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#3149-16
MICROWELL ELISA
THYROXINE (T4) ENZYME
IMMUNOASSAY TEST KIT
Inmunoensayo enzimático para la determinación cuantitativa de la concentración de
tiroxina (T4) en suero humano
Uso
Para la determinación cuantitativa de la concentración de tiroxina (T4) en suero humano.
Introducción
La L-Tiroxina (T4) es una hormona que es sintetizada y almacenada en la glándula
tiroide. La escisión proteolítica de la tiroglobulina folicular libera T4 en el torrente
sanguíneo. Más del 99% de T4 esta reversiblemente unido a tres proteínas plasmáticas en la
sangre – tiroxina unida a globulina (TBG) en un 70%, a tiroxina unida a pre-albúmina en
un 20% y tiroxina unida a albúmina en un 10%. Aproximadamente 0.03% de T4 está en
estado libre y no unido en la sangre.
Las Enfermedades que afectan el funcionamiento de la tiroide pueden presentar un
amplio número de síntomas confusos. La medición de la T4 total por inmunoensayo es la
prueba de detección más conveniente y confiable para determinar la presencia de trastornos
de la tiroides en los pacientes. Niveles elevados de T4 se han encontrado en hipertiroidismo
debido al síndrome de Graves y el síndrome de Plummer en tiroiditis aguda y sub-aguda.
Niveles bajos de T4 han sido asociados con hipertiroidismo congénito, mixedema, tiroiditis
crónica (síndrome de Hashimoto) y con algunas anormalidades genéticas.
Principio de la Prueba
En el EIA para T4, una cierta cantidad de anticuerpo antiT4 recubre los pozos de
microtitulación. Una cantidad medida de suero del paciente y una cantidad constante de
conjugado de T4 con peroxidasa de rábano picante son añadidas a los pozos de
microtitulación. Durante la incubación, la T4 y el conjugado T4 compiten por un número
limitado de sitios de unión en los anticuerpos anti-T4. Después de 60 minutos de
incubación a temperatura ambiente, los pozos son lavados 5 veces con agua para remover
en conjugado T4 no unido. Luego se añade una solución de TMB y se incuba por 20
minutos, resultando el desarrollo de un color azul. El desarrollo del color se detiene con la
adición de HCL 2N, y la absorbancia se mide espectrofotométricamente a 450nm. La
intensidad del color formado es proporcional a la cantidad de enzima presente y está
inversamente relacionada a la cantidad de T4 no unido en la muestra. Tomando como
referencia al análisis de una serie de estándares de la misma manera, se puede cuantificar la
concentración de T4 en muestras desconocidas.
Materiales y Componentes
Materiales Proporcionados con el Kit de Prueba
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Pozos de microtitulación recubiertos de anticuerpos, 96 pozos por bolsa.
Set de estándares de referencia, listo para usar.
Diluente de Conjugado T4 HRPO, 15 ml.
Conjugado concentrado T4 HRPO, 0.8 ml.
Substrato TMB, 12 ml.
Solución de parada, 12 ml.
Materiales Requeridos Pero No Proporcionados
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Pipetas de precisión: 40μl-200μl and 1.0ml.
Puntas desechables para pipetas.
Agua destilada.
Mezclador Vortex o su equivalente.
Papel absorbente o toallas de papel.
Papel milimetrado.
Lector de pozos de microtitulación.
Preparación y Recolección de las Muestras
El suero debería ser preparado de una sola muestra de sangre obtenida con técnicas
médicas aceptables. Este kit es solo para el uso con muestras sin aditivos.
Almacenamiento de los Kits de Prueba e Instrumentación
1- Kits de prueba no abiertos deberían ser almacenados a una temperatura de 2-8 °C
una vez recibidos y la placa de microtitulación debería mantenerse en una bolsa
sellada con desecantes para minimizar la exposición a la humedad del aire. El kit de
prueba puede ser usado dentro de la fecha de expiración (Una año a partir de la
fecha de fabricación). Vea la etiqueta del empaque para ver la fecha de expiración.
2- Kits de prueba abiertos permanecerán estables hasta la fecha de expiración indicada
si se almacenan como se indicó anteriormente.
3- Un lector de placa de microtitulación con una banda de ancho de 10nm o menos y
un rango de densidad óptica de 0-2 o mayor a 450nm de longitud de onda es
aceptable para el uso en medida de absorbancia.
Preparación de los Reactivos
1. Todos los reactivos deberían ser llevados a temperatura ambiente (18-22 °C) antes
de su uso.
2. Para preparar el conjugado de reactivo T4-HRPO, añada 0.1 ml de conjugado
concentrado de T4-HRPO a 2.0 ml de diluente de conjugado T4 (dilución 1:20) y
mezcle bien. La cantidad de conjugado diluido depende del tamaño de su análisis.
En reactivo conjugado es estable a 4 °C por al menos dos semanas.
Nota: El ensayo T4 es sensible a la temperatura.
Las mejores condiciones de temperatura para este ensayo van de 19 °C a 22 °C. Si, en
las condiciones del entorno del ensayo, la temperatura es mayor a lo esperado, se
recomienda incrementar la dilución de conjugado T4 a 1:40.
Procedimiento del Análisis
1- Asegure el número deseado de pozos recubiertos en el mezclador. Haga una hoja de
datos para identificación de las muestras.
2- Dispense 50 μl de estándares, muestras y controles en los pozos apropiados.
3- Dispense 100 μl de reactivo de conjugado enzimático en cada pozo.
4- Mezcle completamente por 10 segundos. Es muy importante tener un mezclado
completo en esta etapa.
5- Incube a temperatura ambiente (18-22 °C) por 60 minutos.
6- Retire la mezcla de incubación sacudiendo los contenidos de la placa en un
contenedor de desechos.
7- Enjuague y sacuda los pozos de microtitulación 5 veces con agua del grifo o agua
destilada.
8- Agite los pozos sobre el papel absorbente o toallas de papel para retirar todas las
gotas residuales de agua.
9- Dispense 100 μl de solución de TMB en cada pozo. Mezcle suavemente por 5
segundos.
10- Incube a temperatura ambiente por 20 minutos sin agitar.
11- Detenga la reacción añadiendo 100 μl de solución de parada en cada pozo. Mezcle
suavemente por 5 segundos.
12- Lea la densidad óptica a 450nm con un lector de placas de microtitulación.
Nota Importante:
El procedimiento de lavado es crítico. Un lavado insuficiente resultará en una precisión
pobre y lecturas de absorbancia falsamente elevadas.
Calculo de los Resultados
1. Calcule los valores promedios de la absorbancia (A450) para cada grupo de
estándares de referencia, controles y muestras.
2. Se recomienda usar un software apropiado para calcular los resultados. Si el
software no está disponible, construya sobre papel milimetrado una curva de
calibración graficando la media de absorbancia obtenida de cada estándar de
referencia contra su concentración en μg/dl, con los valores de absorbancia en el eje
vertical (Y) y la concentración en el eje axisas (X).
3. Usando los valores de la media de absorbancia de cada muestra, determine la
concentración correspondiente de T4 en μg/dl en la curva de calibración.
Ejemplo de Una Curva de Calibración
Resultados de una corrida estándar típica con lectura de densidad óptica a 450nm
reflejada en el eje Y contra concentraciones de T4 reflejadas en el eje X. Esta curva de
calibración es solamente para propósitos de ilustración y no debería ser usada para calcular
concentraciones de muestras desconocidos. Cada usuario debería obtener su propia curva
de calibración.
Valores Esperados
El EIA para T4 fue desarrollado en un estudio de 200 pacientes eutiroideos en una
ubicación geográfica específica y arrojó un rango normal de 5.0 a 13.0 μg/dl. Este rango
corresponde al rango sugerido por otros fabricantes comerciales. Se recomienda que los
laboratorios ajusten sus valores para reflejar diferencias geográficas y de población
especificas para los pacientes que atienden. La concentración mínima de tiroxina estimada
por este ensayo es de 0.4 μg/dl.
Referencias
1. Skelley, D., Brown, L., and Besch, P. Radioimmunoassay. Clin. Chem. 19:146;1973.
2. Wistom, G.B. Enzyme-Immunoassay. Clin. Chem. 22: 1243; 1976.
3. Schuurs, A.H.W.M. and Van Weeman, B.K. Review, Enzymeimmunoassay. Clin. Chem.
Acta. 81:1; 1977
4. Ravel, R. Clinical Laboratory Medicine. Year Book Medical Publ. Chicago. (1973)
5. Robbins, J. Radioassay and Thyroid Gland. Metabolism 22:1021; 1973
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ISO 13485-2003
Fecha de Revisión: 4/4/06
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