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Memoria de Prácticas en Empresa
Tamara Lechón Gómez
Biotecnología, 3º
Introducción
Este verano, durante los meses de julio y agosto (01/07/10 - 31/08/10) y tras
cursar el tercer curso de la licenciatura de Biotecnología, he realizado las
prácticas en empresa en el Centro de Investigación del Cáncer, gracias al
convenio existente entre el CSIC y la Facultad de Biología de la Universidad
de Salamanca.
La elección de este centro y, en particular, del laboratorio del Dr. Rogelio
González Sarmiento como lugar para la realización de dichas prácticas vino
dada por la lectura de las interesantes líneas de investigación llevadas a
cabo por dicho investigador y por la familiaridad con los objetivos y el
método de trabajo de su grupo de investigación, tras haber cursado varias
asignaturas impartidas por el Dr. González Sarmiento.
En esta memoria se expone brevemente mi experiencia como alumna en
prácticas en este centro.
Entorno de trabajo
El Centro de Investigación del Cáncer (CIC) está situado en el campus
Miguel de Unamuno, en Salamanca. Este centro está formado por diversas
unidades que corresponden bien al propio Instituto de Biología Molecular y
Celular del Cáncer, o bien a unidades que proporcionan a los investigadores
la tecnología necesaria. Este centro tiene carácter de Instituto Universitario
Mixto y, como tal, está patrocinado por diversas entidades, como son la
Universidad de Salamanca
y el Consejo Superior de Investigaciones
Científicas. Está también reconocido como Centro Sanitario por la Consejería
de Sanidad y Educación de la Junta de Castilla y León.
El CIC nació en 1997, en base al modelo de los Comprehensive Cancer
Center de Estados Unidos, con el objetivo de aglutinar a los mejores
investigadores regionales y nacionales en la investigación sobre el cáncer,
con vocación de ser referencia internacional. Podemos resumir los objetivos
de este centro así:
2
1. Realizar investigación puntera en cáncer a nivel básico, clínico y
aplicado.
2. Favorecer el transvase bidireccional de información entre la ciencia
biomédica básica y la aplicada.
3. Constituirse como un centro científico de excelencia capaz de
competir
en
igualdad
de
condiciones
con
otros
centros
internacionales.
4. Fomentar la conexión del CIC con redes telemáticas de investigación
oncológica tanto nacionales como internacionales.
5. Potenciar la creación de valor que revierta en el bienestar social y el
desarrollo económico a nivel regional y nacional.
Debido al aspecto clínico de la investigación del laboratorio 14 del CIC, está
unido con el departamento de Medicina Molecular de la Facultad de
Medicina de la Universidad de Salamanca, ya que ambos están a cargo del
Dr. González Sarmiento. Es en este departamento principalmente donde se
han desarrollado mis prácticas.
Rogelio González Sarmiento
El doctor Rogelio González Sarmiento se licenció y doctoró por la
Universidad de Salamanca en 1979 y 1985 respectivamente. Se especializó
en Hematología y Hemoterapia en 1985. Desde esta fecha hasta que obtuvo
la plaza de profesor titular del área de conocimiento de Medicina en 1989,
gozó de numerosas becas: Becario Fulbright en el Lab. of Medicine and
Pathology, Minneapolis Minnessota, USA desde 1985 a 1987. Becario de
reincorporación en el Departamento de Medicina de la Universidad de
Salamanca 1988-1989. Becario EMBO en el Lab. of Molecular Biology,
Cambridge Univ., UK, en 1990. Profesor Titular del área de conocimiento de
Medicina 1989. Ha trabajado en el estudio de reordenamientos genéticos y
caracterización
de
traslocaciones
cromosómicas
en
neoplasias
hematológicas y, posteriormente en la clonación y caracterización de
nuevos genes implicados en tumorogénesis. Sus líneas de investigación:
3
1. Caracterización molecular de alteraciones del gen Ikaros en
leucemias agudas linfoblásticas B.
2. Desarrollo de modelos animales portadores de anomalías del gen
Ikaros.
3. Clonación y caracterización molecular del gen Aiolos humano.
Estudio de su posible implicación en enfermedades.
4. Estudio de anomalías moleculares en cáncer de mama familiar y
esporádico.
5. Estudio de anomalías moleculares en tumores del SNC.
6. Caracterización de alteraciones moleculares en sarcomas de
partes blandas y en pseudomixoma peritoneal.
7. Estudio del gen PATCHED en basalioma y Síndrome de Gorlin.
8. Estudio de genes modificadores de la susceptibilidad al cáncer.
Actividades realizadas
Mi trabajo en laboratorio estuvo determinado por el miembro del equipo que
el Dr. González Sarmiento designó para tutelarme, si bien es cierto que
guarda relación con el del resto de investigadores del laboratorio. Éste ha
consistido
en
el
aprendizaje
del
diagnóstico
genético
de
distintas
enfermedades hereditarias, incluyendo el cáncer hereditario, y de las
técnicas y actividades más habituales empleadas para ello. En particular,
me he centrado en el gen PATCHED y su implicación en el síndrome de
Gorlin, en los genes TSC1 y TSC2 implicados en esclerosis tuberosa, y en
distintas enfermedades dermatológicas o de disfunción del colágeno, como
son la ictiosis X o la osteogénesis imperfecta. Además, he asistido al
investigador que me tutelaba en el inicio de la investigación por parte de
este equipo de los genes NPHS1 y PKHD. Para ello me he basado en las
siguientes técnicas:
1. Extracción de DNA
2. Amplificación de fragmentos de DNA por PCR
4
3. Análisis de heterodúplex
4. Secuenciación automática
5. Análisis bioinformático de las secuencias
A continuación trato detalladamente estas actividades.
1. EXTRACCIÓN DE DNA
La extracción de DNA es el paso básico en todo estudio genético, sea de
carácter básico, clínico o aplicado. Permite obtener un DNA absolutamente
puro, concentrado y fácil de manipular en subsiguientes técnicas.
Se extrajo DNA genómico a partir de sangre periférica y tejido tumoral. En
sangre periférica, las células nucleadas se aislaron mediante centrifugación
repetida y lisis eritrocitaria con solución hipotónica (centrifugación de la
sangre total en 50mL de ddH 2O durante 30 minutos, 1500 rpm, a 4ºC). Tras
la recuperación de la interfase creada y lisis de los glóbulos rojos con agua
destilada, se lavaron las células mononucleadas en tampón Fornace (0.25M
Sacarosa; 50mM Tris-HCl pH: 7.5; 25mM KCl; 5mM MgCl 2) y se precipitaron
mediante centrifugación a 580g durante 20 minutos. El botón de células
nucleadas de la sangre se resuspendió en tampón Fornace a una
concentración estimada de 5x106 células/mL, tras lo cual se añadió EDTA
(ácido etilendiamino-tetraacético, concentración final 10 mM), SDS (Sodium
Dodecyl Sulfate, concentración final 1%) y Proteinasa K (Boehringer
Mannheim, concentración final 50 µg/mL). La mezcla se incubó a 55 ºC
durante 8-16 horas. Tras la incubación, se procedió a extraer DNA por el
método de extracción con fenol y cloroformo, anteriormente descrito.
Las muestras procedentes de tejido tumoral se homogeneizaron con un
homogeneizador (Polytron System PT 1200 E; Kinematica AG). Entre 0.1 y
0.2 g de tejido se resuspenden en tampón Fornace, EDTA, proteinasa K y
SDS, siguiendo el mismo procedimiento que para la extracción de DNA a
partir de sangre periférica.
5
La muestra de DNA, se almacenó en tubos Eppendorf ® a -20ºC, con el fin de
evitar
tanto
la
degradación
progresiva
del
DNA
como
su
posible
contaminación por microorganismos.
2. AMPLIFICACIÓN DE FRAGMENTOS DE DNA MEDIANTE
PCR
La reacción en cadena de la polimerasa, PCR, es una técnica que permite
replicar in vitro pequeñas cantidades de DNA entre cientos de miles y
millones de veces, en el transcurso de unas pocas horas. Se basa en la
capacidad de la DNA polimerasa de sintetizar una cadena de DNA en
sentido 5’ 3’ a partir de dNTPs, un molde de cadena sencilla y una región
de doble cadena, que se consigue mediante los oligonucleótidos cebadores
o primers.
Las reacciones de amplificación se realizaron con el producto comercial PCR
Master Mix (Promega), y se llevó a cabo en un volumen de 20 µL: 10 µL de
Master Mix; 8 µL de agua libre de nucleasas; 0.5 µL de cada oligonucleótido
cebador (sentido y anti-sentido); y 1 µL de DNA obtenido por el método
anteriormente descrito (concentración, medida por absorbancia, de 0,1-0,2
μg/mL).
Como control, para asegurar que no existía contaminación y que las
reacciones eran específicas para cada muestra de partida, se preparó una
reacción conteniendo todos los reactivos antes citados excepto DNA molde.
Todas
las
reacciones
de
amplificación
se
llevaron
a
cabo
en
un
termociclador automático y la manipulación post-PCR se realizó en un
laboratorio distinto de donde se llevó a cabo la extracción del DNA.
Los programas de amplificación utilizados para las diferentes combinaciones
de oligonucleótidos únicamente varían en la temperatura de anillamiento.
PROGRAMA
95ºC, 5 min. (x1 ciclo)
95ºC, 1min.; 50-55ºC, 30 seg.; 72ºC, 1 min. (x35 ciclos)
72ºC, 10 min. (x1 ciclo)
En las reacciones de PCR en las que no se obtuvieron productos de
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amplificación se añadieron 0.5 μl de dimetil sulfóxido (DMSO), reactivo que
facilita la separación de las dos cadenas de la doble hélice de DNA, debido a
que rompe el apareamiento entre las bases.
3. ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA
Estudia la migración de los fragmentos de DNA, cargados negativamente,
en un gel de agarosa sometido a un campo eléctrico. La agarosa es un
polisacárido cuyas disoluciones poseen la propiedad de mantenerse líquidas
por
encima
de
50ºC
y
formar
un
gel
semisólido
al
enfriarse.
Microscópicamente, el gel es una matriz constituida por una trama
tridimensional de fibras poliméricas embebidas en un medio líquido, que se
opone al paso de las moléculas. El gel es pues el soporte que permite la
migración diferencial por tamaño de los distintos fragmentos de DNA.
Los fragmentos amplificados mediante PCR fueron separados por su tamaño
mediante electroforesis en geles horizontales de agarosa al 2% (Gibco-BRL)
preparados con tampón TBE (Tris 0.044 M, ácido bórico 0.044 M, EDTA 1.0
mM pH=8.3). El primer pocillo del gel se reservó para separar, en paralelo
con las muestras a estudiar, un DNA marcador de tamaño conocido que
corresponde con el DNA del fago ФX-174 cortado con la endonucleasa
HaeIII. La electroforesis se llevó a cabo con una diferencia de potencial
constante de 120 voltios durante 60-90 minutos.
Para monitorizar la migración del DNA en el gel utilizamos dos colorantes
que se incluyeron en el tampón de carga: el xyleno cianol, que migra
aproximadamente con los fragmentos de 5 Kb en un gel de agarosa al 0.8%,
y el azul de bromofenol, que migra aproximadamente con los fragmentos de
0.5 Kb.
Tras la electroforesis, los fragmentos amplificados se visualizaron en el gel
de agarosa utilizando SYBR Safe® (Invitrogen), similar al bromuro de etidio,
aunque menos citotóxico, que actúa intercalándose entre las bases
nitrogenadas del DNA y emitiendo fluorescencia al ser expuesto a la luz UV
(254nm). Los resultados obtenidos fueron almacenados mediante un
sistema de fotografía digital (Kodak DC40) acoplado a un programa
informático de tratamiento de imágenes (Kodak Digital Science 1D).
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4. ANÁLISIS MEDIANTE HETERODÚPLEX
Los fragmentos amplificados fueron sometidos a análisis por heterodúplex
siguiendo la técnica descrita por Orita, con algunas modificaciones (Orita,
1989). El gel fue teñido con nitrato de plata.
El paso inicial del análisis por heterodúplex consiste en desnaturalizar el
producto de PCR a 95º C y volver a renaturalizarlo, para permitir la
formación de heterodúplex (apareamiento entre cadenas que difieren en su
secuencia)
en
el
caso
de
individuos
heterocigotos
(figura
1).
Los
heterodúplex y homodúplex de DNA migran de manera diferencial en geles
de acrilamida, lo que permite la resolución de moléculas que difieren en un
solo par de bases.
Figura 1. Formación de heterodúplex tras la desnaturalización y posterior
renaturalización del producto de PCR en un individuo heterocigoto.
Los geles para electroforesis fueron hechos con MDE
TM
2X (AT Biochem, Inc.
USA), que es un polímero modificado derivado del vinilo. Se utilizaron las
siguientes cantidades para preparar cada gel: agua destilada 7.705 mL,
formamida 99% 5.98 mL, etilenglicol 99% 4.025 mL, TBE 10X 2.415 mL,
MDE
TM
2X 20.125 mL, TEMED (N, N, N, N’ Tetrametilendiamina) 36.8 µL,
AMPS 25% 138 µL. La electroforesis se llevó a cabo a 180 voltios durante
aproximadamente 21 horas (el tiempo varía dependiendo del tamaño del
fragmento de PCR).
Para la tinción de plata se utilizó el kit comercial DNA Silver Staining Kit de
Amershan
Pharmacia,
con
un
volumen
de
250
mL,
siguiendo
las
instrucciones del comerciante.
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Los fragmentos de PCR de un mismo exón de distintos pacientes, con
distintos
patrones
de
migración
en
el
gel
de
acrilamida,
fueron
posteriormente secuenciados.
5. SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA
Para la preparación de las muestras se purificó el fragmento de PCR
mediante el kit comercial “High Pure Product Purification Kit” de Roche. Se
preparó una muestra con el oligonucleótido sentido y otra con el
oligonucleótido antisentido con las siguientes concentraciones: 3 pmol de
oligonucleótido de secuenciación y 40 – 60 ng de producto de PCR, en un
volumen final de 8 µL.
La secuenciación automática se llevó a cabo en un secuenciador ABI 377
(Applied Biosystems) en el Servicio Central de Secuenciación de la
Universidad de Salamanca.
6. AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN DE DNA DE GELES DE
AGAROSA
Aunque normalmente la purificación del producto es un paso trivial,
realizado directamente sobre la muestra sobrante de la monitorización en
geles, en ocasiones aparecen bandas correspondientes a otros productos de
PCR que son imposibles de eliminar incluso al llevar a cabo la PCR en
condiciones
restrictivas.
Esto
puede
dificultar
la
secuenciación
del
fragmento de DNA de interés. En ese caso recurrimos a la purificación de la
banda concreta que deseamos directamente del gel.
Los productos amplificados mediante PCR y separados en geles de agarosa
fueron aislados del gel y purificados mediante el sistema Wizard SV Gel and
PCR Clean-Up System (Promega). Después de fundir la agarosa a 55-60ºC
durante 15 min en tampón de solubilización, se añadió sobre la columna
cromatográfica a la que se une el DNA. Se incubó un minuto a temperatura
ambiente, se centrifugó 1 min a 13000 rpm y se lavó con el tampón de
lavado modificado con etanol, repitiendo estos dos pasos hasta tres veces,
tras lo cual se dejó secar durante 5 min a temperatura ambiente.
Seguidamente, se añadió tampón de elución y, tras una centrifugación de 5
min, se recogió la solución eluída, que contiene el DNA.
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La concentración del DNA se determinó mediante espectrofotometría,
midiendo la absorbancia a 260nm con un espectrofotómetro GeneQuant
(Pharmacia).
7. ANÁLISIS BIOINFORMÁTICOS DE LAS SECUENCIAS
El análisis de las secuencias obtenidas se ha llevado a cabo usando
diferentes programas informáticos. La lectura y tratamiento de las
secuencias automáticas se llevó a cabo con ayuda del programa EditView
ABI Automated DNA Sequence Viewer 1.0 (Perkim Elmer).
El diseño de oligonucleótidos específicos para PCR o secuenciación se llevó
a cabo con el programa Oligo 4.05 Primer Analysis Software (National
Biosciences, Inc.).
La identificación de posibles mutaciones en la secuencia se llevó a cabo
con el algoritmo BLAST facilitado por el NCBI. La posterior distinción de
estas mutaciones como patogénicas se llevó a cabo utilizando bases de
datos especializadas cuando era posible. En caso contrario, se recurrió a la
bibliografía disponible.
Para la actualización bibliográfica y la obtención de las secuencias
genómicas de los genes afectados se utilizó la base de datos PubMed de la
National Library of Medicine y el sistema de bases de datos cruzadas
abiertas Entrez del NCBI.
8. ACTIVIDADES COMPLEMENTARIAS
Semanalmente se realiza una reunión de todos los miembros del equipo
para exponer el progreso llevado a cabo en cada proyecto y los problemas
surgidos durante la investigación, que se resuelven mediante un debate
común. Además, si se inicia un nuevo tema o una nueva línea de
investigación, se procede a explicar qué se estudia y la importancia de este
estudio. Esto permite a todos los investigadores estar al tanto del trabajo
global que se realiza tanto en el laboratorio 14 como en el departamento de
Medicina Molecular.
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Valoración personal
Las prácticas en empresa me parecen un complemento formativo casi
necesario para tomar contacto con el entorno laboral al que nos
enfrentaremos en un futuro próximo. Me han permitido darme cuenta de la
utilidad real de varias asignaturas impartidas en mi carrera que de otro
modo podrían parecer accesorias. Éste ha sido el caso, por ejemplo, de la
Bioinformática, que se ha convertido para cualquier investigador en una
herramienta
básica
para
trabajar
con
las
enormes
cantidades
de
información que genera el trabajo experimental. También han conseguido
dar un nuevo enfoque a la carrera, en cuanto a qué se espera de nuestra
formación y cómo los conocimientos adquiridos en ésta se traducen en un
trabajo útil y tangible. He podido comprobar que los alumnos de esta
facultad
poseemos
conocimientos
relativamente
amplios
de
Biología
Molecular, lo que supone una ventaja en cuanto a la comprensión de las
técnicas y experimentos realizados y, por tanto, se traduce en un mejor
aprovechamiento de la estancia de prácticas. Además, las propias prácticas
han contribuido a reforzar esos conocimientos, de manera que ahora estoy
plenamente familiarizada con las técnicas de manipulación del DNA
detalladas anteriormente. Esto me está facilitando el estudio de las
asignaturas del actual curso académico.
En cuanto al lugar elegido para la realización de las prácticas, he tenido la
suerte de estar en un grupo de trabajo formado por gente con verdadera
vocación por la investigación, que han tenido la paciencia necesaria para
enseñarme cuanto estaba en sus manos y responder a mis preguntas sobre
la variedad de sus actividades en el laboratorio, y que han sabido
transmitirme el valor del trabajo en equipo y el entusiasmo por la
investigación, por ardua que pueda ser en ocasiones.
En definitiva, me ha parecido una experiencia muy positiva y muy
recomendable para todos los compañeros de titulación.
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