estudio para la implementacion del analisis de campylobacter spp

ESTUDIO PARA LA IMPLEMENTACION DEL ANALISIS DE
CAMPYLOBACTER SPP SEGÚN LA METODOLOGIA USDA/FSIS MLG
CAPITULO 6 1998 EN EL LABORATORIO LABSER DE RANCAGUA
CHILE
Vivian Arturo Canal
Fabiola Silva Páez
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
Rancagua (Chile)
Septiembre 14 2007
ESTUDIO PARA LA IMPLEMENTACION DEL ANALISIS DE
CAMPYLOBACTER SPP SEGÚN LA METODOLOGIA USDA/FSIS MLG
CAPITULO 6 1998 EN EL LABORATORIO LABSER DE RANCAGUA
CHILE
Vivian Arturo Canal
Fabiola Silva Páez
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para optar al título de
Microbióloga industrial
Directora: Astrid Maldonado Illesca
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
Rancagua (Chile)
Septiembre 14 2007
NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus
alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada
contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques
personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la
verdad y la justicia”.
ESTUDIO PARA LA IMPLEMENTACION DEL ANALISIS DE
CAMPYLOBACTER SPP SEGÚN LA METODOLOGIA USDA/FSIS MLG
CAPITULO 6 1998 EN EL LABORATORIO LABSER DE RANCAGUA
CHILE
Vivian Arturo Canal
Fabiola Silva Páez
APROBADO
________________________
Astrid Maldonado, Tec. Alimentos
Director
________________________
Fernando Fuentes, Ing. Civil Bioquímico
Jurado
________________________
Paulina Rojas, Mic. Industrial
Asesor
________________________
Julio Gomez, Químico lab.
Jurado
ESTUDIO PARA LA IMPLEMENTACION DEL ANALISIS DE
CAMPYLOBACTER SPP SEGÚN LA METODOLOGIA USDA/FSIS MLG
CAPITULO 6 1998 EN EL LABORATORIO LABSER DE RANCAGUA
CHILE
Vivian Arturo Canal
Fabiola Silva Páez
APROBADO
________________________
Angela Umaña Muñoz, M.Phil
Decano, Académico
________________________
David Gomes Méndez, M. Sc
Director de carrera
TABLA DE CONTENIDOS
Pág.
LISTA DE TABLAS
vii
RESUMEN
viii
ABSTRACT
ix
1. INTRODUCCION
1
2. MARCO TEORICO
3
2.1 Historia
3
2.2 Características microbiológicas Campylobacter spp
3
2.2.1 Taxonomia
4
2.2.2 Morfología y características fisiológicas
4
2.2.3 Especies importantes
6
2.2.3.1 Especies termofilas
6
2.3 Vías de transmisión y alimentos implicados
2.4 Enfermedades en humanos
7
10
2.4.1 Epidemiología
10
2.4.2 Patogenia
10
2.4.3 Presentación clínica
11
2.4.4 Diagnostico de laboratorio
14
2.5 Enfermedades en animales
14
2.5.1 Campilobacteriosis
14
2.5.1.1 Campilobacteriosis genital bovina
15
2.5.1.1.1 Manifestaciones clínicas
15
2.5.1.1.2 Diagnostico
16
2.5.1.1.3 Control
16
2.6 Medios de cultivo y pruebas bioquímicas
17
2.7 Laboratorio LABSER
18
3. FORMULACION DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION
3.1Formulación del problema
20
20
-v-
3.2 Preguntas de investigación
20
3.3 Justificación de la investigación
20
4. OBJETIVOS
21
4.1 Objetivo general
21
4.2Objetivos específicos
21
5. MATERIALES Y METODOS
22
5.1 Materiales
22
5.1.1 Materiales para el aislamiento, identificación, y cuantificación
de Campylobacter jejuni/coli en productos de carne y aves.
22
5.1.1.1 Equipos
22
5.1.1.2Reactivos
23
5.1.1.3 Medios de cultivo
23
5.1.2 Métodos
24
5.1.2.1 Preparación de medios de cultivo
24
5.1.2.2 Aislamiento y cuantificación
28
5.1.2.3 Identificación de Campylobacter
30
5.1.2.3.1Pruebas bioquímicas
5.2 Métodos
31
33
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
34
6.1 Cotizaciones
34
6.1.1 Equipos
34
6.1.2 Reactivos
37
6.1.3 Medios de cultivo
37
6.2 Costo por análisis
38
7. CONCLUCIONES
48
8. RECOMENDACIONES
49
9. REFERENCIAS
50
- vi -
LISTA DE TABLAS
Pág.
Tabla 1.Cotización Equipos
35
Tabla 2.Cotización Reactivos
35
Tabla 3.Cotización Medios de cultivo
36
Tabla 4.NMP Campylobacter spp en muestras de carne de vacuno
o esponja
39
Tabla 5. NMP Campylobacter spp en muestras de carne de carcasa
o carne de ave
41
Tabla 6. Aislamiento e identificación de Campylobacter spp en
muestras de vacuno o esponja
43
Tabla 7. Aislamiento e identificación de Campylobacter spp en
muestras de carcasa o carne de ave
45
- vii -
RESUMEN
En los laboratorios de alimentos es muy importante realizar un detallado análisis
de Campylobacter spp ya que este microorganismo es la principal causa de
infección entérica zoonótica en la mayor parte de países desarrollados, al igual
que en los países en vía de desarrollo. En el presente trabajo se realizó un estudio
económico – financiero en el laboratorio LABSER de Rancagua (Chile), con el
objetivo principal de evaluar la implementación del análisis de Campylobacter
spp según la metodología USDA/FSIS MLG- Capitulo 6, 1998.
A través de este trabajo de campo se logró determinar cuales eran los equipos,
reactivos y medios de cultivo necesarios para este análisis. Se realizaron
diferentes cotizaciones, escogiendo los precios más bajos y por último se
estableció cuál es el costo total del análisis que se ofrecerá a los clientes, basado
en los insumos, hora-hombre, gestión de calidad y costos indirectos. Con este
estudio se comprobó que la metodología USDA/FSIS MLG Capitulo 6 1998 es
muy costosa, y no es conveniente su implementación debido a la alta inversión en
los equipos y al reducido número de muestras que llegan al laboratorio.
- viii -
ABSTRACT
In the food laboratories is very important to make the analysis of Campylobacter
spp since this microorganism is the main cause of zoonótica enteric infection in
most of the developed countries like in those in way of development. In the
present work, an economic and financier study was made in laboratory LABSER
of Rancagua - Chile to see if the implementation of the analysis of Campylobacter
spp is possible according to methodology USDA/FSIS MLG Chapter 6 1998 used
The equipment, reagents and crops were identified for this analysis. Different
quotations were made, choosing the low prices to establish the cost of the analysis
that will be offered to the clients, based on inputs, hours per men, indirect
management of quality and costs. With this study, it was verified that the
methodology USDA/FSIS MLG Chapter 6 1998 is too expensive, and is not
advisable his implementation due to the high investment in the equipment and
because the number of samples that arrived at the laboratory are reduced.
- ix -
1. INTRODUCCION
Campylobacter spp es la principal causa de infección entérica zoonótica en la
mayor parte de los países desarrollados como en los de desarrollo y su incidencia
reportada se ha incrementado marcadamente en los últimos 20 años. El reservorio
natural de Campylobacter spp es el tracto intestinal de animales de sangre
caliente.
El diagnóstico de Campylobacter indica que alrededor del 95% de las infecciones
por Campylobacter son causadas por Campylobacter jejuni o Campylobacter coli;
estas dos son responsables de la mayoría de enfermedades en humanos.
Las enteritis relacionadas a Campylobacter spp han emergido como una de las
formas de enfermedades diarreicas de mayor incremento en países desarrollados.
Con la aplicación técnicas mejoradas para su aislamiento se ha podido comprobar
que la incidencia de Campylobacter en estos países es superior a Salmonella.
Actualmente son considerados como la bacteria que más comúnmente causa
enteritis en el mundo siendo su incidencia mayor en niños y jóvenes, decreciendo
con la edad. El mecanismo de transmisión más frecuente es la ingestión de agua y
alimentos contaminados.
Por la importancia epidemiológica de este patógeno bacteriano, su aislamiento y
caracterización es muy importante en muestras de alimentos, principalmente en
productos carnicos.
El laboratorio LABSER cuenta con diversos análisis de gran importancia en el
área de microbiología, pero hace falta el análisis de Campylobacter spp que es un
microorganismo muy común en alimentos.
Por esta razón se quiere implementar este análisis en el laboratorio. Para llevar
acabo esta implementación es importante hacer un análisis de costos de lo que
esta implica y así determinar si es posible hacerla o no.
El estudio económico que se realizo en el presente trabajo esta basado en hacer
una comparación de precios de insumos que las diferentes casas comerciales de
productos microbiológicos proponen, además determinar cuales son los equipos
que se utilizan en este análisis con los que el laboratorio no cuenta y cual debe ser
-1-
su inversión para obtenerlos y por ultimo establecer el costo del análisis para los
clientes; basándose en insumos, horas/hombres, gestión de calidad, costos
indirectos etc.
-2-
2. MARCO TEORICO
2.1 Historia
Las primeras observaciones de bacterias semejantes a Campylobacter fueron
realizadas por Escherich en 1886 a partir de materia fecal de niños y de gatos con
diarrea. Aunque no pudo realizar los aislamientos, Escherich denominó Vibrio
felinus a las bacterias observadas sólo microscópicamente.
Los primeros aislamientos de especies del género Campylobacter fueron
realizados en el área de microbiología veterinaria, en 1909 y 1913. Mac Fadyean y
Stockmann y posteriormente Smith en 1918 establecieron la participación de una
bacteria microaerófila en el aborto del ganado bovino y ovino, de morfología
similar a las especies del género Vibrio, por lo que se la denominó Vibrio fetus.
En 1931, Jones y Little aislaron a partir de bovinos con disturbios intestinales un
“vibrión” microaerófilo, al que denominaron Vibrio jejuni. En 1944, Doyle
describió un “vibrión” aislado del intestino de cerdos con diarrea y lo denominó
Vibrio coli.
La primera asociación entre estas bacterias curvas y diarrea en el hombre fue
sugerida por Levy en 1946, el que realizó un estudio en un brote de gastroenteritis
sobre 357 pacientes en dos establecimientos penales en Illinois, observando en
exámenes directos la presencia de formas bacterianas semejantes a Vibrio en el
20% de las muestras. En 1957, E. King, estudiando las características de estos
“vibrios” aislados de diferentes fuentes, estableció que no todos correspondían a
Vibrio fetus, determinando dos grupos con características serológicas y
bioquímicas diferentes. Mientras algunos eran capaces de crecer a 25 y 37°C,
otros lo hacían a 42°C. A estos últimos se los consideró como “Vibrios
relacionados” (related Vibrios) sugiriendo que eran agentes de diarrea aguda. En
1963, Sébald y Veron proponen la creación del género Campylobacter para incluir
estas bacterias. En la década del 70, Butzler y Skirrow, Bolton y Robertson,
Blaser y Col, desarrollaron medios selectivos que permitieron aislar estos
microorganismos con relativa facilidad y establecer su participación en diferentes
cuadros infecciosos en el hombre.
-3-
En 1972 Dekeyser y Butzler aislaron los microorganismos de las heces de
pacientes con enteritis aguda usando una técnica de filtración que permitía el
pasaje de pequeños bastones curvos a través de una membrana, pero retenía
microorganismos fecales más grandes. Esta técnica se utiliza actualmente para el
aislamiento de otras especies del género, diferentes de C. jejuni o C. coli como
son, por ejemplo, C. upsaliensis, C. hyointestinalis y C. jejuni subsp. doylei.
(Fernández, 2003)
2.2 Características microbiológicas Campylobacter spp
2.2.1 Taxonomía:
Las primeras especies de este género fueron identificadas hace más de 90 años en
animales, pero no fue sino hasta 1970 cuando se reconoció como patógeno
humano. Inicialmente incluidos dentro del género Vibrio, Sin embargo, mas tarde,
debido a que presentan diferencias fundamentales con relación a la constitución
del DNA y por su incapacidad de fermentar los hidratos de carbono, fueron
agrupados en un nuevo género bacteriano denominado Campylobacter (campylo
= curvo) (bacter = bacteria). Actualmente se han incorporado nuevas especies y se
ha creado la familia Campylobacteriaceae, la cual está compuesta por dos
géneros: Campylobacter y Arcobacter; y un género de afiliación incierta
Helicobacter. Las diferencias fundamentales entre los géneros de Campylobacter
y Arcobacter son que Campylobacter no puede crecer a 15°C, es móvil por un
solo flagelo polar en uno o sus dos extremos y en cultivos viejos degeneran a
formas cocoides; Arcobacter tiene un solo flagelo, crece bien a bajas temperaturas
(17°C) pero mal a 37°C y 42°C, a 30°C pueden crecer aeróbicamente. (Ministerio
de
Salud,
2001)
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
entrez/query.fcgi?
CMD
=&DB=taxonomy)
2.2.2 Morfología y características fisiológicas:
El género Campylobacter pertenece a la familia Campylobacteriaceae. Estas
bacterias son patógenas o comensalistas agrupan bacilos Gram negativos
-4-
pequeños (0.3-0.6 µm de diámetro, 0.5-5 µm de ancho), no formadores de esporas
curvos, espirilados o en forma de S que presenta un flagelo polar único en uno o
ambos extremos que les confiere motilidad. Son microaerofílicos capaces de
crecer en una atmósfera de 5% de oxígeno, 10% de dióxido de carbono y 85% de
nitrógeno. En cultivos de varios días (mas de tres) degeneran en formas esféricas
u ovoides que han perdido su viabilidad. La mayoría de estas bacterias crecen a
una temperatura de 37 °C, a excepción de Campylobacter jejuni que crece a 42,
por lo que es práctica habitual en el laboratorio la incubación a esta temperatura
con el fin de facilitar el aislamiento selectivo. Su velocidad de desarrollo es más
lenta que la de las bacterias de la flora normal entérica, por lo que para su
aislamiento a partir de materias fecales se requieren medios de cultivo selectivos
que inhiban esta flora. Los Campylobacter son organismos de lento crecimiento.
Las especies de Campylobacter (C. coli, C. concisus, C. curvus, C. fetus, C.
gracilis C. helveticus, C. hyointestinalis, C. jejuni, C. lari, C. mucosalis, C. rectus,
C. showae, C. sputorum y C. upsaliensis) han sido asociadas con múltiples
enfermedades en animales y humanos. Las dos bacterias de mayor importancia
clínica como agentes causales de la campilobacteriosis humana son C. jejuni y C.
coli. Por lo general se multiplican en forma lenta, en medios enriquecidos como
el de Skirrow, Butzler y Campy-Bap; los dos últimos contienen el antibiótico
cefalotina que inhibe el crecimiento de Campylobacter fetus. Para su
caracterización bioquímica se realizan las pruebas de catalasa, oxidasa y la
hidrólisis del hipurato. También puede ser diagnosticada con muestras frescas de
materia fecal observadas al microscopio con tinción de Gram. Campylobacter
puede ser diagnosticado utilizando Kits comerciales para una detección directa de
antígenos presentes en las heces, utilizando la técnica aglutinación en látex. La
técnica de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) también se utiliza para
detectar diferentes campylobacterias, es rápida y se tienen los resultados el mismo
día,
la
desventaja
que
existe
es
que
es
costosa.
(García,
2007)
(http://www.bvsops.org.uy/pdf/campylobacter.pdf ) (Malavez, 2005) (Ministerio
de Salud, 2001)
-5-
2.2.3 Especies importantes
C. fetus ss. venerealis, C. fetus ss. fetus, C. jejuni, C. sputorum ss. sutorum,
bubulus y mucosalis, C. coli, C. concisus, C. hyointestinalis. Los diferentes
serotipos se definen con base en los antigénos somáticos y flagelares. (Velasco,
2002)
2.2.3.1 Especies termofilas
Son aquellas capaces de crecer a 42-43°C pero no a 25°C, comprende C. jejuni
(subespecies jejuni y doylei), C. coli, C. laridi (biovar ureasa + y -), y C.
upsaliensis. De este grupo, Campylobacter jejuni (subespecie jejuni) es agente
causal de diarreas, siendo considerado el más virulento por su mayor resistencia a
la fagocitosis; luego le sigue Campylobacter coli, pero se considera que la diarrea
que produce es más benigna. Ambos se encuentran como comensales en el tracto
gastrointestinal de un amplio grupo de animales a los cuales se ha adaptado
perfectamente, es por ello que su temperatura óptima de desarrollo es a 42-43°C.
Infecciones extraintestinales pueden ocurrir raramente en huéspedes normales; en
pacientes HIV positivos e inmunocomprometidos pueden producir bacteriemias,
bursitis, artritis, infecciones del tracto urinario, endocarditis, peritonitis, aborto y
sepsis neonatal. Campylobacter lari ha sido aislado de intestino de gaviotas, de
otros animales y también del hombre. Su rol patógeno para este último aún no está
definido. La diferencia con los otros dos enteropatógenos está en que es negativo
para la prueba de indoxyl acetato. Campylobacter upsaliensis raramente es aislado
de diarreas, produce bacteriemias en huéspedes inmunocomprometidos. Son más
resistentes al poder bactericida del suero que las otras especies termófilas, por lo
que puede sobrevivir en sangre. Si bien su fuente de infección no está bien
definida, se ha relacionado con animales, especialmente perros, alimentos como
leche no pasteurizada y sus derivados.
Campylobacter fetus (subsp. fetus y veneralis) son microorganismos de gran
importancia veterinaria producen aborto esporádico en el ganado bovino y ovino.
Para el humano C. fetus subsp. fetus es considerado un patógenos oportunista,
provocando infecciones sistémicas en pacientes debilitados o inmunosuprimidos,
se aísla de intestino de ovejas, vacas y cerdos. C. fetus subsp. veneralis se
-6-
encuentra frecuentemente en el aparato genital de vacas causando infertilidad. La
diferencia entre ambas subespecies es la capacidad de crecer en 1% de glicina de
C. fetus subsp. fetus. Campylobacter hyointestinalis se ha recuperado de
hisopados réctales de hombres homosexuales con proctitis. Anteriormente solo era
hallado en animales, sobre todo como causa de ileitis en cerdos. Presenta
reacciones bioquímicas similares a C. fetus subsp fetus, pero a diferencia de este
también puede crecer a 42°C y produce H2S en TSI.
Campylobacter consisus y Campylobacter rectus se aíslan de pacientes con
enfermedad periodontal, infecciones intestinales y bacteriemia.
Campylobacter sputorum biovar sputorum forma parte de la flora normal de la
boca e intestino humano, ha sido aislado de forúnculos perianales y abscesos
pulmonares.
Campylobacter sputorum biovar bubulus es un comensal de ovejas y vacas, se ha
aislado de forúnculos y abscesos en hígado, escroto, ingle y axilas humanas en
personas que trabajan en el campo.
Campylobacter showae es una especie recientemente descrita, aislada de
enfermedad periodontal, presenta la particularidad de tener múltiples flagelos.
(Ministerio de salud, 2001)
2.3 Vías de transmisión y alimentos implicados
Varias especies de Campylobacter se encuentran como comensales en el tracto
gastrointestinal de animales salvajes y domésticos. Los principales reservorios los
constituyen el ganado bovino, ovino y suino, roedores, perros y gatos. Otro
reservorio principal son las aves, donde está presente como saprofito y también
como patógeno entérico ocasional. El espectro de reservorios varía con la especie:
C.jejuni tiene un reservorio amplio, mientras que C.coli es más frecuentemente
aislado en suinos. La adquisición primaria del germen por los animales ocurre
generalmente temprano en la vida y puede ser causa de morbimortalidad en estos
animales, pero la mayoría de las veces la colonización conduce a un estado de
portador de por vida. (http://www.bvsops.org.uy/pdf/campylobacter.pdf)
(Canals, A).
-7-
La mayoría de las infecciones se originan por consumo de alimentos de origen
animal, sobretodo la carne de pollo y derivados de aves. Otros alimentos
implicados son las carnes rojas, despojos, moluscos, leche y quesos no
pasteurizados y aguas no cloradas. La transmisión de la enfermedad se produce
principalmente por contaminaciones cruzadas entre los alimentos, donde los
manipuladores de alimentos, con sus prácticas higiénicas, tienen una importancia
fundamental. La transmisión por los manipuladores (portadores), es poco
frecuente ya que en el hombre, el Campylobacter spp., es un huésped transitorio,
y por tanto, una fuente poco importante de infección. El microorganismo se
elimina por el tratamiento térmico (cocción). No sobrevive en las cocinas
domésticas ni los tratamientos culinarios tradicionales.
La dosis infectiva del Campylobacter spp. es baja si la comparamos con la de
Salmonella spp. Se ha demostrado experimentalmente, que entre 500-800 células
microbianas son suficientes para instaurar la enfermedad; y que por debajo de 100
células la enfermedad no se desarrolla. Estas diferencias se deben a variaciones
del pH del jugo gástrico del huésped y del tipo de alimento consumido. La leche y
alimentos grasos, permiten salvar la barrera ácida del estómago y producir la
infección de forma más fácil.
Está demostrado que la carne de pollo es sin duda la fuente de infección más
importante. Diferentes estudios epidemiológicos han establecido que entre el 5070 % de las infecciones esporádicas de origen alimentario por Campylobacter spp.
se deben al consumo o manipulación de la carne de pollo poco hecha (por
contaminación de estas carnes con otros alimentos, por contaminación con las
superficies de contacto o las superficies de corte utilizadas). Lo que no está del
todo claro es la fuente de infección principal. Se sabe que la mayoría de las
explotaciones avícolas de engorde están infectadas con C. jejuni. Las camas y
agua no clorada, han estado vinculadas como vehículos de introducción y
transmisión de la infección. Las jaulas, ropa, manos y calzado del personal de las
explotaciones avícolas, también pueden ser vías de entrada del microorganismo.
Otras fuentes podrían ser los animales domésticos o salvajes alrededor de la
explotación.
-8-
Una vez ha entrado en la explotación, el Campylobacter spp. se disemina y
coloniza el intestino de los pollos de engorde (entre 14 y 49 días de edad). Estos
pollos irán la mayoría al matadero para su sacrificio, y en este transporte de la
granja al matadero, por tener un contacto directo entre ellos, hace que se aumente
hasta 1000 veces el grado de contaminación superficial de estos animales,
sobretodo por las heces de los animales. En el matadero, en el proceso del
faenado, se contaminan la mayoría de los equipos y de las herramientas, así como
superficies de contacto, y maquinarias. Unos estudios, aparecidos en junio del
2001, por el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos, Servicio de
Investigación Agraria, han desvelado que la superficie del huevo fértil en el
momento de la eclosión sería uno de los vehículos principales de transmisión del
Campylobacter spp., en las explotaciones avícolas. (Canals, A)
El agua contaminada puede ser la fuente de brotes de Campylobacteriosis, sobre
todo por el consumo de la misma y en vinculación con actividades recreacionales.
También, bajo condiciones que favorecen la replicación del germen, la
contaminación fecal del suelo puede ser origen de infección humana,
principalmente por el consumo de vegetales cosechados en ellas. En los países
industrializados el microorganismo se transmite principalmente a través de
alimentos de origen animal, mientras que en los países menos desarrollados
predominan la transmisión por alimentos y aguas contaminadas con excretas así
como el contacto directo con personas o animales enfermos. La transmisión de
C.jejuni se ve minimizada a temperatura ambiente o menor; además los alimentos
no constituyen un sustrato favorable para su desarrollo. Estos dos hechos sugieren
que la ocurrencia de ETA por este agente refleja condiciones muy inadecuadas en
el manejo de los alimentos (mala refrigeración, malas condiciones de higiene,
etc.). Por otra parte, en todas partes del mundo el número de casos aumenta en
verano y principios del otoño, coincidiendo con el aumento de la temperatura
ambiental. (http://www.bvsops.org.uy/pdf/campylobacter.pdf)
-9-
2.4 Enfermedades en humanos
2.4.1 Epidemiología
La campylobacteriosis es una zoonosis de distribución mundial. Las especies
diarreogénicas de Campylobacter spp se encuentran habitualmente como
comensales del tracto gastrointestinal de una gran variedad de mamíferos y de
aves, tanto domésticos como de vida libre.
Muchos de los casos de enteritis humana han sido asociados al contacto con
animales, agua o alimentos de origen animal especialmente de aves contaminados
con estas bacterias.
En países industrializados, Campylobacter es el primer agente de diarrea. La
enfermedad es más frecuente en los meses de verano. Se considera que un alto
porcentaje de infecciones es provocado por consumo de carne de ave mal cocida o
por contaminación cruzada al momento de preparar alimentos.
En países en vías de desarrollo Campylobacter es el segundo o tercer agente de
diarrea, según sea el lugar geográfico. La enfermedad afecta a todas las edades
pero parece ser más frecuente en niños de corta edad, menores de 4 años y
adultos jóvenes de 15 a 44 años de edad. Los individuos con HIV (SIDA) tienen
un alto riesgo de adquirir la infección por Campylobacter, además de que ésta
puede ser invasiva.
C. jejuni y C. coli son causas importantes de diarreas agudas en viajeros que
visitan zonas en vías de desarrollo. No soportan durante mucho tiempo situaciones
de desecación o congelamiento, características que limitan su transmisión.
Sobreviven en la leche, otros alimentos o el agua a 4°C durante una semana. De la
misma forma que con otros patógenos entéricos, es importante tener presente,
para efectos de prevención, la transmisión fecal-oral de persona a persona sobre
todo en lactantes, que no controlan esfínteres. (Fernández, 2003) ( Kapperud,
1994)
2.4.2 Patogenia
El daño al huésped y las manifestaciones clínicas dependen principalmente de dos
factores: el inóculo ingerido y el estado inmunológico del huésped.
- 10 -
El principal mecanismo de patogenicidad es la invasión de la mucosa intestinal,
en forma similar a como lo hace Shigella. La invasión de la lámina propia se
observa tanto a nivel del intestino delgado como del colon, y el resultado es
generalmente una enterocolitis inespecífica, que puede incluir los siguientes
hallazgos: degeneración y atrofia glandular, pérdida de la producción de mucus,
abscesos de las criptas, y ulceración de la mucosa epitelial. En otros casos, las
características patológicas son similares a las observadas en infecciones por
Salmonella o Shigella. Parece evidente que el lipopolisacárido de la pared
bacteriana, con actividad endotóxica típica, desempeña un rol central en el daño
inflamatorio.
Aunque se han reconocido una toxina termo-lábil similar a la de Vibrio cholerae y
varias citotóxinas, la producción in vivo e in vitro de éstas parece de bajo nivel
por lo que se duda que tenga alguna significación en la patogenia.
Se cree que Campylobacter puede jugar un papel en el Síndrome de GuillainBarré (SGB) por un mecanismo que involucraría la similitud entre el ácido siálico
de algunos antígenos O y los gangliósidos humanos. (Blazer, 2000)
Las campilobacterias producen proteínas citotóxicas que pueden intervenir en el
desarrollo clínico de la enfermedad, además poseen toxinas extracelulares con
actividad citopática y enterotoxinas clásicas, parecidas a las de Escherichia coli.
(http://www.bvsops.org.uy/pdf/campylobacter.pdf) (Noordzij, 2002).Además se
ha demostrado la producción de citotóxinas sobre células CHO, HeLa y Vero,
entre las que destaca la cytolethal distending toxin que tiene la capacidad de
producir distensión y posterior muerte celular.
2.4.3 Presentación clínica
La gastroenteritis aguda causada por Campylobacter se caracteriza por una rápida
elevación de la temperatura, acompañada de malestar general, dolor abdominal,
calambres y retortijones. La infección gastrointestinal por lo general es
autolimitada. El periodo de incubación es de 2 a 5 días, pero puede extenderse
hasta los 10 días. Se ha observado que el 50% de los pacientes con diarrea es
precedida por un periodo febril, malestar generalizado, mialgia, dolor abdominal
y fiebre que puede llegar a los 40 °C. Es habitual que se presente un periodo
- 11 -
prodrómico con fiebre, cefalea, mialgia y malestar general entre 12 y 24 h, antes
del inicio de los síntomas. Al inicio de la infección la materia fecal es acuosa,
pero a medida
que progresa la enfermedad ésta se torna sanguinolenta con
tenesmo, el cual es un síntoma común.
Las deposiciones, disgregadas o acuosas, pueden ser mucosanguinolentas, son
oscuras, con mayor olor, ligeramente verdosas. En el análisis de las heces al
microscopio se observa un exudado inflamatorio con infiltrado de leucocitos, así
como un gran número de campylobacterias, las cuales pueden reconocerse por sus
características morfológicas. Con frecuencia se ven células de inflamación y un
predominio de microorganismos de formas curvas y espirilares.
La presentación puede ser variable, desde una forma leve de corta duración a un
cuadro más severo y prolongado con características similares a Shigellosis o
Salmonelosis. Los casos mas leves no requieren de tratamiento antimicrobiano, la
presentación más grave o recidivante se trata; la droga de elección es la
eritromicina.
En los neonatos puede presentarse con una o más deposiciones sanguinolentas y
ningún otro síntoma. También se puede desarrollar solo una fiebre tan severa y
persistente que es necesario diferenciar de fiebre tifoidea.
En pacientes inmunosuprimidos puede presentarse colecistitis aguda, pancreatitis,
cistitis, artritis reactiva y otras complicaciones como síndrome urémico
hemolítico, nefritis intersticial, hepatitis y síndrome de Guillén-Barré.
Debido a la progresión de la enfermedad en adultos jóvenes, la infección por
Campylobacter jejuni, presenta un cuadro que se le puede confundir con colitis
ulcerosa o enfermedad de Crohn. En la materia fecal puede observarse sangre
fresca al tercer día. La diarrea puede oscilar en severidad desde materia fecal
blanda hasta líquida o sanguinolenta. Puede haber más de 10 evacuaciones en el
peor día de la enfermedad. El dolor abdominal puede ser de tipo cólico que
disminuye durante la defecación.
Es raro que se presente vómito. La diarrea puede continuar por 2 ó 3 días, así
como también pueden persistir el dolor abdominal y malestar aun cuando no haya
diarrea.
- 12 -
En una proporción significativa de pacientes infectados por Campylobacter jejuni
las heces pueden contener sangre fresca, pus o moco, sugiriendo una inflamación
colorrectal, lo cual no es raro. La sigmoidoscopia revela anormalidades de la
mucosa que van desde un edema o una congestión con o sin hemorragia petequial,
hasta una mucosa dañada severamente parecida a tejido carcinogénico.
El dolor abdominal severo puede llegar a confundirse con una peritonitis aguda.
Ocasionalmente estos pacientes, principalmente adolescentes y adultos jóvenes,
pueden desarrollar una peritonitis de una apendicitis aguda, pero en la mayoría de
éstos se observa una inflamación del íleon y el yeyuno con adenitis mesentérica.
Puede haber complicaciones locales como la colecistitis, pancreatitis y peritonitis.
La infección también puede manifestarse como una colitis aguda con síntomas de
fiebre, cólicos abdominales y diarrea sanguinolenta, que persiste durante una
semana o más.
Se ha documentado que personas deficientes en inmunoglobulinas (Igs), las
infecciones por campylobacterias pueden ser prolongadas, severas y recurrentes,
con
frecuencia
desarrollando
bacteriemia
y
otras
manifestaciones
extraintestinales, tales como lesiones cutáneas erisipeloides, osteomielitis.
Además, varias semanas después de la infección, puede aparecer artritis reactiva
en personas que portan los antígenos de histocompatibilidad HLA-B2.
Las
infecciones
extraintestinales
por
Campylobacter
como
meningitis,
osteomielitis y sepsis neonatal son raras, pero se han llegado a observar; se ha
reconocido Campylobacter jejuni asociada con pacientes que padecen síndrome
de Guillain-Barré. El síndrome de Guillain-Barré es una afección autoinmune del
sistema nervioso periférico que produce parálisis fláccida aguda. El síndrome se
ha llegado a correlacionar a una infección previa por Campilobacter jejuni hasta
en un 40% de los casos, demostrándose que este síndrome se produce como
consecuencia del ataque inmune debido al mimetismo molecular que existe entre
algunas moléculas del lipopolisacárido (LPS) de cepas de C. jejuni y los
gangliósidos del tejido nervioso humano, siendo los más severos y que requieren
de hospitalización rápida. Algunos serotipos de C. jejuni también están asociados
al SGB. (Ministerio de Salud, 2001) (García, 2007).
- 13 -
2.4.4 Diagnóstico de laboratorio.
El examen directo de las heces es una herramienta de utilidad en la investigación
inicial del paciente con enteritis. La microscopía de campo oscuro o de contraste
de fases, sobre todo en la fase aguda de la enfermedad, puede revelar la movilidad
característica de Campylobacter que aporta un diagnóstico presuntivo en forma
rápida. También pueden observarse frotis teñidos por técnica de Gram modificado
para observar bacilos-gramnegativos sugestivos del germen, pero la sensibilidad
de este método es de 50-75%. La microscopía directa también sirve para
demostrar hematíes y polimorfonucleares que están presentes en las heces de la
mayoría de los pacientes con enteritis por Campylobacter.
El diagnóstico se confirma mediante el aislamiento del germen en medios
especiales, según ya se describió. Se debe señalar que el cultivo cobra especial
importancia en el diagnóstico de enfermedad sistémica ya que es la única forma
de demostrar bacteriemia.
2.5 Enfermedades en animales:
C. fetus ss. fetus: aborto en ovinos.
C. fetus ss. venerealis: infertilidad, reabsorciones embrionarias y en algunas
ocasiones aborto.
C. sputorum ss. mucosalis y C. hyointestinalis: asociados a enteritis proliferativa
en cerdos.
2.5.1 Campilobacteriosis
Antiguamente conocida como vibriosis, esta enfermedad de ovejas y cabras es
causada por Campilobacter fetus var.fetus, que no es el agente causal de la
vibriosis bovina. La campilobacteriosis causa abortos tardíos en ovejas, pero
raramente afecta a cabras.
Las ovejas se enferman por ingestión de forrajes o agua contaminadas por
descargas vaginales o fecales de otras ovejas que hayan abortado. Esta es una
enfermedad que puede causar tormentas de abortos cuando ingresa por primera
- 14 -
vez a una majada no inmunizada, y Campilobacter generalmente es traído por
ovejas compradas o ingresadas por cualquier motivo.
La enfermedad deja una inmunidad sólida luego de provocar abortos o un
aumento en la mortalidad perinatal. Los abortos son tardíos, y las ovejas no se ven
enfermas, aunque alguna puede morir de peritonitis. Los fetos abortados aparecen
frecuentemente "ventrudos" por el agrandamiento del hígado, en el que se
encuentran focos necróticos blanquecinos del tamaño de una nuez y forma
redondeada. Además hay colectas líquidas en cavidad abdominal.
El diagnóstico se confirma por aislamiento o por microscopía de campo oscuro,
que permite identificar el agente causal en una muestra de contenido estomacal
del feto o de los fluidos vaginales de la oveja o de la placenta.
Se deben eliminar los restos orgánicos y fetos abortados para evitar la difusión de
la enfermedad, y toda la manada debería tratarse inmediatamente con tetraciclina
por vía oral, comenzando con 400 mg/oveja/día durante 3 días para luego
disminuir a la mitad hasta terminar los partos. También pueden tratarse por
inyección de tetraciclinas de larga acción.
(http://www.acampo.com.ar/espanol/ot_gan/ot_gan2.htm)
2.5.1.1 Campylobacteriosis genital bovina
La Campylobacteriosis Genital Bovina (CGB) es una enfermedad asociada a
infertilidad, repetición de celos y ocasionales abortos. Es de transmisión venérea y
afecta al ganado lechero y de carne. El agente etiológico es el Campylobacter
fetus (C.fetus) con 2 subespecies: venerealis y fetus. La subespecie venerealis, a
su vez, tiene 2 biotipos: intermedius y Dedié. La subespecie fetus incluye los tipos
1 (cepas intermediarias) y 2. Esta diferenciación se realiza por biotipificación.
2.5.1.1.1Manifestaciones clínicas
El toro es el portador asintomático de la enfermedad, no afectándose su capacidad
reproductiva. Campylobacter fetus habita en las criptas prepuciales del toro. En
los toros adultos estas criptas son mayores en número y en medida por lo que
- 15 -
contendrían un número importante de bacterias en su interior. El toro juega un rol
importante en la transmisión de la enfermedad asociado al factor etáreo.
En la hembra se manifiesta por ciclos estrales largos, repeticiones de celo,
disminución del porcentaje de preñez, debida a mortalidad embrionaria y abortos
que no suelen superar el 10 %.
Campylobacter fetus habita en la hembra en las mucosas del útero, cérvix y
vagina. La infertilidad en la hembra está relacionada con la restricción de O2 que
provoca el ingreso de C. fetus en el útero, la acción de la mucinasa que
despolimeriza el mucus vaginal y por la endometritis mucopurulenta subaguda.
2.5.1.1.2Diagnostico
El diagnóstico se realiza en los machos, en las hembras y en los fetos. En el toro
se efectúan 3 raspajes prepuciales con intervalo de 7 a 10 días para evitar falsos
negativos. También se puede analizar el semen ya sea fresco o congelado. En las
hembras el material de elección es el mucus vaginal o descargas uterinas de
animales abortados, utilizándose para su extracción la pipeta de inseminación. En
el caso de fetos, el líquido abomasal y el pulmón son los materiales de elección
para aislar Campylobacter fetus.
El aislamiento del microorganismo permite obtener la certeza del diagnóstico y la
biotipificación diferencia las subespecies venerealis y fetus y el biotipo
intermedius. Actualmente también se puede clasificar subespecies de C. fetus por
técnicas de biología molecular como el PCR.
También se utiliza para diagnóstico la técnica de Inmunofluorescencia Directa
como método de “screening”, tanto para machos como para hembras y fetos. Es
una técnica sensible y específica pero tiene el inconveniente de no diferenciar
subespecies de C. fetus.
2.5.1.1.3Control
El control de la enfermedad es posible siempre y cuando se adopten medidas de
manejo, tratamientos con antibióticos en machos y vacunaciones sistemáticas de
todos los bovinos que entren a servicio.
La mayoría de los establecimientos de cría no han adoptado tecnologías para
lograr un buen control reproductivo. Medidas simples como son el
- 16 -
estacionamiento del servicio, el uso de toros jóvenes y con certificado sanitario
que los acredite como libres de Campylobacter fetus, no rotar los toros durante el
servicio, el realizar por lo menos 3 muestreos a partir de los 30 días de retirados
los toros del servicio con intervalos de 7 a 10 días, son instrumentadas en muy
pocos establecimientos.
(http://www.produccionbovina.com/sanidad_intoxicaciones_metabolicos/enferme
dades_reproduccion/08-enfermedades_afectan_reproduccion.htm.).
2.6 Medios de cultivo y pruebas bioquímicas
En este análisis se utilizan varios medios de cultivo y pruebas bioquímicas, entre
ellos están:
Caldo y agar Brucella:
Contiene los componentes mínimos requeridos para el crecimiento de
Campylobacter, como peptona, extracto de levadura, dextrosa, bisulfito de sodio,
etc.
Agar Brucella BBL:
Este medio de cultivo contiene sangre de caballo por la cual el microorganismo
presenta reacciones hemolíticas.
Suplemento FBP:
Este suplemento favorece el crecimiento y la aerotolerancia de Campylobacter.
(DIFCO)
Agar MCCDA:
El uso de este medio es específico por el ministerio de agricultura, pesqueras y
productos alimenticios, el suplemento CCDA inhibe el crecimiento de levaduras,
hongos y enterobacterias. (MERCK)
Oxidasa: La presencia de citocromo C oxidasa en la cadena de trasporte de epuede detectarse utilizando un aceptor de e- artificial p-fenilendiamina. Es una
prueba que detecta la presencia del enzima citocromooxidasa. La enzima
- 17 -
citocromooxidasa, en presencia de oxígeno atmosférico, oxida el reactivo
fenilendiamina oxidasa para formar un compuesto coloreado: indofenol.
Catalasa: La catalasa es una enzima que protege a las células frente al peróxido de
hidrógeno producido en el metabolismo del oxígeno. Se basa en la capacidad del
enzima catalasa de descomponer el peróxido de hidrógeno añadido, formándose
agua y O2, el cual se libera en forma de burbujas. Excluyendo los estreptococos,
la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas poseen actividad
catalasa. (http://chopo.cnice.mecd.es/~gdiaz3/apuntes/UT162.pdf)
Fermentación de la glucosa: Mediante esta prueba se puede determinar la
capacidad que tiene el microorganismo de fermentar un azúcar como la glucosa.
Para esto se utiliza el indicador de pH rojo de fenol, el cual cambia de color en
cuanto el pH del medio cambia, observándose acido (amarillo) cuando el azúcar
fue fermentada y alcalino (rojo) cuando no.
Sensibilidad a antibióticos: Muchos microorganismos presentan sensibilidad o no
a cierto tipo de antibióticos. Mediante estas pruebas se puede determinar que tan
sensibles son frente a cualquier antibiótico. Esto se define observando el halo de
inhibición que el microorganismo presenta en presencia de antibióticos. (Velasco
2002)
2.7 Laboratorio LABSER
La globalización es una realidad que Chile debe asumir para asegurar su
desarrollo económico y bienestar social. LABSER es un laboratorio dotado de
infraestructura tecnológica y profesional que permite ofrecer servicio y asesoría
permanente a las actividades de importación y/o exportación, principalmente de
alimentos y materias primas de manera de garantizar la calidad e inocuidad de
tales bienes de consumo.
Hoy en día la calidad e inocuidad de los alimentos vale decir ausencia de
contaminantes químicos, microbiológicos o físicos- es una condición exigida
- 18 -
prioritariamente por distribuidores y consumidores para aceptar o rechazar un
determinado producto alimenticio.
El laboratorio en el área de microbiología cuenta con diversos análisis tales como:
•
Recuento de Aerobios Mesófilos (BAM FDA / Petrifilm AOAC)
•
Recuento de Microorganismos cultivables.
•
Determinación de Salmonellas (BAM – FDA / USDA – FSIS / SAG /
Assurance EIA)
•
Recuento de Hongos y Levaduras.
•
Recuento de Enterobacterias.
•
Determinación Coliformes (tubos múltiples / Petrifilm)
•
Determinación Listeria
•
Análisis Ambiental de superficie
•
Recuento S. aureus
•
Recuento Clostridium perfringens
•
Recuento Sulfito Reductores
•
Metodología PCR (http://www.labser.cl/HOME.htm)
- 19 -
3. FORMULACION DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION
3.1 Formulación del problema.
El propósito de este trabajo es hacer un estudio financiero (costos) para
determinar si se puede implementar el análisis de Campylobacter spp según la
metodología descrita por USDA/FSIS MLG Capitulo 6 1998 en el laboratorio
LABSER de Rancagua Chile.
3.2 Preguntas de investigación.
La presente propuesta plantea los siguientes interrogantes:
¿Al realizar el estudio financiero (costos) será posible implementar el análisis de
Campylobacter spp USDA/FSIS Capitulo 6 1998 en el laboratorio LABSER?
¿Será que la implementación de esta técnica es muy costosa?
3.3 Justificación de la investigación.
El laboratorio LABSER ubicado en la ciudad de Rancagua Chile es un laboratorio
encargado de realizar diferentes análisis tanto químicos como microbiológicos.
Este laboratorio no cuenta con todo el procedimiento para análisis
de
Campylobacter spp por eso este trabajo se realizo con el fin de evaluar los costos
para determinar si se puede implementar el método de análisis de Campylobacter
spp según la USDA/FSIS Capitulo 6 1998.
Campylobacter es el microorganismo causante de muchas enfermedades en el
hombre como en los animales. La mayoría de las infecciones se originan por
consumo de alimentos de origen animal, sobretodo la carne de pollo y derivados
de aves. Otros alimentos implicados son las carnes rojas, despojos, moluscos,
leche y quesos no pasteurizados y aguas no cloradas. Por eso su identificación es
muy importante hacerla en muestras de alimentos.
- 20 -
4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo general
Realizar un estudio para la implementación del análisis de Campylobacter spp
basado en la metodología USDA/FSIS MLG Capitulo 6 1998 en el laboratorio
LABSER de Rancagua Chile, haciendo una investigación económica- financiera y
según esta determinar si es posible la implementación de este método en el
laboratorio.
4.2 Objetivos específicos
Comparar entre las diferentes casas comerciales de productos microbiológicos
cual es la más económica y conveniente para el análisis de Campylobacter spp.
Determinar cuales son los equipos que se utilizan en este análisis con los que el
laboratorio no cuenta y cual debe ser su inversión para obtenerlos.
Establecer el costo del análisis para los clientes, basándose en insumos,
horas/hombres, gestión de calidad, costos indirectos etc.
Comparar el costo final del análisis en esta investigación con el costo establecido
por el laboratorio de la Universidad de Chile a la cual LABSER subcontrata para
el análisis.
- 21 -
5. MATERIALES Y METODOS
5.1 Materiales
Los materiales y métodos descritos a continuación, son los propuestos por la
metodología USDA/FSIS MLG Capitulo 6 1998
5.1.1 Materiales para el aislamiento, identificación y cuantificación de
Campylobacter jejuni/coli en productos de carne y aves de corral.
5.1.1.1 Equipos
•
Microscopio. Objetivo de 100X
•
Incubadoras con agitación/baño termostatado a 37 ± 1.0°C y 42 ± 1.0ºC
•
Incubadora estática 42 ± 1.0 ºC
•
Balanza, sensibilidad de 0.1 g
•
Bolsas de Qwik Seal® (metales Co. de Reynolds, Richmond, VA; # RS78)
tamaño 1/4
•
Jarras anaerobiosis (expresadas o no ventiladas)
•
CampyPak PlusÔ (BBL 71045) o kits para Campylobacter que generan gas
(Oxoid BR56 para tarros de 3.0-3.5 litros, o BR60 para tarros de 2.5-3.0 litros)
•
Bomba al vacío con tubería y conectores para la evacuación de gas en jarras
anaerobiosis
•
Cilindro de gas que contiene una mezcla de O2 al 5%, CO2 al 10%, y N2 al
85% con tubería y conectores apropiados para traspasarse a jarras de
anaerobiosis y bolsas de Qwik Seal®
•
Regulador para el cilindro de gas compatible con la conexión en el cilindro
•
Papel de filtro (para humectar con glicerol y para la prueba de oxidasa)
•
Placas de Petri (100 x 15 milímetros)
•
Asas estériles
•
Filtros de membrana estériles de 0.2 µm
•
Laminas, laminillas y aceite de inmersión
- 22 -
•
Tubos de tapa rosca de 16 x 150 milímetros y de 16 x 125 milímetros
•
Frascos de 250 ml
•
Esponjas estériles
•
Pinzas y tijeras estériles
•
Pipetas estériles
•
Bolsas plásticas grandes estériles
•
Stomacher 400, y bolsas Stamacher 400
•
Centrifuga, rotor, para botellas de 250 ml estériles
•
Embudos estériles
5.1.1.2 Reactivos
•
Glicerol
•
Solución de peróxido de hidrógeno al 3%
•
Discos de sensibilidad a antibióticos (Cefalotina 30 µg)
•
Discos de sensibilidad a antibióticos (Acido Nalidixico 30 µg)
•
Reactivo para prueba de Oxidasa (Solución tetrametil-p-fenilendiamina
dihidrocloridrico al 1%)
5.1.1.3 Medios de cultivo
•
Caldo de enriquecimiento Hunt (HEB)
•
Agua peptonada al 0.1%
•
Agar diferencial modificado para Campylobacter (MCCDA)
•
Caldo Brucella-FBP (BFBP)
•
Medio semisólido glucosa Brucella
•
Agar Brucella-FBP (BFBP)
- 23 -
5.1.2 Métodos
5.1.2.1 Preparación de medios de cultivo
•
Caldo de enriquecimiento Hunt (HEB)
Caldo básico
Caldo nutritivo 25.0g
Extracto de levadura 6.0g
Agua destilada 950.0ml
Disolver el caldo nutritivo y el extracto de levadura en agua destilada. Autoclavar
121ºC por 15 minutos. pH final 7.5 ± 0.2 a 25ºC
Los suplementos (FBP, antibióticos, y sangre del caballo esterilizados con filtro
por filtración) se agregan momentos antes del uso y se mezclan.
Suplemento FBP
Sulfato ferroso 0.25g
Metabisulfito de sodio 0.25g
Piruvato de sodio 0.25g
Ver preparación abajo.
Antibióticos
Clorohidrato vancomicina 10.0 mg
Solución stock de Vancomicina
En un frasco volumétrico, disolver 0.25g vancomicina en 100ml de agua
destilada, mezclar y esterilizar con filtración por membrana. Almacenar a 4oC.
Utilizar 4ml para cada litro de caldo del enriquecimiento.
Trimetoprim Lactato 12.5 mg
- 24 -
Solución stock de lactato del Trimetoprim
En un frasco volumétrico, disolver 0.3125g de lactato de trimetoprim en 100ml de
agua destilada, mezclarte y esterilizarlos con filtro. Almacenar en 4oC. Utilizar
4ml para cada litro de caldo del enriquecimiento.
Cefoperazona de Sodio 15.0 mg
Solución stock de Cefoperazona
En un frasco volumétrico, disolver 0.375g de cefoperazona en 100ml de agua
destilada, mezclar, y esterilizarlos con filtración por membrana. Almacenar a 70oC en alícuotas de 4ml. Inicialmente, utilizar 4ml para cada litro de caldo de
enriquecimiento (para las primeras cuatro horas, la incubación está a 37oC).
Después de cuatro horas, agregar 4ml/l adicional, para traer la concentración final
a 30mg/l, y aumentar la temperatura de incubación a 42oC.
Cicloheximida 100.0 mg
Solución stock de Cicloheximida
Preparar una solución al 10% en etanol al 50%. En un frasco volumétrico de 50
ml, disolver 5g de cicloheximida en 50 ml de etanol al 50%, mezclar y esterilizar
con filtración por membrana y almacenar en 4oC. Utilizar 1ml para cada L de
caldo.
Sangre lisada de caballo estéril 50.0 ml
Lise la sangre del caballo sujetándola a dos ciclos de heladas/deshielo. Almacenar
en congelación.
•
Agua peptonada al 0.1%
Agregar 0.1g de peptona en 100ml de agua destilada según el análisis lo requiera.
•
Agar diferencial modificado para Campylobacter (MCCDA)
Caldo nutritivo 25.0 g
- 25 -
Carbón activado 4.0 g
Caseína hidrolizada 3.0 g
Desoxicolato de sodio1.0 g
Sulfato ferroso 0.25 g
Piruvato sodico0.25 g
Agar 12.0 g
Cefoperazona de sodio 0.032 g
Agua destilada 1.0 L
Preparación del medio:
Suspender 45.5g del agar base selectiva sin sangre de Campylobacter Oxoid
(CM739) en 1L de agua destilada y llevarlo a ebullición para disolver. Esterilizar
en autoclave a 121°C por 15 minutos. Enfriar a 50°C. Agregar en condiciones
asépticas 1 vial del suplemento selectivo SR0155 de CCDA. Mezclar bien y verter
en las placas de Petri estériles.
•
Caldo Brucella-FBP (BFBP)
Bacto triptona 10.0 g
Bacto Peptona 10.0 g
Bacto dextrosa 1.0 g
Bacto extracto de levadura 2.0 g
Cloruro de sodio 5.0 g
Bisulfito de sodio 0.10 g
Agua destilada 1.0 L
Suplemento FBP
Sulfato ferroso 0.25g
Metabisulfito de sodio 0.25g
Piruvato de sodio 0.25g
Ver preparación abajo
- 26 -
Disolver 28g de caldo Brucella en 1L de agua destilada y autoclavar a 121oC por
15 minutos. Enfriar el medio a temperatura ambiente y agregar la solución FBP.
En condiciones asépticas dispensar en tubos tapa rosca. pH final 7.2 ± 0.2 a 25ºC
•
Medio semisólido glucosa Brucella
Pancreatic digest of casein 15.0 g
Peptic digest of animal tissue 5.0 g
Extracto de levadura 2.0 g
Cloruro de sodio 5.0 g
Bisulfito de sodio 0.1 g
Agar 1.6 g
Dextrosa 11.0 g
Rojo de fenol 0.02 g
Agua destilada 1.0 L
Suspender 28g del caldo Brucella (Albimi; deshidratado; BBL) excepto rojo de
fenol y el agar en 1L de agua destilada, y ajustar el pH a 7.4 con NaOH al 8 N.
Agregar el agar. Calentar la mezcla hasta que se observe que está bien disuelta.
Enfriar a 55°C y agregar 2.5ml de la solución rojo de fenol (0.08 g/10 ml de 0.1 N
NaOH ). Reajustar el pH a 7.4 en caso de necesidad, dispensarlo y esterilizarlo en
121oC por 10 minutos.
pH final 7.0 + 0.2 a 25oC.
•
Agar Brucella-FBP (BFBP)
Bacto peptona 20.0 g
Bacto dextrosa 1.0 g
Bacto extracto de levadura 2.0 g
Cloruro de sodio 5.0 g
Bisulfito de sodio 0.1 g
- 27 -
Bacto Agar 15.0 g
Agua destilada 1.0 L
Suplemento FBP
Sulfato ferroso 0.25g
Metabisulfito de sodio 0.25g
Piruvato de sodio 0.25g
Ver preparación abajo.
Suspender 43g de agar Brucella (Deshidratado; Difco) en 1L de agua destilada.
Calentar la mezcla hasta observar que está bien disuelta. Autoclavar a 121oC por
15 minutos. Enfriar a 50oC y agregar la solución ferrosa esterilizada con filtro por
filtración 4 ml de la solución FBP. Mezclarte y servir.
•
solución stock FBP
Sulfato ferroso 6.25g
Metabisulfito de sodio 6.25g
Piruvato de sodio 6.25g
Disolver los ingredientes en 100ml de agua destilada en un frasco volumétrico.
Conservar a -20oC. Utilizar 4ml por cada litro de caldo del enriquecimiento.
5.1.2.2 Aislamiento y cuantificación
1. 25g para muestras de carne o esponja en 100 ml de HEB en bolsas de Qwik
Seal® tamaño 1/4. Colocar las bolsas en el Stomacher a 400 RPM durante 2
minutos. Quitar todo el aire posible sin derramar el contenido, después sellar
las bolsas, dejando una abertura de 1/2 pulgada en un extremo. En condiciones
asépticas insertar una pipeta estéril de 10 ml. Conectar la boca de la pipeta con
la mezcla del gas de Campy microaerofilo (O2 al 5%, CO2 al 10%, y N2 al
85%) con un tubo de goma estéril y un filtro estéril, inflar lentamente la bolsa
- 28 -
con el Campy para proveer gas a la mezcla y continuar llenando hasta que
exceso del gas salga de la bolsa. Continuar con el párrafo 4.
2. Colocar la carcasa o la carne de pollo cruda (hasta 1360 g) en una bolsa
plástica grande estéril y agregar 200 ml de agua peptonada al 0.1%. Sellar las
bolsas y mezclar el contenido por 2 minutos. Inclinar la bolsa permitiendo
fluir el líquido a una esquina. Esterilizar la esquina de la bolsa con una
solución de hipoclorito 1000 PPM o etanol al 70%, después enjuagar con agua
destilada estéril. En condiciones asépticas cortar la esquina de la bolsa y verter
el líquido en una botella estéril de 250 ml para centrifugar. Centrifugar a
16.000 RPM x g durante 15 minutos. Desechar el sobrenadante y resuspender
el pellet en 10 ml de agua peptonada al 0.1%. Para la detección, inocular 1 ml
del lavado concentrado en 100 ml HEB en una bolsa de Qwik Seal®. Seguir
con los pasos descritos en la tercera línea del párrafo 1.
3. Si desea cuantificar, debe realizar NMP con HEB utilizando series de tres
tubos. Se deben elegir las diluciones y los volúmenes de caldo HEB según el
nivel de contaminación que las muestras tengan. Por ejemplo, para productos
de aves de corral se agregan 10ml de la muestra en tres bolsas o botellas con
90ml de caldo HEB. Realizar diluciones seriadas de la muestra con agua
peptonada al 0.1%. Preparar el NMP en tubos subsecuentes y agregar 1ml en
tubos de 9ml de HEB por triplicado para la dilución decimal. Colocar todos
los tubos en jarras de anaerobiosis, como se indica en el párrafo 7. Seguir los
pasos de la incubación del párrafo 4. Según los tubos positivos obtenidos
después de la incubación calcular el resultado según la tabla MPN de
Campylobacter.
4. Incubar las bolsas de Qwik Seal® o las jarras de anaerobiosis que contienen
los tubos de NMP a 37 ± 1 ºC, agitando a 100 RPM durante 4 H.
5. Después de la incubación, en condiciones asépticas agregar una solución
adicional de cefoperazona estéril 4 ml/l para tener una concentración final en
- 29 -
cada recipiente de enriquecimiento de 30 mg/l. Restablecer la atmósfera
microaerófila y aumentar temperatura 42 al ± 1 ºC. Continuar la incubación
durante 20 h a 100 RPM.
6. Enriquecimiento directo de la esponja en dilución 1:100 sobre las placas de
MCCDA (para productos cocinados, dilución 1:50) la dilución se hace
dependiendo del tipo de matriz que se vaya a analizar, puede ser directa o
consecutiva. Sembrar 0.1ml del caldo de enriquecimiento o de las diluciones y
con un rastrillo expandir la muestra.
7. Incubar las placas de MCCDA a 42 ± 1 ºC durante 24 h en las jarras de
anaerobiosis bajo condiciones microaerófilas. Agregar cerca de 4 gotas de
glicerol a un papel de filtro y colocarlo en la jarra, para disminuir el
confluente. Si no hay crecimiento después de 24 h, reincubar las placas
durante 24 a 48 h adicionales para procurar la recuperación. Las condiciones
microaerófilas se pueden alcanzar en la jarra con cualquiera de los siguientes
métodos:
•
Evacuar el aire en una jarra de anaerobiosis expresado al vacío con 20
pulgadas de mercurio y llenar la jarra con una mezcla del gas del O2 al 5%,
CO2 al 10%, y N2 al 85%. Repetir el procedimiento del evacuación reemplazo
tres veces para asegurar las condiciones atmosféricas apropiadas.
•
CampyPak PlusÔ (BBL) o kit para Campylobacter que genera gas (Oxoid).
Seguir las instrucciones de uso del fabricante y la disposición de los materiales
del kit.
5.1.2.3 Identificación de Campylobacter
Las colonias de Campylobacter en MCCDA son lisas, brillantes, con borde plano
o definido, transparente o translúcido, y con superficie de borde irregular;
descolorido como crema grisácea y ligera; y generalmente 1 a 2 milímetros de
diámetro pero dentro pueden tener una punta de varios milímetros. Las placas con
- 30 -
las colonias de Campylobacter se pueden almacenar hasta 48 h refrigeradas bajo
condiciones microaerófilas.
Utilizar un asa para escoger tres colonias sospechosas de Campylobacter de las
placas de MCCDA y transferirlas cada una a 10 ml de caldo del Brucella-FBP
(BFBP). Puesto que Campylobacter puede tener varios cambios en cuanto a su
morfología colonial, es recomendable cultivar paralelamente por lo menos uno o
todos los tipos de colonias presentes en las placas, para asegurar no pasar por alto
ninguna. Alternativamente, las colonias se pueden investigar con microscopia
antes de sembrarlas en BFBP. Para cultivar colonias aisladas, se deben incubar los
tubos de BFBP con las tapas flojas durante 24 a 48 h a 42 ± 1 ºC en una atmósfera
del O2 al 5%, CO2 al 10%, y N2 al 85%. Los tubos no deben ser mezclados ya
que esto introducirá oxígeno en los medios.
Realizar las siguientes pruebas para la identificación de las colonias crecidas en
caldo BFBP:
•
Examinar superficie mojada en el caldo BFBP y observar las colonias en el
microscopio con un objetivo de 100X usando aceite de inmersión. Las células
jóvenes de Campylobacter aparecen como barras curvadas estrechas (0.2 a
0.8µm de ancho por 1.5 a 5µm de largo). Estos microorganismos demuestran
el movimiento rápido. Los pares de células pueden asemejarse a la silueta de
la letra S. Cuando las cadenas son mas largas pueden parecer helicoidales,
curvadas, y multiespirales, las formas filamentosas alargadas pueden existir.
Células crecidas durante más de 72 h pueden convertirse en no cultivables y
cocoides. Campylobacter se caracteriza por ser Gram – pero las características
más significativas de estos organismos son la morfología y la motilidad.
5.1.2.3.1 Pruebas bioquímicas
•
Inocular las colonias del caldo BFBP a una profundidad de 10 milímetros en
los tubos de medio semisólido glucosa para Brucella. Incubar los tubos con las
tapas flojas dentro de una jarra de anaerobiosis bajo condiciones
microaerófilas a 42 ± 1.0oC durante 1 a 3 días.
- 31 -
1. Prueba de la fermentación de la glucosa: Campylobacter no es un fermentador
de la glucosa, así que el color del medio seguirá siendo rojo-anaranjado. Una
reacción positiva demuestra un color amarillo (ácido con el indicador del rojo
de fenol) en el medio semisólido glucosa para Brucella.
2. Prueba de la Catalasa: Después de leer los resultados de la prueba de la
fermentación de la glucosa, agregar 1 ml de peroxido de hidrógeno al 3% a la
colonia en el medio semisólido glucosa para Bruella, después de dos a tres
minutos, invertir suavemente el tubo para distribuir el reactivo. Examinar
después de 1 a 10 minutos la formación de burbujas, indicando una reacción
positiva. C, Jejuni y C. coli son catalasa positivo.
•
Agregar cerca de seis gotas de la colonia del caldo de BFBP a una placa de
agar BFBP, y sembrar por agotamiento el inoculo sobre la superficie con una
torula o con un rastrillo. En condiciones asépticas colocar un disco de ácido
nalidixico (30µg) y un disco de cefalotina (30µg) en cada placa. Presionar
cada disco con pinzas estériles para adherirlo a la superficie del agar. Incubar
las placas en una jarra de anaerobiosis a 42 ± 1 ºC durante 1 a 3 días en una
atmósfera microaerófila.
1. Susceptibilidad al ácido nalidixico y a la cefalotina: Observar el crecimiento
alrededor de los discos impregnados con el antibiótico C. Jejuni y C. coli son
sensibles al ácido nalidixico, existirá alrededor del disco una zona clara debido
a la inhibición. Una zona de cualquier tamaño que indica la sensibilidad. Este
organismo es resistente a la cefalotina, así que el crecimiento será presente
hasta el disco. El crecimiento de Campylobacter puede ser muy ligero y difícil
de ver, así que es adecuado inclinar la placa en ángulo bajo luz para verlo.
2. Prueba de Oxidasa: Poner un pedazo de papel de filtro cuadrado de 2
centímetros en una placa vacía y agregar de 1 a 2 gotas del reactivo de oxidasa
al papel. Impregnar el papel con reactivo sobre un punto con células de 3 a 5
milímetros diámetro usando un asa en loop de platino o plástico. La prueba es
positiva si el papel cambia a color púrpura oscuro en un plazo de 30 segundos.
- 32 -
Alternativamente, la prueba de oxidasa de Disco DrySlideÔ puede ser
utilizada. Campylobacter es oxidasa positivo. (USDA/FSIS MLG 1998.
Capitulo 6)
5.2 Métodos
Según la metodología USDA/FSIS descrita en el numeral 5.1 se determino cuales
eran los equipos, reactivos y medios de cultivo necesarios para implementar
Campylobacter spp en el laboratorio LABSER.
Estos fueron organizados en una lista, y en el caso de los equipos se verifico con
cuales contaba el laboratorio y en cuales tenia que hacer la inversión.
Posteriormente se hicieron las diferentes cotizaciones para los medios de cultivo,
reactivos y equipos. Estas cotizaciones se realizaron en diferentes casas
comerciales de productos microbiológicos, de las cuales LABSER provee todos
sus materiales. Se hizo una comparación entre estas casas comerciales para
determinar cual era la más conveniente en el laboratorio.
Después de haber realizado este estudio financiero se estableció cual es el costo
total del análisis que se ofrecerá a los clientes, basado en insumos, horas hombres,
gestión de calidad y costos indirectos etc.
Los costos horas hombres, gestión de calidad y costos indirectos se obtuvieron
según los valores establecidos por LABSER en previos análisis. Las horas
hombres se adquieren haciendo un análisis directo del tiempo de trabajo que
requiere el método, los costos indirectos incluyen inversión, servicios de agua, luz
y gas, además de la utilización de equipos, materiales de trabajo, los insumos
necesarios para el área de lavado y preparación de material; y en gestión de
calidad se evalúa el trabajo diario del personal realizando control de calidad a
equipos , medio ambiente, materiales, cepas, y medios de cultivo a los cuales se
les hace pruebas de estabilidad, selectividad, productividad y control de pH.
- 33 -
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1 Cotizaciones
6.1.1 Equipos
Según el listado de equipos necesarios para el análisis de Campylobacter spp
LABSER tiene los siguientes: microscopio, incubadora estática, balanza, bomba
al vacío con tubería y conectores para la evacuación de gas en jarras anaerobiosis,
cilindro de gas que contiene una mezcla de O2 al 5%, CO2 al 10%, y N2 al 85%
con tubería y conectores apropiados para traspasarse a jarras de anaerobiosis y
bolsas de Qwik Seal, regulador para el cilindro de gas compatible con la conexión
en el cilindro, stomacher. Algunos de estos se encuentran disponibles en el área de
química. En la tabla 1 se indican los equipos con los que este laboratorio no
cuenta y sus respectivas cotizaciones.
Dentro de los equipos está la incubadora con agitación, que es muy importante ya
que esta tiene establecidas las temperaturas a las cuales Campylobacter spp debe
ser sometido para su
crecimiento, además de proporcionar un permanente
movimiento al medio facilitando un mejor desarrollo del microorganismo. Debido
a que Cambylobacter spp es un microorganismo microaerofilico es importante
someterlo a una atmósfera mínima de oxigeno, para esto se utilizan las jarras de
anaerobiosis las cuales protegen a los cultivos del oxigeno libre.
La centrifuga es un aparato mecánico que utiliza la fuerza centrípeta para separar
sustancias de diferentes densidades, pueden usarse para la separación rápida de
sustancias que en condiciones normales se separarían lentamente bajo la
influencia de la gravedad. El principio de la centrifuga es separar partículas en un
medio líquido por sedimentación.
(http://www.aguamarket.com/diccionario/terminos.asp?Temas=453&termino=&I
d=453)
En este caso la centrifuga se utilizara para separar el microorganismo del medio
de cultivo, esto con el fin de obtener mas concentración para los posteriores
análisis.
- 34 -
Tabla 1. Cotización de equipos
Equipos
Recipiente de anaerobios 2.5 L
Centrifuga botellas
Baño termoregulado con agitación
Total
Costo Merck
$ 87.313
$ 4.438.000
Costo Arquimed
Costo Andes Import
$ 95.700
Costo Establecido
$ 87.313
$ 4.438.000
$ 1.779.500
$ 6.304.813
Costo/l-uni Andes
import
$ 21.720 /1L
Costo/l-uni
Establecido
$ 21.720 /1L
$ 5.900 / 250 Discos
$ 5.900 / 250 Discos
$ 17.550 / 50 Tiras
$ 4.968.900
$ 1.779.500
Tabla 2. Cotización reactivos
Reactivos
Peróxido de hidrógeno al 3%
Discos (Cefalotina 30 µg)
Discos (Acido Nalidixico 30 µg)
Oxidasa
Costo/l-uni Merck
Costo/l-uni PV Equip
S.A
$ 7.200 / 250 Discos
$ 7.200 / 250 Discos
$ 5.900 / 250 Discos
$ 5.900 / 250 Discos
$ 17.550 / 50 Tiras
* Sin IVA
* Valores en pesos chilenos
- 35 -
Tabla 3. Cotización medios de cultivo
Componentes y/o Medios
Caldo nutritivo
Extracto de levadura
Peptona
Suplemento FBP
Agar (MCCDA)
Caldo Brucella FBP (BFBP)
Caldo Brucella Albimi BBL
Agar Brucella FBP (BFBP)
Clorohidrato Vancomicina
Trimetoprim Lactato
Cefoperazona de Sodio
Cicloheximida
NaOH
Rojo de fenol
Sangre lisada de caballo
Costo/g-ml Merck
Costo/g-ml PV Equip
S.A
$ 46.100 / 500g
$ 27.900 / 500g
$ 77.000 / 500g
$ 31.770/ 3.75g
$57.960/ 500g
$ 65.300 /250mg
$ 71.100 /50mg
$ 56.500 /1g
$ 198.102 / 5g
$ 15.600/ 5g
$ 9,500/ 500ml
$ 17.800/ 5g
Costo/g-ml Andes
Import
$ 41.630 / 500g
$ 19.398 / 454g
$ 33.095 / 500g
$ 58.536 /500g
$ 50.560 / 500g
$ 52.682 /500g
$ 61.990 / 250mg
$ 65.750 / 50mg
$ 55.700 / 1g
$ 60.600 / 1g
$ 11,200/ 500ml
$ 63.000 /500ml
* Sin IVA
* Valores en pesos chilenos
- 36 -
Costo/g-ml
Establecido
$ 46.100 / 500g
$ 19.398 / 454g
$ 33.095 / 500g
$ 31.770/ 3.75g
$57.960/ 500g
$ 58.536 /500g
$ 50.560 / 500g
$ 52.682 /500g
$ 61.990 / 250mg
$ 65.750 / 50mg
$ 55.700 / 1g
$ 198.102 / 5g
$ 9,500/ 500ml
$ 15.600/ 5g
$ 63.000 /500ml
Según la tabla 1 el laboratorio tendría que hacer una inversión de $ 6.304.813 para
adquirir estos equipos, el costo es alto y se requiere de tener una alta demanda con
el análisis de Campylobacter spp para recuperar la inversión. Se debe tener en
cuenta que al laboratorio no entran muchos análisis para este microorganismo con
relación a los otros.
Para operar estos equipos es importante que el personal este capacitado, además
requieren mantenimiento cada cierto periodo de tiempo y son equipos que
únicamente se utilizarían en el laboratorio para este análisis.
6.1.2 Reactivos
LASER trabaja con la mayoría de estos reactivos debido a los diferentes análisis
que este laboratorio realiza. Estos reactivos son importantes para la identificación
bioquímica de Campylobacter spp. Las cotizaciones de estos se muestran en la
tabla 2.
6.1.3 Medios de cultivo
En el caso de los medios de cultivo se hicieron varias averiguaciones en las
diferentes casas comerciales que LABSER maneja, estas no contaban con el caldo
HEB descrito en la técnica, por esta razón se realizo la cotización de los
componentes por separado, los otros medios junto con el suplemento FPB fueron
cotizados sin ningún problema. La tabla 3 muestra cada medio necesario para
implementar este análisis.
Para el estudio de reactivos y medios de cultivo se hicieron cotizaciones a tres
proveedores con los cuales LABSER trabaja hace mucho tiempo, el parámetro de
elección para estos insumos fue escoger precio más económico para el laboratorio.
Estos medios de cultivo proveen al microorganismo de interés todos los nutrientes
necesarios para su crecimiento y desarrollo. Algunos de estos tienen sustancias
inhibidoras de flora acompañante que puede ser competencia de nutrientes para y
además intervenir en el aislamiento e identificación de Campylobacter spp.
- 37 -
Campylobacter spp es un microorganismo patógeno causante de enfermedades en
animales y humanos por eso su aislamiento y caracterización es muy importante
en muestras de alimentos, principalmente productos carnicos de aves de corral y
ganado vacuno. Está demostrado que la carne de pollo es sin duda la fuente de
infección más importante.
Diferentes estudios epidemiológicos han establecido que entre el 50-70 % de las
infecciones esporádicas de origen alimentario por Campylobacter spp. se deben al
consumo o manipulación de la carne de pollo. (Canals, A)
Para prevenir infecciones por esta bacteria es importante la higiene escrupulosa en
la Industria Alimentaría, detección de los portadores sanos, detección precoz de
la enfermedad, correctos tratamiento térmicos y de manipulación posterior así
como de almacenamiento, para impedir recontaminaciones cruzadas. Los
laboratorios de análisis de alimentos son los responsables de aislar e identificar
diferentes microorganismos causantes de enfermedades por esta razón es
importante someter los alimentos que se comercializan, a un análisis
microbiológico.
6.2 Costo por análisis
La metodología descrita por la USDA/FSIS MLG Capitulo 6 1998 va dirigida a
cuatro matrices para el análisis de Campylobacter spp en alimentos. Las matrices
son: Carne de ave, carne de vacuno, esponja y carcasa. Estas se pueden cuantificar
mediante la técnica de número más probable (NMP) o identificar por medio de
aislamiento y pruebas bioquímicas.
En las tablas 4 y 5 se muestra el análisis de costos para la prueba de NMP
correspondiente a las cuatro matrices y en las tablas 6 y 7 el costo para el
aislamiento e identificación del microorganismo en las diferentes matrices.
- 38 -
Tabla No.4 NMP Campylobacter spp en muestras de carne de vacuno o esponja. Series 3 tubos. Dil 3
Insumo
Hra. Hombre
Aseg. Calidad
Costos indirectos
Bolsa estéril
Agua peptonada 0,1%
HEB
Extracto de Levadura
Caldo nutritivo
Suplemento FBP
Clorohidrato vancomicina
Trimetoprim lactato
Cefaperazona de sodio
Cicloheximida
Sangre lisada de caballo
HEB
Extracto de Levadura
Caldo nutritivo
Suplemento FBP
Clorohidrato vancomicina
Trimetoprim lactato
Cefaperazona de sodio
Cicloheximida
Sangre lisada de caballo
Presentación Cantidad
Presentación
en Análisis
a Usar Volumen ml/Mta $/Producto por Producto
HR
UN
UN
UN
1
$ 114
Tubo
3
9
27
$ 33.095
500
$/g-ml
Receta
gEnvase(g/Lt) ml/Mta
66,2
1
0,027
$/Mta
$ 817
$ 160
$ 12.456
$ 114
$2
Botella
Botella
Botella
Botella
Botella
Botella
Botella
Botella
1
1
1
1
1
1
1
1
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
$ 19.398
$ 41.630
$ 31.770
$ 61.990
$ 65.750
$ 55.700
$ 198.102
$ 63.000
454
500
3,75
0,25
0,05
1
5
500
42,7
83,3
8472,0
247960,0
1315000,0
55700,0
39620,4
126,0
6
25
0,75
0,01
0,0125
0,015
0,1
50
0,600
2,500
0,075
0,001
0,001
0,002
0,010
5,000
$ 26
$ 208
$ 635
$ 248
$ 1.644
$ 84
$ 396
$ 630
Tubo
Tubo
Tubo
Tubo
Tubo
Tubo
Tubo
Tubo
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
81
81
81
81
81
81
81
81
$ 19.398
$ 41.630
$ 31.770
$ 61.990
$ 65.750
$ 55.700
$ 198.102
$ 63.000
454
500
3,75
0,25
0,05
1
5
500
42,7
83,3
8472,0
247960,0
1315000,0
55700,0
39620,4
126,0
6
25
0,75
0,01
0,0125
0,015
0,1
50
0,486
2,025
0,061
0,001
0,001
0,001
0,008
4,050
$ 21
$ 169
$ 515
$ 201
$ 1.331
$ 68
$ 321
$ 510
- 39 -
Glicerol
Campi Pack Plus
Papel filtro
Total
Gota
Bolsa
UN
4
1
1
* Sin IVA
* Valores en pesos chilenos
- 40 -
0,05
0,5
0,5
0,2
0,5
0,5
$ 4.900
$ 44.660
$ 5.363
1000
25
100
4,9
1786,4
53,6
1
1
1
0,200
0,500
0,500
$1
$ 893
$ 27
$ 21.476
Tabla No.5 NMP Campylobacter spp en muestras de carcasa o carne de ave. Series 3 tubos. Dil 3
Insumo
Hra. Hombre
Aseg. Calidad
Costos indirectos
Bolsa estéril
Agua peptonada 0,1%
Agua peptonada 0,1%
HEB
Extracto de Levadura
Caldo nutritivo
Suplemento FBP
Clorohidrato vancomicina
Trimetoprim lactato
Cefaperazona de sodio
Cicloheximida
Sangre lisada de caballo
HEB
Extracto de Levadura
Caldo nutritivo
Suplemento FBP
Clorohidrato vancomicina
Trimetoprim lactato
Cefaperazona de sodio
Cicloheximida
Sangre lisada de caballo
Presentación Cantidad
Presentación
en Análisis
a Usar Volumen ml/Mta $/Producto por Producto
HR
UN
UN
UN
1
$ 114
Botella
1
200
200
$ 33.095
500
Tubo
3
9
27
$ 33.095
500
$/g-ml
Receta
gEnvase(g/Lt) ml/Mta
66,2
66,2
1
1
0,200
0,027
$/Mta
$ 817
$ 160
$ 10.780
$ 114
$ 13
$2
Botella
Botella
Botella
Botella
Botella
Botella
Botella
Botella
3
3
3
3
3
3
3
3
90
90
90
90
90
90
90
90
270
270
270
270
270
270
270
270
$ 19.398
$ 41.630
$ 31.770
$ 61.990
$ 65.750
$ 55.700
$ 198.102
$ 63.000
454
500
3,75
0,25
0,05
1
5
500
42,7
83,3
8472,0
247960,0
1315000,0
55700,0
39620,4
126,0
6
25
0,75
0,01
0,0125
0,015
0,1
50
1,620
6,750
0,203
0,003
0,003
0,004
0,027
13,500
$ 69
$ 562
$ 1.716
$ 669
$ 4.438
$ 226
$ 1.070
$ 1.701
Tubo
Tubo
Tubo
Tubo
Tubo
Tubo
Tubo
Tubo
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
81
81
81
81
81
81
81
81
$ 19.398
$ 41.630
$ 31.770
$ 61.990
$ 65.750
$ 55.700
$ 198.102
$ 63.000
454
500
3,75
0,25
0,05
1
5
500
42,7
83,3
8472,0
247960,0
1315000,0
55700,0
39620,4
126,0
6
25
0,75
0,01
0,0125
0,015
0,1
50
0,486
2,025
0,061
0,001
0,001
0,001
0,008
4,050
$ 21
$ 169
$ 515
$ 201
$ 1.331
$ 68
$ 321
$ 510
- 41 -
Glicerol
Campi Pack Plus
Papel filtro
Total
Gota
Bolsa
UN
4
1
1
* Sin IVA
* Valores en pesos chilenos
- 42 -
0,05
0,5
0,5
0,2
0,5
0,5
$ 4.900
$ 44.660
$ 5.363
1000
25
100
4,9
1786,4
53,6
1
1
1
0,200
0,500
0,500
$1
$ 893
$ 27
$ 26.393
Tabla No.6 Aislamiento e identificación Campylobacter spp en muestras de carne de vacuno o esponja. Dil 3
Insumo
Hra. Hombre
Aseg. Calidad
Costos indirectos
Bolsa Qwik Seal
Agua peptonada 0,1%
HEB
Extracto de Levadura
Caldo nutritivo
Suplemento FBP
Clorohidrato vancomicina
Trimetoprim lactato
Cefaperazona de sodio
Cicloheximida
Sangre lisada de caballo
MCCDA
Glicerol
Campi Pack Plus
Papel filtro
Caldo Brucella
Suplemento FBP
M. semisólido glucosa
Rojo de fenol
NaOH
Presentación Cantidad
Presentación
en Análisis
a Usar Volumen ml/Mta $/Producto por Producto
HR
UN
UN
UN
1
$ 304
Tubo
3
9
27
$ 33.095
500
$/g-ml
Receta
gEnvase(g/Lt) ml/Mta
66,2
1
0,027
$/Mta
$ 957
$ 160
$ 7.647
$ 304
$2
Botella
Botella
Botella
Botella
Botella
Botella
Botella
Botella
1
1
1
1
1
1
1
1
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
$ 19.398
$ 41.630
$ 31.770
$ 61.990
$ 65.750
$ 55.700
$ 198.102
$ 63.000
454
500
3,75
0,25
0,05
1
5
500
42,7
83,3
8472,0
247960,0
1315000,0
55700,0
39620,4
126,0
6
25
0,75
0,01
0,0125
0,015
0,1
50
0,600
2,500
0,075
0,001
0,001
0,002
0,010
5,000
$ 26
$ 208
$ 635
$ 248
$ 1.644
$ 84
$ 396
$ 630
Placa
Gota
Bolsa
UN
Tubo
Tubo
Tubo
Tubo
Tubo
1
16
4
4
3
3
3
1
1
80
0,05
0,5
0,5
10
10
10
2,5
10
80
0,8
2
2
30
30
30
2,5
10
$ 57.960
$ 4.900
$ 44.660
$ 5.363
$ 58.536
$ 31.770
$ 50.560
$ 15.600
$ 9.500
500
1000
25
100
500
3,75
500
5
500
115,9
4,9
1786,4
53,6
117,1
8472,0
101,1
3120,0
19,0
45,5
1
1
1
28
0,75
28
0,08
100
3,640
0,800
2,000
2,000
0,840
0,023
0,840
0,000
1,000
$ 422
$4
$ 3.573
$ 107
$ 98
$ 191
$ 85
$1
$ 19
- 43 -
Peroxido de hidrogeno
Agar BFBP
Suplemento FBP
Disco Cefalotina
Disco Acido nalidixico
Bactident Oxidasa
Placa Petri Desechable
TOTAL
Gota
Placa
Placa
UN
UN
UN
Placa
3
3
3
3
3
3
7
* Sin IVA
* Valores en pesos chilenos
- 44 -
1
20
20
1
1
1
3
60
60
3
3
3
$ 21.720
$ 52.682
$ 31.770
$ 5.900
$ 5.900
$ 17.500
$ 45
1000
500
3,75
250
250
50
21,7
105,3
8472,0
23,6
23,6
350,0
1
43
0,75
1
1
1
3,000
2,580
0,045
3,000
3,000
3,000
$ 65
$ 272
$ 381
$ 71
$ 71
$ 1.050
$ 315
$ 19.665
Tabla No.7 Aislamiento e identificación Campylobacter spp en muestras de carcasa o carne de ave. Dil 3
Insumo
Hra. Hombre
Aseg. Calidad
Costos indirectos
Bolsa estéril
Bolsa Qwik Seal
Agua peptonada 0,1%
Agua peptonada 0,1%
Agua peptonada 0,1%
HEB
Extracto de Levadura
Caldo nutritivo
Suplemento FBP
Clorohidrato vancomicina
Trimetoprim lactato
Cefaperazona de sodio
Cicloheximida
Sangre lisada de caballo
MCCDA
Glicerol
Campi Pack Plus
Papel filtro
Caldo Brucella
Suplemento FBP
Presentación Cantidad
Presentación
en Análisis
a Usar Volumen ml/Mta $/Producto por Producto
HR
UN
UN
UN
1
$ 114
UN
1
$ 304
Botella
1
200
200
$ 33.095
500
Tubo
3
9
27
$ 33.095
500
Tubo
1
10
10
$ 28.000
500
$/g-ml
Receta
gEnvase(g/Lt) ml/Mta
66,2
66,2
56,0
1
1
39,5
0,200
0,027
0,395
$/Mta
$ 957
$ 160
$ 7.742
$ 114
$ 304
$ 13
$2
$ 22
Botella
Botella
Botella
Botella
Botella
Botella
Botella
Botella
1
1
1
1
1
1
1
1
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
$ 19.398
$ 41.630
$ 31.770
$ 61.990
$ 65.750
$ 55.700
$ 198.102
$ 63.000
454
500
3,75
0,25
0,05
1
5
500
42,7
83,3
8472,0
247960,0
1315000,0
55700,0
39620,4
126,0
6
25
0,75
0,01
0,0125
0,015
0,1
50
0,600
2,500
0,075
0,001
0,001
0,002
0,010
5,000
$ 26
$ 208
$ 635
$ 248
$ 1.644
$ 84
$ 396
$ 630
Placa
Gota
Bolsa
UN
Tubo
Tubo
1
16
4
4
3
3
80
0,05
0,5
0,5
10
10
80
0,8
2
2
30
30
$ 57.960
$ 4.900
$ 44.660
$ 5.363
$ 58.536
$ 31.770
500
1000
25
100
500
3,75
115,9
4,9
1786,4
53,6
117,1
8472,0
45,5
1
1
1
28
0,75
3,640
0,800
2,000
2,000
0,840
0,023
$ 422
$4
$ 3.573
$ 107
$ 98
$ 191
- 45 -
M. semisólido glucosa
Rojo de fenol
NaOH
Peroxido de hidrogeno
Agar BFBP
Suplemento FBP
Disco Cefalotina
Disco Acido nalidixico
Bactident Oxidasa
Placa Petri Desechable
TOTAL
Tubo
Tubo
Tubo
Gota
Placa
Placa
UN
UN
UN
Placa
3
1
1
3
3
3
3
3
3
7
* Sin IVA
* Valores en pesos chilenos
- 46 -
10
2,5
10
1
20
20
1
1
1
30
2,5
10
3
60
60
3
3
3
$ 50.560
$ 15.600
$ 9.500
$ 21.720
$ 52.682
$ 31.770
$ 5.900
$ 5.900
$ 17.500
$ 45
500
5
500
1000
500
3,75
250
250
50
101,1
3120,0
19,0
21,7
105,3
8472,0
23,6
23,6
350,0
28
0,08
100
1
43
0,75
1
1
1
0,840
0,000
1,000
3,000
2,580
0,045
3,000
3,000
3,000
$ 85
$1
$ 19
$ 65
$ 272
$ 381
$ 71
$ 71
$ 1.050
$ 315
$ 19.909
Según las anteriores tablas podemos determinar que el análisis de Campylobacter
spp es costoso tanto para el laboratorio como para el cliente; ya que esta técnica
requiere de equipos y medios de cultivos específicos que tienen un alto valor en el
mercado. Se debe tener en cuenta que estos precios no incluyen IVA ni tampoco
el porcentaje de ganancia que el laboratorio establece. Cuando estos valores se
sumen al costo del análisis, el valor final de la prueba será mayor y este no
favorece a los clientes.
No todas las empresas chilenas le dan importancia a este análisis, son pocas las
que tienen en cuenta hacerlo. Desde enero hasta agosto del 2007 solo entraron 14
muestras para el análisis de Campylobacter spp al laboratorio, numero que no es
bueno para una prueba tan costosa.
La inversión que el laboratorio tendría que hacer en equipos es alta y pasaría
mucho tiempo en recuperarse si tenemos en cuenta los pocos análisis que llegan al
laboratorio, un promedio de 2 análisis por mes. La proyección de ingresos es baja.
Actualmente el laboratorio subcontrata a la Universidad de Chile para realizar este
análisis, ellos se basan en la metodología de la 4º ED. Compendium of Methods
for the Microbiological Examination of Foods, APHA donde hacen únicamente la
cuantificación del microorganismo por un valor de $ 20.640 por análisis.
- 47 -
8. CONCLUCIONES
No es posible implementar el análisis de Campylobacter spp basado en la
metodología USDA/FSIS MLG Capitulo 6 1998 debido a que es muy costoso.
Al comparar el costo del análisis determinado por la investigación y el costo del
análisis subcontratado es conveniente seguir con el laboratorio subcontratado.
Según este estudio los equipos necesarios para el análisis de Campylobacter spp
basado en la USDA/ FSIS son muy costosos y solo se utilizarían para esta prueba.
La proyección de ingresos no es prospera para el laboratorio ya que no muestra la
recuperación de la inversión a corto o mediano plazo.
La metodología USDA/FSIS MLG capitulo 6 1998 para el aislamiento y
cuantificación de Campylobacter spp descrita en este estudio es de fácil manejo.
Para los clientes no es favorable realizar un análisis tan costoso teniendo en
cuenta la competencia que hay en el mercado.
- 48 -
9. RECOMENDACIONES
Para implementar el análisis de Campylobacter spp en el laboratorio LABSER es
importante hacer una evaluación de otros métodos para el aislamiento e
identificación y cuantificación de este microorganismo.
Se podría desarrollar una segunda evaluación de costos directos e indirectos para
tener el margen de precios que existen en el mercado actualmente.
Realizar diferentes cotizaciones de los insumos con otras casas comerciales ya que
en este estudio solo se tuvieron en cuenta algunos proveedores a los cuales
LABSER siempre compra sus productos.
Hacer un análisis mercados y exigencias futuras que estos tienen para
exportaciones de productos alimentarios; que países exigen este análisis a los que
Chile exporta, y si realmente es importante implementar Campylobacter spp.
Desarrollar un programa con el proveedor con el fin de disminuir el costo del
análisis.
- 49 -
10. REFERENCIAS
Aguamarket.
Productos
y
servicios
para
la
industria
del
agua
Latinoamericana.
(http://www.aguamarket.com/diccionario/terminos.asp?Temas=453&termino
=&Id=453) (Consulta 2 Septiembre 2007)
Blaser, M. 2000. Campylobacter jejuni and related species. In: Mandell,
Bennett, Dolin, eds. Principles and Practice of Infectious Diseases. 5th Ed.
New York: Churchill Livingstone.
Campylobacter: http://www.bvsops.org.uy/pdf/campylobacter.pdf (Consulta:
21 de Agosto 2007).
Canals A. Campylobacteriosis en aves de corral. Departament de Sanitat i
Seguretat Social. Generalitat de Catalunya. Veterinario Oficial Matadero de
Aves Moré, S.A. (Argentina). http://www.colvet.es/ infovet/ ene02/ciencias_v/
articulo 1.htm (Consulta: 20 de Agosto 2007).
DIFCO laboratories. Difco Manual: Dehydrated culture media and reagents
for microbiology.Detroit Michigan.
Fernández, H. 2003. Manual de procedimientos diagnostico de Campylobacter
en muestras clínicas y de alimentos. Instituto de Microbiología Clínica.
Facultad de Medicina. Universidad Austral de Chile. Argentina. Pág.: 1- 22.
García, E. Cravio, A. 2007. Campylobacter y enfermedades asociadas.
Epidemiología Molecular y Genómica Bacteriana. Facultad de Medicina,
UNAM. Vol.50 No.1 Enero-Febrero. Pág.: 31– 35.
Kapperud ,G. 1994. Campylobacter infection. Epidemiology, risk factors and
preventive measures. Tidskr Nor Laegeform. Vol 114: 795-799.
- 50 -
LABSER.
Laboratorio
de
servicios
avanzados.
http://www.labser.cl/HOME.htm (Consulta: 20 Agosto 2007)
Malavez, Y. 2005 . Detección de Campylobacter jejuni en las incubadoras de
una planta procesadora de pollos barrilleros de Puerto Rico. Maestro en
Ciencias y tecnología de alimentos. Universidad de Puerto Rico. Recinto
Universitario de Msayagüez. Puerto Rico. Pág.: 1- 52.
MERCK. Microbiology Manual. 12 th edition, Darmstadt, Germany.
Ministerio de Salud. 2001. Manual de procedimientos de Campylobacter.
Subsecretaria de Investigación y Tecnología. Instituto Nacional de
Enfermedades Infecciosas. Departamento de Bacteriología. Bacteriología
sanitaria. Buenos Aires, Argentina. Pág.: 1-29.
National Center for Biotechnology Information. Taxonomy browser:
Campylobacter group. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ entrez/query.fcgi? CMD
=&DB=taxonomy (Consulta: 15 Agosto 2007).
Noordzij,
P.
2002.
Ganglioside
mimicry
of
Campylobacter
jejuni
lipopolysaccharide determines antiganglioside specificity in rabbits. Infect
Immun. Vol 70: 5081-5085.
Otros
ganados:
aborto
caprino
y
ovino.
http://www.a-
campo.com.ar/espanol/ot_gan/ot_gan2.htm. (Consulta: 24 Agosto 2007)
Protocolos
de
las
pruebas
de
identificación
http://chopo.cnice.mecd.es/~gdiaz3/apuntes/UT162.pdf.
Septiembre 2007)
- 51 -
bacteriana.
(Consulta:
3
Repiso,
M.
Campylobacteriosis
genital
bovina.
http://www.produccionbovina.com/sanidad_intoxicaciones_metabolicos/enfer
medades_reproduccion/08-enfermedades_afectan_reproduccion.htm.
(Consulta: 25 Agosto 2007)
USDA/FSIS Microbiology Laboratory Guidebook 3rd edition/1998. Chapter
6. Isolation, identification, and enumeration of Campylobacter jejuni/coli from
meat and poultry products. Gerri m. Ransom and Bonnie E. Rose
Velasco, E. Yamasaki, A. 2002. Bacterias de interés veterinario. Medicina
veterinaria vol. 19 (1): 1-11.
- 52 -