prácticasdeempresa - Universidad de Salamanca

PRÁCTICAS DE EMPRESA: DEPARTAMENTO
DE MEDICINA MOLECULAR DE LA UNIVERSIDAD DE
SALAMANCA
Alumna: Paula Díez García
Titulación: Licenciatura en Biotecnología (actualmente en 5º curso)
Período de prácticas: 7 de junio – 30 de julio de 2010
Tutor: Dr. Rogelio González Sarmiento
Objetivo: el objetivo principal de estas prácticas de empresa ha sido el de introducir al
estudiante en el mundo laboral, darle a conocer cómo transcurre el trabajo diario en
una laboratorio de investigación y diagnóstico, mostrando las diferentes técnicas
empleadas en el mismo, así como la manera de emplear los conocimientos adquiridos
en diferentes situaciones de experimentación.
Por esta razón, el tutor de las prácticas, Dr.Rogelio González Sarmiento, me
ofreció elegir entre el laboratorio 14 del Centro de Investigación del Cáncer y el
laboratorio de diagnóstico situado en la facultad de Medicina, ambos bajo su tutela.
Para poder efectuar la elección, pasé una semana en cada emplazamiento observando
en qué trabajaban y qué técnicas utilizaban.
LABORATORIO 14 DEL CIC
Este laboratorio está especializado en el estudio de anomalías moleculares en
cáncer de mama y ovario familiar y esporádico (genes BRCA1 y BRCA2), aunque
también realizan estudios del cáncer colón-rectal hereditario (polipósico: APC, y no
polipósico: MLH-I, MLHII y MSHII). Se encargan de analizar todas las muestras que
reciben de distintos hospitales dentro de la región, así como de otros centros
nacionales.
El tiempo que estuve en este laboratorio me dediqué a conocer su
funcionamiento: cómo llegan las muestras, se procesan, se analizan mediante PCR,
heterodúplex, secuenciación…Todo ello de forma general.
Las técnicas aprendidas fueron:
- Preparación de geles de agarosa para PCR.
- Preparación de heterodúplex: geles de acrilamida, montaje del
soporte, carga de las muestras, desmontaje del mismo, tinción, secado,
análisis.
- PCR: carga de las muestras en los geles.
LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO DE LA FACULTAD DE MEDICINA
Después de pasar unos días en el laboratorio 14 me trasladé al laboratorio de
diagnóstico molecular de la facultad de Medicina, especializado en el estudio de
enfermedades raras, poco comunes, generalmente, de afección epidérmica.
Decidí quedarme en este laboratorio principalmente por dos causas:
a) El estudio de enfermedades raras me atrajo mucho más por
diferentes razones: su propio carácter de “rara”, el hecho de que
sean pocos los casos diagnosticados, supone un mayor reto a la hora
de estudiarlos, no sólo por el poco conocimiento que existe sobre
ellos, sino también por la oportunidad que aporta este laboratorio
de dar resultados concluyentes a los pacientes. Asimismo, quedarme
en ese laboratorio me ofrecía la posibilidad de conocer nuevas
enfermedades, nuevas variaciones…cada enfermedad ofrecía la
posibilidad de estar implicada por varios genes distintos, teniendo
cada uno de ellos muchos exones, cada uno de los cuales había que
analizar en busca de la alteración responsable de la enfermedad. En
conclusión, este laboratorio suponía una visión más amplia y variada
de los estudios de diagnóstico molecular.
b) En segundo lugar, la razón que determinó que me decantase por
este laboratorio fue el hecho de que podía tener una formación más
personalizada, ya que prácticamente la responsable del diagnóstico,
encargada de instruirme, tenía bajo su tutela apenas a dos personas
más. Sin embargo, en el laboratorio 14 éramos varias las personas
que estábamos realizando prácticas allí, con la consecuente
dificultad de poder llegar a realizar un trabajo independiente.
Dicho esto, procedo a exponer, ahora de forma más detallada, el trabajo
realizado.
HETERODÚPLEX
El heterodúplex es una técnica consistente en analizar mediante gel de
poliacrilamida las moléculas de DNA de doble cadena formadas por hibridación de
cadenas sencillas complementarias.
El procedimiento de la técnica consta de varios pasos:
* Montaje de los cristales: se dispone de dos cristales, uno grande y otro
más pequeño. Han de limpiarse con etanol y fijarse en qué borde está mejor
(presenta menos alteraciones) antes de colocarlos para evitar futuras fugas
del gel. Colocar los separadores entre ambos cristales y, una vez montados,
situar las pinzas laterales. Colocar, finalmente, en el soporte (cada soporte
tiene capacidad para dos geles).
* Gel de poliacrilamida: H2O destilada + TBE 10X + TEMED + MD`+
FORMAMIDA + APS
* Relleno de los cristales: una vez echado el APS la mezcla comienza a
gelificar, por lo que hay que apurarse a la hora de verter la solución. Debe
observarse si se producen pérdidas. Colocar el peine procurando que no
queden burbujas.
* Preparación de la muestra: la mezcla resultante consta de tampón de
carga, que marca la zona por donde va corriendo la muestra, y ésta misma
(procedente de PCR). La proporción de ambos es de: 1µL de tampón de carga
por cada 0-5µL de muestra, 2µL de TC por cada 5-10µL….
A la hora de cargar las muestras se incluye también un marcador de
tamaño y un control negativo (sin muestra).
* Conexión: se introducen los geles en la cubeta y se añade buffer. Se
deja corriendo durante varias horas hasta que el tampón de carga llegue a la
zona baja del gel.
* Desmontaje: se retiran las pinzas, cristales y separadores. Una vez
separado el gel, se marca de tal manera que se reconozcan el pocillo donde se
ha empezado a cargar y qué gel es (primero o segundo en cargar).
* DNA Silver Staining Kit: conjunto de soluciones empleadas para el
revelado de los heterodúplex formados.
1. Solución de fijación
2. Solución de tinción: de plata
3. Solución de revelado
4. Solución de paro
Hay que intentar que no queden manchas de plata en el gel, así como
que no quede muy oscuro para que la visualización de las bandas sea óptima.
* Secado: cubrir los geles con plástico y colocar las pinzas. Secar en el
horno durante un día, más o menos.
MUTACIÓN HETEROCIGÓTICA (AG)
INDIVIDUO NORMAL
MUTACIÓN HOMOCIGÓTICA (AG)
VISUALIZACIÓN GEL
MARCADOR C (-)
()
()
__
__
__
__
__
__
__
C(+)=NORMAL
()
HETEROC.
()
HOMOC.
()
__
__
__
__
__
__
Esta técnica no es válida para enfermedades homocigóticas recesivas, por lo
que en estos casos es mejor enviar directamente a secuenciar la muestra de PCR. En
heterocigosis deberían observarse 4 bandas, aunque suele ser difícil.
GELES DE AGAROSA PARA PCR
Normalmente se hacen al 2% para fragmentos de alrededor de 300Kb. A
mayor tamaño de fragmento, menor % de agarosa. El gel es una mezcla de agarosa (se
pesa en la balanza) y TBE0’5X (50 o 100mL dependiendo de la cubeta). El matraz donde se
realiza la mezcla se cubre con film de plástico y se agujerea para evitar que estalle el
recipiente dentro del microondas. Una vez la agarosa se haya fundido completamente,
se añade bromuro de etidio o Sypro green (compuestos que se intercalan entre las
bases del DNA) y se vierte en la cubeta previamente montada. Se ponen los peines y se
espera a que polimerice. Una vez esto haya ocurrido, se retira el peine y se cargan las
muestras de la PCR (4mL de muestra + una gota de tampón de carga). Al igual que en
el heterodúplex, se carga también un marcador de tamaño, y un control negativo para
confirmar que no ha habido contaminaciones. Una vez se han cargado todos los
pocillos, se echa TBE hasta que el gel quede cubierto, se coloca la tapa teniendo
especial cuidado en la correcta distribución de los polos negativo y positivo y se pone a
correr a 140V durante unos 20 minutos. Controlar el avance del tampón de carga para
saber cuándo parar. Seguidamente hacer una fotografía del gel para observar las
bandas.
De estos geles puede extraerse directamente una de las bandas para su
análisis. Para ello, habría que eliminar la agarosa mediante un kit de extracción y luego
usar el producto de PCR según el fin.
PCR: Reacción en cadena de la polimerasa
Se trata de una técnica de biología molecular desarrollada por Kary Mullis
cuya finalidad es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN
particular, partiendo de un mínimo, es decir, se busca amplificarlo.
La PCR se realiza en un termociclador con unas condiciones de temperatura
adecuadas para cada fragmento que se desea amplificar. Para ello hay que preparar
previamente la muestra. Todo el proceso se realiza en cámara de flujo laminar para
evitar contaminaciones. Por esta misma razón todo el material que entra en la cámara
ha de limpiarse con etanol.
Muestras: - Master-Mix: contiene Taq polimerasa, tampón, MgCl2 y dNTPs
- Agua libre de nucleasas
- Oligos
- DNA
Por cada muestra hay que preparar un control negativo para asegurarse de que
la muestra de DNA no está contaminada, ni tampoco el master-mix o los oligos. El DNA
que se recibe (extraído a partir de sangre periférica) está muy concentrado, por lo que
se hace una dilución 2:50 del stock.
DIGESTIONES DEL PLÁSMIDO pGEMT + inserto
El objetivo del experimento era conseguir insertar un fragmento de DNA
determinado dentro del plásmido pGEMT. Participé en el proceso de la digestión,
crecimiento en placas, realización de réplicas, extracción y PCR de las digestiones.
Asimismo efectuamos un nuevo stock de células competentes.
PCR cuantitativa (qPCR)
La PCR cuantitativa permite detectar duplicaciones y deleciones de genes. La
preparación de la muestra es similar, pero en este caso no se carga en geles, sino que
se disponen en el aparato de qPCR mediante una placa que hay que diseñar
previamente. Hay que incluir un control endógeno (p53,por ejemplo) y un DNA de
referencia (DNA de otro paciente que se sabe con seguridad que no padece la
enfermedad en estudio).
Esta técnica requiere saber la cantidad exacta de DNA que se echa. Para
determinarla se utiliza el NanoDrop, que permite determinar la concetración y, por
tanto, la cantidad de DNA.
GENES ESTUDIADOS
p53: también llamado el "guardián del genoma", se encuentra en el brazo
corto del cromosoma 17 (17p13) y codifica un factor de transcripción nuclear de 43.7
KDa. Su nombre hace referencia a su masa molecular aparente: corre como una
proteína de 53 KDa. Resulta esencial para inducir la respuesta de la célula ante el daño
del ADN, deteniendo el ciclo celular en caso de mutación. El gen p53 es un gen
supresor tumoral que desempeña un papel importante en apoptosis y control del ciclo
celular. Un p53 defectuoso podría permitir que las células anormales proliferen dando
como resultado cáncer.
LQT1: gen implicado en el síndrome QT-largo. Éste es un tipo de arritmia
cardíaca caracterizada por alteraciones típicas del perfil electrocardiográfico. En la
forma congénita o familiar es una enfermedad hereditaria asociada a elevado riesgo de
muerte súbita. La mayoría de los enfermos son asintomáticos y son detectados
accidentalmente en electrocardiogramas de rutina, por la historia familiar o después
de sobrevivir a episodios de síncope o arritmia ventricular severa.
LQT1 (KVLT1) codifica la subunidad α del canal de potasio.
LQT2 (HERG) codifica la subunidad α del canal de potasio.
LQT3 (SCN5A) codifica la subunidad α del canal de sodio.
La importancia del examen genético radica en la precoz detección de la
enfermedad que ayuda a definir el pronóstico y seleccionar los tratamientos más
adecuados de acuerdo a las variantes genotípicas.
En primer lugar se estudia LQT1, si no se hallan mutaciones, se estudian LQT2 y
LQT3. El gen LQT1 suele presentar problemas de análisis en los exones 1a, 13, 14 y 15.
Por ello suele complementarse la PCR con sustancias como DMSO o espermidina que
permiten hacer gradientes y detectar mejor las bandas tras correr las muestras en el
gel.
BGN: gen de la distrofia muscular.
FAM58A: gen del síndrome Star. Se caracteriza por presentar los pacientes
ojos separados, deformaciones anogenitales y renal, sindactilia. Está próximo en el
genoma a BGN, por lo que podrían estar relacionados.
ANÁLISIS DE SECUENCIAS
Ya sean secuencias obtenidas a partir de muestras mandadas directamente a
secuenciar (caso del gen p53) o bien de aquéllas en las que se hayan observado
anomalías en los heterodúplex. En ambos casos hay que analizar la secuencia base por
base, tanto la secuenciada con el oligo forward, como con el reverse (es decir,
dirección 5’3’,y 3’5’). Los oligos se añaden en las muestras antes de mandarlas al
secuenciador. Se ha de realizar una vista preliminar de la secuencia: no tener en
cuenta las primeras bases ni las últimas, descartar el ruido de fondo y localizar zonas
con dos posibles bases o bien con cambios completos. La secuencia se compara con
otra obtenida de una base de datos y correspondiente a la situación normal (no
patogénica) del gen. Se pueden detectar polimorfismos, mutaciones patogénicas,
mutaciones no identificadas todavía…
CONCLUSIONES
El desarrollo de las prácticas ha sido mejor de lo esperado. Además de
aprender el manejo habitual de un laboratorio: materiales, técnicas, precauciones…he
podido tener cierta independencia, lo que me ha acercado aún más al mundo laboral.
Tras aprender las bases del funcionamiento del laboratorio se me asignaron tareas
propias, con toda la responsabilidad que conlleva el análisis de muestras reales de
pacientes. Por lo tanto puede concluir que la valoración de las prácticas ha sido muy
positiva, tanto por lo aprendido durante las mismas como por el trato personal
recibido, en primer lugar, por el tutor, como por los instructores y demás personal.
Finalmente quiero añadir que gracias a estas prácticas me he animado a solicitar una
beca de colaboración, ya que me ha inspirado un gran interés en el mundo de la
investigación como un posible futuro profesional.