construcción de una curva dosis respuesta de absorbancia y concentración. A partir de la comparación a la curva dosis respuesta, La absorbancia de una muestra desconocida puede estar correlacionada con la capacidad de unión a la hormona tiroidea. D. Microplaca cubierta de Anticuerpo T4 - 96 pozo s- Icono Una microplaca de 96 pocillos cubiertas con suero anti tiroxina de oveja y empaquetada en una bolsa de aluminio con un agente de secado. Almacenar a 2-8ºC. E. Concentrado de Solución de Lavado- 20 ml – Icono Un vial que contiene un surfactante en suero salino tamponado. Un preservante ha sido adicionado. Almacenar a 2-30ºC. PRINCIPIO Ensayo Inmunoenzimométrico Competitivo (Tipo 5) Los componentes requeridos para la evaluación de la capacidad de unión del suero humano son el conjugado enzimático T3, tiroxina, proteína de unión (P) y anticuerpo de tiroxina inmovilizado (Ab). Luego de la mezcla del conjugado enzimático y la tiroxina con la muestra, una reacción de unión resulta entre las proteínas de unión del paciente y la tiroxina agregada pero no con el conjugado enzimático. Esta interacción es representada como: F. Substrato A – 7 ml/vial- Icono SA Una (1) botella que contiene tetrametilbenzidina (TMB) en buffer. Almacenaje a 2-8ºC. G. Substrato B – 7 ml/vial – Icono SB Una (1) botella que contiene peróxido de hidrógeno (H2O2) en buffer. Almacenaje a 2-8ºC. STOP T4 + P T3-uptake (T3U) Código 525-300 Uso programado: La Determinación de la cantidad Total de Sitios de Unión disponibles para las Hormonas Tiroides en Suero o plasma Humano por ensayo inmunoenzimométrico con microplacas. RESUMEN Y EXPLICACION DE LA PRUEBA La glándula tiroides bajo el control regulador de la hormona tirotropina secreta tiroxina (T4) y triyodotironina (T3) dentro de la circulación general. Las hormonas liberadas no circulan como moléculas libres pero casi en su totalidad (99.9%) se unen a las proteínas séricas específicas. 3 fracciones de proteínas con afinidades variantes y capacidades para la interacción con T3 y T4 han sido identificadas por la electroforesis con papel de flujo reverso. La tiroxina unida a la globulina (TBG) transporta 65-75% de la concentración circulante total. La tiroxina unida a la prealbúmina (TBPA) tiene una actividad intermedia para la tiroxina (transporta aproximadamente 15-25%) pero poca avidez para triyodotironina. La albúmina con una baja afinidad pero mayor capacidad transporta 10% de la tiroxina y 30% de la triyodotironina disponible. Incluso los procesos metabólicos son regulados enteramente por la concentración de las hormonas tiroideas libres, los cuales son inversamente relacionados a los niveles de las proteínas de unión, una evaluación de la capacidad de unión del suero humano fue desarrollado en 1957 por Halmolsky. En este método temprano, el T3 radioactivo fue adicionado a una muestra de la sangre total. Después de un período de incubación, la mezcla fue centrifugada y los glóbulos rojos lavados. La radioactividad de uptake de los glóbulos rojos fue inversamente relacionado a la capacidad de unión del suero. Aunque este método tiene varias limitaciones, probó ser una herramienta de valor diagnóstico. Otras mejorías técnicas en la metodología del ensayo de la prueba de T3 uptake resultaron como varios agentes de separación tales como la cubierta de carbón, resinas de intercambio iónico, albúmina desnaturalizada, silicatos, anticuerpos y polímeros orgánicos fueron empleados en lugar de los glóbulos rojos. Esta metodología de inmunoensayo enzimático de microplaca proporciona al técnico una sensibilidad óptima donde requiere algunas manipulaciones técnicas. En este método, los sueros de referencia, la muestra del paciente o controles son primero adicionados al pocillo de microplaca. El conjugado enzima-T3 y tiroxina (T4) son adicionados y luego los reactivos son mezclados. Las proteínas de unión endógenas de la muestra reaccionan con la tiroxina, pero no con el conjugado de enzima. Esto conduce a una mayor unión del conjugado de enzima a los sitios de combinación con el anticuerpo, reactivos para triyodotironina y tiroxina, inmovilizados en los pozos mientras la capacidad de unión se incrementa. Después de completar el período de incubación requerida, el conjugado tiroxina-enzima unido al anticuerpo es separado del conjugado enzima-tiroxina no unido mediante aspiración o decantación. La actividad de la enzima presente en la superficie de los pozos es cuantitativa por reacción con sustratos adecuados para producir color. El empleo de varios sueros de referencia de la hormona tiroidea no saturada conocida con capacidad de unión permite la H. Solución de parada – 8ml/vial – Icono Una (1) botella que contiene un ácido fuerte (HCl 1N). Almacenaje a 2-30ºC. T4-P (1) T4 = Tiroxina adicionada (cantidad constante) P = proteínas de Unión específicas (Cantidad variante) I. Instrucciones del Producto La tiroxina adicionada (T4) no se consumió en la reacción 1 incluso se completa con el conjugado T3-enzima para un número limitado de sitios de unión insolubles. La interacción es ilustrada por la siguiente ecuación: Ka Enz Enz T3 + T4r + Ac c.w. T4Acc.w. + T3 Accw (2) K-a Acc.w = Anticuerpo Inmovilizado (Cantidad constante) Requeridos pero no proporcionados: 1. Pipeta(s) de 25 µl con una precisión superior al 1.5% T4r = T4 no reactivo adicionado en la reacción (1) (Cantidad variable) 4. Lavador de microplaca o una botella de lavado (opcional). 5. Lector de microplaca con capacidad de absorbancia de 450nm y 620nm. 6. Tubo de prueba para mezclar los substratos A y B. 7. Papel absorbente para secar los pocillos de la microplaca. 8. Cubierta plástica o de microplaca para los pasos de incubación. 9. Aspirador al vacío (opcional) para los pasos del lavado. Enz T3 = Conjugado Enzima-Antígeno (Cantidad constante) T4Acc.w.= Complejo Tiroxina- Anticuerpo Enz T3 Accw = Complejo Anticuerpo- conjugado Enzima- T3 Ka = Tasa Constante de Asociación 2. Dispensador(es) para las distribuciones repetidas de 0.100 ml y 0.350ml volúmenes con una precisión superior al 1.5%. 3. Volumen ajustable (20 - 200 µl) y (200 – 1000 µl) con dispensador para conjugado y diluciones de substratos. k-a = Tasa Constante de Disociación K = Ka / K –a = Constante de Equilibrio 10. Cronómetro Después que el equilibrio se mantiene, la fracción unida al anticuerpo es separada del antígeno no unido por decantación o aspiración. La actividad de la enzima en la fracción unida al anticuerpo es directamente proporcional a la capacidad de unión de la muestra. Así, en el hipotiroidismo, las proteínas de unión son relativamente insaturadas (debido al bajo nivel de las hormonas tiroideas) resultando en mayor consumo de la tiroxina adicionada que en un muestra eutiroideo. Esto conduce a mayor unión del conjugado enzima-triyodotironina causado por la concentración reducida de la tiroxina disponible. En el hipertiroidismo, lo inverso es correcto. Las proteínas que se unen son relativamente saturadas con tiroxina (debido al mayor nivel de hormona tiroidea) resultando en el bajo consumo de la tiroxina adicionada. La tiroxina restante es relativamente mucho mayor que en una muestra eutiroidea resultante en la unión menor del anticuerpo enzima-antígeno debido a la competición incrementada de la tiroxina para los sitios limitados de anticuerpos. Nota 1: No usar reactivos después de la fecha de expiración Nota 2: Los reactivos abiertos son estables por 60 días cuando son almacenados a 2-30ºC. Nota 3: Los reactivos anteriormente nombrados son para una microplaca sencilla de 96 pocillos. B C. Buffer de Conjugado T3 Uptake – 13 ml – Icono Un (1) botella de reactivo que contiene buffer, tinción naranja y preservante. Almacenaje a 2-8 ºC. 2. Buffer para Lavado Diluir los contenidos del Concentrado de Lavado a 1000 ml con agua destilada o desionizada en un contenedor de almacenaje adecuado. Almacenar a temperatura ambiente de 20-27ºC hasta 60 días 3. Solución de Substrato de Trabajo Vierta el contenido del vial ámbar marcado con solución “A” dentro del vial claro marcado como solución “B”. Colocar la tapa amarilla al vial claro para fácil identificación. Mezclar y marcar según corresponda. Almacenar de 2-8 Cº Nota: No usar el substrato de trabajo si se ve azul. PROCEDIMIENTO DE PRUEBA Antes de proceder con el ensayo, permita que todos los reactivos, sueros de regencia y los controles alcancen temperatura ambiente (20-27ºC). 1. Formatear los pocillos de la microplaca para cada suero de referencia, la muestra del paciente y control para que sean ensayada en duplicado. Regresar cualquier tira del micropozos no usada dentro de la bolsa de aluminio, sellarlo y almacenarlo a 2-8ºC. 2. Pipetear 0.025 ml (25µl) del suero de referencia apropiado, control o muestra dentro del pocillo asignado. 3. Adicionar 0.100ml (100µl) de Reactivo de trabajo A, solución T3U enzima a todos los pocillos. 4. Agitar la microplaca suavemente por 20-30 segundos para mezclar y cubrir. 5. Incubar 60 minutos a temperatura ambiente. 6. Descartar los contenidos de la microplaca por decantación o aspiración, si se decanta golpee la placa y secar con papel absorbente. 7. Adicionar 350µl de buffer de lavado (ver Sección Preparación de Reactivos), decantar (golpear y secar) o aspirar. Repetir 2 veces adicionales para un total de 3 lavados. Un lavador de placa automático o manual puede ser usado. Seguir las instrucciones del fabricante para el uso apropiado. Si la botella de lavado es empleado, llenar cada pocillo oprimiéndola (evitar la formación de burbujas de aire) para dispensar el lavado. Decantar el lavado y repetir 2 veces adicionales. 8. Adicionar 0.100 ml (100µl) de solución de substrato de trabajo a todos los pocillos (Ver Sección de Preparación del Reactivo). Siempre adicione reactivos en el mismo orden para minimizar las diferencias del tiempo de reacción en los pocillos. PRECAUCIONES Para el uso Diagnóstico in Vitro No para el Uso Interno ni Externo en Humanos o Animales Todos los productos que contienen suero humano se encontraron no reactivos para el Antígeno de Superficie de la Hepatitis B, VIH 1 y 2 y anticuerpos para VHC mediante pruebas aprobadas por la FDA. No se conoce prueba que pueda ofrecer seguridad a pesar que los agentes infecciosos estén ausentes, todos los productos séricos de humanos serán manejados como potencialmente peligrosos y capaces de transmitir enfermedades. Las buenas practicas de laboratorio para el manejo de productos sanguíneos pueden ser encontrados en el Centro de Control de Enfermedades/ Instituto Nacional de Salud, “Bioseguridad en Laboratorios Microbiológicos y Biomédicos”, 2da Edición, 1988, HHS Publicación Nº (CDC) 88-8395. E RECOLECCION DE LA MUESTRA Y PREPARACION Se deben seguir las precauciones en la recolección de muestras de sangre, plasma o suero por punción venosa. Se debe obtener para la comparación exacta de los valores normales establecidos, una muestra de suero en ayunas. La sangre debe ser recolectada en un tubo de tapa roja sin aditivos o anticoagulantes (para suero) o tubos que contienen EDTA o heparina. Permitir que la sangre coagule. Centrifugar la muestra para separar el suero de las células. Las muestras pueden ser refrigeradas de 2-8ºC por un período máximo de 5 días. Si la muestra no puede ser ensayada dentro de este tiempo, la muestra puede ser almacenada a temperatura de -20ºC por hasta 30 días. Evitar ciclos de en PREPARACION DE LOS REACTIVOS 1. Reactivo de Trabajo A- Solución reactivo enzima -T3U Diluir el reactivo T3U-enzima 1:11 con el buffer del conjugado T3 uptake en un contenedor adecuado. Por ejemplo, diluir 160µl de conjugado con 1.6 ml de buffer para 16 pocillos (un exceso leve de solución es hecha). Este reactivo será usado dentro de las 24 horas para el rendimiento máximo del ensayo. Almacenaje a 2-8ºC. Fórmula General: Cantidad de Buffer requerido = Número de pocillos * 0.1 Cantidad de T3- Enzima necesaria = # de pocillos *0.01 Por ejemplo = 16 x 0.1 = 1.6 ml para Buffer Conjugado T3/T4 total 16 x 0.01 = 0.16 ml (160µl) para conjugado T3 enzima 11. Materiales de control de calidad. REACTIVOS Materiales proporcionados A. Sueros de referencia Humano – 1ml/vial- Iconos A-D 4 viales de suero humano de la capacidad de unión de la hormona tiroidea insaturada a niveles aproximados* de 18 (A), 25 (B), 35 (C) y 47 (D) %U. Almacenar a 2-8ºC. Un preservante ha sido adicionado. * Los niveles exactos están dados sobre la etiqueta basados en especificidad del lote. B. Reactivo de Enzima – T3 Uptake- 1.5 ml/vial – icono Un (1) vial que contiene conjugado de triyodotironina peroxidasa de rábano picante (HRP) y tiroxina en una matriz estabilizada con albúmina. Un preservante ha sido adicionado. Almacenaje a 2-8ºC. congelación y descongelación. Cuando ensayamos duplicado, se requiere 0.05ml de las muestras NO AGITAR LA MICROPLACA DESPUES DE ADICIONAR DE SUBSTRAT0 9. Incubar a temperatura ambiente por 15 minutos. 10. Adicionar 0.050 ml (50µl) de solución de parada para cada pocillo y mezclar ligeramente (por 15-20 segundos). Siempre adicione reactivos en el mismo orden para minimizar las diferencias del tiempo de reacción en los pocillos. 11. Leer la absorbancia en cada pozo a 450 nm (usando una longitud de onda de referencia de 620-630 nm para minimizar las imperfecciones del pocillo) en un lector de microplaca. Los resultados serán leídos dentro de los 30 minutos de adicionar la solución de parada. RESULTADOS Una curva dosis respuesta es usada para hallar la capacidad de unión de las hormonas tiroideas no saturadas en muestras desconocidas 1. Registrar la absorbancia obtenida del listado del lector de microplacas como se delineó en el Ejemplo 1. 2. Graficar la absorbancia para cada suero de referencia por duplicado versus el %T3-uptake (%U) correspondiente en el papel de gráfica lineal (no promediar los duplicados del suero de referencia antes de la grafica). 3. Sacar la mejor curva fija a través de los puntos de la grafica. Determinar el %T3 uptake para un desconocido, localizar la absorbancia promedio de los duplicados para cada desconocido en el eje vertical del gráfico, encontrar el punto de intersección de la curva y leer el %T- uptake (%U) del eje horizontal de la gráfica (los duplicados de lo desconocido pueden ser promediados como se indicó). En el siguiente ejemplo, la absorbancia promedio 1.690 (intercepta la curva de referencia a 26.6%U) (Ver Figura 1). EJEMPLO 1 Muestra Pozo I.D. Nombre Abs (A) A1 2.644 B1 2.600 C1 1.888 Cal A Cal B D1 1.872 E1 0.710 F1 0.726 G1 0.265 Cal C Cal D H1 0..247 A2 1.701 Ctrl 1 B2 Media Valore Abs (B) (%U) 2.622 18 C2 0.330 D2 0.298 ANALISIS DE RIESGOS A. Desempeño de la prueba 2. El pipeteo de las muestras no se extenderá más de 10 minutos para evitar derivaciones. 3. No se deben emplear muestras altamente lipémicas, hemolizadas o contaminadas 4. Si más de 1 placa es usada, se recomienda repetir la curva dosis respuesta. 5. La adición de la solución sustrato inicia una reacción cinética, la cual es terminada por la adición de la solución de paralización. Por tanto, la adición de los substratos y la solución de detención serán adicionadas en la misma secuencia para eliminar cualquier desviación durante la reacción. RANGOS DE VALORES ESPERADOS Un estudio de una población eutiroidea adulta (85 muestras) fue tomado para determinar los valores esperados para el T uptake y son presentados en la Tabla 1. 6. Los lectores de placa miden verticalmente. No tocar el fondo de los pozos. TABLA 1 Valores Esperados para el Sistema de Prueba T Uptake EIA 7. La falla en remover la solución adherente adecuadamente en los pasos de aspiración o lavado por decantación puede resultar en una pobre replicación y resultados falsos. 8. Usar componentes del mismo lote. No mezclar los reactivos de diferentes lotes. Estado Eutiroideo Eutiroideo (Hipotiroideo o Unión excesiva de TBG) (Hipertiroideo o Saturación de TBG) 9. Es esencial un pipeteo preciso y exacto así como seguir el tiempo exacto y la temperatura requerida. Cualquier desviación de las instrucciones de uso puede arrojar resultados inexactos. 0.718 35 10. Se deben seguir las buenas prácticas de laboratorio todos los estándares nacionales aplicables, regulaciones y leyes de manera estricta para asegurar el cumplimiento y uso adecuado del dispositivo. 0.256 47 11. Es importante calibrar todos los equipos, por ejemplo: pipetas, lectores, lavadores y/o instrumentos automatizados con este reactivo y realizar un mantenimiento preventivo rutinario 1.690 26.6 0.314 45.5 12. El análisis de riesgo – como lo requiere la directiva IVD 98/79/EC de la marca CE- para estos y otros dispositivos elaborados por Monobind, pueden ser solicitados vía Email: [email protected] B. Interpretación 1. Los resultados de laboratorio por si solos son únicamente un aspecto para determinar el cuidado del paciente y no deben ser la única base para una terapia, particularmente si los resultados están en conflicto con otros determinantes. 2. Para resultados de pruebas válidas, los controles adecuados y otros parámetros deben estar dentro de los rangos listados y requerimientos del ensayo. 3. Si los kits de prueba están alterados, ya sea por mezcla de partes de diferente kits, lo cual puede producir resultados de prueba falsos o si los resultados son interpretados incorrectamente, Monobind no tendrá responsabilidad. 4. Si se utiliza el sistema de reducción de datos controlados por Computador para interpretar los resultados del ensayo, es necesario que los valores de predicción para los calibradores se ubiquen dentro del 10% de las concentraciones asignadas. La T uptake puede también ser expresada como un radio T uptake. Divida el %U por 30% para convertirlo a T uptake radio ver ejemplo 2 EJEMPLO 2 5. La prueba T3 uptake es dependiente de una multiplicidad de factores: La glándula tiroides y su regulación, la concentración de la globulina unida a la tiroxina (TBG) y la unión de las hormonas tiroideas a la TBG. Por lo tanto la prueba T3uptake por si sola no es suficiente para evaluar el estado clínico. 27.3%U / 30% 6. = 0.910 CONTROL DE CALIDAD Cada laboratorio ensayará los controles a niveles en el rango del hipotiroideo, eutiroideo e hipertiroideo para el monitoreo del rendimiento del ensayo. Estos controles serán tratados como desconocidos y los valores determinados en cada procedimiento de prueba realizado. Las tarjetas de control de calidad serán mantenidas en seguir el rendimiento de los reactivos suministrados. Los métodos estadísticos pertinentes serán empleados para acertar en las tendencias. La desviación significante de rendimiento establecido puede indicar cambio no notificado en condiciones experimentales o degradación de los reactivos del kit. Los reactivos frescos serán usados para determinar la razón para las variaciones Es importante que el tiempo de reacción en cada pozo sea sostenido en forma constante para resultados reproducibles. 25 * Los datos presentados en el Ejemplo 1 y Figura 1 son únicamente para ilustración y no deben ser usados en lugar de la curva de dosis-respuesta preparada con cada análisis. evaluación mas exacta del estado tiroide. El valor FTI compensa con cualquier condición o medicamento tales como embarazo o estrógenos los cuales alteran los niveles de TBG y T4 pero no cambian el estado tiro metabólico. Una tabla de medicamentos interferentes y condiciones, han sido compiladas en el Journal de la asociación americana de química clínica. 1. 1.880 1.680 Ctrl 2 PARAMETROS DE CC Con el fin de que los resultados del análisis sean considerados válidos se deben cumplir los siguientes criterios: 1. La absorbancia (OD) del calibrador A será ≥ 1.3 2. 4 de 6 grupos de control de calidad estarán dentro de los rangos establecidos El índice de tiroxina libre (FTI), el cual es producto del radio T up take y la concentración de tiroxina total, a ganado una amplia aceptación química como una % T- uptake 25 – 35 < 25 Ratio T 0.83 – 1.17 < 0.83 > 35 > 1.17 CARACTERISTICAS DEL RENDIMIENTO A. Precisión La precisión dentro y entre los ensayos del Sistema de Prueba de microplaca T uptake EIA fue determinada por análisis en 3 diferentes niveles de suero de control. El número, valor promedio, la desviación estándar y el coeficiente de variación para cada uno de estos sueros controles son presentados en la Tabla 2 y Tabla 3. TABLA 2 Precisión dentro del Ensayo (Valores en %U)) N 24 24 24 TABLA 4 Análisis de Regresión Coeficiente de Método Promedio (x) Última Correlación Este Método 29.3 y = 1.56 + 0.956(x) 0.972 Referencia 29.0 Solamente pequeñas cantidades de desviaciones entre el este método y el método de referencia son indicadas por la proximidad de los valores promedios. La ecuación de regresión cuadrada última y el coeficiente de correlación indican excelente ordenamiento del método. REFERENCIAS 1. Inada, M., and Sterling, K., J. Clin. Invest, 46, 1442. (1967) 2. Murphy, B., 1968, Radioisotopes in Medicine, U.S. Atomic Energy Commission, Technical Information Center, Tennessee. 3. Hollander, C.S. and Shenkman, L., Methods of Hormone Radioimmunoassay, Academic Press, New York. (1974) 4. Hamolsky, M.W., Stein, M. and Freedberg, S.A., J. Clin. Endocrinol 17, 33. (1957) 5. Hebert, V., U.S. Patent Office #3,442, 819. (1971) 6. Mitchell, M.L., Harden, A.B. and O’Rourke, M.E.. J. Clin. Endocrinol. 20, 1474. (1960) 7. Rolleri, E., Buzzigoli, G., and Plassio, C., J Nucl. Med. 13, 892. (1972) 8. Nusynowitz, M.L., and Waliszewski, Am. J. Clin. Pathol 56, 523. (1971) 9. Clark, F. and Horn, D.B., J. Clin. Endocrinol. Metab. 25, 39 (1965) Es importante guardar en mente que el establecimiento de un rango de valores el cual puede ser esperado sea encontrado por un método dado para una población de personas “normales” es dependiente bajo una multiplicidad de factores. La especificidad del método, la población probada y la precisión del método en las manos del analista. Por estas razones cada laboratorio dependerá bajo el rango de valores esperados establecidos por el fabricante solamente hasta un rango local pueden ser determinados por los analistas usando el método con una población local en la cual el laboratorio está ubicado. Muestra Bajo Normal Alto para el T uptake EIA en comparación con el método de referencia. Los datos obtenidos son descritos en la Tabla 4 X 28.7 37.8 45.4 σ 0.39 0.51 0.33 C.V. 1.37% 1.36% 0.73% TABLA 3 Precisión Entre Ensayo (valores en %U) Muestra N X σ C.V. Bajo 10 28.4 0.45 1.6% Normal 10 37.1 0.65 1.8% Alto 10 45.7 0.52 1.1% * Medido en 10 experimentos en duplicado por un periodo de 10 dias. B. Exactitud (Método de comparación) El Sistema de prueba de Microplaca T-uptake EIA fue comparado con un método de radioinmunoensayo de T3. Las muestras biológicas de las poblaciones eutiroideas, hipotiroideas, hipertiroideas y embarazadas fueron usados (Los valores van del rango de 14%– 48 %U). El número total de tales muestras fue de 120. La última ecuación de regresión cuadrada y el coeficiente de correlación fueron computados 10. Young. D.S., Pestaner, L.C. and Giberman, U., Clinical Chemistry 21, 3660. (1975) Revisión: 2 Date: 11-22-10 Cat #: 525-300