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Σ=96 pruebas
3176
Thyroid Uptake Enzyme Immunoassay Kit
NÚMERO DE CATÁLOGO: 3176 (96 pruebas)
Uso: Medir la Cantidad Total de Sitios de unión Disponibles para las Hormonas
Tiroideas en Suero o Plasma Humano por Inmunoensayo Enzimático en Microplaca.
INTRODUCCIÓN Y EXPLICACIÓN DE LA PRUEBA
La glándula tiroidea bajo el control regulador de la hormona tirotropina, secreta tiroxina
(T4) y triyodotironina en la circulación general. Las hormonas liberadas no circulan como
moléculas libres, están casi completamente unidas (99.9%) a proteínas específicas del
suero.
Tres fracciones de proteína con afinidad variable y capacidad de interacción con el T3 y
T4 han sido identificadas con electroforesis en papel de flujo inverso (1). La tiroxina unida
a la globulina (TBG) tiene el 65~75% de la concentración total en circulación. La tiroxina
unida a la pre-albúmina (TBPA) tiene una avidez intermedia por la tiroxina
(aproximadamente un 15~25%) pero poca o ninguna avidez para la triyodotironina. La
albúmina tiene baja afinidad pero alta capacidad, ya que lleva un 10% de tiroxina y un
30% de la triyodotironina disponible (1, 2, 3).
Debido a que los procesos metabólicos son completamente regulados por la
concentración de hormonas tiroideas libres, las cuales están inversamente relacionadas a los
niveles de las proteínas unidas, Hamolsky desarrolló un análisis de capacidad de unión del
suero humano en 1957 (4). En este método, el T3 radiactivo se agregó a una muestra de
sangre completa. Después del período de incubación, se centrifugó la mezcla y se lavaron
las células rojas. La radiactividad uptake de las células rojas fue inversamente proporcional
a la capacidad de unión del suero. Aunque este método tenía severas limitaciones, demostró
ser una valiosa herramienta de diagnóstico.
Las mejoras técnicas en la metodología de análisis del la prueba T-uptake resultaron en
varios agentes de separación como el carbón vegetal recubierto (5), resinas de intercambio
iónico (6), albúmina desnaturalizada (7), silicatos (8), anticuerpos y polímeros orgánicos se
emplearon en lugar de células rojas.
Esta metodología de inmunoensayo enzimático de microplaca le proporciona al técnico
una sensibilidad óptima al mismo tiempo que requiere poca manipulación técnica. En este
método, la muestra del paciente, suero o control se añaden primero a un pozo de una
microplaca. Se agrega el conjugado enzimático T4 y la tiroxina T4, luego se mezclan los
reactivos. Las proteínas endógenas de unión de la muestra reaccionan con la tiroxina, pero
no con el conjugado enzimático. Esto lleva a una mejor unión del conjugado enzimático al
anticuerpo, combinando sitios inmovilizados en el pozo mientras aumenta la capacidad de
unión de la muestra.
Una vez completado el período de incubación requerido, el anticuerpo unido al
conjugado enzimático de tiroxina es separado del conjugado enzimático no unido por
aspiración o decantación. La actividad de la enzima presente en la superficie del pozo es
cuantificada por su reacción con un sustrato adecuado para producir color.
El empleo de varios sueros de referencia de concentraciones conocidas, no saturados de
la capacidad de unión de la hormona tiroidea, permite construir un gráfico de absorbancia y
concentración. Mediante la comparación con la curva decalibración, puede relacionarse la
absorbancia de una muestra desconocida con la capacidad de unión de la hormona tiroidea.
PRINCIPIO
Inmunoensayo Enzimático Competitivo
Los componentes requeridos para evaluar la capacidad de unión del suero humano son el
conjugado enzimático de tiroxina, tiroxina, proteína de unión (P), y anticuerpo de tiroxina
inmovilizado (Ab).
Después de mezclar el conjugado enzimático y la tiroxina presente en la muestra, se
obtiene una reacción de unión entre las proteínas de unión del paciente y la tiroxina añadida
pero no con el conjugado enzimático. Esta interacción está representada debajo:
T4 = Tiroxina agregada (cantidad constante)
P = Proteínas de unión específicas (Cantidad variable)
La tiroxina añadida (T4) no consumida en la reacción 1 compite entonces con el conjugado
de enzima-antígeno por un número limitado de sitios de unión insolubilizados.
La interacción se ilustra con la siguiente ecuación:
AbC.W. = Anticuerpo Inmovilizado Monoespecífico T4 (Cantidad Constante)
T4r = Tiroxina no reaccionada agregada en reacción (1) (Cantidad Variable)
EnzT4 = Conjugado de enzima-antígeno (Cantidad Constante)
T4AbC.W. = Complejo Tiroxina-Anticuerpo
EnzT4 AbC.W. = Complejo de anticuerpo conjugado de enzima-tiroxina
ka = Constante de la Tasa de Asociación
k-a = Constante de la Tasa de Disociación
K = ka / k-a = Constante de Equilibrio
Una vez alcanzado el equilibrio, se separa la fracción de anticuerpo unido de la enzimaantígeno por decantación o aspiración. La actividad enzimática de la fracción de anticuerpo
unido es directamente proporcional a la capacidad de unión de la muestra. Aunque en el
hipotiroidismo las proteínas de unión están relativamente insaturadas (debido al bajo nivel
de hormonas tiroideas) originando un consumo más alto de la tiroxina agregada que en una
muestra eutiroidea. Esto conlleva a una unión mayor unión del conjugado enzimático de
tiroxina causado, por la concentración reducida de la tiroxina disponible. En el
hipotiroidismo, esto ocurre de manera inversa. Las proteínas de unión están relativamente
saturadas de tiroxina (debido al alto nivel de hormonas tiroideas) resultando en un menor
consumo de la tiroxina agregada. La tiroxina sobrante es relativamente mucho más alta que
en una muestra eutiroidea, lo cual reduce el número de anticuerpos unidos a la enzimatiroxina debido a la creciente competencia de la tiroxina por los limitados sitios de unión en
el anticuerpo.
REACTIVOS PARA LA MICROPLACA DE 96 pozos
A. Suero Humano de Referencias– vial de 1.0 ml - Íconos A-D
Cuatro (4) viales de sueros de referencias no saturados de capacidad de unión para la
hormona tiroidea a niveles aproximados* de 15.0 (A), 26.5 (B), 35.5 (C), y 46.0 (D) %U.
Almacene a 2-8°C. Se ha agregado un preservativo.
* Se dan niveles exactos en las etiquetas de especificaciones de los lotes.
B. Conjugado de Enzimático-T4 – vial de 1.0ml - Ícono
Un (1) vial de conjugado de tiroxina de peroxidasa de rábano picante (HRP) y tiroxina en
una matriz estabilizante de albúmina bovina. Se ha agregado un preservativo. Almacene a
2-8°C.
C. Tampón de conjugado T-Uptake -- 10 ml - +Icono
Una (1) botella de reactivo con tampón, de color anaranjado y preservativo. Almacene a 28°C.
D. Microplaca recubierta de Anticuerpo -- 96 pozos - Icono
Una microplaca de 96 pozos recubiertos con suero de oveja anti-tiroxina y empacada en
una bolsa de aluminio con desecante. Almacene a 2-8°C.
E. Concentrado de Solución de Lavado -- 20ml - Icono
Un (1) vial con un surfactante en solución salina fosfatada. Se ha añadido un preservativo.
Almacene a 2-30°C.
F. Sustrato A –vial de 7.0ml - Icono
Una (1) botella con tetrametilbenzidina (TMB) en tampón. Almacene a 2-8°C.
G. Substrato B – vial de 7.0ml – Icono
Una (1) botella con peróxido de hidrógeno (H2O2) en tampón. Almacene a 2-8°C.
H. Solución Stop – vial de 6.0ml - Icono
Una (1) botella con un ácido fuerte (1N HCl). Almacene a 2-30°C.
Nota 1: No utilice los reactivos después de la fecha de expiración del kit.
Nota 2: Los reactivos, una vez abiertos, permanecen estables por sesenta (60) días cuando
son almacenados a 2-8°C.
PRECAUCIONES
Para Uso de Diagnóstico In Vitro
No para Uso Interno o Externo en Humanos o Animales
Todos los productos que contienen suero humano que han sido probados y encontrados
no reactivos para el antígeno de superficie de la hepatitis B, anticuerpos VIH 1&2 y HCV
utilizando reactivos con licencia FDA. Ya que no existe un método de prueba que pueda
asegurar completamente que agentes infecciosos estén ausentes, estos reactivos deben ser
manejados como potencialmente peligrosos y capaces de transmitir enfermedades. Se
pueden encontrar buenos procedimientos de laboratorio para manipular productos de la
sangre en el manual “Biotecnología en laboratorios Microbiológicos y Biomédicos” 2da
edición, 1988. HHS Publicación No. (CDC) 88-8395.
RECOLECCIÓN Y PREPARACIÓN DE MUESTRAS
La recolección de muestras por venopunción se realizan en un tubo con diez (10) ml de
silicón con EDTA o heparina. Deben tomarse en cuenta las precauciones usuales en la toma
de muestras por venopunción. Separe las células rojas de la sangre por centrifugación,
utilice suero o plasma para el procedimiento de T-Uptake. La (s) muestra (s) debe (n)
refrigerarse a 2-8°C por un período máximo de 48 horas. Si no se puede realizar el análisis
en 48 horas, las muestras deben almacenarse a temperaturas de -20°C por hasta 30 días.
Cuando se analizan en duplicado, se requiere el 0.05ml de la muestra.
Se evaluó la reactividad cruzada del anticuerpo de tiroxina con sustancias seleccionadas,
agregando la sustancia de interferencia a una matriz de suero a varias concentraciones. Se
calculó la reactividad cruzada obteniendo una proporción entre la dosis de sustancia de
interferencia y la dosis de tiroxina necesaria para desplazar la misma cantidad de trazador.
Sustancia
l -Tiroxina
d-Tiroxina
d-Tryodotironina
l -Tryodotironina
Yodotirosina
Diodotirosina
Diodotironina
Reactividad Cruzada
1.0000
0.9800
0.0150
0.0300
0.0001
0.0001
0.0001
Concentración
--10μg/dl
100μg/dl
100μg/dl
100μg/ml
100μg/ml
100μg/ml
MATERIALES
Proporcionados:
1. Cuatro (4) viales de sueros de referencias humano T-uptake.
2. Un (1) vial de Conjugado Concentrado enzimático de Tiroxina
3. Un (1) vial de Tampón de Conjugado T-Uptake.
4. Una Microplaca de 96 pozos recubierta de Anticuerpo.
5. Una (1) botella de tampón de lavado concentrado.
6. Una (1) botella de Sustrato A.
7. Una (1) botella de Sustrato B.
8. Una (1) botella de Solución Stop.
9. Instrucciones.
Requeridos pero no Proporcionados:
1. Pipeta capaz de dispensar 25μl volúmenes con una precisión mayor a 1.5%.
2. Dispensador (es) para distribuciones repetitivas de 0.100ml y 0.300ml volúmenes con
una precisión mayor a 1.5%
3. Volumen ajustable (20-200μl) y dispensadores de (200-1000μl) para conjugado y
diluciones de sustrato.
4. Lavador de microplaca o botella flexible (Opcional)
5. Lector de microplaca con capacidad de lecturas de absorbancia de 450nm y 620nm.
6. Tubos de ensayo para hacer el conjugado enzimático y el sustrato A y B.
7. Papel absorbente para secar los pozos de la microplaca.
8. Envoltorio plástico y tapa de microplaca para los pasos de incubación.
9. Aspiradora (opcional) para los pasos de lavado.
11. Cronómetro.
12. Materiales de control de calidad externa.
PREPARACIÓN DEL REACTIVO:
1. Solución de conjugado enzimático de T4-Enzyma. Reactivo de trabajo (Working
T4-Enzime) – Preparar mensualmente.
Diluya el conjugado enzimático de Tiroxina 1:11 con el tampón de conjugado
enzimático T-Uptake en un contenedor limpio adecuado. Por ejemplo, diluya 160μl de
conjugado con 1.6ml de tampón para 16 pozos (Se hace un pequeño exceso de solución.)
Este reactivo debe utilizarse en un período de dos a treinta (30) días para un máximo
desempeño del análisis. Almacene a 2-8°C.
Fórmula General:
Cantidad de Tampón requerido = Número de pozos * 0.1
Cantidad necesaria de Conjugado Enzimático = # de pozos * 0.01
Ejemplo = 16 x 0.1 = 1.6ml para Tampón de Conjugado de T4
16 x 0.01 = 0.16ml (160μl) para conjugado enzimático T4
2. Tampón de Lavado
Diluya el contenido del tampón de Lavado Concentrado en 1000ml de agua destilada o
deshionizada en un contenedor adecuado. Almacene a temperatura ambiente hasta la fecha
de expiración impresa en la etiqueta. Es esencial que todo el contenido del tampón de
lavado se diluya.
La formación de cristal en el tampón de lavado concentrado puede eliminarse por
medio de un breve calentamiento (aprox. 5 minutos) en baño de maría a 37°C o
almacenándolo a temperatura ambiente.
3. Solución de Sustrato de Trabajo – Prepare diariamente
Determine la cantidad de reactivo necesario y prepárelo mezclando porciones iguales de
Sustrato A y B en un contenedor apropiado. Por ejemplo, agregue 1ml de A y 1ml de B por
dos (2) tiras de ocho pozos (Se hace un ligero exceso de solución). Utilice en un período
de veinticuatro horas de preparación para una ejecución máxima del análisis.
PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA
Antes de proceder con el análisis, lleve todos los reactivos y muestras de los pacientes a
temperatura ambiente (20 - 27° C).
1. Disponga del número requerido de micropozos para cada calibrador, control y muestra
del paciente para analizarlas por duplicado. Coloque cualquier tira de micropozos que no
haya sido utilizada, de vuelta en la bolsa de aluminio, selle y almacene a 2-8°C.
2. Pipetee 0.025 ml (25μl) de los sueros de referencia apropiados, control o muestra en los
pozos asignados.
3. Añada 0.100 ml (100μl) de Reactivo de trabajo 1, solución de enzima-T4 a todos los
pozos.
4. Sacuda la microplaca suavemente por 20 a 30 segundos para mezclar y tape.
5. Incube durante 60 minutos a temperatura ambiente.
6. Deseche el contenido de la microplaca por decantación o aspiración. Si utiliza la
decantación, seque la placa con papel absorbente.
7. Añada 300μl de tampón de lavado (vea la sección de Preparación de Reactivo), decante
(de suaves golpecitos y seque) o aspire. Repita el procedimiento dos (2) veces adicionales
para un total de tres (3) lavados. Puede utilizarse un lavador de placa automático o
manual. Siga las instrucciones del fabricante para un uso adecuado. Si se emplea una
botella flexible, llene cada pozo exprimiendo el contenedor (evitando burbujas de aire)
para dispensar el lavado. Decante el lavado y repita dos (2) veces adicionales.
8. Agregue 0.100 ml (100 μl) de solución de sustrato de trabajo a todos los pozos. (Vea el
Paso #1 de Preparación de Reactivo.) Siempre añada los reactivos en el mismo orden
para minimizar las diferencias de tiempo de reacción entre los pozos.
9. Incube a temperatura ambiente por quince (15) minutos.
10. Agregue 0.050 ml (50μl) de solución Stop a todos los pozos y mezcle suavemente de 15
a 20 segundos. Siempre añada los reactivos en el mismo orden para minimizar las
diferencias de tiempo de reacción entre los pozos.
11. Lea la absorbancia en cada pozo a 450nm (utilizando una longitud de onda de 620630nm para minimizar las imperfecciones de los pozos.) en un lector de microplaca. Los
resultados deben leerse en un período de treinta (30) días después de agregar la
solución Stop.
CONTROL DE CALIDAD
Cada laboratorio debe analizar los controles en el rango de la hipotiroides, eurotiroides e
hipertiroides para monitorear la ejecución del análisis. Estos controles deben tratarse como
desconocidos y los valores deben ser determinados en cada procedimiento de análisis
ejecutado.
Deben mantenerse los cuadros de datos de tendencias de control de calidad para seguir
la ejecución de los reactivos proporcionados. Deben emplearse los métodos estadísticos
pertinentes para determinar las tendencias. Cada laboratorio debe establecer límites
aceptables de ejecución. Además, la absorbancia máxima debe ser consistente con la
experiencia pasada. Una desviación significativa de la ejecución establecida puede indicar
cambios inadvertidos en condiciones experimentales o la degradación de los reactivos del
kit. Los reactivos frescos deben utilizarse para determinar la razón de las variaciones.
PARÁMETROS DE CONTROL DE CALIDAD
Absorbancia máxima (O calibrador) = > 1.2
RESULTADOS
Se utiliza una curva de calibración para comprobar la capacidad de unión de las
hormonas tiroideas no saturada en muestras desconocidas.
1. Registre la absorbancia obtenida de la impresión del lector de microplaca como se indica
en el Ejemplo 1.
2. Trace la absorbancia por duplicado de cada suero de referencia contra su correspondiente
%T-Uptake (%U) en papel milimetrado lineal (No calcule la media de las absorbancias
obtenidas por duplicado de los sueros de referencia antes de hacer el trazado.)
3. Conecte los puntos para trazar una curva de calibración bien ajustada.
4. Para determinar el %T-uptake en una muestra desconocida, coloque la absorbancia
promedio de los resultados obtenidos por duplicado para cada muestra desconocida en el
eje vertical del gráfico, encuentre el punto de intercepción en la curva de calibración y lea
él %T-uptake (%U) en el eje horizontal del gráfico. (Los resultados obtenidos por
duplicado de la muestra desconocida deben promediarse como se indica.) En el siguiente
ejemplo, la absorbancia promedio 1.698 (intercepta la curva se referencia a 27.3%U) (Ver
Figura 1.)
EJEMPLO 1
POZO
1
2
3
4
5
6
7
8
REFERENCIAS DE SUERO
5.0 %U
15.0 %U
26.5 %U
26.5 %U
35.5 %U
35.5 %U
46.0 %U
46.0 %U
ABSORBANCIA
2.605
2.638
1.802
1.719
1.082
1.030
0.582
0.547
Pozo
9
10
Promedio Desconocido
I. D.
D.O.
D.O.
Valor
Unknown #1 1.701
Unknown #1 1.695
1.698
27.3%U
El T-Uptake también puede expresarse como una relación T-uptake. Divida el %U entre
30% para convertirlo en una relación T-Uptake.
EJEMPLO 2
27.3%U / 30% = 0.910
Figura 1
Absorbancia
% T-Uptake (%U)
*Los datos presentados en el Ejemplo 1 y Figura 1 son solo para ilustración no deben
utilizarse en lugar de una curva estándar preparada con cada análisis.
CARACTERÍSTICAS DE DESEMPEÑO
A. Precisión
Las precisiones inter e intra-ejecución del sistema de análisis de microplaca T-Uptake se
determinaron a través del análisis de tres niveles diferentes de grupos de suero control. El
número, valor de la media, desviación estándar y coeficiente de variación para cada uno de
estos sueros de control están representados en las Tablas 2 y 3.
Sample
Bajo
Normal
Alto
Sample
Bajo
Normal
Alto
N
24
24
24
TABLA 2
Precisión Intra Análisis (Valores en %U)
X
σ
C.V.
28.7
0.393
1.37%
37.8
0.515
1.36%
45.4
0.332
0.73%
N
10
10
10
TABLA 3
Precisión Inter Análisis (Valores en %U)
X
σ
C.V.
28.4
0.45
1.6%
37.1
0.65
1.8%
45.7
0.52
1.1%
*Medido en diez experimentos por duplicado en un período de diez días.
B. Exactitud
El sistema de prueba de Microplaca EIA T-Uptake fue comparado con el método de
radioensayo de T3 Uptake. Se utilizaron muestras biológicas de poblaciones hipotiroideas,
eutiroideas e hipertiroideas y embarazadas (Los valores variaban entre 14% – 48%U). El
número total de dichos especímenes fue de 120. Se computo la ecuación de regresión de
mínimos cuadrados y el coeficiente de correlación para este EIA T-Uptake en comparación
con el método de referencia. Los datos obtenidos se muestran en la Tabla 4.
Método
Media (x)
Este Método 29.3
Referencia 29.0
TABLA 4
Reg. Mín. Cuadrada
y = 1.56+0.956(x)
Análisis de Co. De Correlación
0.972
Sólo se indicaron pequeñas cantidades de sesgo entre este método y el método de
referencia, debido a la proximidad de los valores de la media. La ecuación de regresión de
mínimos cuadrados y el coeficiente de relación indican un excelente acuerdo de métodos.
REFERENCIAS
1. Inada, M., and Sterling, K., J. Clin. Invest, 46,1442 (1967).
2. Murphy, B., 1968, Radioisotopes in Medicine, U.S. Atomic Energy Commission,
Technical Information Center, Tennessee.
3. Hollander, C.S. and Shenkman, L., 1974, Methods of Hormone Radioimmunnassay,
Academic Press, New York.
4. Hamolsky, M.W., Stein, M. and Freedberg, S.A., J. Clin. Endocrinol.,17, 33 (1957).
5. Hebert, V., U.S. Patent Office #3,442, 819 (1971).
6. Mitchell, M.L., Harden, A.B. and O’Rourke, M.E.. J. Clin. Endocrinol., 20,1474 (1960).
7. Rolleri, E., Buzzigoli, G., and Plassio, C., J Nucl. Med., 13, 892 (1972)
8. Nusynowitz, M.L., and Waliszewski, Am. J. Clin. Pathol, 56.523 (1971).
9. Clark, F. and Horn, D.B., J. Clin. Endocrinol. Metab., 25, 39 (1965)
10. Young. D.S.,. Pestaner, L.C. and Giberman, U., Clinical Chemistry, 21, 3660 (1975)
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Fecha de Revisión: 24/05/06