APLICACIONES DE LA PCRA TIEMPO REAL CON EL
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APLICACIONES DE LA PCR A TIEMPO REAL CON EL TERMOCICLADOR Mx3005P Y MxPRO DETERMINACIÓN DEL TÍTULO DE VECTORES LENTIVIRALES EXPRESIÓN RELATIVA DE GENES DE INTERÉS POR MIGUEL GARCÍA TOSCANO, PhD CENTRO DE GENÓMICA Y ONCOLOGÍA (GENYO) GRANADA CONCEPTO AMBAS APLICACIONES ESTÁN BASADAS EN LA CAPACIDAD DE CUANTIFICAR QUE PERMITE LA PCR A TIEMPO REAL OBTENCIÓN DE UN VALOR DADO POR EL Ct (threshold cycle) EL VALOR DEL Ct SE DETERMINA EN LA INTERSECCIÓN DE LA LÍNEA UMBRAL CON LA CURVA DE AMPLIFICACIÓN Ct Threshold DETERMINACIÓN DEL TÍTULO DE VECTORES LENTIVIRALES (LV) Los vectores lentivirales son partículas virales basadas en el HIV-1 utilizados para la expresión estable, en células diana, de elementos genéticos de interés, como genes marcadores, genes terapéuticos o pequeños RNA de interferencia. (293T) Integrativos PROCESO EXPERIMENTAL PARA OBTENER EL TÍTULO Sobrenadante células empaquetadoras 1) 100 ul 10 ul 1 ul neg 1x10e5 células 293T por pocillo en placa de 24 pocillos 4-5 días en cultivo 2) Purificación de DNA genómico 3) Cuantificación IMP: En cada tubo de PCR se utiliza para amplificar 0.6 ug de DNA genómico, cantidad de DNA que corresponde al DNA genómico de 10e5 células, cantidad inicial de células transducidas. EL PROCESO EN EL MxPRO PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS La curva estándar se compone de diluciones seriadas de cantidades de plásmido vector conocidas Principio: 1 ug de un plásmido de unas 12.000 bp contiene 2.15 x 1011 moléculas o copias DNA plásmido (copias) 293T genómico DNA RESULTADOS LA CURVA ESTÁNDAR ANÁLISIS RESULTADOS DETERMINACIÓN FINAL DEL TÍTULO Punto de 10 ul de vector → 4,5x10e5 copias EQUIVALEN a 4,5x10e5 unidades de transducción (UT) Título (UT/ml) = 4,5x10e5 UT / 10ul = 4,5x10e7 UT / ml EXPRESIÓN RELATIVA DE GENES DE INTERÉS La PCR a tiempo real permite cuantificar de forma relativa la expresión de nuestro gen de interés en determinadas condiciones Principio: utilizar un gen de referencia cuya expresión es constante durante las condiciones del experimento (gen constitutivo). El proceso consta de dos partes: La expresión del gen de interés será normalizada con la expresión del gen constitutivo. La expresión del gen de interés en las condiciones experimentales será relativizada con la expresión del mismo gen en las condiciones control. PROCESO EXPERIMENTAL Condición control Condición experimental 1 Condición experimental 2 Aislamiento de RNA total Importante 2ug Obtención de DNA complementario Reacción de PCR PROGRAMA DE EXPRESIÓN RELATIVA EN EL MxPRO LA PLANTILLA Condición Sobre-expresión control Expresión bloqueada LA PLANTILLA GEN DE INTERÉS NORMALIZADOR: GAPDH, BETA-ACTINA RESULTADOS Sobre-expresión Condición control Expresión bloqueada CALCULAR LA EXPRESIÓN RELATIVA “MANUALMENTE” PASO 1 Primer diferencial ( Ct) Ct = Ct muestra - Ct normalizador PASO 2 Segundo diferencial ( Ct) Ct = Ct muestra – Ct control PASO 3 2^-( Ct)
