UNIVERSIDAD VERACRUZANA F A C U L T A D DE MEDICINA VETERINARIA Y Z O O T E C N I A COMPARACION DEL USO DE LA BIOTECNOLOGÍA REPRODUCTIVA ENTRE HUMANOS Y BOVINOS T R A B A J O R E C E P C I O N A L EN LA MODALIDAD DE: MONOGRAFÍA COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER EL TÍTULO DE MÉDICO VETERINARIO ZOOTECNISTA PRESENTA: ROXANA DE JESÚS CORTÉS LAZCANO ASESORES: MVZ R O D O L F O C A N S E C O SEDAÑO MVZ FELIPE MONTIEL PALACIOS VERACRUZ, VER. F E B R E R O 2011 INDICE 1. - Agradecimientos 4 2. - Dedicatorias 5 3. - Resumen 6 4. - Introducción 7 5. - Objetivo 10 6. - Justificación 11 7. - Metodología 12 8. -Desarrollo 13 8.1 Endocrinología 8.1.1 Humanos 8.1.1.1 Anticoncepción 8.1.1.2 Inducción a la ovulación 8.1.1.3 Hiperestimulación ovárica 13 13 8.2 Bovinos 14 8.2.1 Inducción y sincronización de celo 8.2.2 Superovulacion 8.2 Inseminación Artificial 16 8.3 Transferencia embrionaria 17 8.3.1 Transferencia embrionaria en bovinos 17 9.3.1.1 Fertilización invitro 8.3.2 Humanos. Tratamiento infértil 18 8.3.2.1 Fertilización invitro 8.3.2.2 Transferencia 8.4 Clonación 21 8.4.1 Bovinos- Replicas de animales adultos 21 8.4.2 Humanos 22 8.4.2.1 Células madre 8.4.2.2 Clonación reproductiva y terapéutica. 8.5 Preservación de la fertilidad 26 8.5.1 Humanos - Criopreservación de semen, óvulos, embriones, tejido testicular y ovárico 26 8.5.2 Bovinos - Criopreservación de semen, óvulos, embriones, tejido testicular y ovárico 29 9.- Conclusión 31 10.- Bibliografía 32 AGRADECIMIENTOS A la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Veracruzana por haberme dado la oportunidad de formar parte de su programa durante cinco años. Al M V Z Rodolfo Canseco Sedano por haber aceptado ser mi asesor de tesis, por ser paciente conmigo y por su tiempo dedicado a mi trabajo recepcional. Muchas gracias por su amistad y confianza brindada. A los médicos y doctores que me apoyaron en mi formación profesional y que me brindaron su amistad y cariño en el transcurso de mi carrera. DEDICATORIAS A mi padre Donato Cortés Barragán. Por haberme dado la vida, por apoyarme en este sueño, por ser mi ejemplo y por demostrarme que los sueños siempre se cumplen mientras uno tenga la fuerza y las ganas de querer lograrlo. A mi madre Clementina Lazcano Morales. por ser mi mejor amiga, mi confidente y cómplice de alegrías y tristezas. Por todo el amor que me brindó incondicional y por hacer de mi la persona que ahora soy. A mis hermanos Chantal y Salvador, por apoyarme siempre y ser mis amigos más fieles, por sus abrazos y sus momentos de risas que algunas veces alegraron momentos de mucha tristeza, por su amor y confianza. A mi tío Luis Gonzalo Cortés por enseñarme que los animales son lo más hermoso que el mundo puede tener, por motivarme a estudiar Medicina Veterinaria, por alegrarse de mis triunfos, por pilotear su nave para arrebatarme una sonrisa, porque donde quiera que se encuentre se que siempre estará conmigo. A mis amigos por apoyarme y estar a mi lado en momentos tan importantes, por compartir travesuras, por los desvelos de todo tipo, pero sobre todo por su amistad y confianza. RESUMEN Cortés Lazcano Roxana de Jesús. Comparación del uso de la biotecnología reproductiva entre humanos y bovinos. Monografía de licenciatura, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Veracruzana, México. Asesores: M V Z Rodolfo Canseco Sedano, M V Z Felipe Montiel Palacios. La biotecnología de la reproducción comprende las técnicas desde la inseminación artificial hasta la clonación, que van a permitir la eficiencia productiva de los animales. Existen tratamientos hormonales diseñados para controlar el ciclo reproductivo de humanos y bovinos. En humanos estos se enfocan a métodos anticonceptivos o inducción de la ovulación, mientras que en bovinos se utilizan para inducción, sincronización de celo y Superovulación. La Inseminación Artificial es un método de reproducción en el que el semen es depositado en la mujer o hembra mediante instrumental especializado y utilizando técnicas que reemplazan a la copulación, en el útero, en el cérvix o en las trompas de Falopio. La transferencia de embriones consiste en recoger un embrión del útero de una hembra llamada donadora para introducirlo en el útero de una hembra llamada receptora. Así continuará su crecimiento y desarrollo hasta el parto. En bovinos esto se hace con el propósito de aprovechar a las hembras de mejor genética, mientras que en humanos esta técnica se utiliza en tratamientos de reproducción asistida. S e ha definido a un clon como un grupo de organismos de idéntica constitución genética que proceden de un único individuo mediante manipulación asexual, siendo a su vez iguales a él. Esta técnica se encuentra a nivel experimental en bovinos aunque ya se ha logrado aunque con baja eficiencia en ovinos. En humanos ha avanzado una técnica llamada clonación reproductiva. Esta involucra el cultivo de células indiferenciadas y pluripotenciales que pueden obtenerse de diversos tejidos o bien de embriones y que se pueden dirigir químicamente a que formen un tejido deseado, inclusive pueden formar espermatozoides u óvulos. Si esta técnica continúa avanzando, es posible que se pueda combatir al infertilidad casi al 100%. En conclusión, La biotecnología reproductiva tiene muchas similitudes entre humanos y bovinos. Es probable que en el futuro se sigan desarrollando técnicas intercambiables que ayuden a combatir al infertilidad en ambas especies. Palabras claves: Bovino, humano, biotecnología, reproducción. INTRODUCCION Las últimas cuatro décadas han visto la adaptación comercial de cuatro generaciones de biotecnologías reproductivas, en particular con el ganado vacuno. (Palma Gustavo 2003) Esto empezó con la inseminación artificial (IA) y la sincronización de celos y pasó a un segundo nivel cuando se recolectaron y transfirieron embriones obtenidos in vivo. L a tercera generación consistió en los embriones fecundados in vitro, la selección del sexo de los espermatozoides, recogida de los embriones para la clonación y, por último, estamos en una etapa en la que se usan para deleciones y adiciones funcionales de genes específicos en el genoma de los descendientes, mediante la transgénesis, en combinación con técnicas de biología molecular potentes de A R N si y el uso de vectores virales. Hay ciertas aplicaciones de la biotecnología reproductiva en el ganado vacuno, cada una con sus ventajas y a continuación se mencionan algunas: • Inseminación artificial y congelación de semen o Eliminación y disminución de enfermedades sexuales o Uso intensivo de un macho de alto valor genético o Aumento de la eficiencia de la estimación del valor genético o Aumento de la eficiencia de la producción de terneros o Aumento de la eficiencia del manejo productivo y reproductivo Superovulacion, transferencia y congelación de embriones o Uso intensivo de la hembra de alto valor genético o Recuperación más eficaz de individuos exóticos y razas en peligro de extinción o Formación de bancos de germoplasma o Importación y exportación de material genético Clonación de animales por medio de transferencia nuclear o Eliminación de la variabilidad de genotipos individuales o Aumento de la eficiencia de la transgénesis Desde épocas muy tempranas, las personas se dieron cuenta de que no todos los individuos eran iguales. (Palma 2003) La primera intervención debió de limitarse a seleccionar a los individuos reproductores. Resultado de ello es la diversidad de razas que utilizamos en nuestro provecho. Los cruces de animales entrañan una serie de problemas inherentes al acoplamiento: es necesaria la presencia del macho y la hembra, lo que supone un gasto económico importante para los ganaderos. El control de la reproducción animal a gran escala estuvo muy dificultado hasta el presente siglo. Durante la primera mitad del siglo X X , los investigadores desarrollaron un conjunto de técnicas que han permitido la transferencia rápida de semen y embriones. Dos son las técnicas que se han utilizado con más asiduidad y mejores resultados: la inseminación artificial y la transferencia de embriones. L a inseminación artificial en ganado bovino, actividad que consiste en el depósito de semen en el tracto de la hembra de forma artificial en el momento mas adecuado para obtener una alta probabilidad de que la hembra quede gestante en el mismo proceso de IA, donde la participación del macho queda limitada al porte del semen obtenido por algunas de las técnicas de extracción del semen. (Peréz P. Félix 1990) Otra técnica que ha tomado importancia es la transferencia de embriones (TE). Hasta hace algunos años la colección y T E en bovinos se realizaba en forma quirúrgica por lo que se hacía muy difícil su aplicación a nivel de campo. El desarrollo de nuevos instrumentos, métodos de colección y colocación de los embriones en hembras receptoras, abrió la posibilidad de usarla como una técnica más en los programas reproductivos en animales de alto pedigree en los criaderos. Hoy, la técnica de transferencia de embriones, se practica en forma rutinaria en muchos países en el mundo. L a transferencia de embriones aumenta la capacidad reproductiva de hembras de gran valor genético, disminuye el intervalo generacional, hay recuperación de hembras infértiles de elevado valor genético como enfermedades, edad o accidentes, y también permite la conservación de diversidad genética de animales en peligro de extinción así como un intercambio de material genético. (Carlos Layva 1999) Por otra parte, la biotecnología reproductiva también ha logrado avances en el campo de la medicina humana. Gracias a los grandes avances de la ciencia ahora en nuestros días son muchas las soluciones con respecto a la infertilidad, bien s e a femenina o masculina. Entre ellas tenemos: L a IA, la cual consiste en la colocación en el útero de la mujer el semen del hombre cuando este no reúne las condiciones necesarias para hacerlo de manera natural. L a Inseminación Donante, esta es utilizada cuando el semen de la pareja presenta características significativamente anormales. La fecundación In vitro, en estas técnicas los espermatozoides y los ovocitos de la mujer se combinan fuera del cuerpo de la mujer y son colocados en una incubadora y cuando ocurre la fertilización el embrión es transferido al útero materno donde se implantará. La Microinyección Espermática, la misma es muy parecida a la fecundación in-vitro con la diferencia se encuentra en el óvulo fertilizado, en el FIV se dejan los ovocitos incubando con los espermatozoides y estos se encargan de penetrarlo y en el ICSI se toma un solo espermatozoide y se inyecta cada ovocito. (María Berta Martín, 2003) OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL Compilar información actualizada sobre la relación que existe entre un humano y un bovino en materia de la biotecnología reproductiva. OBJETIVO ESPECIFICO - Describir los avances reproductivos - Describir los avances reproductivos más más importantes importantes en humanos. en bovinos. JUSTIFICACION La biotecnología reproductiva es un área de la ciencia que ha avanzado rápidamente en los últimos años. En la actualidad es posible manipular los ciclos reproductivos de humanos y animales aunque frecuentemente por diferentes razones. Es importante conocer las nuevas tecnologías que se han desarrollado en ambas especies. Frecuentemente existe la creencia de que la tecnología desarrollada en animales (en este caso bovinos), no se puede aplicar al humano, y viceversa, por lo que es de suma importancia, llevar a cabo una revisión minuciosa del tema para informar al interesado en esta área, de que técnicas se pueden utilizar en cada especie y cuales serían sus ventajas y desventajas. También es necesario sugerir cual es el alcance de las técnicas que se están desarrollando en la actualidad y de las que existe mucha controversia, tal como es el caso del uso de las células madre o la clonación reproductiva, temas que tanto en humanos como en bovinos puede provocar inconformidades por parte de un sector de la población que puede no estar bien informada. Por lo anterior se considera que la relevancia de este trabajo justifica su elaboración. METODOLOGIA Para la elaboración de este trabajo fue necesaria información de diversas páginas de internet y de distintos libros de reproducción de la biblioteca de la Universidad Veracruzana. DESARROLLO ENDOCRINOLOGIA 9.1.1 HUMANOS 9.1.1.1 Anticoncepción Hay hormonas que se utilizan en el humano para poder impedir la fecundación de una mujer, a este conjunto de métodos o procedimientos se le llama anticoncepción. (Toni Weschler 2002) Hay muchos tipos de anticonceptivos, desde los métodos de barrera como los condones, hasta los hormonales que como ejemplo están las pastillas anticonceptivas. Este fármaco está compuesto por dos sustancias: estrógenos y progesterona sintéticos, similares a las hormonas femeninas. S e expanden a través de la sangre por todo el cuerpo, impidiendo que los ovarios produzcan un óvulo. Esto provoca que no haya fecundación. Según el tipo de píldora que se use, se toman durante 21 días a partir del quinto día después de la menstruación, o bien, durante 28 días desde el primer ciclo. La menstruación recomenzará de 2 a 5 días después de que se haya tomado la última píldora, aproximadamente un 3% de mujeres que las toman no sucede así. aunque en 9.1.1.2 Inducción de ovulación. Ante la falta de ovulación es necesario inducirla mediante la administración de hormonas que hacen posible reestablecer una ovulación normal, es decir que el ovario produzca y elimine un solo óvulo. Pero en ocasiones la ovulación ocurre normalmente a pesar de lo cual es conveniente estimularla con el objeto de aumentar la cantidad de óvulos y, con ello, las posibilidades de embarazo tal como ocurre con las técnicas de Reproducción Asistida. La inducción de la ovulación consiste en la administración de hormonas para lograr que el ovario produzca y elimine un óvulo porque la ovulación no ocurre o es de mala calidad; en cambio la estimulación de la ovulación consiste en la administración de hormonas a una mujer que ovula normalmente con el objeto de aumentar la cantidad de óvulos que produce el ovario para aumentar las posibilidades de embarazo. El objetivo de la inducción de la ovulación es imitar el proceso natural mediante el cual el organismo femenino elimina un solo óvulo y que, por distintos motivos, no se lleva a cabo espontáneamente. Esto se logra con dos tipos de medicaciones: los antiestrógenos y las gonadotrofinas. Los primeros actúan a nivel del hipotálamo, generando la liberación de gonadotrofinas (LH y F S H ) por parte de la hipófisis; la droga más utilizada es el citrato de clomifeno, que se administra por vía oral durante 5 días, entre el tercero y el quinto día del ciclo menstrual. El citrato de clomifeno, ocasionalmente, puede producir calores y molestias visuales, pero ofrece dos ventajas: es asequible y eficaz en la mayoría de los casos, ya que el ovario responde adecuadamente con habitualmente un solo óvulo. El control ecográfico permite al médico seguir el proceso ovulatorio de la paciente. (Womens Health 2010). 9.1.1.3 Hiperestimulacion ovarica. Es una complicación que ocasionalmente se ve en mujeres que toman ciertos medicamentos para la fertilidad que estimulan la producción de óvulos. (Speroff L, Fritz MA. 2005) Normalmente, una mujer produce un óvulo por mes. A algunas mujeres que se someten a tratamientos de fertilidad se les suministran medicamentos para ayudar a normalizar el desarrollo de los óvulos o incrementar su producción. Sin embargo, si los medicamentos estimulan demasiado los ovarios, éstos pueden resultar de repente muy hinchados y el líquido puede escaparse al área del vientre y del pecho. Esto se denomina síndrome de hiperestimulación ovárica (SHO) y sólo ocurre después de que los óvulos son liberados del ovario (ovulación). El síndrome de hiperestimulación ovárica afecta hasta el 10% de mujeres que pasan por la fecundación in vitro. En la mayoría de los casos, la afección es leve, pero algunas mujeres contraen una forma severa y peligrosa de este síndrome. 9.1.2 BOVINOS 9.1.2.1 Inducción y sincronización del celo La sincronización de celo ha abierto una puerta que parecía infranqueable unos años atrás, para la aplicación masiva de la inseminación artificial en rodeos Bovinos. ( Adams, G.P., 1994) La sincronización del estro involucra el control o manipulación del ciclo estral con el propósito de que las hembras elegidas en un rebaño expresen estro (celo) aproximadamente al mismo tiempo. Es un manejo bastante utilizado en los programas de inseminación artificial, transplante de embriones, concentraciones de partos y uso intensivo, por pocos días, de un toro con monta natural. El factor determinante en el éxito de la sincronización es la elección del método adecuado, que se ajuste a las condiciones de cada animal. La sincronización consiste en la aplicación de un producto hormonal obtenido en laboratorio. Según cada producto es la forma, momento y número de aplicaciones. Un ejemplo de estos productos llamado dispositivo CIDR Es Progesterona activa 10%, es un dispositivo de aplicación intravaginal a base de progesterona, indicado para la sincronización de servicios y tratamiento del anestro en vacas y vaquillonas de carne o leche. El dispositivo CIDR actúa como un depósito de progesterona natural, la cual es liberada y absorbida por la mucosa vaginal, en cantidades suficientes para inhibir la liberación de las hormonas luteinizante (LH) y folículo estimulante (FSH) por la hipófisis frenando la ovulación y consecuente aparición del celo. Cuando el CIDR es retirado, la concentración de progesterona en sangre decrece en menos de 6 horas y el animal entra en celo entre las 30-90 hs posteriores. Protocolo de uso del CIDR: Día 0: Colocar el CIDR. Inyectar 2 mg de Benzoato de estradiol vía intramuscular. Día 8: Retirar el CIDR. Inyectar una dosis de Prostaglandina (vacas cíclicas). Día 9: Inyectar Benzoato de estradiol; 1 mg en vacas y 0,75 en vaquillonas. Día 10: Inseminar a celo detectado o bien realizar inseminación artificial a tiempo fijo (IATF). (M.C. Ramón Frías Teresa 2006) 9.1.2.2 Superovulacion La Superovulacion (SPO) es la inducción de ovulaciones múltiples mediante el uso de gonadotropinas exógenas. Esta técnica es empleada en el procedimiento de producción y colecta de embriones y sin ella sería imposible llevar a cabo esta práctica de mejoramiento genético. (Perez P. Efrain 2010) El tratamiento de Superovulacion más efectivo es aquel en el cual se elimina la detección del celo. Para realizar este tratamiento utilizamos un dispositivo liberador de progesterona junto a una progesterona inyectable (P4) y Benzoato de Estradiol (BE). La nueva onda folicular se inicia al día 4 después de aplicado el BE. El día 4 de tratamiento con P4 y BE comenzamos el verdadero tratamiento de Superovulación con F S H . INSEMINACIÓN ARTIFICIAL L a Inseminación Artificial en la mujer es todo aquel método de reproducción en el que el semen es depositado en la mujer o hembra mediante instrumental especializado y utilizando técnicas que reemplazan a la copulación, ya s e a en óvulos (intrafolicular), en el útero, en el cérvix o en las trompas de Falopio. L a Inseminación Artificial es un procedimiento de fertilización en el que se colocan artificialmente espermatozoides en el cuello del útero (Inseminación Artificial intracervical) o el útero (Inseminación Artificial intrauterina) de una mujer. Los óvulos maduros se deben madurar in vitro se prepara el semen congelado y se capacitan in vitro para penetrar el ovulo y así poder realizar la fertilización, se realiza un cultivo embrionario de siete días y de ahí se coloca en la vaca sin necesidad de cirugía. (Paolo Marco Ronaldo 2010) Finalidades Los objetivos principales de la inseminación artificial son: Asegurar la existencia de óvulos disponibles Acercar los espermatozoides al óvulo en el aparato genital femenino Mejorar e incrementar el potencial de fertilidad de los espermatozoides realizando una serie de procedimiento de laboratorio al eyaculado, llamados en conjunto capacitación espermática. La inseminación artificial en ganado bovino, es una actividad que consiste en el deposito de semen en el tracto de la hembra de forma artificial en el momento mas adecuado para obtener una alta probabilidad de que la hembra quede gestante en el mismo proceso de IA, donde la participación del macho queda limitada al porte del semen obtenido por algunas de las técnicas de extracción del semen. (Nebel Ray 2009). TRANSFERENCIA DE EMBRIONES La transferencia de embriones (o trasplante embrionario) es un método artificial de reproducción que consiste en recoger un embrión del útero de una hembra llamada donadora para introducirlo en el útero de una hembra llamada receptora. Así continuará su crecimiento y desarrollo hasta el parto. Básicamente las T.E. consisten en tratar las hembras donadoras con hormonas que inducen la maduración y ovulación de un número mayor de folículos, tratamiento superovulatorio. En el momento del celo, la donadora recibe servicio natural o por I.A. con el toro superior elegido. Los oocitos una vez fecundados in vivo e iniciado el desarrollo embrionario, entre los días 6 y 8 después del celo, son colectados del útero de la donadora, aislados y luego transferidos a hembras receptoras. El embrión recibe de la donadora y del toro padre todo su genotipo y la función de la receptora es la de incubar el embrión y alimentarlo hasta el parto. Luego, mediante los anticuerpos del calostro y la lactancia, protegerlo durante los primeros meses de vida, contra enfermedades particulares de cada zona además de enseñarlo a convivir con el medio ambiente. Todas las operaciones que se efectúan en el aparato reproductor de donadoras (inseminación y recolección de embriones) y receptoras (transferencia) son por métodos no-quirúrgicos, sin anestesia general y sin riesgos para el futuro reproductivo. (Palma Gustavo 1993) 9.3.1 TRANSFERENCIA EMBRIONARIA EN BOVINOS La técnica de la T.E. y criopreservación de embriones envuelve numerosos pasos, los cuales son simples en si mismos, pero dada la complejidad del conjunto requiere de la organización de un grupo humano especialmente entrenado y capacitado para la atención minuciosa de cada detalle. Los diferentes pasos de la técnica y factores claves son: • Selección y manejo de donadoras. Selección de los toros padres, calidad del semen y fertilidad. • Selección y manejo del grupo de receptoras. Sincronización de los ciclos estrales entre donadoras, embriones y receptoras. Tratamientos superovulatorios. Inseminación artificial de donadoras. Recuperación de embriones, métodos no-quirúrgicos. • Aislamiento, evaluación y conservación de embriones in vitro, cultivo y congelación. Mantenimiento de embriones en nitrógeno líquido, manejo de información y datos zootécnicos. Transferencias de embriones, método no-quirúrgico. Diagnostico precoz de gestación por palpación rectal. Cuidados y manejos sanitarios de la vaca preñada y parturienta, distocia, cesárea, cuidados del recién nacido. Controles administrativos, sistema de computación del control de gestación y banco de datos. identificación permanente de donadoras, receptoras, terneros. tipificación sanguínea de donadores genéticos y crías de T.E. Normas de la internacional embryo transfer society. • Economia de las T.E. en cuanto a costo de producción y beneficios. Actualización permanente en tecnología y zootecnia. 9.3.1.1 Fertilización in vitro La fertilización in vitro (FIV) es una técnica de reproducción asistida que permite desarrollar un embrión a partir de la unión de un ovulo con un espermatozoide en medios especiales de laboratorio que imitan las condiciones fisiológicas de fecundación. (Cabrera Valverde J . Mario 2005) S e utiliza principalmente en vacas que por distintas causas no pueden dejar descendencia atreves de las técnicas reproductivas convencionales. Algunas de las vacas candidatas para FIV serian: Vacas refractarios o tratamientos superestimulatorios. Vacas que no dan embriones transferibles. Vacas con alteraciones anatómicas que impiden una correcta fecundación o anidación del embrión. Vacas o vaquillonas en el primer tercio de gestación Vacas en puerperio 9.3.2 HUMANOS. TRATAMIENTO INFÉRTIL L a infertilidad es la incapacidad de la pareja de lograr una gestación que lleve al nacimiento de un hijo, después de un año de mantener relaciones sexuales sin métodos de planificación. L a infertilidad es un problema de pareja y no es una enfermedad, sino consecuencia de una o varias enfermedades. L a infertilidad es un problema frecuente que consiste en la no concepción después de un año de mantener relaciones sexuales sin ningún medio de planificación. Aproximadamente 2 0 % de las parejas están aquejadas por infertilidad, la cual podría ser curable en más del 9 0 % de los casos si se hiciera un diagnóstico adecuado. Sin embargo la falta de dicho diagnóstico impide lograr el embarazo. 9.3.2.1 Fertilización in vitro L a fecundación in vitro (FIV) es un término genérico que comprende varios métodos médicos que se utilizaran para superar algunos tipos de esterilidad. Es una técnica mediante la cual se consigue que un óvulo y un espermatozoide puedan encontrarse en una placa de cultivo de un laboratorio, cuando esto no se ha logrado por el mecanismo natural. Los ovulos que salen son maduros y es necesario capacitar al semen in vitro igual que bovino y de ahí la fertilización in vitro convencional o bien la Inyección Intracitoplasmática de Espermatozoides (ICSI) (L. Jain 2009) Para ello es preciso: Disponer del semen de un hombre, recogido previamente. Poseer uno o más óvulos de una mujer, recogidos por un procedimiento técnico en un centro sanitario adecuado. Poner en contacto el semen con el ovulo u óvulos en una placa de cultivo esperando que la fecundación in vitro se produzca. Cuando los embriones producidos por la FIV se llevan al interior del útero, estamos frente a la fecundación in vitro con transferencia de embriones (FIVTE). Existen otras variantes como la transferencia intratubárica de gametos (GIFT), la técnica de Kraft y la del lavado uterino. La fecundación in vitro con transferencia de embriones puede realizarse con gametos de la pareja o de donantes y la transferencia se hace en el útero de la mujer que forma parte de la pareja o en otra ajena; en el último caso, estamos frente a lo que se ha llamado maternidad subrogada o de sustitución. La FIVTE permite varias posibilidades, según la procedencia de los gametos y de si la transferencia se realiza en el útero de la mujer o en una madre sustituta, para solucionar los problemas de esterilidad. 9.3.2.2 Transferencia Tras el cultivo de embriones y la valoración de la calidad embrionaria en ciclos de FIV convencional o ICSI, se determina el número de embriones a transferir y se seleccionan los de mayor calidad. (Layva Carlos 1999) La transferencia de embriones es una técnica sencilla en la que se depositan los embriones en el útero materno. S u duración es de unos minutos. S e realiza mediante un catéter muy fino en el que se depositan los embriones seleccionados. Éste se introduce vía vaginal hasta el útero. Allí se depositan lentamente los embriones y se retira paulatinamente el catéter de la cavidad uterina. Esta técnica es completamente indolora, no requiere ningún tipo de anestesia y la paciente se marcha tras unos 20 minutos de reposo en la camilla y realiza su vida normalmente. La transferencia se realiza, generalmente, dos o tres días después de la punción ovárica o bien, cinco días después. E n función del tratamiento utilizado para la estimulación controlada del ovario será necesario prescribir progesterona a la mujer a partir de la realización de la punción ovárica. La progesterona mejora la receptividad del endometrio y la implantación del embrión. Unas dos semanas después de la transferencia de embriones se efectúa una prueba de embarazo si no ha habido menstruación. CLONACIÓN S e ha definido a un clon como un grupo de organismos de idéntica constitución genética que proceden de un único individuo mediante manipulación asexual, siendo a su vez iguales a él. De éste modo, arribamos a una primitiva conceptualización de lo que implica el proceso de clonación entendiendo que el mismo se refiere a la producción de clones que puede ser provocado o espontáneo. A partir de ésta primera definición, estoy en condiciones de referirme a la producción de clones de células no embrionarias o de tejidos con fines de investigación o de futura realización de trasplantes, o de clonación de embriones mediante su división en los primeros estadios de su desarrollo, o de clonación de individuos la transferencia del núcleo de una célula no necesariamente reproductiva a un óvulo previamente pre nucleado. Sin embargo, la clonación propiamente dicha, importa una técnica compleja que importa una transferencia nuclear de la dotación completa de cromosomas de una célula somática o totipotente 1, lo que deriva en un nuevo individuo con una dotación de cromosomas idéntica a la de la célula original de la cual dicha dotación fue extraída. (McLaren Anne 2003) 9.4.1 BOVINOS - REPLICAS DE ANIMALES ADULTOS La tecnología del clonado, aplicada a los animales domésticos de interés productivo, promete ser una técnica que contribuirá de manera sustancial en el desarrollo de la biotecnología, la producción animal, la biomedicina, la preservación de especies en extinción y en la investigación básica en países desarrollados. Proceso de clonación 1) Enucleación: Mediante técnicas de micro manipulación se extrae el núcleo del óvulo, que se visualiza mediante un colorante que tienen afinidades por el A D N . El óvulo queda "vacío" de material genético, lo que le permite recibir a la célula del animal a clonar. 2) Transferencia de la célula al espacio peri vitelino: La célula del animal a clonar se transfiere al espacio peri vitelina del óvulo "vacío", entre la membrana plasmática y la zona pelucida. 3) Electro fusión Mediante un pulso eléctrico la célula con el material genético del animal a clonar ingresa al citoplasma del óvulo, de esta manera el óvulo recibe el núcleo y la información genética del animal a reproducir. 4) Desarrollo embrionario Durante 6 a 7 días los embriones se cultivan en una estufa con medios y condiciones especiales que permiten su desarrollo. 5) Transferencia embrionaria Los embriones desarrollados en cultivo se transfieren a hembras receptoras que llevan a cabo la gestación, la preñez se confirma mediante ecografía. (Palma Gustavo 1993) 9.4.2 HUMANOS 9.4.2.1 Células madre U n a célula madre es una célula que tiene capacidad de autorrenovarse mediante divisiones mitóticas o bien de continuar la vía de diferenciación para la que está programada y, por lo tanto, producir células de uno o más tejidos maduros, funcionales y plenamente diferenciados en función de su grado de multipotencialidad. L a mayoría de tejidos de un individuo adulto poseen una población específica propia de células madre que permiten su renovación periódica o su regeneración cuando se produce algún daño tisular. Algunas células madre adultas son capaces de diferenciarse en más de un tipo celular como las células madre mesenquimales y las células madre hematopoyéticas, mientras que otras son precursoras directas de las células del tejido en el que se encuentran, como por ejemplo las células madre de la piel o las células madre gonadales (células madre germinales). Es común que en documentos especializados se las denomine stem cells, en inglés, donde stem significa tronco, traduciéndolo lo más a menudo como «células troncales». (Anne McLaren 2003) Las células madre embrionarias son aquellas que forman parte de la masa celular interna de un embrión de 4-5 días de edad y que tienen la capacidad de formar todos los tipos celulares de un organismo adulto. U n a característica fundamental de las células madre embrionaria es que pueden mantenerse (en el embrión o en determinadas condiciones de cultivo) de forma indefinida, formando al dividirse una célula idéntica a ellas mismas, y manteniendo una población estable de células madre. Existen técnicas experimentales donde se pueden obtener células madre embrionarias sin que esto implique la destrucción del embrión. Son células indiferenciadas que tiene la capacidad de dividirse indefinidamente sin perder sus propiedades. Existen cuatro tipos de células madre: Las células madre totipotentes pueden crecer y formar un organismo completo, tanto los componentes embrionarios (como por ejemplo, las tres capas embrionarias, el linaje germinal y los tejidos que darán lugar al saco vitelino), como los extraembrionarios (como la placenta). E s decir, pueden formar todo los tipos celulares. Las células madre pluripotentes no pueden formar un organismo completo, pero sí cualquier otro tipo de célula correspondiente a los tres linajes embrionarios (endodermo, ectodermo y mesodermo), así como el germinal y el saco vitelino. Pueden, por tanto, formar linajes celulares. Las células madre multipotentes son aquellas que sólo pueden generar células de su misma capa o linaje de origen embrionario (por ejemplo: una célula madre mesenquimal de médula ósea, al tener naturaleza mesodérmica, dará origen a células de esa capa como miocitos, adipocitos u osteocitos, entre otras). Las células madre unipotentes pueden formar únicamente un tipo de célula particular. 9.4.2.2 Clonación reproductiva y terapéutica. El estado de la unión de las células homocigotas al momento de ser colocados en el útero o bien congelados, es aquel en el que no existe una identidad genética realmente diferenciada ya que todavía no hubo una unión de prenúcleos y dentro de esa unión o pre-embrión encontramos desde el exterior hacia el interior (en ese orden) las células que luego darán lugar a la formación de la placenta, y más adentro y rodeadas por éstas, las células que luego darán lugar al embrión (blastocitos). Si extraemos de este pre - embrión aquel células que luego darán lugar al embrión mismo, y las colocamos en una placa de cultivo en condiciones especialmente preparadas, estamos en condiciones de obtener material genético que permitirá el desarrollo de: células sanguíneas, glándulas de secreción, neuronas y músculos; que podrían llegar a ser utilizados para trasplantes de órganos. La clonación reproductiva implica, por un lado, la transferencia de un núcleo de una célula de una persona a un óvulo enucleado para dar como resultado lo que podríamos denominar como "embrión sintético" para diferenciarlo de aquél producido por fecundación de un óvulo por un espermatozoide; y, por otro lado, implica la implantación de este embrión sintético en el útero de la mujer a los efectos de completar la gestación y llegar al nacimiento de un nuevo individuo. Este procedimiento ha sido unánimemente prohibido en seres humanos a nivel internacional, fundamentalmente debido al hecho de que, en las condiciones actuales, las experiencias con animales han demostrado una alta incidencia de alteraciones en el desarrollo fetal. (Lizbeth Sagols. 2006) Clonación Terapéutica S e ha comprobado que células no diferenciadas (que no tienen características específicas) obtenidas tanto de un embrión temprano (menos de 14 días de post fecundación) como de fetos derivados de abortos terapéuticos, poseen la capacidad de dar origen a distintos tejidos luego de ser colocados en el ambiente adecuado. A éstas células se denominan Stem o células madres* Estas experiencias han planteado la posibilidad de generar tejido de reemplazo para distintos tipos de afecciones humanas, tales como el mal de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer, la diabetes, etc.; a partir de cultivos celulares de células embrionarias o fetales. En el caso de los embriones producidos por fecundación in vitro, el procedimiento implicaría el cultivo de los mismos hasta el estadio de blastocito (6¬ 7 días, 100-200 células). En éste estadio es posible diferenciar células del denominado macizo celular interno (que daría origen al embrión) y células externas, del trofoblasto, que darían origen a la placenta. Las células del macizo celular interno, pueden ser luego tratadas con factores que orienten su diferenciación hacia un tejido en particular. Estas células madre serían luego implantadas en el paciente a los efectos de restaurar la función del órgano afectado. (Lizbeth Sagols 2006) El uso de estas células está sujeto a las mismas limitaciones en cuanto a compatibilidad que los trasplantes de órganos. Por lo tanto, esto exigiría contar con un banco de células embrionarias aptas para cubrir las necesidades de los distintos pacientes. Dicho banco debería ser constituido a partir de embriones excedentes de los procedimientos de FIV (fecundación in vitro), que han sido donados por las parejas en razón de no desear un nuevo embarazo. Esta limitación se vería subsanada si se parte de un "embrión sintético" producto de la transferencia nuclear de una célula del paciente a un óvulo enucleado. E n este caso se obtendrían células embrionarias totalmente compatibles con el paciente. Por otro lado, dado que todavía no se ha comprobado que, en seres humanos, éste embrión sintético tenga viabilidad, es decir que pueda dar lugar a un embarazo, su status jurídico no puede ser comparable al de un embrión producido por FIV (fecundación in vitro), tanto ética como legalmente. D e esta manera estamos en condiciones de precisar que se entiende por células troncales o stem cells:: Son células generalmente no diferenciadas y que pueden dar origen por diferenciación y replicación a uno o más tipos celulares especializados. Así, las células stem, son capaces de reproducirse a sí mismas en forma definitiva. Existen diferentes clases de células troncales humanas que difieren en su origen y en su potencial para diferenciarse. U n a primera categoría la constituye las células troncales embrionarias derivadas de la masa interna de un embrión en estadio de blastocito: éstas son capaces de diferenciarse y transformarse en células constitutivas de casi todos los tejidos y órganos. Pero si bien tienen la capacidad de participar en el desarrollo de cualquier órgano cuando son inyectadas en un embrión en el estadio blastocito no pueden desarrollarse en un embrión o feto normal, todavía. U n a segunda categoría la constituyen las células embrionarias germinales que son los precedentes de las células germinales presentes en los embriones en estado fetal. L a última categoría son las células troncales adultas presentes en determinadas "secciones" tales como el sistema nervioso, piel, músculos e intestinos. D e ésta diferenciación y concentrándonos en las células embrionarias, éstas pueden ser obtenidas de tres maneras distintas: a) a partir de un feto muerto, en caso de abortos espontáneos o provocados; b) por Clonación Terapéutica, partiendo de las células del paciente a partir de su creación in vitro con objetivos reproductivos; c) obtenidas por fecundación in vitro. Sin dejar de lado lo recientemente explicado, es dable destacar la opinión del Dr. Belluscio, según el cual "debe desecharse de entrada el pensamiento de que la clonación permite crear seres perfectamente idénticos. Podrán ser genéticamente idénticos, pero ello no significa identidad total pues en la formación del ser humano influyen factores ambientales, culturales y de diversa índole. L a identidad no puede ser mayor que la de los gemelos monocigóticos. Es obvio que entre éstos existen diferencias, y esas diferencias se verán acentuadas por el simple motivo de que el clon no habría nacido contemporáneamente, de manera que crecería en un medio familiar, social y aún históricamente diferente de aquel en que se formo el proveedor del material genético" PRESERVACIÓN DE LA FERTILIDAD 9.5.1 Humanos. Criopreservación de semen, óvulos, embriones, tejido testicular y tejido ovárico. Criopreservación del semen: Gracias a esta técnica es ahora posible que existan bancos de semen los cuales son muy útiles para poder ayudar a parejas con problemas de fertilidad, así mismo, permite el que una pareja se someta a cualquiera de los procedimientos de reproducción asistida y si el esposo o pareja de la paciente no se encuentra disponible por motivos de trabajo, viajes, etc., se puede utilizar el semen congelado y así llevar a cabo la fecundación. Otro aspecto en el que es importante la criopreservación de semen es en el caso de la preservación de la fertilidad. Pacientes que por problemas de cáncer vayan a ser sometidos a quimioterapia o radioterapia pueden criopreservar su semen antes del tratamiento ya que se ha comprobado que estos son muy agresivos para los gametos. Generalmente en este proceso se busca suspender los espermatozoides en una mezcla que deshidrata esta célula lo necesario para que no se formen cristales de hielo, que producirían ruptura de está célula, mientras se le congela. Para ello, el semen se enfría en pajuelas a la velocidad estimada en el vapor del nitrógeno líquido. Luego que esté congelada, la muestra se guarda directamente en el nitrógeno líquido a -196 grado C° hasta que se quiera utilizar. Ciertamente, hay estudios donde se demuestra que el semen de ciertos animales sigue viable hasta pasados 50 años de congelación. Crio preservación de óvulos L a criopreservación de óvulos es una técnica que crece y que posibilita "preservar" la fertilidad, ya sea por soledad, temor al paso del tiempo y miedo a no concretar el deseo de la maternidad o por padecer una enfermedad con riesgo de reducir o perder la función reproductiva como consecuencia de un tratamiento quirúrgico o médico (como radioterapia o quimioterapia), muchas mujeres optan por la criopreservación de óvulos como una alternativa para "resguardar" su función reproductiva. También están las que por priorizar el crecimiento profesional, la construcción de espacios propios o el crecimiento económico, prefieren postergar la maternidad para después de los 35 años. Sin embargo, las mujeres que planean su maternidad para esa edad deben tener en cuenta que las posibilidades de embarazo disminuyen ya que los óvulos a partir de los 35 años pierden calidad. Dado que se trata de una técnica relativamente nueva, no está establecido el tiempo que pueden conservarse los óvulos, pero por otro lado no hay un límite de edad para implantarlos, aunque más allá de los 50 años hay más riesgos obstétricos. Además, hay toda una cuestión ética por la cual se establece una edad límite. Este método no tiene un 100% de efectividad. Las tasas de embarazo con ovodonación rondan el 50% de éxito, las de fecundación in vitro convencional, 40% y las de óvulos criopreservados 20%. Pero hay que tener en cuenta que las tasas de embarazo con los métodos convencionales en mujeres mayores de 40 años con óvulos propios son de 5%. Para que una mujer pueda acceder a la técnica de criopreservación de ovocitos deberá en una primera instancia consultar a un médico especialista, quien le indicará la realización de estudios previos (como determinaciones hormonales, cultivos, estudios pre quirúrgicos e infectológicos). U n a vez firmado el consentimiento de que se llevará a cabo la técnica de criopreservación, se procede a realizar la estimulación de la ovulación; para esto se administran una serie de medicamentos para que los ovarios produzcan varios ovocitos maduros, pudiendo así tener la posibilidad de criopreservar mayor cantidad de ovocitos. Luego de la estimulación ovárica, se identifican los folículos, se aspiran y se obtienen de allí los óvulos. Este es un procedimiento que se realiza en quirófano con anestesia general. Cuando se identifican ecográficamente los óvulos maduros, se aspiran; y una vez en el laboratorio, se identifican los ovocitos maduros y se criopreservan los mismos. Ya realizado este procedimiento, los óvulos se mantienen congelados hasta que la mujer decida su descongelamiento. Si más adelante la mujer decidiera utilizar los óvulos congelados, s e deberá preparar el endometrio para la implantación de los embriones, s e descongelarán los ovocitos y los mismos se inyectarán con los espermatozoides obtenidos de su pareja a través de la técnica ICSI (Inyección intracitoplasmática de espermatozoides) para luego realizar la transferencia de los embriones. Criopreservación de embriones: Los embriones humanos pueden ser criopreservados de una manera eficaz en el estadio de 2 P N (día 1); también en el de 2 a 6 células (día 2-3) o en el de blastocito Por lo general, cuando se obtienen más de 10 zigotos, algunos de los que se encuentran en 2 P N serán congelados y el resto de los embriones permanecerán en los cultivos para la Transferencia Embrionario en los días 2 o 3. Los 2 ó 3 embriones que de acuerdo a su morfología se clasifiquen como los mejores, serán los seleccionados para ser transferidos hacia el útero materno; el número de embriones varía de acuerdo a la edad de la paciente, historia de su caso, así como a la calidad de los embriones. U n a vez que se transfieren, los embriones continuarán creciendo hasta lograr una extrusión de la capa protectora, denominada zona pelúcida, e iniciar el proceso de implantación sobre la superficie uterina entre el día 6 ó 7. L a calidad de los embriones restantes es calificada. Los evaluados de buenos a excelentes, con formación celular normal y con menos de 2 0 % de fragmentación celular, podrán ser congelados. D e otra manera, los embriones residuales continuarán en el cultivo y serán monitorizados día a día. Cualquier embrión que alcance el estadío de Blastocito podrá ser congelado. D e esta manera, se hace evidente cuáles son los embriones que no son viables, evitando así ser congelados o transferidos. Cerca del 25% de los embriones que evolucionan no tiene la calidad adecuada para ser congelados. Aproximadamente, 75% de los embriones congelados sobrevive a la descongelación. Crio preservación de tejido testicular Cuando el semen de un hombre no puede moverse a través del tracto genital porque se encuentra bloqueado, es posible extraer quirúrgicamente el semen del epidídimo ó del tejido testicular. L a extracción del semen testicular ó epididimal permite que el espermatozoide sea cosechado directamente de los testículos ó epidídimo. Esta es una opción para pacientes cuya eyaculación es imposible ó para cuando el espermatozoide es poco, no viable ó poco movible y no puede ser recobrado del eyaculado. Este procedimiento es usualmente realizado por urólogos para permitirle al hombre concebir un hijo usando técnicas de reproducción asistida (TRA) como Fertilización In Vitro (FIV). La extracción del semen (cuando se realiza la técnica adecuada) es un procedimiento normalmente exitoso que permite a los hombres con baja producción de espermatozoides concebir un hijo propio. Criopreservación de tejido ovárico El diagnóstico de un cáncer afecta a todos. Pero cuando esto le sucede a una mujer en plena etapa fértil de su vida, o cuando incluso aún no ha llegado a ella, la pregunta de rigor es: ¿Podrá tener hijos? Si bien el cáncer en sí mismo no destruye la fertilidad, sí lo pueden hacer los tratamientos para combatirlo, como son la quimioterapia y la radioterapia. El procedimiento consiste en extraer mediante cirugía laparoscópica un fragmento del ovario, que no es más del 2 0 % de éste. Luego se congela a una temperatura de -196° y se guarda. La ventaja de esta intervención es que no se extraen los ovarios en su totalidad, lo que permite que la mujer siga creciendo y teniendo su desarrollo y madurez sexual sin problemas. (Interfaz bioética 2006) 9.5.2 Bovinos. Criopreservación de semen, óvulos, embriones, tejido testicular y tejido ovárico. Crio preservación de semen. E n la aplicación de las técnicas de la biotecnología reproducitva, como es la fecundación in vitro (FIV), se requiere de la selección y recuperación de espermatozoides motiles, de formas normales, y libres de contaminantes del plasma seminal. (MSc R. Sanchez 1994) La criopreservación (o congelación) es un método que permite la conservación de los espermatozoides durante largos períodos de tiempo en vistas a su utilización futura. Básicamente consiste en someter al semen a un proceso de enfriamiento progresivo hasta ser llevado a una temperatura de -196°C en un medio de nitrógeno líquido. Crio preservación de embriones: La criopreservación posibilita almacenar embriones de una amplia variedad de especies mamíferas sin que pierdan mamíferas sin que pierdan su capacidad de desarrollar y nacer vivos. Si bien los embriones son un conjunto de células, se aplican principios criobiológicos originalmente estudiados en células aisladas tales como linfocitos y fibroblastos. En el caso particular de los bovinos, cuyos embriones son recolectados y transferidos mediante métodos no quirúrgicos, las ventajas que brinda la criopreservación se ven reflejadas, en primera instancia, durante la ejecución del programa de transferencia y luego, en mucha mayor magnitud, en el comercio nacional e internacional de reproductores. En lo que respecta a la organización del programa de transferencia, la criopreservación permite utilizar eficientemente donantes y receptoras, otorgando una mayor flexibilidad en la disponibilidad de estas últimas. También posibilita transferir algunos embriones y conservar el resto en bancos de germoplasma hasta poder analizar los registros de producción de la descendencia. En referencia a la comercialización de reproductores, la criopreservación permite a los ganaderos progresar genéticamente a bajo costo, comparando los valores del embrión y de su transporte con el de los animales en pie. También hace posible controlar enfermedades, reemplazando la importación de animales en pie por la de embriones criopreservados libres de ellas. Las razones enunciadas convierten a la criopreservación en una herramienta insustituible en la aplicación de la transferencia embrionaria. Criopreservación de tejido ovárico Permite almacenar folículos primordiales de la corteza ovárica, reserva de oocitos. Debido al limitado éxito de métodos anteriores, principalmente por los daños que genera la congelación, las investigaciones se han enfocado en el congelamiento de oocitos inmaduros en el interior de folículos primordiales. Este método tendría más éxito debido a que el oocito se encuentra menos proclive a isquemia gracias a la protección folicular. U n a ventaja significativa asociada este método es que como la corteza ovárica es muy rica en folículos primordiales una limitada cantidad de tejido es suficiente para restablecer la fertilidad en humano y la función endocrina. Las pérdidas de viabilidad en estos procesos están más relacionadas con los efectos de la isquemia aguda, estrés oxidativo y defectos de perfusión tras el implante del tejido ovárico crioconservado que con el proceso mismo de crioconservación. (Palma Gustavo 1993) 10.- Conclusión L a biotecnología reproductiva tiene muchas similitudes entre humanos y bovinos. E s probable que en el futuro se sigan desarrollando técnicas intercambiables que ayuden a combatir al infertilidad en ambas especies. 11.- BIBLIOGRAFÍA * Cabrera Valverde J . Mario 2005. Temas de bioética: Del inicio al final de la vida humana. Pag 107 * L. Jain 2009 Clinicas pediátricas de norteamerica. Volumen 56 no. 3 Pag. 468 * Peréz P. 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