la colecta de las muestras, se retiró la solución de
cacodilato de sodio y se les agregó tetraoxido de osmio al 2% por una hora.
Posteriormente, se lavaron tres veces (5 minutos c/u) con una solución
amortiguadora de cacodilato-HCl para eliminar el exceso de osmio. Una vez
lavadas, se procedió a la deshidratación mediante la inmersión en etanol en
orden creciente de 40, 50, 60, 70, 80, 90 y 100% (10 minutos de duración en
cada concentración). Después de la deshidratación, se les añadió óxido
propileno. Este paso se hizo 2 veces; 20 minutos entre uno y otro, para
asegurar la eliminación del etanol para prepararlas para la incorporación de la
resina dentro del tejido. Para la inclusión en resina, se agregó una solución 1:3
de resina y óxido propileno, una hora después, se cambió por una solución en
proporción 1:1 y a continuación se cambió a una proporción 3:1 por 15 horas.
Finalmente se incluyó en resina (EMBed-812, Electron Microscopy Sciences,
PA) al 100% (se repitió el proceso 2 veces, una hora entre una y otra) y se
etiquetó cada muestra antes de meterse a polimerizar en una estufa a 60 ºC
por 24 h. Se realizaron cortes finos de 60 nanómetros en un ultramicrotomo
(Leica módelo Ultracut UCT, Electron Microscopy Sciences, PA) y fueron
depositados en rejillas de cobre de 60 mallas. Las muestras fueron
15
contrastadas con acetato de uranilo y citrato de plomo. Finalmente, los cortes
fueron observados bajo el microscopio electrónico de transmisión (JEOL JEM1010 Electron Microscope, MA) a diferentes aumentos.
6.2.2 Aparato bucal
Se recolectaron 50 larvas al momento de la eclosión y después de 6, 12,
18, 24, 36, 48, 70 y 93 hde. Se anestesiaron con 2-fenoxietanol 400 ppm y se
tomaron imágenes digitales para realizar mediciones de la longitud total y del
ancho de la boca. Posteriormente, se fijaron en formol 10% saturado con
borato de sodio. Después de 5 días, se colocaron en alcohol etílico 70% para
su conservación hasta proceder a la deshidratación. Las larvas fueron
transparentadas y teñidas mediante el método descrito por Potthoff (1984) pero
con modificaciones (Tabla 1) (Ver anexo 1 para más detalles).
Tabla 1.- Técnica de transparentación y tinción para larvas de peces marinos
(modificado de Potthoff, 1984).
Pasos
Sustancias o Reactivos
Tiempos (h)
Fijación
Formol 10% saturado con borato de sodio
48
Deshidratación
Alcohol 50%, 70% y 100%
24
Tinción de cartílago
Solución azul alcian
18
Neutralización
Solución de borato de sodio saturada
6
Digestión tripsina
Solución de tripsina (1%)
4
Tinción de hueso
Solución rojo alizarin
3
Decoloración
Solución tripsina (1%)
<1*
* El tiempo en tripsina no pudo ser estimado con exactitud debido a que las
muestras se degradaban por lo que se mantuvieron bajo observación y se
lavaron cuando eran decoloradas.
16
Finalmente, se realizaron los esquemas del desarrollo a partir de
fotografías de las larvas teñidas. La estimación de la apertura máxima potencial
de la boca (AB) se realizó utilizando la ecuación de Shirota (1970):
AB = √2 * LMS
Donde:
AB = Ancho de la boca
LMS = Longitud de la mandíbula superior
6.3 Eficiencia en la alimentación exógena.
En esta parte del trabajo se realizaron cinco experimentos. Con la
finalidad de complementar un estudio realizado previamente en el cual se
observó que las larvas incubadas a 24 ºC presentan una longitud mayor que
las incubadas a 28 y 30 ºC (Zavala-Leal, 2007), se evaluó en el primer
experimento el efecto de la temperatura de incubación sobre la eficiencia
alimenticia al momento de la primera alimentación. En el resto de los
experimentos se evaluó el efecto de diferentes factores sobre la eficiencia
alimenticia como, la intensidad de luz, color del tanque y tipo de presa (exp. 2),
talla de la presa y densidad de presa (exp. 3), temperatura del agua y salinidad
(exp. 4) y concentración de microalga y densidad de presa (exp. 5).
Los experimentos se realizaron en acuarios rectangulares de 30x20x20
cm con capacidad de 10 litros pintados con pintura epóxica no tóxica de color
negro (Fulmex-E-26-B, Prometal, México), excepto en el experimento 2. Se
llenaron con agua tratada mediante filtro de arena, luz ultravioleta, clorada
(16ppm) y tiosulfatada (10ppm). Se les suministró una aireación constante. Las
larvas fueron transferidas a los acuarios alrededor de 60 horas después de la
eclosión a densidad de 50 larvas/litro. La temperatura del agua fue de 25-26
ºC, la salinidad de 35 ups (excepto en el experimento 4), y la intensidad de luz
de 3000 lux (excepto en el experimento 2). Se empleó una concentración de
3x105 células de Nannochloropsis oculata como agua verde (excepto en el
experimento 5). Los tratamientos se hicieron por triplicado. Se ofreció el
alimento (presas vivas) cuando las larvas presentaron el ojo bien pigmentado,
17
la boca abierta y articulada y el ano abierto. El momento óptimo para muestrear
las larvas fue determinado en los 3 primeros experimentos. Para este fin, se
colocaron 2 acuarios extras para identificar el momento del inicio de la
alimentación. Se muestreó cada hora después de proporcionar el alimento y se
determinó que el tiempo necesario para que las larvas inicien la alimentación
es de seis horas. Seis horas después de proporcionar el alimento se
recolectaron de manera aleatoria 30 ± 5 larvas de cada acuario. Se
anestesiaron con 2-fenoxyetanol (400ppm) y se observaron bajo una lupa
estereoscópica para evaluar la eficiencia alimenticia contando el número de
larvas con alimento en el tracto digestivo (Incidencia alimenticia) y el número de
presas por larva (Intensidad alimenticia). Cuando fue necesario se realizó una
disección del tracto digestivo de la larva para contar las presas.
El alimento vivo que se probó fue nauplios del copépodo Euterpina
acutifrons y rotíferos Brachionus rotundiformis. Ambas especies fueron
cultivadas en la Unidad Piloto de Maricultivos a temperatura de 26 y 25 ºC,
respectivamente. Se alimentaron con Nannochloropsis oculata, Chaetoceros
calcitrans y Dunaliella sp. La cosecha de los nauplios se realizó con tamices de
luz de malla de 90 y 50 μm para separar los estadios IV-VI y de 50 y 25 μm
para estadios I-III. Los rotíferos fueron cosechados en tamices de 70 y 100 μm,
y se alimentó con la fracción más pequeña.
6.3.1 Exp. 1 Temperatura de incubación
Las diferentes temperaturas probadas fueron 26, 28 y 30 ºC. Los
embriones fueron incubados en tanques cónicos de 180 litros de capacidad,
con paredes negras y fondo blanco. La temperatura fue mantenida utilizando
calentadores para acuario. A cada uno de los tanques se les recambió
diariamente el 50% del volumen total del agua cuidando mantener constante la
temperatura del agua. Una vez que las larvas eran morfológicamente aptas
para iniciar la alimentación, como se describió en el párrafo anterior, se
transfirieron a los acuarios para ofrecerles el alimento. El alimento que se les
proporcionó fue nauplios (estadio I-III) de copépodos Euterpina acutifrons (45 ±
6 μm de ancho) a razón de 10 ml-1. La temperatura de los acuarios para la
alimentación fue de 25 ± 0.5 ºC. Se registró la longitud total promedio (n = 30)
de las larvas para cada una de las temperaturas.
18
6.3.2 Exp. 2 Efecto de la intensidad de luz, tipo de presa y color
del tanque
Se realizó un experimento multifactorial. Se probaron diferentes
intensidades de luz (2000, 2500 y 3000 lux), colores de tanque (negro y gris) y
tipos de presa (nauplios de copépodos Euterpina acutifrons (estadio I-VI) y
nauplios de copépodos (estadio I-VI) con rotíferos Brachionus rotundiformis en
proporción 1:1) a una densidad de 10 presas ml-1. La talla de los nauplios de
copépodos fue de 80 ± 15 μm (altura) y 65 ± 7 μm (ancho) y de los rotíferos de
143 ± 28 μm (altura) y 95 ± 10 μm (ancho). La fuente de luz fueron lámparas de
luz blanca de 100 W (Philips, Somerset, NJ). La intensidad de luz fue medida en
la superficie del agua con un fotómetro (L246373, Extech Instruments, Long
Branch, NJ). La intensidad luminosa fue ajustada colocando una malla sobre la
superficie del acuario para alcanzar las intensidades de luz más bajas (2 000 y 2
500 lux). Los acuarios fueron pintados de color negro y gris con pintura epóxica
no toxica (Fulmex-E-26-B, Prometal, México).
6.3.3 Exp. 3 Talla de la presa y densidad
Se ofrecieron nauplios de copépodos en estadios I-III (altura: 63 ± 17;
ancho: 46 ± 8 μm) y estadios IV-VI (altura: 91 ± 12 μm; ancho: 75 ± 12 μm). Se
proporcionaron a unas densidades de 5, 10 y 15 nauplios ml-1.
6.3.4 Exp. 4 Temperatura del agua y salinidad
Las temperaturas probadas fueron de 25 y 28 ºC en combinación con
25, 30 y 35 ups. La temperatura fue mantenida utilizando calentadores para
acuarios. La salinidad fue ajustada utilizando agua de mar y agua dulce filtrada.
El alimento proporcionado fue nauplios de copépodos Estadios I-III (ancho: 46
± 8μm) a razón de 10 nauplios ml-1.
6.4.5 Exp. 5 Concentración de microalga y densidad de presa
Las concentraciones de microalgas empleadas fueron 0, 3x105 y 1x106
células de Nannochloropsis oculata ml-1. Se proporcionó nauplios de
copépodos estadios I-III (ancho: 45 ± 13 μm de ancho) a razón de 10 y 15
nauplios de copépodos por mililitro.
19
Después de verificar la normalidad y homogeneidad de varianzas
(Shapiro-Wilks y Cochran C test, respectivamente), los resultados se analizaron
estadísticamente con un análisis de varianza multifactorial, excepto por el
primer experimento, el cual fue de una sola vía (Statistics 6.0). En el caso de la
incidencia alimenticia se transformaron los datos mediante la raíz cuadrada de
arcoseno. Para las pruebas a posteriori se utilizó la prueba de Tukey. Las
gráficas se realizaron en el software Sigma-Plot 9.
20
VII. RESULTADOS
7.1 Aspectos generales del desarrollo
Durante el periodo de muestreo se registró la longitud total de un
promedio de 40 larvas para cada tiempo de muestreo (tabla 1).
Tabla 2.- Longitud total (Lt); promedio y desviación estándar (DE) de las
larvas de huachinango del Pacífico Lutjanus peru a cada tiempo de muestreo.
Estadio de
desarollo
Larva
vitelina
Larva preflexión
Edad
(hde)
Lt (mm)
DE
0*
6
12
18
24
36
48
70
93
2.45
2.77
3.02
3.04
3.09
3.22
3.31
3.44
3.73
0.08
0.10
0.08
0.06
0.07
0.12
0.12
0.22
0.19
* La edad 0 corresponde a la eclosión
Las larvas eclosionaron (50% de eclosión) alrededor de las 26 horas
después de la fertilización a 25-26.5 ºC, provistas de un saco de vitelo de forma
piriforme localizado en la región antero-ventral que ocupó casi la mitad de la
longitud de la larva, y también de un glóbulo de aceite esférico en posición
anterior en el saco de vitelo (Fig. 1A). El periblasto
o sincitio vitelino que
separa al embrión de las estructuras de reserva presentó múltiples núcleos de
forma irregular, una cantidad considerable de mitocondrias y abundantes
parches de retículo endoplásmico y complejos de Golgi, así como también
algunos cuerpos vesiculares con estructuras membranosas y material
electrodenso (Fig. 1B, C). A las 24 hde, se observó una disminución
considerable del saco vitelino, mientras que el glóbulo de aceite también fue
consumido pero en menor proporción (Fig. 2A). Dada la transparencia de las
larvas se pudo observar que el tubo digestivo incrementó en diámetro y
longitud. En la región posterior presentó una ligera curvatura separándose de la
21
musculatura del tronco, sin embargo, aun no presentaron aperturas hacia el
exterior (boca y ano). En las larvas anestesiadas, era posible percibir
los
latidos del corazón en la región anterior de la cavidad ventral en posición dorsal
del saco vitelino
A las 48 hde, el saco vitelino era casi reabsorbido por completo mientras
que el glóbulo de aceite permanecía (Fig. 2B). Se observó un mayor
ensanchamiento en la región media del tubo digestivo (conforme avance en el
desarrollo dará origen al intestino anterior), formando una especie de bolsa
alargada, mientras que la región posterior del tracto digestivo (posteriormente
originará al intestino posterior y el recto) no apareció tan ensanchado.
La
curvatura del tubo digestivo se observó más marcada con un ángulo de 90º con
respecto a la musculatura troncal. Así mismo, se pudo observar la formación
de la válvula intestinal (Fig. 2B).
Figura 1.- Larvas de huachinango del Pacífico Lutjanus peru al momento de la eclosión. A)
Larva completa, barra = 20μm. B) saco de vitelo mostrando el periblasto (per), técnica MET,
barra = 2μm C) ultraestructura del periblasto mostrando sus organelos y algunos cuerpos
vesiculares (flechas), técnica MET, barra = 500nm. G, aparato de Golgi; ga, glóbulo de aceite;
m, mitocondrias; mt, musculatura troncal; N, núcleo; oj, ojo; pl, pliegue de la aleta; sv, saco
vitelino; re, retículo endoplásmico.
22
El saco vitelino y glóbulo de aceite fueron reabsorbidos entre las 55 y 60
hde a temperatura de 26.5-27.5 ºC. La primera alimentación ocurrió entre las
70 y 80 hde. Al momento de la primera alimentación las larvas presentaron una
musculatura troncal robusta (Fig. 3A), así como un pliegue o membrana que
rodeó toda la superficie del cuerpo (Fig. 1A). La musculatura del tronco mostró
tanto músculo estriado como fibras musculares de tipo liso y una gran cantidad
de mitocondrias (Fig. 3A). El pliegue esta constituido por una membrana
delgada que presentó fibras musculares de tipo estriado como esqueleto
interno, mientras que por la periferia se observaron cordones delgados de
musculo liso, algunas mitocondrias y retículo endoplásmico (Fig. 3B).
23
Figura 2.- Morfología externa de larvas de huachinango del Pacífico Lutjanus peru. A) 24 horas
después de la eclosión (hde). B) 48 horas después de la eclosión, barras = 20μm; ga, glóbulo
de aceite; ia, intestino anterior; ip, intestino posterior; mt, musculatura troncal; oj, ojo; sv, saco
vitelino; td, tubo digestivo; vi, válvula intestinal.
Figura 3.- Musculatura de lavas del huachinango del Pacífico Lutjanus peru a las 70 hde,
técnica MET. A) Musculatura troncal, y B) pliegue de la aleta, barras = 500nm; fm, fibras
musculares; m, mitocondrias; me, músculo estriado; ml, músculo liso; re, retículo endoplásmico.
24
7.2 Desarrollo de órganos y sistemas involucrados en la alimentación.
7.2.1 Desarrollo de órganos sensoriales
7.2.1.1 Retina
Al momento de la eclosión (Lt = 2.45 ± 0.08 mm), los ojos eran
indiferenciados. Era difícil de distinguirlos como tal, se localizaron en posición
dorsal-posterior al glóbulo de aceite (Fig. 4A). Histológicamente, se apreció el
cristalino rodeado por la retina, la cual era rodeada por la esclera formada de
tejido conectivo en arreglo centrífugo sin estratificación (Fig. 4B). A nivel
ultraestructural, la retina presentó un cierto grado de estratificación aunque las
diferentes capas eran todas constituidas por células similares las cuales eran
alargadas o planas con un gran núcleo de forma irregular que ocupó
relativamente todo el volumen celular (Fig. 4C, D). Mientras que en el escaso
citoplasma se pudieron apreciar algunas mitocondrias y retículo endoplásmico
(Fig. 4D). A lo largo de toda la retina se pudieron observar algunos cordones
nerviosos compuestos de múltiples fibras delgadas los cuales se encontraron
localizados entre los espacios intercelulares (recuadro en Fig. 4C).
Figura 4.- Ojo al momento de la eclosión en larvas del huachinango del Pacífico Lutjanus peru.
A) morfología externa, barra = 20μm. B) región anterior de la larva mostrando la retina (r),
técnica H-E, barra = 10μm. C) retina mostrando cordones nerviosos (flechas), barra = 2μm,
recuadro: detalle de un cordón nervioso, técnica MET, barra = 100nm. D) células de la retina;
las flechas indican la membrana celular, técnica MET, barra = 500nm. cr, cristalino; es, esclera;
ga, glóbulo de aceite; m, mitocondria; mt, musculatura troncal; N, núcleo; oj, ojo; re, retículo
endoplásmico; sv, saco de vitelo.
25
A las 18 hde (3.04 ± 0.06 mm) se observó el inicio de la estratificación
de la retina con la formación de la primera capa llamada capa nuclear externa
(CNE) (Fig. 5A), con células alargadas con un núcleo eucromatíco grande y de
forma alargado e irregular. El núcleo ocupó casi todo el volumen de la célula y
el citoplasma presentó retículo endoplásmico y algunas mitocondrias de gran
tamaño (Fig. 5B). En algunos espacios intercelulares se apreciaron los
cordones nerviosos (Fig. 5B). De igual manera, a nivel ultraestructural se
observó la diferenciación de la capa plexiforme externa. Se encontró una zona
delgada de transición entre la capa nuclear externa y el resto del mosaico de
celular sin diferenciación aparente. Esta capa era constituida por los axones de
las neuronas modificadas que conforman la CNE (Fig. 5C). En el interior de los
axones, en el axoplasma, se podían observar microtúbulos y microfilamentos
(Fig. 5C). A las 36 hde (3.09 ± 0.07) se observó la diferenciación de tres capas
más en la retina. En orden desde el exterior hacia el interior se observaron la
capa nuclear externa (CNE), capa plexiforme externa (CPE), capa nuclear
interna (CNI), capa plexiforme interna (CPI) y capa ganglionar (CG) (Fig. 2D).
26
Figura 5.- Retina en larvas del huachinango del Pacífico Lutjanus peru entre las 18 y 36 hde. A)
retina a las 18 hde, se oberva la capa nuclear externa (cne) en formación. técnica H-E, barra =
20μm. B) capa nuclear externa 18 hde, técnica MET, barra = 2μm. C) capa plexiforme externa
24 hde, nótese en el recuadro superior los microtúbulos y microfilamentos dentro de los
axones, técnica MET, barras, 500nm y 100nm en el recuadro. D) capas de la retina
diferenciada a las 36 hde, técnica H-E, barra = 5μm. cg, capa ganglionar; cne, capa nuclear
externa; cni, capa nuclear interna; cpi, capa plexiforme interna; cr, cristalino; m, mitocondria; N,
núcleo; re, retículo endoplásmico; flechas, cordones nerviosos.
27
A los 48 hde (3.31 mm ± 0.12), la morfología externa de las larvas se
encontró muy diferente de lo que se observó a la eclosión (Fig. 6A). Los ojos
eran pigmentados aunque la boca y el ano permanecían cerrados. En el ojo,
una delgada capa de pigmento epitelial se observó en la zona de la CNE, sin
embargo todavía un tanto difuso y aun escaso (Fig. 6B, comparece con la Fig.
6C). Se observaron también escasas células redondeadas en desarrollo. Eran
células fotorreptoras llamadas conos (Fig. 6B). El resto de las capas de la
retina eran fácilmente distinguible, sin embargo poco diferenciadas a nivel
celular (Fig. 6B). Al momento de la primera alimentación (70 hde, Lt: 3.44 ±
0.22mm) la retina era más diferenciada (Fig.6C). Se observaron ocho capas
principales: capa de pigmento epitelial (PE), capa de células fotorreceptoras o
conos (CO), capa nuclear externa (CNE), capa plexiforme externa (CPE), capa
nuclear interna (CNI), capa plexiforme interna (CPI), capa ganglionar (CCG) y
capa de fibras nerviosas (CFN) (Fig. 6C). La capa del pigmento epitelial
presentó mayor grado de arreglo y una mayor densidad de pigmento. En la
capa
de
células
fotorreceptoras
se
observaron
células
mayormente
diferenciadas y un mayor número de conos. La CNE era compuesta por una
sola hilera de células con núcleos alargados, eucromatícos y de forma más o
menos irregular. La CPE presentó un aspecto granuloso. Era constituida por
axones y/o dendritas de las células adyacentes (Fig. 6C, D). Dentro de la CNI
se encontraron desde el exterior hacia el interior, tres tipos diferentes de
células: las células horizontales orientadas de manera paralela a la superficie
de la retina (Fig. 6C, D), las células bipolares y finalmente, en el borde inferior,
las células amacrinas (Fig. 3C). La CPI tenía un aspecto muy similar a la CPE
pero era más ancha. La CCG era constituida por células ganglionares
conectadas al tallo óptico mediante una serie de fibras nerviosas que
constituyen la última capa de la retina (CFN) (Fig. 6C).
28
29
Figura 6.- Retina en larvas del huachinango del Pacífico Lutjanus peru entre las 48 y 70 hde. A)
Morfología externa de la larva a las 48 hde con ojo (oj) pigmentado, barra = 20μm. B)
estratificación de la retina a las 48 hde, técnica MET, barra = 2μm. C) retina diferenciada a las
70 hde mostrando las células bipolares (asteriscos) y células amacrinas (flechas blancas) en la
capa nuclear interna (cni), técnica MET, barra = 10μm. D) capa plexiforme externa (cpe) y capa
nuclear interna (cni) mostrando las células horizontales (ch), técnica TEM, barra = 2μm. b,
boca; ccg, capa ganglionar; cfn, capa de fibras nerviosas; cg, célula ganglionar; ch, células
horizontales; cne, capa nuclear externa; cni, capa nuclear interna; cpe, capa plexiforme
externa; cpi, capa plexiforme interna; co, capa de células fotorreceptoras (conos); cr, cristalino;
pe, capa de pigmento epitelial; td, tubo digestivo.
Pocas horas después de la primera alimentación se observó un
incremento en el número de conos y una mayor cantidad de pigmento en la PE
(Fig. 7A). El pigmento epitelial era dispuesto alrededor de las células
fotorreceptoras (conos) en un arreglo ordenado (Fig. 7B) e incluso unidos entre
sí (Fig 7C).
Figura 7.- Retina de larvas del huachinango del Pacífico Lutjanus peru a las 93 hde. A) parte
superior de la retina mostrando un denso pigmento epitelial (pe) y abundantes conos (co),
técnica H-E, barra = 5μm. B) corte transversal de la retina mostrando el arreglo del pigmento
epitelial (pe) y las células fotorreceptoras (co), técnica MET, barra = 2μm. C) corte transversal
de los conos mostrando en su interior los discos (di) y la fusión con el pigmento epitelial (pe),
técnica MET, barra= 500nm. se, segmento externo de los conos.
30
Dentro de los conos y del exterior al interior de la retina, se encontró el
segmento externo (SE), constituido por una serie homogénea de placas o
laminas planas también llamadas discos (Fig. 7C), seguido del segmento
interno, compuesto por el elipsoide (EL) y el mioide. El EL era unido al SE
mediante un cilio. En el mioide, se observaron algunos organelos como el
retículo endoplásmico (Fig. 8). En el segmento interno, se observaron algunas
mitocondrias. En la zona periférica donde convergen el SE y EL, se observó
una estructura conocida como proceso apical.
Figura 8.- Ultraestructura de los conos en la retina del huachinango del Pacífico Lutjanus peru a
las 93 hde, técnica MET, barra = 500nm. ap, proceso apical; ci, cilio; el, elipsoide; m,
mitocondria; mio, mioide; se, segmento externo.
31
7.2.1.2 Neuromastos
Morfológicamente,
los
neuromastos
libres
se
observaron
como
estructuras convexas que sobresalían de la superficie corporal de la larva.
Desde la eclosión, las larvas presentaron un par de neuromastos libres en la
región frontal, ligeramente por encima del hocico (el cual permaneció cerrado
hasta las 70 hde aproximadamente) (Fig. 9A). Se observaron de dos a tres
pares alrededor de los ojos (Fig. 9B) y de 4 a 5 pares en el tronco (Fig. 9C).
Figura 9.- Neuromastos libres en larvas del huachinango del Pacífico Lutjanus peru al momento
de la eclosión, técnica MEB. A) dos neuromastos frontales (flechas), barra = 50 μm. B) tres
neuromastos en la región del ojo (flechas), barra = 200μm. C) cuatro neuromastos en la región
del tronco (flechas), barra = 200μm; oj, ojo.
32
Los neuromastos eran constituidos por células sensoriales alargadas o
piriformes con un gran núcleo basal, grandes y alargadas mitocondrias, retículo
endoplásmico y complejo de Golgi. Eran rodeados por células de soporte (Fig.
10A.) En la región apical, de las células sensoriales, dos tipos de cilios se
observaron. El primer tipo se presentó como un conjunto de cilios relativamente
cortos llamados estereocilios y el segundo tipo más largo, como un solo cilio
llamado kinocilio (Fig. 10A, C). El kinocilio presentó una estructura típica fibrosa
con un arreglo 9+2 de sus microtúbulos (Fig. 10D). Al momento de la primera
alimentación (70 hde; Lt: 3.44 ± 0.22 mm) el único cambio aparente fue un
desplazamiento ascendente del par de neuromastos de la región frontal (Fig.
13C).
Figura 10.- Neuromastos libres en larvas del huachinango del Pacífico Lutjanus peru a las 18
hde, técnica MET. A) ultraestructura de un neuromasto, barra = 2μm. B) células sensoriales de
un neuromasto libre, barra = 500nm. C) región apical de un neuromasto, las flechas señalan los
estenocilios, barra = 500nm. D) estructura de un kinocilio mostrando el arreglo 9+2 de sus
microtúbulos, barras = 500nm y 100nm en el recuadro. cs, células sensoriales; cso, células de
soporte; G, aparato de Golgi; ki, kinocilio; m, mitocondria; N, núcleo; re, retículo endoplásmico.
33
7.2.1.3 Oído interno
Los oídos internos de las larvas se presentaron como estructuras
pareadas localizadas en el cráneo, cerca del cerebro medio. Al momento de la
eclosión, el oído interno se apreció como una vesícula ovalada que contenía
dos pares de otolitos de tejido cartilaginosos: el Lapillus y el Sagitta (Fig. 11A y
B).
Figura 11.- Oído interno en larvas del huachinango del Pacífico Lutjanus peru al momento de la
eclosión. A) región anterior dorsal, en el acercamiento (imagen derecha) se muestra la cámara
ótica (co) conteniendo un otolito (ot), técnica MEB, Barra de la sección izquierda = 200μm,
barra de sección derecha = 20 μm. B) vesícula ótica mostrando los otolitos, técnica H-E, barra
= 5μm. Lp: otolito Lapillus; oj, ojo; Sg: otolito Sagitta; co: vesícula ótica.
A las 24 hde, la cavidad ótica era relativamente más grande y
compuesta por un epitelio simple en la región dorsal y por un epitelio
estratificado en la región ventral, el cual era constituido por células de soporte y
células sensoriales formando la mácula (Fig. 12A y B). Ultraestructuralmente,
estas
células
sensoriales
presentaron
un
gran
núcleo
centro-basal,
mitocondrias supranucleares, grandes complejos de Golgi, así como grandes
cisternas de retículo endoplásmico con ribosomas unidos. Presentaron en la
región apical cilios o kinocilios (Fig. 12C). Se observó también una
comunicación entre los canales semicirculares (Fig. 12D).
34
Figura 12.- Oído interno en larvas del huachinango del Pacífico Lutjanus peru a las 24 hde A)
borde de la cámara ótica mostrando un epitelio simple (eps) y epitelio estratificado (epe),
técnica MET, barra = 10μm. B) epitelio sensorial de la cámara ótica, técnica MET, barra = 2μm.
C) ultraestructura de las células sensoriales, con la presencia de kinocilios (ki) técnica MET,
barra = 500nm. D) cámara ótica mostrando los canales semicirculares con sus otolitos, técnica
H-E, barra = 5μm. cs, célula sensorial; csa, cámara sacular; cso, celula de soporte; cu, cámara
utricular; G, aparato de Golgi; lu, lumen; m, mitocondria; N, núcleo; re, retículo endoplásmico.
35
7.2.1.4 Órgano olfativo
El órgano olfativo al momento de la eclosión era rudimentario. Sin
embargo, aunque los nostrilos aun permanecían cerrados, seis horas después
de la eclosión se observaron las lamelas de las placas olfativas (Fig. 13A). La
apertura de los nostrilos se observó a las 48 hdde (Fig. 13B), mientras que el
epitelio olfativo era presente en las larvas a las 70 hdde (primera alimentación)
(Fig. 13C). A esa edad, se observó que el epitelio olfativo era conectado al
bulbo olfatorio.
Figura 13.- Órgano olfativo en larvas del huachinango del Pacífico Lutjanus peru hasta el
momento de la primera alimentación. A) ubicación de las placas olfativas (po) a las 6 hde,
técnica MEB, barra = 5μm. B) parte frontal de una larva de 48 hde mostrando los nostrilios (no),
técnica MEB, barra = 30μm. C) región anterior de una larva de 70 hde mostrando el epitelio
olfativo (eo), técnica H-E, barra = 20μm. n, neuromasto libre; oj, ojo.
36
7.2.2 Desarrollo del aparato bucal
Al momento de la eclosión, las larvas presentaron una boca cerrada, en
posición subventral que carecía
de estructuras bucales. Las primeras
estructuras en desarrollarse fueron, el cartílago de Meckel, cuadrado, hioideo y
hiomandibular, las cuales se observaron en larvas de 3.31 ± 0.12 mm de Lt (48
hde). Sin embargo, presentaron un desarrollo limitado y la boca se encontraba
todavía cerrada (Fig. 14A). El interhial se observó a los 3.45±0.21 mm de Lt y
un ancho de boca de 0.208 ± 0.01 (70 hde). A esta talla, las larvas ya
presentaron la boca abierta (Fig. 14B). Al momento de iniciar la alimentación
exógena, las larvas presentaron una longitud total promedio de 3.72 ± 0.19 mm
y un ancho de la boca de 0.22 ± 0.02 mm (93 hde). Las estructuras presentes
incrementaron en diámetro (Fig. 14C) y se observó la presencia de cuatro
pares de arcos branquiales (Fig. 15A). Además de presentar la boca abierta, se
observaron movimientos permitidos por dos articulaciones entre el cartílago de
Meckels y el cuadrado, y entre el hiomandibular y el cráneo.
Todas las estructuras que componen el aparato bucal hasta esta edad
eran constituidas por cartílago hialino, el cual era formado por una abundante
matriz extracelular ubicando a los condrocitos en espacios vacíos llamados
lagunas (Fig. 15B). La matriz extracelular de los condrocitos era compuesta de
fibras de colágeno y acido hialurónico (Fig. 15C, D). Cada placa de tejido
cartilaginoso, estuvo rodeada por el pericondrio compuesto de tejido conjuntivo
denso en el cual se distinguía una capa externa fibrosa y una capa interna
celular. Es esta capa, se observan algunas células que pueden dar origen a
condroblastos que son los precursores de los condrocitos (células maduras)
(Fig. 15D). Dentro de una misma placa de tejido cartilaginoso los condrocitos
estaban
separados
por
la
matriz
interterritorial,
que
principalmente de colágeno tipo II y glicoproteinas (Fig. 15B).
37
esta
formada
Figura 14.- Ilustración del desarrollo de estructuras que componen el aparato bucal en larvas
del huachinango del Pacífico Lutjanus peru. c, cuadrado; cM, cartílago de Meckel; hi, hiodeo;
hm, hiomandibular; ih, interhial. Las abreviaturas: hde, horas después de la eclosión; Lt,
longitud total.
38
Figura 15.- Estructura del cartílago en larvas del huachinango del Pacífico Lutjanus peru al
momento de la primera alimentación. A) corte longitudinal de la región anterior mostrando
cuatro pares de arcos branquiales (a), técnica H-E, barra = 10μm. B) cartílago de Meckel
mostrando los condrocitos (c), técnica MET, barra = 10μm. C) placa de tejido cartilaginoso
mostrando la capa interna celular (cic) y la capa externa fibrosa (cef) del pericondrio (pc),
técnica MET, barra = 10μm. D) ultraestructura de un condrocito, técnica MET, barra = 2μm. al,
aleta; c, condrocitos; cM, cartílago de Meckel; fc, fibras de colágeno; mt, matriz territorial; mit,
matriz interterritorial; N, núcleo; re, retículo endoplásmico; v, vesícula de secreción.
39
7.2.3 Sistema digestivo
El tracto digestivo de las larvas de huachinango, al momento de la
eclosión, se observó como un simple tubo recto e indiferenciado localizado
sobre el saco de vitelo (Fig. 16A). No se distinguían la boca ni el ano (Fig. 16A
y B). Se observó un epitelio simple cuboidal recubriendo el tracto digestivo el
cual presentó un lumen muy estrecho (Fig. 16B). En la región media del tracto
digestivo, se pudo observar las células del epitelio, sentadas sobre una delgada
capa o lámina basal que a su vez descansó sobre una capa de tejido
subepitelial. Las células epiteliales presentaron un gran núcleo de forma
irregular, así como numerosas mitocondrias, retículo endoplásmico rugoso,
ribosomas dispersos y aparatos de Golgi (Fig. 17A). En posición supranuclear
se observaron cuerpos vesiculares con estructuras membranosas y material
electrodenso rodeado por un halo irregular. El borde apical del epitelio presentó
pequeñas microvellosidades (menores de 100 nm) en aparente desarrollo y
ligadas al citoplasma mediante complejos de unión (Fig. 17A y B). Tanto el
hígado como el páncreas se observaron como un pequeño conjunto de células
indiferenciadas (Fig. 16C). Alrededor de las 18 hde se observó el inicio del
ensanchamiento del tubo digestivo en su región anterior y un incremento de
tamaño tanto en páncreas como en hígado (Fig. 18A). El hígado se encontró
rodeado por tejido conjuntivo (Fig. 18B). Los hepatocitos presentaron un gran
núcleo ocupando alrededor de dos terceras partes de la célula, mientras que en
el citoplasma se observó una gran cantidad de mitocondrias y retículo
endoplásmico (Fig. 18C).
40
Figura 16.- Larvas de huachinango del Pacifico Lutjanus peru al momento de la eclosión. A)
estructura general, técnica H-E, barra = 10μm. B) tubo digestivo (td) con el lumen estrecho (*),
técnica H-E, barra = 10μm. C) región anterior de una larva mostrando el desarrollo incipiente
del hígado (h) y el páncreas (p), técnica H-E, barra = 25μm. c, corazón; enc, encéfalo; ga,
glóbulo de aceite; mt, musculatura troncal; oj, ojo; td, tubo digestivo; v, saco de vitelo.
41
Figura 17.- Ultraestructura de la región media del tracto digestivo de larvas del huachinango del
Pacífico Lutjanus peru al momento de la eclosión, técnica MET. A) futuro intestino anterior
compuesto por el tejido subepitelial (tse), la lamina basal (lb) y los enterocitos. B) zona apical
del futuro intestino anterior mostrando pequeñas microvellosidades en desarrollo (flechas).
Barras = 500nm; cu, complejo de unión; G, aparato de Golgi; lu, lumen; m, mitocondrias; me,
material electrodenso; N, núcleo; cv, cuerpos vesiculares.
Figura 18.- Estructura del hígado en larvas del huachinango del Pacífico Lutjanus peru a las 18
hde. A) región ventral de la larva, técnica H-E, barra = 10μm. B) corte transversal del hígado
mostrando los hepatocitos (hp), técnica MET, barra = 2μm. C) ultraestructura de un hepatocito
mostrando un prominente núcleo (N), técnica MET, barra = 500nm. ga, glóbulo de aceite; h,
hígado; m, mitocondrias; mt, musculatura troncal; oj, ojo; p, páncreas, re, retículo
endoplásmico; tc, tejido conectivo; td, tubo digestivo; v, saco de vitelo.
42
A las 48 hde se observó de manera externa cierta diferenciación e
incremento de tamaño del tubo digestivo, así como un incremento en el tamaño
del hígado y páncreas (Fig. 19A). El intestino anterior se apreció como una
especie de saco alargado y más dilatado en su porción rostral, seguido de la
válvula intestinal en formación (Fig. 19A). Finalmente, la región posterior
también presentó un mayor ensanchamiento y una curvatura en un ángulo de
90º, sin embargo el ano aun no era abierto. A nivel histológico se pudo
observar una regionalización del tracto digestivo: cavidad bucofaríngea,
esófago e intestino anterior y posterior (Fig. 19B). La cavidad bucofaríngea era
comunicada con el intestino anterior a través del esófago que apareció como
una región corta y de lumen estrecho, recubierto por un epitelio escamoso
simple (Fig. 19B). Tanto el intestino anterior y posterior eran recubiertos por un
epitelio
columnar
simple
con
microvellosidades
desarrolladas.
Ultraestructuralmente, sus células presentaron un núcleo eucromatíco con un
espacio perinuclear dilatado, un gran número de ribosomas libres dispersos por
toda la célula (Fig. 20A) y mitocondrias rodeadas por estructuras lamelares
(Fig. 20B). Se presentaron también mitocondrias ramificadas y mitocondrias en
aparente degradación, con un menor número de crestas en su interior y una
matriz electrolúcida (Fig. 20B). En el borde plumoso de los enterocitos se
observaron las microvellosidades con un casquete apical electrodenso (Fig.
20A).
43
Figura 19.- Morfología de larvas del huachinango del Pacífico Lutjanus peru a las 48 hde. A)
morfología externa, barra = 20μm. B) regionalización del tracto digestivo, técnica H-E, barra =
50μm. b, boca; cbf, cavidad bucofaríngea; e, esófago; h, hígado; ia, intestino anterior; ip,
intestino posterior; mt, musculatura troncal; p, páncreas.
44
A esta misma edad, se observó una diferenciación de las glándulas
accesorias como el hígado y páncreas (Fig. 19B). El páncreas era fácilmente
detectable en posición dorsal del intestino anterior, aunque se pudo observar
también rodeando al intestino, y conectándose a este por medio del conducto
pancreático o canal de Wirsung, compuesto de células cúbicas (Fig. 21A).
Dentro del tejido pancreático se observó el primer islote de Langerhans
constituido por células endocrinas unidas entre sí en el seno del tejido
pancreático exocrino. Las células endocrinas presentaron un núcleo de
contorno irregular y alargado y en su citoplasma exhibieron algunas
mitocondrias, retículo endoplásmico y escasos gránulos endocrinos de
contenido relativamente electrodenso, y en ocasiones, rodeados por un
delgado halo claro (Fig. 21B). El páncreas exocrino, el cual se encontró
rodeando al islote de Langerhans, era compuesto de grandes células redondas
con un gran núcleo relativamente céntrico. El citoplasma de estas células era
ocupado por mitocondrias y retículo endoplásmico. Igualmente se apreciaron
vesículas y vacuolas de diferentes tamaños y de contenido electrodenso de
variable intensidad que diferencia a los diferentes estadios de la formación de
gránulos de zimógeno (Fig. 21B). El hígado localizado en posición ventral del
esófago (Fig. 19b) presentó hepatocitos con un núcleo grande y más o menos
central, grandes y abundantes mitocondrias, así como complejos de Golgi y
abundantes ribosomas libres (Fig. 21C). Se observaron también los sinusoides
con un gran espacio de Disse (espacio perisinusoidal) y algunos canalículos
biliares con aparentes microvellosidades (Fig. 21C). En posición supranuclear,
se observaron algunas inclusiones de material electrodenso las cuales al
parecer son material de reserva como el glucógeno. Se observaron también
otras inclusiones transparentes las cuales corresponden a lipoproteínas (Fig.
21C).
45
Figura 20.- Ultraestructura del intestino en larvas del huachinango del Pacífico Lutjanus peru a
las 48 hde, técnica MET. A) región apical del intestino mostrando la presencia de las
microvellosidades (mic). B) región sub-nuclear mostrando estructuras lamelares (el) unidas a
las mitocondrias (m), la flecha indica el espacio intercelular Barras = 500nm. lu, lumen; m,
mitocondrias; me, material electrodenso; mr, mitocondrias ramificadas; N, núcleo; asterisco,
mitocondrias en aparente degeneración.
46
Figura 21.- Estructura del páncreas e hígado en larvas del huachinango del Pacífico Lutjanus
peru a las 48 horas después de la eclosión. A) corte transversal del tracto digestivo mostrando
el páncreas (p) y el conducto pancreático (cp), técnica H-E, barra = 1μm. B) ultraestructura del
páncreas endocrino mostrando un islote de Langerhans (IL) con pequeños gránulos endocrinos
(flechas) y el páncreas exocrino (Ex) mostrando gránulos de zimógeno (z), técnica MET, barra
= 2μm. C) ultraestructura del hígado mostrando gránulos de glucógeno (gl) y lipoproteínas (lp),
técnica MET, barra = 2μm. cb, canales biliares; cp, conducto pancreático, eD, espacio de
Disse; ia, intestino anterior; m, mitocondria; N, núcleo; re, retículo endoplásmico; s, sinusoide.
47
Al inicio de la primera alimentación (70 hde), la cavidad bucofaríngea
presentó cuatro pares de arcos branquiales (Fig. 15A). El esófago era cubierto
de un epitelio con células caliciformes con un gran núcleo en posición central,
escasas mitocondrias y una gran cantidad de retículo endoplásmico (Fig. 22A).
En la región apical del epitelio se observó una gran cantidad de vesículas de
secreción expulsadas mediante la evaginación de la membrana celular (Fig.
22A). Seguido del esófago se observó el estómago en desarrollo, que consistió
en un tubo recto y corto de lumen más amplio y sin repliegues agudos como es
el caso del intestino. Era tapizado por una simple capa de células de tipo
columnar (Fig. 22B). Las células epiteliales del estómago presentaron un
núcleo eucromático de forma irregular ocupando gran parte del volumen celular
y rodeado por un espacio perinuclear ligeramente dilatado. Por encima del
núcleo, se observaron generalmente los complejos de Golgi (Fig. 22C). En la
zona apical del citoplasma se apreciaron escasas vesículas. En la membrana
plasmática, se observaron escasas microvellosidades apicales, cortas,
irregulares y sin casquete apical electrodenso como en el caso del intestino. En
el lumen estomacal, se presentaron estructuras membranosas cerradas, que
probablemente representaban secciones de estructuras globulares con
contenido electrolúcido similar al del lumen (Fig. 22C). La lámina basal,
formada
por una capa delgada con aspecto claro era continua. El tejido
subepitelial era constituido por una capa de una a dos células indiferenciadas
de forma más o menos alargadas, de contorno irregular y de tipo
mesenquimatoso que mostrarón un núcleo alargado y eucromatíco y en su
citoplasma, ribosomas dispersos y escasos complejos de Golgi. El (Fig. 22D).
Finalmente, a las 93 hde, en el intestino se observaron repliegues en la
mucosa más pronunciados y en posición supranuclear, una mayor cantidad de
mitocondrias ramificadas (Fig. 22E). Una mayor cantidad de microvellosidades
de mayor tamaño y con algunas ramificaciones se observaron en el bordo
plumoso (Fig. 22E). Una válvula compuesta de epitelio columnar simple y fibras
musculares se observó entre el intestino anterior y posterior (Fig. 22F).
48
49
Figura 22.- Tubo digestivo en larvas del huachinango del Pacífico Lutjanus peru después de la
primera alimentación. a-d, 72 hde y e-f, 93 hde. A) corte transversal del esófago con algunas
vesículas de secreción (vs), técnica MET, barra = 2μm. B) corte transversal del tracto digestivo
mostrando el desarrollo del futuro estomago (es), técnica H-E, barra = 5μm. C) estómago
mostrando algunas vesículas de pinocitosis (vp) y en la región apical escasas
microvellosidades (mic), técnica MET, barras = 2μm. D) estómago envuelto en una capa de
tejido subepitelial (tse) y lamina basal (lb), técnica MET, barra = 1μm. E) intestino bien
desarrollado con abundantes y alargadas microvellosidades (mic), técnica MET, barra =
500nm. F) válvula intestinal (vi) separando ambos intestinos, técnica H-E, barra = 5μm. cu,
complejo de unión; el, estructura lamelar; em, estructura membranosa; G, aparato de Golgi; h,
hígado: ia, intestino anterior; ip, intestino posterior; lu, lumen; m, mitocondria; mr, mitocondria
ramificada; N, núcleo; p, páncreas; re, retículo endoplásmico.
50
7.3 Eficiencia en la alimentación exógena
En todos los experimentos, se observó que las larvas presentaron
alimento en el tracto digestivo a las 6 horas después de habérselos
proporcionado. El rango de talla de las larvas al momento de la primera
alimentación (74-80 hde) fue de 3.22 a 3.76 y con un ancho de boca de 2.07 a
2.26.
7.3.1 Temperatura de incubación
En este experimento no se presentaron diferencias significativas en la
eficiencia alimenticia (p>0.05) entre las temperaturas de incubación (Fig. 23A y
B). La incidencia alimenticia fue de 29.6 ± 4.4 a 26 ºC, 26.9 ± 5.4 a 28 ºC y 31.1
± 3.8 a 30 ºC. La intensidad alimenticia fue de 1.1 ± 0.1 a 26 ºC, 1.1 ± 0.2 a 28
ºC y de 1.1 ± 0.1 a 30 ºC.
40
A
1,4
B
a
a
Número de presas por larva
a
Larvas con alimento (%)
a
a
a
1,2
30
20
10
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0,0
26
28
30
26
Temperatura de incubación (ºC)
28
30
Temperatura de incubación (%)
Figura 23.- Eficiencia alimenticia en larvas del huachinango del Pacífico Lutjanus peru
incubadas a diferentes temperaturas. A) incidencia alimenticia, y B) intensidad alimenticia.
Letras diferentes indican diferencias significativas (p<0.05).
51
7.3.2 Efecto de la intensidad de luz, tipo de presa y color del tanque
En cuanto al color del tanque, no se presentaron diferencias
significativas sobre la incidencia alimenticia (p=0.493), ni en la intensidad
alimenticia (p=0.195). De manera general, la incidencia alimenticia fue menor al
25% en todos los tratamientos (Fig. 24A). Se observaron diferencias
significativas para el tipo de presa e intensidad de luz. De la misma manera se
observó una interacción significativa entre estos dos factores. A 3000 lux no
hubo diferencias significativas entre el tipo de presa, a 2500 y 2000 lux la
incidencia alimenticia fue significativamente mayor con nauplios de copépodos.
Sin embargo, es importante mencionar que con 3000 lux, no hubo consumo de
neonatos de rotíferos en el tratamiento de dieta mixta. En cuanto a la
intensidad alimenticia, no se observó diferencias significativas (p>0.05) para
ningún factor. El número promedio de presas por larva fue de 1.1 ± 0.1 nauplios
(Fig. 24B).
1,6
25
N
M
A
a
B
1,4
a
Número de presas por larva
Larvas con alimento (%)
20
b
b
15
c
c
10
5
1,2
N
M
a
a
a
a
a
a
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0
3000
2500
3000
2000
2500
2000
Intensidad de luz (Lux)
Intensidad de luz (Lux)
Figura 24.- Eficiencia alimenticia en larvas del huachinango del Pacífico Lutjanus peru
alimentadas bajo diferentes condiciones de luz y tipo de presa, durante la primera alimentación
exógena. A) incidencia alimenticia, y B) intensidad alimenticia. N=nauplios de copépodos E.
acutifrons; M= mezcla de nauplios de E. acutifrons y neonatos de rotíferos B. rotundiformis en
una proporción 1:1. Letras diferentes indican diferencias significativas (p<0.05).
52
7.3.3 Talla de presa y densidad
La incidencia alimenticia mostró diferencias significativas, con respecto a
la talla del nauplio. Se observó que la mayor (p=0.00001) incidencia alimenticia
fue con nauplios I-III (Fig. 25A). En cuanto a la densidad de presa, la menor
incidencia (p=0.001) se observó a 5 nauplios ml-1, mientras que no hubo
diferencias (p=0.38) entre 10 y 15 nauplios ml-1. Se observó una interacción
(p=0.002) entre los factores talla del nauplio y la densidad. La incidencia
alimenticia fue mayor (p=0.01) en el tratamiento con 5 nauplios ml -1 de talla 46
± 8μm (estadio I-III) que en los tratamientos de 5, 10 y 15 nauplios ml -1 a una
talla de 72 ± 12μm (estadio IV-VI) (Fig. 25A). La intensidad alimenticia no
mostró diferencias significativas (p>0.05), el número promedio de presas
consumidas fue de 1.1 ± 0.2 nauplios larva-1(Fig. 25B).
b
15 nauplios/ml
30
a
20
c
10
c
5 nauplios/ml
10 nauplios/ml
B
5 nauplios/ml
10 nauplios/ml
15 nauplios/ml
Número de presas por larva
A
Larvas con alimento (%)
2,5
b
40
a
2,0
a
1,5
a
a
a
a
1,0
0,5
c
0,0
0
I-III
I-III
IV-VI
IV-VI
Estadio naupliar
Estadio naupliar
Figura 25.- Eficiencia alimenticia en larvas del huachinango del Pacífico Lutjanus peru
alimentadas con nauplios de copépodos de diferentes estadios (I-III y IV-VI) y densidad. A)
incidencia alimenticia, y B) intensidad alimenticia. Letras diferentes indican diferencias
significativas (p<0.05)
53
7.3.4 Temperatura del agua y salinidad
La incidencia alimenticia fue afectada solo por la temperatura del agua.
La mayor (p=0.0003) incidencia se presentó a temperatura de 25 ºC (Fig. 26A).
En cuanto a la salinidad, no hubo diferencias significativas (p=0.149). La
interacción entre los factores no fue significativa (p=0.549). La intensidad
alimenticia no mostro diferencias significativas (p>0.05) para ningún factor, el
número promedio de nauplios consumidos fue de 1.3 ± 0.1 presas larva-1 (Fig.
26B).
1,8
70
25 ups
30 ups
35 ups
a
60
Larvas con alimento (%)
a
a
50
40
b
b
30
b
20
1,6
Número de presas por larva
A
10
a
B
25 ups
30 ups
35 ups
a
a
a
1,4
a
a
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0
25
25
28
28
Temperatura de alimentación (ºC)
Temperatura de alimentación (ºC)
Figura 26.- Eficiencia alimenticia en larvas del huachinango del Pacífico Lutjanus peru
alimentadas a diferentes temperaturas y salinidades. A) incidencia alimenticia, y B) intensidad
alimenticia. Letras diferentes indican diferencias significativas (p<0.05).
54
7.3.5 Concentración de microalga y densidad de presa
No
se
observaron
diferencias
significativas
(p>0.05)
para
la
concentración de microalga y tampoco para la densidad de presa (Fig. 27A y
B). El valor promedio de la incidencia alimenticia fue de 21.7 ± 2.2, mientras
que la intensidad alimenticia fue 1.2 ± 0.1.
40
15 nauplii/ml
1,6
a
Número de presas por larva
Larvas con alimento (%)
a
30
B
15 nauplios/ml
a
10 nauplii/ml
1,8
10 nauplios/ml
A
a
a
a
20
10
1,4
a
a
a
a
a
a
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0
0
300
0
1000
300
1000
Concentración de microalgas (miles de celulas/ml)
Concentración de microalgas (miles de células/ml)
Figura 27.- Eficiencia alimenticia en larvas del huachinango del Pacífico Lutjanus peru
alimentadas a diferentes concentraciones de microalga Nannochloropsis oculata y diferentes
densidades de presa. a) Incidencia alimenticia, b) Intensidad alimenticia.
55
VIII. DISCUSIÓN
8.1 Aspectos generales del desarrollo
En Lutjanus peru, el diámetro promedio del huevo fue de 0.82 mm, la larva
eclosionó en 2.45 mm de LT y al momento de la primera alimentación midió
alrededor de 3.45 mm de LT. Estos datos son similares a lo registrado para
otras especies de la Familia Lutjanidae (Leu et al., 2003). En el huachinango, la
completa reabsorción del vitelo se observó entre las 55-60 hde. La absorción
de las reservas vitelinas se da mediante el periblasto o sincitio el cual era
compuesto de
una membrana multi-nucleada
con
gran cantidad de
mitocondrias, parches de retículo endoplásmico y complejos de Golgi, al igual
que en otras especies como Stizostedion lucioperca (Mani-Ponset et al., 1994),
Perca fluviatilis (Krieger & Fleig, 1999). Heming & Buddington (1988)
mencionan que se pueden distinguir dos regiones a nivel ultraestructural. La
primera, caracterizada por la presencia de retículo endoplásmico liso,
numerosos mitocondrias y gránulos de glucógeno, e involucrada con el
metabolismo de carbohidratos y lípidos; y la segunda, caracterizada por la
presencia de retículo endoplásmico rugoso y complejos de Golgi, involucrada
en la síntesis y transporte de sustancias proteicas.
Al inicio de la alimentación exógena (3 días después de la eclosión) las larvas
presentan la boca y ano abiertos. El tiempo de inicio de la alimentación varía
según la especie y la temperatura; por ejemplo, en Sigannus guttatus, Lates
calcarifer (Avila & Juario, 1987) y Scophthalmus rhombus (Hachero-Cruzado et
al., 2009) se da al día 1 después de la eclosión (DE); en Paralabrax
maculatofasciatus se da al día 2 DE (Peña et al., 2003); en Sparus aurata
(Calzada, 1996), Paralichthys californicus (Gisbert et al., 2004) y Lutjanus peru
(Zavala-Leal, 2007) al día 3 DE; mientras que en Stizostedion lucioperca se da
entre 5-6 días DE (Mani-Ponset et al., 1996). En este estudio se observó que la
apertura de la boca y ano, coincidieron con la diferenciación o regionalización
del tracto digestivo como se ha mencionado para otras especies (HacheroCruzado et al., 2009; Gisbert et al., 2004). Además, coincidió con la presencia
de pigmento en el ojo lo que le confiere funcionalidad (Porter & Theilacker;
1999; Roo et al., 1999) y con la presencia de una musculatura troncal bien
56
desarrollada que rodea la notocorda, una aleta media o pliegue que rodea todo
el cuerpo y un par de aletas pectorales, lo cual permite tener un nado activo y
ataque sobre su presa (Osse & Akser, 1996) para poder capturarla e ingerirla.
8.2 Desarrollo estructural
La mayoría de los estudios realizados sobre el desarrollo del ojo y el tubo
digestivo en peces se han realizado mediante técnicas histológicas
convencionales (Sarasquete et al., 1995; Porter & Theilacker, 1999; Roo et al.,
1999; Peña et al., 2003; Peña & Dumas, 2007). Y los que se realizan a nivel
ultraestructural solo describen el periodo exotrófico (Avila & Juario, 1987;
Deplano et al., 1991; Segner et al., 1994; Calzada et al., 1998; Elbal et al.,
2004). El presente trabajo describe de una manera más detallada el desarrollo
ontogénico de los órganos sensoriales, sistema digestivo y aparato bucal de
Lutjanus peru desde el momento de la eclosión hasta el inicio de la primera
alimentación, periodo en el cual se presentan los mayores cambios
ontogénicos (Calzada, 1996; Hunt von Herbing et al., 1996; Matsuoka, 2001;
Rodríguez & Gisbert, 2001; Peña & Dumas, 2007), haciendo más completo el
estudio de la organogénesis.
Los resultados de la presente tesis describen el desarrollo de cada uno de los
órganos o estructuras antes mencionadas, sin embargo, con la finalidad de
presentar una mejor perspectiva sobre el desarrollo de las larvas de
huachinango del Pacífico me he permitido realizar una discusión basada en las
diferentes etapas del desarrollo de los organismos como lo son la eclosión,
periodo de alimentación endógena y la primera alimentación exógena.
57
8.2.1 Eclosión (0 hde)
Los peces de ontogenia indirecta, como es el caso del huachinango, eclosionan
con un bajo grado de desarrollo (Kendall et al., 1984). Al igual como se ha
observado en otras especies (Porter & Theilacker, 1999), los sistemas visual y
digestivo presentaron escaso desarrollo, ambos compuestos de células
indiferenciadas. La retina se observó, sin estratificación y con un arreglo
concéntrico como sucede en otras especies (Kawamura & Ishida, 1985;
Kawamura et al., 2003; Peña & Dumas, 2007). El tracto digestivo apareció
como un tubo recto e indiferenciado, situado en la parte dorsal del saco de
vitelo. La boca y ano permanecían cerrados. El epitelio digestivo no era
diferenciado y constó de una sola capa de células cuboidales, con núcleos
basales y con algunas microvellosidades cortas en la región apical tal y como
se ha descrito también en Scophthalmus rhombus (Hachero-Cruzado et al.,
2009). En Sparus aurata se observó que, al igual como sucede en el
huachinango las células epiteliales del tracto digestivo poseen características
embrionarias, como son: la presencia de cilios, núcleos voluminosos,
eucromatícos y de forma irregular, escases de organelos y numerosas
mitocondrias alargadas. Sin embargo, como lo ha descrito Calzada (1996), es
posible detectar algunas señales de diferenciación y una regionalización del
tracto digestivo en 5 regiones. La presencia de algunas estructuras
membranosas en la luz del tubo digestivo aún no es muy clara, sin embargo,
Calzada (1996) quien reporta su presencia en Sparus aurata, menciona que
podrían ser restos celulares procedentes del recambio celular y que mientras
no se abre el ano permanecen en la luz del tubo digestivo, evacuándose con la
apertura de este. Las glándulas accesorias como el hígado y el páncreas, se
observan como un conjunto de células indiferenciadas como en muchas otras
especies (Morrison, 1993; Hamlin et al., 2000; Peña et al., 2003) en forma de
parches compactos.
Las estructuras que presentaron mayor grado de desarrollo al momento de la
eclosión fueron órganos sensoriales como neuromastos libres, el oído interno y
el órgano olfativo. En L. peru, se observaron de 2-3 pares de neuromastos en
la región cefálica y de 4-5 en el tronco. El número de neuromastos presentes,
varía de acuerdo a la especie y la edad (Matsuoka, 2001; Diaz et al., 2003;
58
Kawamura et al., 2003). Presentaron células sensoriales con estenocilios y
kinocilios. Su presencia denota funcionalidad como es reportado para Thunnus
orientalis (Kawamura et al., 2003) lo cual le
permite detectar o evadir
depredadores.
Se conoce poco sobre el desarrollo temprano del oido interno (Matsuoka, 2001)
y su funcionalidad en los primeros días de vida (Baxter, 1986). En el
huachinango, al igual que en otras especies como Sardinops melanostictus
(Matsuoka, 2001), Paralichthys olivaceus (Kawamura & Ischida, 1985),
Oxyeleotris marmoratus (Senoo et al., 1994), el oído interno, al momento de la
eclosión, se presentó como una vesícula ovalada con dos otolitos. La mácula
fue detectada alrededor de las 24 hde mientras que en S. melanostictus se
presenta una mácula bien desarrollada desde la eclosión. Kawamura & Ishida
(1985) mencionan que la presencia de la mácula otorga a la larva la capacidad
de orientarse horizontalmente lo que se acompaña de un mejor nado. En L.
peru se ha observado que a las 24 hde cuando ya esta presente la macula, las
larvas presentan una mayor capacidad de nado, es decir, nadan de una
manera dirigida y no errática como al momento de la eclosión.
Otra estructura sensorial presente al momento de la eclosión es el órgano
olfatorio (Ishida & Kawamura, 1985; Kawamura & Ishida, 1985). En Sardinops
melanostictus las placas olfativas se observan desde 4 hde (Matsuoka, 2001)
mientras que en el huachinango se observó la presencia de las placas olfativas
en el segundo muestreo o sea 6 hde. Existe la posibilidad que hayan estado
presentes antes pero no se ha observado entre la eclosión y 6 hde. Por otra
parte, en otras especies aparecen días después de la eclosión (Appelbaum et
al., 1983; Kawamura & Washiyama, 1989). En especies como
Engraulis
mordax (O`connell, 1981), Sardinops melanostictus (Matsuoka, 2001) y
Thunnus orientalis (Kawamura et al., 2003), se observó que con la formación
de las placas olfativas se encuentran dos tipos de células receptoras, ciliadas y
con microvellosidades. Sin embargo, en las muestras revisadas no se
encontraron estos tipos de células. Kawamura (1991) sugiere que el órgano
olfativo es funcional antes de la pigmentación de los ojos y la apertura de la
boca, debido a la conexión que existe entre el bulbo olfativo y el cerebro, y la
apertura de los nostrilos.
59
8.2.2 Periodo de alimentación endógena (6 - 48 hde)
En larvas de huachinango se presentaron notorios cambios en la morfología de
la retina, el aparato bucal y el tracto digestivo entre 24-48 hde. De manera
general se ha reportado que los cambios más agudos se presentan en órganos
asociados a la localización de presas (retina), captura (boca), ingestión y
digestión (sistema digestivo) (Yúfera & Darias, 2007). Lo que puede ser
atribuido al hecho que el cambio de alimentación endógena a exógena implica
que, en un tiempo relativamente corto, procesos complejos y altamente
dinámicos de diferenciación de órganos, morfogénesis y crecimiento se lleven a
cabo (Sala et al., 2005).
La retina mostró una estratificación iniciando con la formación de la capa
nuclear externa (CNE), conformada por células precursoras de los conos,
seguida de la capa plexiforme interna (CPE). Posteriormente inicia el desarrollo
de otras capas, siendo la aparición de la capa ganglionar (CG) la que sugiere
una posible conexión entre la retina y el tallo óptico antes de la aparición del
segmento externo de los conos como ha sido observado en previos estudios
sobre el desarrollo simultáneo de la retina y el cerebro (Powers & Raymond,
1990). No obstante, Kawamura et al. (1984) mencionan que el ojo es funcional
solamente cuando se desarrolla completamente la capa de pigmento epitelial.
En especies como Paralichthys olivaceus (Kawamura & Ishida, 1985), Theregra
chalcogramma (Porter & Theilacker, 1999), Pagrus pagrus (Roo et al., 1999),
Paralabrax maculatofasciatus (Peña & Dumas, 2007) se ha observado el
mismo grado de desarrollo en este periodo, lo cual nos puede indicar la falta de
funcionalidad.
Las estructuras bucales inician su desarrollo antes de la apertura de la boca
(Kohno, 1998), e incluso en algunas especies desde el momento de la eclosión
(Hunt von Herbing et al., 1996). En el presente estudio, se describen
únicamente las estructuras esqueléticas de la cavidad bucal, sin incluir las
estructuras viscero-craniales y la musculatura. En el huachinango, el aparato
bucal fue formado por cuatro estructuras cartilaginosas en desarrollo
(cuadrado, cartílago de Meckel, hioideo e hiomandibular) como sucede en
Gadus morhua y Pseudopleuronectes americanus (Hunt von Herbing, 2001),
60
las cuales son las encargadas de dar soporte y movimiento a las mandíbulas
una vez desarrolladas.
Conforme se estaban desarrollando la retina y el aparato bucal, se observó
una regionalización del tracto digestivo, confirmando lo que varios autores han
mencionado, es decir, una sincronía en el desarrollo de los principales órganos
asociados a la localización de presas, captura, ingestión y digestión como en
otras especies de peces (Roo et al., 1999; Yúfera & Darias, 2007). Las
regiones parcialmente diferenciadas en este periodo fueron la cavidad
bucofaríngea, esófago, intestino anterior e intestino posterior. Calzada (1996)
en larvas de Sparus aurata describió 5 regiones del tracto digestivo (esófago,
estómago, intestino medio, posterior y recto) mediante la técnica de
microscopia
electrónica
de
transmisión,
mientras
que
Sarasquete
y
colaboradores (1995) en la misma especie describen solamente tres regiones
(esófago, estomago rudimentario e intestinos), mediante técnicas de histología
convencional. Calzada, (1996) menciona que estas diferencias pueden estar
más relacionadas con las técnicas de análisis debido a que las principales
diferencias se dan a nivel epitelial o celular y que son detectadas más
fácilmente con la microscopia electrónica.
En el huachinango, el tracto digestivo estaba recubierto por un epitelio simple
(en algunos casos llamado monoestratificado) y de tipo escamoso en la
cavidad
bucofaríngea
y
el
esófago,
como
sucede
en
Paralabrax
maculatofasciatus (Peña et al., 2003), Dentex dentex (Gisbert et al., 2004) y
Sparus aurata (Calzada, 1996). Sin embargo, en esta última especie se
observaron dos tipos de epitelios, uno escamoso y otro cuboidal, atribuido al
inicio del desarrollo del futuro estómago (Calzada 1996) lo cual no se observó
en L. peru. El intestino anterior y posterior no presentó grandes diferencias
morfológicas. La principal diferencia es el mayor ensanchamiento del intestino
anterior. Estas regiones son separadas por una válvula en desarrollo, la cual se
forma por plegamiento de la mucosa (Calzada, 1996). Ambas regiones son
similares a nivel de epitelial. El epitelio es de tipo columnar, aunque en otras
especies también se han reportado de tipo cilíndricas (Calzada et al., 1998) o
piramidal (Elbal et al., 2004). Las células epiteliales presentan núcleos
prominentes eucromatínicos característicos de la división celular (mitosis)
61
(Stroband & Debets, 1978), la cual es mayor en el intestino anterior
reflejándose en la gran cantidad de pliegues formados (Stroband & Debets,
1978; Rombout et al., 1984). Además, una gran cantidad de mitocondrias de
forma alargada y en algunos casos se observan rodeadas de estructuras
lamelares las cuales parecen ser típicas de los intestinos de peces teleósteos
(Calzada et al., 1998) y cuya función aun sigue siendo objeto de controversia.
Se les ha atribuido un rol en el transporte de partículas lipo-proteicas desde los
enterocitos hacia los espacios extracelulares (Deplano et al., 1991; OstosGarrido et al., 1993), pero también se ha señalado su función en el transporte
de agua e iones (Yamamoto, 1966; Stroband, 1977; Calzada, 1996). La
presencia de las estructuras lamelares asociadas a las mitocondrias quizá sea
debido a la demanda de energía necesaria para los procesos de
osmoregulación (Calzada et al., 1998). El borde apical del epitelio intestinal
está constituido por microvellosidades responsables de la absorción
de
moléculas (Storch, 1996).
Las
glándulas
accesorias
también
presentaron
un
cierto
grado
de
diferenciación. Dentro del tejido pancreático se localizó un islote de Langerhans
(páncreas endocrino), el cual está rodeado por células del páncreas exócrino
como se ha observado en Scophthalmus rhombus (Hachero-Cruzado et al.,
2009). Las células endocrinas muestran un núcleo irregular alargado y en el
citoplasma algunos gránulos endocrinos. Las células del islote de Langerhans
son de mayor tamaño y un gran núcleo redondeado y contienen a esta edad
gránulos de zimógeno en diferentes estadios, como lo observado por Calzada
(1996) en Sparus aurata. La presencia de gránulos de zimógeno y del conducto
pancreático o canal de Wirsung observado en este estudio, según Beccaria et
al., (1991) denotan la funcionalidad del páncreas. En Dicentrarchus labrax con
estas características se ha detectado actividad tripsina (Zambonino-Infante &
Cahu, 1994). El hígado presenta el desarrollo de sinusoides y canalículos
biliares. Los hepatocitos muestran inclusiones de material de reserva como el
glucógeno y presuntas lipo-proteínas como ha sido observado para otras
especies (Mani-Ponset et al., 1994; Calzada, 1996). En Sparus aurata las
partículas de glucógeno son observadas horas después de la eclosión, y
momentos antes de la primera alimentación se ha observado una funcionalidad
62
del hígado en el metabolismo de los nutrientes (Guyot et al., 1995). Por lo
anterior, es posible que en L. peru también a esta edad, las glándulas
accesorias ya sean funcionales.
8.2.3 Primera alimentación exógena (70 – 93 hde)
El inicio de la primera alimentación es un momento crucial en el desarrollo de
las larvas. En el huachinango, el ojo se observó completamente pigmentado, la
boca y ano estaban abiertos y se observó un par de aletas pectorales. Este
conjunto indica funcionalidad en la localización, captura, ingestión y digestión
de presas (Kvenseth et al., 1996; Porter & Theilacker, 1999: Roo et al., 1999;
Yúfera & Daria, 2007). De hecho, Yufera & Darias (2007) se refieren a este
momento como el momento cumbre en la sincronía entre el desarrollo
morfológico y fisiológico.
En la retina, se pudo observar la presencia de tres capas más: capa de fibras
nerviosas, capa de células fotorreceptoras o conos y la capa de pigmento
epitelial. La conexión existente entre la capa de fibras nerviosas con el tallo
óptico y el desarrollo de los segmentos externos de los conos indican la
funcionalidad de la retina, permitiendo la transmisión de impulsos nerviosos al
sistema nervioso central (Kvenseth et al., 1996; Peña & Dumas, 2007). El
pigmento epitelial (PE) se apreció en contacto de manera centrífuga al
segmento externo de los conos en la región más externa de la retina. Un día
después de la primera alimentación, el arreglo y fusión entre el PE y los conos
se extendió a regiones más internas dentro de la retina, sugiriendo por una
parte una mayor cantidad de pigmento en la retina y por otra, la capacidad de
migrar del pigmento. Kvenseth y colaboradores (1996) reportan la migración del
pigmento al momento de la primera alimentación. Neave (1984) reporta la
migración del pigmento un poco después de la primera alimentación en
Pleuronectes platessa y Scophthalmus maximus, mientras que Blaxter &
Staines (1970) no encontraron evidencia de migración del pigmento antes de la
metamorfosis en diversas especies de larvas. De acuerdo a Neave (1984), este
tipo de discrepancias puede ser debido a la diferencia entre los niveles de
intensidad y exposición a la luz, sugiriendo la posibilidad de que las larvas
63
jóvenes necesiten altas intensidades de luz para estimular la reacción
retinomotora (Kvenseth et al., 1996). En la capa nuclear interna, se observó
una sola capa de células horizontales en el periodo de estudio. Sin embargo,
en Thunnus orientalis se observa que, dos días después de que el ojo llega a
ser funcional, las células horizontales forman tres capas indicando una
agudeza visual en dirección dorso-nasal de la larva (Kawamura et al., 2003).
En esta etapa de desarrollo, la retina del huachinango está compuesta
únicamente de células fotorreceptoras simples tal como sucede en otras
especies de larvas pelágicas (Porter & Theilacker, 1999; Roo et al., 1999;
Moorman, 2001; Kawamura et al., 2003; Peña & Dumas, 2007). La boca es
funcional. La presencia de los cinco siguientes elementos (cuadrado, cartílago
de Meckels, hiodeo, hiomandibular e interhial) aún constituidos de cartílago
permiten inferir según Hunt von Herbing et al. (1996) que la boca era funcional.
En Siganus guttatus, el aparato bucal también es cartilaginoso al momento de
la apertura de la boca, sin embargo, 6 horas después se desarrolla la maxila
superior y está osificada (Kohno, 1998). Hunt von Herbing (2001) encontró que
la osificación de las estructuras bucales está relacionada con el tipo de simetría
del organismo. Por ejemplo, en Gadus morhua; que presenta simetría en su
periodo larval y juvenil como L. peru, la osificación se observa al final del
estadio larval, mientras que en Pseudopleuronectes americanus la osificación
se presenta hasta después de completar la metamorfosis y adquirir una forma
asimétrica (Hunt von Herbing, 2001). El desarrollo de las estructuras que
conforman el aparato bucal (número, tamaño y grado) determina el tipo de
alimentación de las larvas. El movimiento mandibular está dado por dos
articulaciones principales. La primera es entre el cartílago de Meckels y el
cuadrado (unión mandibular) y la segunda entre el hiomandibular y el cráneo;
estas dos articulaciones permiten el movimiento mandibular simple en dirección
dorso-ventral (Hunt von Herbing, 2001) característico de la alimentación por
succión. Ya presentes el cartílago de Meckel y el cuadrado se puede inferir que
las larvas de huachinango se alimentan por succión (sucking), de manera
similar a Lutjanus argentimaculatus, el cual cambia al tipo de alimentación por
“grasping” (asimiento) a las 150 horas después de la apertura de la boca
(Kohno, 1998), sin embargo como nuestro estudio no llegó mas allá de las 13
64
horas de la apertura de la boca, desconocemos el momento en que se da el
cambio en el tipo de alimentación.
El tracto digestivo era diferenciado como en Sparus aurata, permitiendo la
digestión, absorción y asimilación del alimento (Calzada, 1996). La cavidad
bucofaríngea está más expandida debido a la completa formación de los arcos
branquiales, lo cual le permite una mayor capacidad de succión al momento de
alimentarse (Hunt von Herbing et al., 1996). Está recubierta por un epitelio
escamoso simple rodeado por tejido conectivo y una capa muscular circular
como en diferentes especies (Peña et al., 2003; Santamaría et al., 2004;
Hachero-Cruzado et al., 2009). A diferencia de otras especies como Dentex
dentex (Santamaría et al., 2004) y Scophthalmus rhombus (Hachero-Cruzado
et al., 2009), en Lutjanus peru no se observaron células caliciformes en la
cavidad bucal pero si se observaron en el esófago al igual que lo reportado
para otras especies (Ribeiro et al., 1999; Boulhic & Gabaudan, 1992; Bisbal &
Bengtson, 1995; Baglole et al., 1997; Gordon & Hecht, 2002; Hachero-Cruzado
et al., 2009). Peña et al., 2003 señalan que estas células secretan mucina que
permite mantener húmedo el epitelio de recubrimiento del sistema digestivo. En
Scophthalmus rhombus se ha reportado que estas células contienen
principalmente mucosustancias neutras y glicoproteínas (Hachero-Cruzado et
al., 2009).
La aparición de un estómago rudimentario separado del intestino anterior
mediante un esfínter pilórico primordial tal como se ha observado en L. peru al
momento de la primera alimentación, ha sido reportado en otras especies cómo
Sparus aurata (Calzada, 1996), Paralabrax maculatofasciatus (Peña et al.,
2003), Dentex dentex (Santamaría et al., 2004), Scophthalmus rhombus
(Hachero-Cruzado et al., 2009). Sin embargo, el estómago no es funcional
hasta la aparición de las glándulas gástricas (Elbal et al., 2004). El intestino en
esta etapa mostró mayor cantidad de pliegues en su mucosa incrementando la
superficie de absorción. La ultraestructura de las células de la mucosa intestinal
de Lutjanus peru al inicio de la primera alimentación exógena fue muy similar a
las de otras especies de teleósteos (Avila & Juario, 1987; Deplano et al., 1991;
Calzada et al., 1998; Elbal et al., 2004). Algunos autores han observado que
poco antes de recibir la primera alimentación los enterocitos son células
65
diferenciadas, e incluso son similares a los enterocitos de los adultos, excepto
por la presencia de un mayor número de estructuras lamelares asociadas las
mitocondrias (Calzada, 1996; Elbal et al., 2004).
8.3 Eficiencia en la alimentación exógena
Gran parte del éxito en la larvicultura se basa en proporcionar las condiciones
de cultivo adecuadas que mejoren la eficiencia en la alimentación y el
crecimiento de las larvas desde que inician con la alimentación exógena,
reduciendo el riesgo de inanición, lo cual puede impactar en el posterior
crecimiento y supervivencia (Peña & Dumas, 2005, Zhang et al., 2009; Wang et
al., 2010). En comparación con los resultados obtenidos en otras especies en
la primera alimentación, la incidencia alimenticia (menos del 40%) e intensidad
alimenticia (aprox. 1.1 presas por las larvas) observados en L. peru fueron
bajas. Una alta eficiencia alimenticia durante la primera alimentación aumenta
las posibilidades de supervivencia y la tasa de crecimiento, y reduce el riesgo
de inanición (Ashton & Rust, 2003). Estos mismos autores reportaron que una
incidencia alimenticia superior al 50% puede ser considerado como un
indicador apropiado de una buena tasa de supervivencia en etapas posteriores.
Algunos factores tuvieron un impacto más significativo que otros en el éxito de
alimentación de L. peru. Los rotíferos y copépodos se han utilizado como un
alimento exitoso al momento de la primera alimentación en la larvicultura de
peces marinos (Wilcox et al., 2006). En nuestro estudio, los rotíferos no fueron
consumidos bajo ninguna de las condiciones experimentales. Algunos estudios
han demostrado la relevancia de proporcionar un tipo de presa con el tamaño
adecuado en la transición de la alimentación endógena a la alimentación
exógena (Hunter, 1981). Este mismo autor sugiere que el tamaño de la presa
ingerida
durante
los
primeros
días
de
desarrollo
está
determinado
principalmente por el ancho de la boca de las larvas; aunque también
diferencias en los movimientos de natación entre los nauplios de copépodos y
rotíferos afectan la respuesta de la alimentación de las larvas (Buskey et al.,
1993). Sin embargo, la diferencia en el tamaño de las presas utilizadas en este
estudio (B. rotundiformis y nauplios de E. acutifrons) pudo haber sido el factor
66
más importante en la eficiencia alimenticia. Por otra parte el hecho de que los
nauplios de copépodos I-III hayan sido ingeridos más intensamente que los
nauplios IV-VI demostró que las larvas de L. peru prefieren presa más
pequeña.
La intensidad de la luz también tuvo un efecto sobre el número de larvas que
se alimentaron. Un número significativamente mayor de larvas alimentadas se
registró en tratamientos de 3000 lux respecto a 2500 y 2000 lux. Puvanendran
& Brown (1998) sugieren que el aumento en la iluminación permite un mayor
contraste entre las paredes del tanque y la presa. Los fotoreceptores de la
retina en las larvas al momento de la primera alimentación son conos sencillos,
lo que les proporciona una limitada agudeza visual y menor sensibilidad a
diversas longitudes de onda, reduciendo el contraste con la presa (Evans &
Browman, 2004).
La densidad de presa también influyó en la incidencia alimenticia. Laurel et al
(2001) mencionan que la densidad determina la disponibilidad y la distribución
de la presa, que a su vez afecta la eficiencia alimenticia en las larvas. En este
estudio se encontró una mayor incidencia alimenticia en altas densidades de
presa. Una alta densidad de presa reduce el tiempo de búsqueda de la presa y
la distancia de reacción para las larvas, lo que aumenta la tasa de encuentro
depredador-presa y disminuye el tiempo de manejo de presas (Hart, 1997). Sin
embargo, cuando la intensidad de luz se incrementó a 3000 lux, la incidencia
fue igual entre el tratamiento con 10 nauplios y el tratamiento con 5 nauplios: 5
rotíferos, sugiriendo que con altas intensidades de luz se puede utilizar una
menor densidad de nauplios. No obstante, no se puede descartar un posible
efecto de la presencia de rotíferos en el acuario.
La eficiencia alimenticia no se vio afectada por los otros factores evaluados en
este estudio. Por ejemplo, el color del tanque, la salinidad, y la adición de
microalgas no tuvieron efectos significativos. Rocha et al. (2008) no
encontraron ninguna diferencia en la incidencia alimenticia en la primera
alimentación de Sparus aurata y Solea senegalensis, empleando agua verde.
De igual manera, se ha reportado que en Gadus morhua no hay cambio en el
comportamiento de alimentación de las larvas entre el agua clara y agua verde
67
en la primera alimentación (Skiftesvik et al., 2003). Numerosos reportes han
demostrado que el uso de microalgas mejora la respuesta visual de las larvas
al momento de la alimentación, el tiempo de inicio de la primera alimentación,
la proporción de larvas que ingieren alimento y la cantidad de alimento que
ingieren (Naas et al., 1992; Lazo et al., 2000; Shaw et al., 2006). Sin embargo,
como han observado Shaw et al (2006), el agua verde mejora el número de
presas consumidas cuando la densidad de la presa es baja, lo que tal vez
explica que el uso de altas densidad de presas en este estudio no permitió esa
observación.
El número de larvas con presas en el tracto digestivo se vio más afectada por
las condiciones de cultivo que el número de presas ingeridas por las larvas, lo
que sugiere que la intensidad alimenticia no es afectada por los factores
bióticos y abióticos probados. Se ha reportado que la cantidad de presas
ingeridas por larva está regulado por varios factores como la temperatura
(Blaxter, 1986), la densidad y el tamaño de presa (Hunter, 1981), el desarrollo
de la conducta alimentaria (Coughlin, 1991), la saciedad (Yúfera & Darias,
2007) y mecanismos hormonales (Ronnestad et al., 2007). En el presente
estudio, se evaluó la eficiencia de la alimentación en cuando se pudo detectar
la presencia de alimento en el tracto digestivo, o sea, seis horas después de la
adición de la presa. En el inicio de la alimentación exógena, el proceso de
aprendizaje del comportamiento alimenticio puede tardar varias horas o días
para lograr una captura de presas más eficiente (Yúfera & Darias, 2007). De
haber esperado más tiempo hubiera permitido observar una incidencia e
intensidad mayores.
Sin embargo, existe el riesgo de que el alimento sea
digerido y difícilmente evaluado.
68
IX. SUMARIO Y CONCLUSIONES
9.1 Eclosión
Al momento que las larvas de Lutjanus peru eclosionan presentan un
gran saco vitelino y glóbulo de aceite que constituyen las reservas nutritivas. La
presencia de una musculatura troncal y de una aleta media (pliegue) permite
que realicen movimientos de cierta amplitud, aunque no como para evadir
depredadores. En este momento, todavía hay órganos y/o estructuras que no
han comenzado su morfogénesis, como el ojo, hígado, páncreas, aparato
bucal. El tubo digestivo es un tubo recto simple e indiferenciado, recubierto por
un epitelio cuboidal simple y con pequeñas microvellosidades en el borde
apical, considerándose no funcional. Las vías sensoriales desarrolladas y
funcionales son la mecánica, constituida de neuromastos libres dispersos en la
cabeza y tronco, y la auditiva que está compuesta por los otolitos Lapillus y
Sagitta, lo que les permite percibir algunas vibraciones en el ambiente.
9.2 Periodo de alimentación endógena
Durante este periodo se constituyen la mayor parte de los sistemas
orgánicos de Lutjanus peru. La retina se diferencia en cinco capas. Presenta
células fotorreceptoras de tipo cono en desarrollo, e inicia la diferenciación de
la capa de pigmento epitelial. Aunque a esta edad aparentemente no es
funcional. Inicia el desarrollo de las estructuras bucales esqueléticas de soporte
(Cartílago de Meckels, Cuadrado, Hioideo, Hiomandibular). El tubo digestivo
presenta una regionalización compuesta por la cavidad buco-faríngea, esófago
e intestinos anterior y posterior. Ambos intestinos presentan un epitelio
columnar, pliegues en la mucosa y microvellosidades en la zona apical. Al final
de este periodo, los enterocitos presentan características ultraestructurales de
células diferenciadas. Las glándulas accesorias ya se han diferenciado. El
páncreas esta conectado al intestino anterior mediante el conducto de Wirsung.
Se diferencia el islote de Langerhans que se encuentra rodeado por células
pancreáticas exocrinas que sintetizan gránulos de zimógeno denotando
funcionalidad. En el hígado se observan algunos sinusoides y canículos
69
biliares. Los hepatocitos presentan en posición supranuclear inclusiones
aparentemente de reserva como glucógeno y lipoproteínas. Todas estas
características son indicadoras de que las larvas son aptas; en términos de
digestión, para iniciar la alimentación exógena.
9.3 Primera alimentación
La primera alimentación exógena es un momento clave en el periodo
larval de los peces por la sincronía que se puede observar entre los órganos
y/o estructuras involucradas en la localización, captura, ingestión y digestión de
las presas. La retina está formada por completo y funcional. Lo mismo que el
aparato bucal y tracto digestivo. Los órganos sensoriales están presentes,
excepto las papilas gustativas. No obstante, se ha demostrado en este y
anteriores trabajos que la visión es la principal vía sensorial para la localización
de presas debido a que las larvas de Lutjanus peru no se alimentan en
ausencia de luz y son poco eficientes al momento de alimentarse a bajas
intensidades de luz. El ojo está diferenciado y es funcional. Presenta conos
sencillos como únicas células fotorreceptoras. Por tanto, se ha observado que
su agudeza visual y sensibilidad a las longitudes de onda es limitada por lo que
necesita iniciar su alimentación en ambientes bien iluminados. El aparato bucal
está constituido por 5 elementos cartilaginosos: cartílago de Meckels,
cuadrado, hioideo, hiomandibular e interhial. La funcionalidad es adquirida por
las articulaciones entre el cartílago de Meckels y el hioideo, y el hiomandibular
y el cráneo. La apertura bucal es de 0.22 ± 0.02 mm y como se ha comprobado
en este trabajo, son capaces de capturar presas de tallas iguales o menores a
45-50% de su ancho de boca. En relación al desarrollo del tubo digestivo, se
observa que el esófago presenta células caliciformes con vesículas de
secreción. Así también, se observa la formación de un estómago rudimentario.
El
intestino
es
mayormente
plegado
con
una
gran
cantidad
de
microvellosidades en el borde apical de su epitelio. Se ha formado la válvula
intestinal, por lo que ya se puede regular el flujo del alimento para una mejor
digestión. Finalmente, el número de larvas que consumen alimento es afectado
por la intensidad de luz, tipo de presa, la talla y concentración de presa, y la
70
temperatura. Parece también que a intensidad alta como 3000 lux, menos
nauplios de copépodos pueden ser usados.
71
X. RECOMENDACIONES
Debido a la experiencia generada a través de la realización de este trabajo se
dan las siguientes recomendaciones técnicas:
1) Cuando se vaya a realizar microscopia electrónica de transmisión para
observar el tubo digestivo, se recomienda seccionar a las larvas bajo
una lupa estereoscópica previo a la fijación para seleccionar solamente
la porción que incluye la estructura a observar, de tal manera que al
momento de realizar los cortes semifinos sea más fácil reconocer la
región observada.
2) Dado que la mayor incidencia alimenticia se presentó con nauplios de
copépodos en estadio I-III, una intensidad de luz de 3000 lux y
temperatura del agua de 25º C, se recomienda el uso de estas
condiciones en el cultivo larval del huachinango.
Así también, se presentan algunas recomendaciones y propuestas de
investigación:
3) De manera general, la eficiencia alimenticia ha sido bajas. Además de lo
que ya se ha comentado al respecto, probablemente se deba a que los
experimentos se hayan realizado en acuarios. En ese sentido, se
recomienda evaluar los factores ambientales que hayan resultado más
favorables en este estudio en tanques de mayor capacidad, y probar
presas de tamaño más pequeño como pueden ser las larvas trocóforas y
el rotífero Proales similis.
4) Evaluar el crecimiento y supervivencia empleando las condiciones
ambientales que han resultado más favorables en estos experimentos
en una escala mayor.
5) Describir la organogénesis de las estructuras aquí abordadas durante
todo el periodo larval.
72
XI. LITERATURA CITADA
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ANEXO I. Técnica de transparentación y tinción descrito por Potthoff (1984)
90