universidad veracruzana facultad de biología
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UNIVERSIDAD VERACRUZANA FACULTAD DE BIOLOGÍA Determinación de cepas bacterianas enteropatógenas en los principales manantiales del municipio de Banderilla, Veracruz TESIS TRABAJO DE EXPERIENCIA RECEPCIONAL QUE PRESENTA: MAGDIEL ALEJANDRA RAMÍREZ BARRAGÁN DIRECTOR: Biol. S. Augusto Hernández Rivera XALAPA, VER. 2009 CONTENIDO RESUMEN I.- INTRODUCCIÓN Y ANTECEDENTES….…………………………….…………. 4 1.1.- La contaminación………………………………………….…………………4 1.2.- El problema de la contaminación en los cuerpos de agua ...………………...5 1.3.- Contaminación bacteriana en el agua subterránea…………..………...….…6 1.4.- Microorganismos patógenos: Indicadores de contaminación …….……….. 9 1.5.- Bacterias de importancia clínica en el agua de consumo …………………. 11 II.- OBJETIVOS………………………………………………………………………. 14 III.- MATERIALES Y MÉTODOS…………………………………..………………. 15 3.1.- Área de estudio...…………………………………………...….................. 15 3.2.- Determinación de los manantiales muestreados...…………………........... 18 3.3.- Material biológico....……………………….………………………......…. 19 3.4.- Determinación de coliformes totales y fecales…………..…….................. 20 3.5.- Obtención, aislamiento y purificación de bacterias………………....…..... 21 3.6.- Determinación de géneros bacterianos……………………………........… 21 3.7.- Pruebas diferenciales para la familia Enterobacteriaceae....…………….... 22 3.8.- Pruebas diferenciales para el género Vibrio spp. ………………………… 24 3.9.- Pruebas diferenciales para el género Pseudomona spp………………..… 25 IV.- RESULTADOS…………………………………………………………….…..… 26 4.1.- Palenquillo………………………………………………………….…...... 26 4.2.- Ocotita……………………………………………………………..……... 28 4.3.- Álamos 1……………………………………………………..………….... 30 4.4.- La fragua…………………………….………………………………........ 32 4.5.- La mistela…………………………………………………………….…... 34 4.6.- Poza verde……………………………………………………………..…. 36 4.7.- Boquerón 2…………………………………………………….…….….... 38 V.- DISCUSIÓN ………………………………………………..……………….…..... 43 VI.- CONCLUSIONES ……………………………….……………………………… 47 VII.- ANEXOS.…… ……….……………………………………………..………….. 48 VIII.- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS………….……..……………………….. 52 RESUMEN La contaminación del agua se ha vuelto un problema a nivel mundial, ya que en las últimas décadas se ha observado el incremento de contaminantes en los mares, río, lagos y acuíferos. El presente trabajo tuvo como objetivos evaluar la calidad bacteriológica, aislar y obtener cepas bacterianas, así como la determinación de bacterias patógenas en loas principales manantiales del municipio de Banderilla, Veracruz. El trabajo se realizó en los meses de Enero, Marzo, Abril, Mayo y Junio del año 2008. Se analizaron 34 muestras de agua de los principales manantiales del municipio de Banderilla, Veracruz. De estas muestras se aislaron los géneros pertenecientes a la familia de las Enterobacteriaceae, entre los que destacan Salmonella spp., Escherichia spp., Enterobacter spp., Citrobacter spp. y Serratia spp., así como el género Pseudomona spp. También se encontraron Klebsiella spp., Proteus spp., Providencia spp., Aeromona spp. y Vibrio spp. En conclusión, se encontraron coliformes totales y fecales en la mayoría de los manantiales así como géneros bacterianos patógenos, por lo cual la calidad del agua se considera deficiente. El manantial La fragua se encontró libre de coliformes, sin embargo, se logró aislar el género Pseudomona spp., conocido como patógenos oportunistas, el cual puede causar un efecto dañino en las personas que llegasen a ingerirlas por medio del agua. I.- Introducción y Antecedentes El agua es un líquido imprescindible para la vida, además de ser ampliamente utilizada en actividades diarias, se encuentra distribuida en la tierra de manera dulce y salada, esta última ocupando más del 97% del total y distribuida en los mares y océanos, el 3% restante es agua dulce, pero casi toda esta congelada en los polos y en los glaciares. El agua congelada representa el 69.7% del agua dulce, el agua subterránea representa el 30% y en los ríos y en los lagos solamente encontramos el 0. 3% de agua dulce (Guerrero, 1991). México posee una gran riqueza de agua superficial, ya que cuenta con 39 ríos importantes cuyas cuencas ocupan el 58% de la extensión territorial continental por los que escurre el 87% del agua, así como pequeños ríos y lagos importantes (CONAGUA, 2007). Independientemente de la importancia que representa mantener este líquido, lo relevante es conservar su calidad natural para poder garantizar su aprovechamiento; sin embargo, los niveles de contaminación en los cuerpos de agua se han incrementado considerablemente, esto en gran medida al aumento de la población (Arcos et al., 2005), a la sobreexplotación del recurso, la contaminación por desechos industriales, así como el uso de agroquímicos en la agricultura (Bruzzone, 2004). 1.1.- La contaminación Actualmente el problema de la contaminación es uno de los principales temas de atención y discusión, sin embargo, esta se presenta en mayor magnitud en las grandes ciudades, debido a que las concentraciones poblacionales hacen que los desechos que generan las actividades sociales y productivas se manifiesten con mayor incidencia y peligrosidad en el medio ambiente (Rivera et al., 2006). La contaminación, en términos generales, es la introducción de un contaminante en el medio, puede ser un agente físico, químico o biológico en lugares, formas y concentraciones que pueden ser perjudiciales para la salud o reducen la capacidad de las áreas afectadas para mantener la vida. Si bien es cierto que el suelo y el aire presentan niveles de contaminación; el agua, ya sea esta en corrientes subterráneas o a cielo abierto en nacimientos y ríos, por estar sometida de manera constante a la acción de las actividades antropogénicas y disminuyendo de manera significativa su calidad, cobra mayor importancia (Fernández y Fernández, 2007). La contaminación del agua puede observarse desde dos puntos de vista: la contaminación antropogénica y contaminación natural. La contaminación antropogénica puede ser dividida en tres tipos: bacteriológica, inorgánica, y orgánica. La contaminación natural esta relacionada principalmente con áreas donde se encuentran elementos o compuestos naturales que son tóxicos como el plomo o arsénico (Marín, 2004). 1.2.- El problema de la contaminación en los cuerpos de agua El agua, es un medio que puede convertirse en un vehículo para la adquisición de diversas enfermedades (Sánchez et al., 2000). El peligro más común y difundido, relacionado con el agua de consumo humano, es el de su contaminación microbiana, si esta contaminación es reciente y se hallan microorganismos patógenos, es posible que dichos microorganismos se encuentren vivos y con capacidad de producir enfermedades (Martínez y García, 2002). Las aguas superficiales son las que están más expuestas a una amplia gama de factores que pueden alterar su calidad y tener diferentes niveles de intensidad (Aurazo, 2004). Sin embargo, este tipo de aguas pueden “limpiarse” por medio de procesos de depuración, pero no así el agua subterránea, la cual tiene el problema de que su movimiento natural es lento, su tiempo de renovación es corto y por lo tanto tiene mayor tiempo de residencia, por lo que el contaminante no desaparece tan fácilmente (Perdomo, 2001). El agua subterránea se encuentra debajo del suelo, donde pasan por filtración lluvia, nieve derretida, arroyos u otra fuente de agua superficial, que funcionan como la recarga de estos acuíferos, posee de manera natural cierta calidad, ya que filtra, diluye, transforma o destruye contaminantes naturales y humanos en el subsuelo (McQuillan et al., 2000) por lo que su uso principal es la de consumo. El origen de la contaminación del agua subterránea es muy variado, siendo el más importante el vertido de desechos urbanos (Martínez y García, 2002), como ejemplo la presencia de los microorganismos que llegan a los cursos de agua a través de esta vía y en menor nivel de drenajes de lluvias, desechos de industrias alimentarias y corrales ganaderos (Aurazo, 2004). De acuerdo a la Organización Mundial de la Salud (OMS) “el agua debe ser adecuada para el consumo humano y para todo uso doméstico habitual, en el caso de microorganismos patógenos y oportunistas no deben estar presentes en el agua potable destinada al consumo, preparación de alimentos, bebidas e higiene personal” (Soto et al., 2006). 1.3.- Contaminación bacteriana en el agua subterránea El problema de la contaminación del agua no solo se circunscribe a los países en vías de desarrollo si no a nivel mundial. El continente Europeo se encuentra en un estado grave, ya que de sus 55 ríos, solo 5 no están contaminados y en cuanto a aguas subterráneas, el estudio realizado por Powell et al. (2003) en el Reino Unido, muestra que la calidad de las aguas subterráneas depende de la profundidad de los pozos de donde se adquiere esta agua, ya que existe vulnerabilidad de los mismos por fisuras o ranuras presentes en las profundidades y debido a la corriente tan lenta que presentan estos cuerpos de agua, no logran “limpiarse” de manera natural por lo que la parte más profunda resulta ser la más afectada, llegando a esta conclusión al observarse coliformes fecales. En España, Vendrell et al. (1998) realizaron estudios en aguas termales, que además de su uso terapéutico, son utilizados para procesos relacionados con los alimentos; determinando que existía contaminación en el agua por la presencia de coliformes totales y fecales, probablemente ocasionada por infiltraciones de las aguas de desecho de los habitantes que están a los alrededores, mezclándose con el agua de las fuentes, así también, aislaron especies como Sthaphyloccocus aureus, Enteroccocus y Pseudomona aureginosa, que de acuerdo a la ley en ese país, el agua de consumo no debe de contener ninguno de los microorganismos antes mencionados. En cuanto a Asia, los ríos de la India están totalmente contaminados al igual que el río Amarillo y las aguas subterráneas de China. En Australia la sobreexplotación de los ríos y de las reservas de agua subterránea están concentrando grandes cantidades de sal en la superficie, África, a pesar de poseer 2 enormes acuíferos esta en estado crítico, todos sus ríos y lagos están contaminados por la sobreexplotación humana. En el continente americano la situación es similar, millones de personas dependen del agua subterránea. Estudios realizados en acuíferos de Canadá, mostraron que existe susceptibilidad de estos cuerpos de agua debido al tipo de tierra y rocas que los conforman, ya que dependiendo de estas, será la facilidad con la que logre penetrar algún contaminante al agua (Conboy y Goss, 2000), lo cual es preocupante, ya que más de un cuarto de canadienses se abastecen de agua subterránea para uso doméstico y en algunas regiones, el agua se usa con mayor rapidez que con la que se recargan los acuíferos. E.U.A. tiene el 40% de sus ríos y lagos contaminados y en diversas partes del país el agua subterránea es la única fuente disponible de agua potable, como es el caso de Nuevo México, donde sus habitantes dependen únicamente de agua subterránea para todas sus necesidades (McQuillan et al., 2000). En América central y del sur abundan ríos y acuíferos, sin embargo, los proyectos hídricos se encuentran en manos de inversionistas que no cubren el total de los acuíferos existentes (Bruzzone, 2004). Existen estudios, como el realizado por Valiente y Mora (2002) en Costa rica basado en un brote de enfermedades diarreicas que afectaron a una parte del país, en el cual, se evaluó el papel que tuvo el agua como vía de transmisión de los potenciales agentes causantes, los resultados mostraron que parte de la responsabilidad del brote había sido el agua de consumo. En Uruguay, Perdomo et al. (2001) realizaron análisis para determinar la calidad de las aguas subterráneas, esto debido a la cercanía de los pozos a las fosas sépticas de la zona y el mayor consumo de agua de los mismos, mostrando así, el grado de contaminación en el que se encuentra el cuerpo de agua al hallar coliformes fecales y nitritos. México también enfrenta diversos problemas de abastecimiento de este recurso debido a que las soluciones para el tratamiento de los residuos sólidos y líquidos no son las adecuadas (Rivera et al., 2006), ocasionando la escasez y contaminación de los cuerpos de agua. A finales del año 2001, más del 70% de los cuerpos de agua superficiales y subterráneas del país presentaban indicios de contaminación (Carabias y Landa, 2005). Existen alrededor de 653 cuerpos de agua subterránea o acuíferos, de los cuales 104 están sometidos a sobreexplotación (INEGI, 2008), sin embargo, el mayor problema de contaminación que presenta México es la bacteriológica, ya que va asociado a la falta de tratamiento de las aguas residuales. Ejemplo de ello es la Península de Yucatán, la que hasta hace algunos años, más del 60% de las muertes de niños menores a cinco años, era causada por patógenos transportados por el agua subterránea. En un estudio realizado por Pacheco et al. (2000) a un acuífero kárstico de Yucatán, que funciona como única fuente de abastecimiento de agua y receptor de las aguas de desecho, se determino la presencia de coliformes totales y fecales así como de diferentes géneros bacterianos pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae, entre los que destacan Klebsiella, Enterobacter, Salmonella, Shigella, Serratia y Escherichia, presentándose con mayor frecuencia los géneros Escherichia, Serratia y Enterobacter, los cuales son responsables de algunos cuadros clínicos de gastroenteritis. Debido al uso y consumo de esta agua sin ningún tratamiento los habitantes han presentado problemas de salud. En Chiapas, a pesar de la cantidad de recursos hidrológicos con los que cuenta el estado, se sufre de la disponibilidad de agua de óptima calidad; en cuanto a enfermedades infecciosas y parasitarias, es uno de los estados con mayor incidencia en el país, causando mortalidad y estando asociadas algunas al consumo de agua (Sánchez et al., 2000). Por otra parte, análisis realizados por Isaac et al. (1994) en la ciudad de Campeche, se enfocaron en conocer la calidad de las fuentes de abastecimiento de agua, obteniendo que más del 50% de los suministros de agua de la ciudad de Campeche, presentan niveles de organismos coliformes no permisibles en aguas para consumo humano, demostrando la deficiente calidad de los suministros y su entorno, poniendo en riesgo la salud de la población. De manera similar, Mazari et al. (1997) realizaron estudios en la ciudad de México enfocados a determinar la calidad del agua de consumo en 5 pozos que se encuentran en la zona metropolitana de la ciudad, mostrando contaminación por la presencia de coliformes fecales y totales en la mayoría de los pozos. En la parte norte del país, también se han efectuado estudios para observar la calidad del agua de consumo, por ejemplo, en el estado de Sonora, Solís et al. (2005) realizaron una evaluación de la calidad del agua subterránea en los pozos de abastecimiento de agua de consumo en dos épocas del año en diferentes poblados, detectando coliformes fecales y totales en concentraciones no aptas para su consumo de acuerdo a la NOM-127-SSA1-1994. En Sinaloa, específicamente Culiacán y Navolato, Soto et al. (2006) determinaron la presencia de coliformes totales y fecales, logrando aislar también patógenos oportunistas como Pseudomona aeruginosa y Aeromona que tienden a pasar desapercibidos debido a que su presencia no se detecta por los métodos comúnmente usados para la determinación de la calidad del agua, por lo que el agua no es apta para su consumo. El estado de Veracruz se caracteriza por disponer de una gran cantidad de recursos hídricos, en comparación con otras entidades del país. La precipitación media anual representa casi el doble de la media nacional y por sus cauces fluye un tercio del escurrimiento total del país. En cuanto a los mantos acuíferos, Veracruz también dispone, aunque no en la misma forma ni en toda su extensión, de abundantes recursos subterráneos, en condiciones óptimas para su aprovechamiento, aun cuando algunos acuíferos costeros presentan intrusión salina. La abundancia de recursos hídricos en el estado ha propiciado la dispersión de la población, ya que prácticamente en cualquier zona en la que se establece una comunidad, tiene en su entorno una fuente que le proporciona el volumen requerido para cubrir sus necesidades mínimas; sin embargo, en gran medida esta disponibilidad es relativa, ya que la mayoría de las veces, las fuentes responden a periodos estacionales, lo que reduce sus gastos considerablemente durante el estiaje. Aunado al crecimiento de las propias comunidades y junto con la modificación de sus patrones de aprovechamiento, incrementaron el volumen requerido. Por otra parte, en algunos casos los procesos contaminantes en zonas aguas arriba de las comunidades, han afectado la calidad del agua que tradicionalmente utilizaban. Los estudios existentes en materia de calidad del agua de los principales ríos del estado, revelan que en los 14 ríos más importantes se registran niveles importantes de contaminación, en cuanto a los acuíferos, se realizan mediciones del nivel del agua subterránea con cierta periodicidad, sin embargo, la actualización de los estudios de éstas no se realiza con frecuencia, al igual que los censos de aprovechamiento (CSVA, 2005). El municipio de Banderilla posee una gran diversidad de manantiales que proveen de agua en tiempo de escasez o falta total del servicio de agua potable para consumo humano y los diversos usos para los que es destinada, por ello es indispensable mantenerlos en buenas condiciones (Landa, 2006). Estudios previos realizados a los manantiales mostraron concentraciones mínimas o nulas de coliformes totales y fecales, pero no así de bacterias patógenas, las cuales representan un serio riesgo para la salud pública y es prioritario eliminarlas del agua de consumo humano, debido a que su ingestión podría traer consecuencias para la salud de la población . 1.4.- Microorganismos patógenos: indicadores de contaminación. Los microorganismos en general, son encontrados en agua, suelo y aire. La cantidad de ellos va a depender de ciertos factores, como lo son la temperatura, la humedad y los nutrientes (Marchand, 2002). Determinar el tipo de microorganismos presentes en el agua y su concentración, proporciona herramientas indispensables para conocer la calidad de la misma y para la toma de decisiones en cuanto su conservación y uso, evitando así el riesgo de contaminación de las personas y el ambiente (Arcos et al., 2005). La gran variedad de microorganismos patógenos que pueden encontrarse en una muestra de agua, así como la complejidad de la mayor parte de las técnicas de enriquecimiento para el aislamiento e identificación, hacen inviable el control rutinario de todos estos microorganismos (Soto et al., 2006), por lo que la presencia de organismos coliformes es determinante como grupo indicador de contaminación fecal en el agua, lo que se fundamenta en el hecho de encontrarse presentes en el intestino y en las heces de los seres humanos y en los animales de sangre caliente, en mayor número que las bacterias patógenas (Isaac et al., 1994). De acuerdo a la Norma Oficial Mexicana NOM-112-SSA1-1994, los organismos coliformes son aquellos capaces de crecer aeróbicamente a 35 ± 1°C ó a 37 ± 1°C en un medio de cultivo líquido lactosado con producción de ácido y gas dentro de un período de 48 h, mientras que los coliformes fecales (termotolerantes) son organismos que tienen las mismas propiedades fermentativas como los ya mencionados, pero crecen a 44 ±0.5°C. La presencia de indicadores de contaminación usualmente va acompañada de patógenos, como las bacterias (Schaffer y Parriaux, 2002). Las bacterias patógenas se definen como aquellas que tienen la capacidad para producir daño a la salud del huésped y de la resistencia o susceptibilidad del mismo (Brock, 1978). Las bacterias patógenas de transmisión hídrica provienen de seres humanos y de animales de sangre caliente (animales domésticos, ganado y animales silvestres), estos microorganismos, llegan a los cursos de agua a través de descargas de aguas residuales, drenaje de lluvias, etc. Sin embargo, no todas las bacterias patógenas que se transmiten por el agua tienen el mismo impacto en la salud, ya que la presencia de algunas representa un serio riesgo y su eliminación del agua de consumo humano es de alta prioridad y otras se presentan en forma natural en las aguas y normalmente no son patógenas, pero pueden afectar a personas con un sistema inmune débil, ancianos y niños, por lo que a estas bacterias se les denomina bacterias patógenas oportunistas (Aurazo, 2004). 1.5.- Bacterias de importancia clínica en el agua de consumo Estudios realizados, evidencian la importancia de bacterias de interés clínico, destacando las pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae, como Escherichia coli (Thorn y Coxon, 1992 y Close y Dann, 2005), Shigella spp. y Salmonella spp. (Bitton et al., 1984 y Pac Sa et al., 1998) así como Vibrio spp. perteneciente a la familia Vibrionaceae (García et al., 2006 y Paris, 2005) y algunas del grupo de las no fermentadoras, como es el caso de Pseudomona spp. (Vendrell et al., 1998, Soto et al., 2006 y Marchand, 2002). Con la finalidad de tener un conocimiento más detallado sobre estos géneros, mencionaremos a continuación algunos aspectos relevantes sobre estos organismos. Los organismos de la familia Enterobacteriaceae son bacilos gram negativos que con frecuencia residen en el colon del hombre sin causar daño a la salud y también se encuentran en la naturaleza, pero debido a esta ubicuidad dentro y fuera del cuerpo a menudo causan infecciones oportunistas en personas debilitadas. Como grupo, la familia Enterobacteriaceae es responsable de una tercera parte de los aislamientos en las bacteriemias, de dos tercios de los aislados en gastroenteritis y de tres cuartas partes de los aislamientos en infecciones del tracto urinario. Escherichia coli es una bacteria que coloniza de manera natural el tracto digestivo de los animales y del hombre. Produce infección en personas sanas, siendo la puerta de entrada más común la vía urinaria ocasionando la mayoría de las bacteriemias e incluso otros síntomas clínicos. En los últimos años, E. coli ha sido considerada como la causa más frecuente de la diarrea del viajero (gastroenteritis bacteriana) asociada con los viajes a países de riesgo. Las infecciones entéricas causadas por E. coli pueden ser debidas a 5 variedades distintas que actúan por mecanismos diferentes (Almirante, 2002, Aguado y Lumbreras, 1998). Las especies del género Shigella son bacilos gram negativos inmóviles y no fermentan lactosa; causantes de la shigelosis, la cual es la diarrea bacteriana conocida como disentería bacilar. Esta es la gastroenteritis con mayor riesgo de contagio, ya que se ha demostrado que menos de 200 bacterias viables pueden producir enfermedad en adultos sanos. La shigelosis es una infección de distribución universal, que afecta principalmente a niños de edad inferior a 10 años. Algo distintivo de este género, es que el hombre es el único reservorio. La mayoría de los casos de shigelosis se producen por transmisión de persona a persona a través de la vía fecal-oral. Pueden observarse brotes epidémicos si se produce contaminación de alimentos o agua con heces de enfermos, teniendo en cuenta que estas bacterias pueden sobrevivir durante meses (Almirante, 2002). El género Salmonella pertenece a la familia de las enterobacterias al igual que el género Shigella, pero a diferencia de este ultimo, los reservorios de Salmonella son principalmente los animales y en menor medida, el ser humano (Pac Sa et al., 1998). Es una bacteria no muy resistente ante las condiciones adversas del ambiente (pH, temperatura, luz, etc.), sin embargo, le resulta fácil adaptarse a los animales y seres humanos colonizando así el intestino, iniciando la infección con una serie de síntomas indicativos. Tanto las personas enfermas, como los animales y personas no enfermas pero que tienen salmonela en su intestino son sus portadoras por un periodo que puede abarcar desde unos pocos meses hasta años. Es decir, la materia fecal de individuos enfermos, e incluso de los portadores, contiene una elevada concentración de este patógeno (Rodríguez, 2006). Dentro de la familia Vibrionaceae se encuentra el género Vibrio, el cual se encuentra constituido por bacilos gram negativo, algunos móviles y unos cuantos inmóviles, tolerantes a la sal y anaerobios facultativos. Es el principal agente patógeno conocido que se transmite por el agua, basta recordar la pandemia más reciente que se esparció por todos los países latinoamericanos ocasionada por esta bacteria en su entrada por Perú en 1991, con más de 1.3 millones de casos y 12 000 muertes (Valiente y Mora, 2002). Las especies que se asocian a diarrea son el Vibrio parahaemolyticus, V. cholerae, V. mimicus, V. hollisae, V. fluviales y V. fruncí. Por su parte, el V. vulnificus causa septicemia e infección de heridas en pacientes inmunodeprimidos (Paris, 2005). También existen bacterias consideradas patógenas oportunistas, por ejemplo el género Pseudomona, el cual se presenta de forma natural en las aguas y el suelo. El género es perteneciente a la familia de las Pseudomonadaceae y se encuentra formado por bacilos gram negativos (Soto et al., 2006), presentan flagelos para su locomoción que pueden producir un pigmento fluorescente, son oxidasa positivo, utilizan la glucosa oxidativamente y no forman gas. Pueden ocasionar enfermedades a individuos cuya salud es precaria o inmunodeprimidos, así como ancianos, niños y pacientes que están recibiendo terapias que disminuyen las defensas. Estas bacterias pueden producir una variedad de infecciones que ingresan por la piel, las membranas mucosas de los ojos, oídos y la nariz, por vía oral e inhalación y tienen resistencia entre leve y moderada al cloro (Aurazo., 2004). Algunas de las especies más importantes son: P. aeruginosa, P. fluorescens, P. putida, P. maltophila y P stutzeri (Arcos et al., 2005, Marchand, 2002). Lo antes mencionado, permite tener un panorama amplio de la importancia que resguarda el cuidado del medio ambiente y que asegure la no contaminación de las fuentes de abastecimiento del agua, ya que al verse alterada la calidad de la misma, el impacto que suele tener en la salud de las poblaciones que las consumen puede verse afectada de manera considerable. Por ello, con el fin de evitar algún daño posterior a la población, es importante la determinación de cepas bacterianas patógenas presentes en los principales manantiales del municipio de Banderilla, ya que una única exposición a un agente patógeno puede bastar para provocar una enfermedad. ll.- OBJETIVOS: General: Caracterización de cepas bacterianas patógenas presentes en los manantiales del municipio de Banderilla, Veracruz. Particulares: Determinar conforme al número de microorganismos presentes, la calidad bacteriológica del agua para consumo humano. Obtener y aislar cepas bacterianas presentes en las aguas de los manantiales. Realizar pruebas químicas y bioquímicas a las cepas bacterianas aisladas. Determinar el género de las cepas aisladas lll.- MATERIALES Y MÉTODOS 3.1.- Área de estudio El municipio de Banderilla se localiza en la zona centro del Estado de Veracruz, en las coordenadas 19° 35’ latitud norte y 95° 56’ longitud oeste, a una altura de 1600 metros sobre el nivel del mar. Limita al norte y noreste con Jilotepec, al este y sur con Xalapa, al suroeste y oeste con Rafael Lucio. Tiene una superficie de 22.21 km2, cifra que representa un 0.03 % del total del Estado (Fig 1). Fig.1.- Mapa de Veracruz donde se observa la ubicación del municipio de Banderilla (INEGI, 2008). Orografía El Municipio se encuentra ubicado en la zona central del Estado en el eje neovolcánico, en las estribaciones últimas del Cofre de Perote, por lo que su topografía es irregular, pero sin accidentes de importancia. El cerro de mayor consideración es el de La Martinica. Hidrografía Al municipio lo riegan pequeños ríos tributarios del río Sedeño, que a su vez es tributario del río Actopan. Clima Su clima es frío-húmedo con una temperatura promedio de 18 °C; su precipitación pluvial media anual es de 1 500 mm. Principales Ecosistemas Los ecosistemas que coexisten en el municipio son el de bosque mesófilo, un ejemplo es el área protegida la Martiníca, en el cual se puede observar flora y fauna nativa del lugar, en donde las trepadoras leñosas son abundantes y las especies características del estrato arbóreo son: Carpinus caroliniana (pipinque), Clethra mexicana (marangola), Liquidambar styraciflua (liquidámbar), Calocedrus decurrens (cedro blanco), Manilkara zapota (zapotillo) y Ulmus minor (olmo), así como helechos arborescentes del género Cyathea en peligro de extinción. Esta área es la única del país en la que se pueden observar más de 140 especies de helechos. La fauna esta compuesta por poblaciones de Meles meles (tejon), Didelphis virginiana (Tlacuache), Mephitis mephitis (zorrillo), Oryctolagus cuniculus (conejo), Dasypus novemcinctus (armadillo) y Eutamias sibiricus (ardilla). Recursos Naturales Su riqueza esta representada por minerales como el gilsonita, cales y bauxita. Características y Uso del Suelo Su suelo es de tipo coluviosol e in-situ derivado de roca volcánica y con poca suceptibilidad a la erosión. Sus principales actividades son la agricultura y la ganadería (INDM, 2005). 3.2.- Determinación de los manantiales muestreados: Se efectuó un reconocimiento preliminar en la zona con la finalidad de tener la ubicación exacta de cada manantial (Fig. 2). De los 22 manantiales existentes en el municipio, se eligieron 7, ya que se observó que eran representativos de la ciudad por el fácil acceso a sus tomas y por lo tanto, más usados (Tabla 1) (Cruz et al., 2006). El boquerón 2 Ocotita La mistela Álamos 1 Poza Verde La fragua Palenquillo Fig. 2.- Localización de los manantiales en el municipio de Banderilla, Veracruz (INEGI, 2008). Tabla 1. Ubicación de los manantiales en el municipio de Banderilla. Punto Nombre del manantial Ubicación 1M Palenquillo Privada Fidel Cruz 2M Ocotita Prolongación 20 de Mayo 3M Álamos 1 Prol. Palenque Esq. Priv. Vicente Guerrero 4M La fragua Benito Juárez No. 79 5M La mistela Calle Agua Azul 6M Poza verde Calle Palenque 7M Boquerón 2 Km. 1 Carretera a Jilotepec. 3.3.- Material biológico: Se obtuvieron 34 muestras de agua en total, tomadas de los principales manantiales de Banderilla, que comprenden los meses de Enero, Marzo, Abril, Mayo y Junio. Las muestras de agua de los manantiales se tomaron dejando fluir el agua de 2- 5 minutos de manera que se limpiara la línea de conducción, un recipiente estéril (vaso copropack) se colocó debajo de la llave hasta que se llenara parcialmente, de tal manera que se pudiera mezclar (Mazari et al., 1997). Se evitó escurrir o salpicar el recipiente. Las muestras fueron registradas para su identificación con los siguientes datos: Nombre del manantial, fecha y hora del muestreo (Cruz et al., 2006). También se registraron los valores de 3 parámetros fisicoquímicos in situ con el Check mate 90 : pH, temperatura y oxigeno disuelto. Las muestras fueron transportadas en un recipiente limpio donde se mantuvieron a una temperatura de 4°C aproximadamente (Solís et al., 2005) hasta llegar al laboratorio del Instituto de Investigaciones Biológicas en el área de Microbiología para su posterior análisis. 3.4.- Determinación de Coliformes totales y Fecales Para realizar la determinación se procedió de acuerdo a la NOM- 112- SSA1- 1994. [Bienes y servicios. Determinación de bacterias coliformes. Técnica del Número Más Probable (NMP)]. El método se basa en que las bacterias coliformes, fermentan la lactosa incubadas a 35 ± 1°C durante 24 a 48 horas, resultando una producción de ácidos y gas el cual se manifiesta en las campanas de fermentación. Para ello se observan dos pruebas, la presuntiva y la confirmativa, las cuales se realizan con caldos enriquecidos en donde se observara el crecimiento de las bacterias coliformes si están presentes. Pruebas para la determinación de coliformes totales Prueba presuntiva.- Esta se realizó con caldo lactosado y se distribuyeron en tubos de 16 x 160 mm. Se colocaron dentro de los mismos, unos tubos que sirvieron como indicadores para observar la formación de gas, posteriormente se esterilizaron en autoclave a 121°C durante 15 minutos. Inoculación.- Se agitó la muestra de tal manera que se homogenizara y se transfirieron volúmenes de 1ml a la serie de tres tubos con su duplicado, 0.1 ml y 0.01 ml de muestra a otras series de tubos que contenían caldo lactosado también con su replica. Se incubaron los tubos a 35 °C y se observaron a las 24 ± 2 h para ver la formación de gas, aquellos que no la presentaron se incubaron por otras 24 ± 2 h. Prueba confirmativa.- De cada tubo de la prueba presuntiva que mostró formación de gas, se agitó y se tomaron 3 asadas para inocular en tubos que contenían caldo lactosa bilis verde brillante , también conteniendo tubos como indicadores para la formación de gas. Se incubaron a 35 por 24 ± 2 horas y posteriormente se observó la presencia de gas o turbidez y los que no presentaron, se incubaron por 24 ± 2 horas más. Para determinar coliformes fecales (termotolerantes) Para confirmar la presencia de organismos coliformes termotolerantes, se incubaron otros tubos de caldo lactosa bilis verde brillante, pero a 44°C durante 24 hr. Se observó si había producción de gas. 3.5.- Obtención, aislamiento y purificación de bacterias El método utilizado para la obtención, aislamiento y purificación de las cepas encontradas, fue el señalado en el manual de Bergey´s (Hendricks y Holt, 1994) y el de Cowan (Cowan y Steel, 1993). Se agregó 1 ml. aproximadamente de muestra a cajas petri que contenían agar de soya y tripticaseína (TSA) y con un asa estéril se esparció por toda la caja, y se incubaron a 30°C por 24 hr. Una vez crecidas las colonias, se realizó la siembra individual en agar EMB aislando las colonias que presentaran color y formas diferentes, posteriormente se metieron a incubación. Se realizaron las siembras necesarias para lograr la purificación de las bacterias. Una vez purificadas las colonias bacterianas, se sembraron por estría en tubos inclinados con agar TSA para la conservación de las colonias (cepario) y su posterior uso. 3.6.- Determinación de géneros bacterianos. A las cepas bacterianas purificadas, se les realizaron 6 pruebas químicas y bioquímicas básicas de acuerdo al manual de Bergey´s (Hendricks y Holt, 1994), las cuales nos indicaron a que grupo podrían pertenecer. Las pruebas fueron: Tinción gram: Con la cual se observó a que grupo gram pertenecen, gram positivas o negativas. La prueba también mostró la forma que presentaban las bacterias, ya sean bacilos o cocos. Movilidad.- Se realizó en el medio MIO, en el cual se observa la movilidad por la turbidez o forma de “abanico” que presenta la punción realizada al medio con la cepa en estudio. Catalasa.- En un portaobjetos se colocó la cepa y se agregó 1 gota de una solución de peróxido de hidrógeno (H202) al 3%. La presencia de burbujas (efervescencia) confirma la positividad de la reacción. Oxidasa.- En papel filtro se colocó una porción de cultivo puro y se le agregó 1 gota del reactivo de oxidasa (Kovacs). La prueba se tomó como positiva al aparecer un color negro o morado, si no se presentaba el color, la prueba era negativa. Producción de acidez.- Se realizó con diferentes tipos de azúcares en diferentes tubos con agar inclinado. El cambio de color del medio a amarillo indica un resultado positivo a esa prueba. Oxidación - Fermentación (Prueba de Hugh- Leifson).- Esta prueba ayuda a la determinación de microorganismos que degradan los azúcares por la vía fermentativa u oxidativa. Se sembraron 2 tubos con la cepa a identificar, cada uno con su replica, uno se cubría con aceite mineral, mientras el otro no. La bacteria que creció en el tubo cubierto con aceite mineral mostró que el carbohidrato era degradado por la vía fermentativa, sin embargo, el microorganismo que creció en el tubo que no se encontraba cubierto con aceite mineral mostró que degradaba el carbohidrato por la vía oxidativa. De acuerdo al libro de pruebas bioquímicas de MacFaddin et al. (2003) y el libro de diagnóstico microbiológico clínico de Koneman et al. (1998), se realizaron las pruebas diferenciales para la determinación de los géneros de la familia Enterobacteriaceae y posteriormente se realizaron pruebas diferenciales para los géneros Vibrio y Pseudomona. 3.7.- Pruebas diferenciales para la familia Enterobacteriaceae. Las pruebas diferenciales permitieron determinar diferentes géneros de la familia. Uno de los medios utilizados para determinar la presencia de enterobacterias, fue el agar TSI, el cual es un medio que permite diferenciar géneros por medio de las reacciones que se observan en el. Este medio se siembra por punción y estría superficial. Las cepas sembradas que produjeron un cambio de color del medio a amarillo, ya sea en todo el tubo, en el fondo del tubo o en la superficie inclinada se tomó como reacciones hechas por posibles enterobacterias, algunas cepas produjeron gas y también ácido sulfhídrico (H2S). A las bacterias que se sospechaban eran enterobacterias se les realizó pruebas diferenciales para determinar el género de las mismas. Las pruebas diferenciales realizadas fueron: Indol.- Algunos géneros bacterianos tienen triptófano, el cual puede ser hidrolizado por la enzima triptofanasa si esta presente y producir indol. Esta prueba se basa en la reacción producida por el agregado del reactivo de Kovacs a un cultivo puro de 24 hrs. en caldo de triptona y la formación de un anillo rojo o fucsia como resultado del mismo. NOTA: Para esta prueba también se puede utilizar el medio MIO y observar esta reacción después de observar la descarboxilación de la Ornitina y la movilidad. Rojo de Metilo.- Una de las características taxonómicas que se utilizan para identificar los diferentes géneros de enterobacterias lo constituyen el tipo y la proporción de productos de fermentación que se originan por la fermentación de la glucosa. El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo de viraje entre 6,0 (amarillo) y 4,4 (rojo), que se utiliza para visualizar la producción de ácidos por la vía de fermentación ácido mixta. Las bacterias que dieron positivo a esta prueba tomaron un color rojo, aquellas que conservaron un color anaranjado o amarillento, se tomaron como negativas. Voges- Proskauer.- El acetil-metil-carbinol (o acetoína) es un producto intermediario en la producción de butanodiol. En medio alcalino y en presencia de oxígeno la acetoína es oxidada a diacetilo. Este se revela en presencia de alfa-naftol dando un color rojo-fucsia. Para realizar esta prueba, se requirió de un cultivo puro de 24 hr, se le agregaron los reactivos A y B, dejando reposar por 15 minutos a 4 hrs, se tomó como positiva la prueba cuando se presentó un color rojo en el medio de cultivo, los tubos que no presentaron este color se tomaron como negativos. Utilización del citrato.- Algunas enterobacterias pueden utilizar el citrato como única fuente de carbono. Por estriado, se sembró un cultivo fresco en cajas de agar citrato de Simmons, el crecimiento o cambio de color en el medio indicó que el microorganismo utilizaba el citrato y por lo tanto daba positivo a esta prueba. Ureasa.- La ureasa es una enzima que poseen muchas especies de microorganismos que pueden hidrolizar urea con liberación de amoníaco y dióxido de carbono. Se sembró por estriado superficial una pequeña porción de la cepa a identificar en agar urea de Christensen y se incubó. El cambio de color del medio a un rosado indica la presencia de la enzima. Algunas enterobacterias tienen la facilidad de hidrolizar la urea en 24 hr. y otras requieren de mayor tiempo haciéndolo hasta 7 días después. Descarboxilación de un aminoácido.- La descarboxilación de aminoácidos es llevada a cabo por descarboxilasas y se forman aminas y CO2. Cada descarboxilasa es específica para un aminoácido y la reacción es completa e irreversible. Para determinar la descarboxilación de la ornitina se utilizó el medio MIO y se observó al cambiar el color del medio a morado o lila, la prueba era negativa si el medio mantenía su color normal o cambiaba a un color amarillo, a causa de la acidez. Para la descarboxilación de lisina se utilizó el caldo de Möeller, un resultado positivo de la prueba fue el cambio de color a lila o púrpura, fue negativo al presentarse un color amarillo en el medio. Reducción de nitratos.- Esta prueba se realizó para observar la capacidad de las bacterias para reducir los nitratos a nitritos. Se sembró en el caldo nitratado una porción de cultivo puro y se incubó por 24 hr. Para determinar si el nitrato fue reducido a nitrito, se agregó a los cultivo 2 gotas de los reactivos A y B de Griess. La aparición de un color rojo indicó la reducción de nitratos a nitritos, al caldo que no presentó un cambio de color se le agregó una pequeña cantidad de polvo de zinc puro, la reacción fue negativa completamente al aparecer un color rojo o anaranjado señalando que el nitrato fue reducido, de no presentarse el cambio de color después del agregado de zinc, significó que el nitrato fue reducido a nitrógeno gaseoso (desnitrificación). 3.8.- Pruebas diferenciales para el género Vibrio spp. A las cepas bacterianas presuntivamente del género Vibrio spp. se les realizaron las siguientes pruebas comprobatorias: Crecimiento en agua peptonada.- Aquellas cepas que se tomaron como posibles vibrios se sembraron en agua peptonada con diferentes concentraciones de NaCl (0%, 7%, 11% y 13%), ya que el género Vibrio no crece en concentraciones de NaCl arriba del 6%. Crecimiento en carbohidratos.- El género Vibrio no crece en un medio que contiene solo el carbohidrato lactosa, por lo que se realizó la prueba de carbohidratos con lactosa, sacarosa y manitol, solo para confirmar lo ya observado en prueba anteriores. Algunas cepas, debido a sus reacciones en las pruebas básicas, fueron sembradas en agar TSI, estas no produjeron gas, un color amarillo por el descenso de pH o producción de ácido sulfhídrico, por lo que fueron catalogadas como no fermentadoras y se les realizaron pruebas diferenciales para determinar la presencia de Pseudomona spp. 3.9.- Pruebas diferenciales para la determinación de Pseudomona spp. Crecimiento en agar PIA.- Este medio no permite el crecimiento de otras bacterias que no sean Pseudomonas. Una característica de este género es el olor que pueden desprender, como a frutas o maíz (nixtamal). Fluorescencia.- Algunas cepas de Pseudomonas, pueden presentar fluorescencia ya sea por el contenido de piocianína o fluoresceína. El medio TECH permite observar esta característica por medio de luz ultravioleta. También se les realizaron pruebas como reducción de nitratos a nitritos y desnitrificación, indol, utilización de citrato, ureasa y descarboxilación de aminoácidos ya descritos anteriormente. lV.- RESULTADOS De los cuatro muestreos llevados a cabo, se obtuvieron34 muestras en total de las cuales 28 resultaron positivas para coliformes totales y 20 para coliformes fecales. A continuación, se muestran los resultados obtenidos en cada manantial: 4.1.-Palenquillo Determinación de coliformes totales y fecales. Los coliformes totales se determinaron en los meses de Marzo, Abril, Mayo y Junio. Solo en los meses de Marzo y Junio se observó la presencia de coliformes fecales (tabla 2). Tabla 2.- Presencia de coliformes totales y fecales en el manantial Palenquillo de Banderilla, Veracruz. Organismos Enero Marzo 0 7 0 3 Coliformes totales Abril Mayo Junio 4 4 15 0 0 7 (NMP/ 100 ml) Coliformes fecales (NMP/ 100 ml) El aislamiento de las cepas bacterianas por medio de agares selectivos ayudo a una mejor diferenciación por la forma y el color que tomaron las colonias y a lograr una mejor purificación (fig. 3). De acuerdo a las pruebas que se les realizó a las cepas, algunas daban positivo para el género Salmonella, por lo que se sembró en agar Sulfito y bismuto, en donde las colonias de este género toman un color y forma característico (fig.4). Fig. 3.- Purificación de cepas bacterianas en agar TSA. Fig. 4.- Placa de agar Sulfito y Bismuto sembrada con una cepa del género Salmonella. Determinación de géneros bacterianos En este manantial se obtuvieron cepas bacterianas y en los meses de Marzo, Abril, Mayo y junio y ninguna en el mes de Enero. Se realizaron las pruebas correspondientes y se determinaron los géneros que se mencionan en la tabla 3. Tabla 3.- Géneros bacterianos presentes en el manantial Palenquillo, Banderilla, Veracruz. Enero Marzo No se Escherichia Enterobacter Enterobacter spp. spp. spp. Escherichia Citrobacter spp. Proteus spp. Eschericha coli Aeromona spp. Citrobacter spp. obtuvieron Abril Mayo Junio Enterobacter spp. Géneros bacterianos cepas coli Salmonella spp. Pseudomona spp. 4.2.- Ocotita Determinación de coliformes totales y fecales En este manantial se observó la presencia de coliformes totales en todos los meses y coliformes fecales solo en los meses de Abril, Mayo y Junio, sin embargo, las cantidades son mínimas (Tabla 4). Tabla 4.- Presencia de coliformes totales y fecales en el manantial Ocotita de Banderilla, Veracruz. Organismos Coliformes totales Enero Marzo Abril Mayo Junio 3 7 11 4 11 0 0 4 3 7 (NMP/ 100 ml) Coliformes fecales (NMP/ 100 ml) Para la determinación de una cepa de Escherichia coli se realizaron pocas pruebas, entre las que destacan la positividad a la prueba de rojo de metilo (fig. 5) y la no utilización del citrato como única fuente de carbono (fig. 6). En medios como el agar de Eosina y azul de Metileno (EMB), las colonias tomas un color verde metálico observando la caja a contraluz (fig. 7), sin embargo, existen pruebas comunes que comparte con los géneros pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae, como la prueba de oxidasa (fig. 8) y la reducción de nitratos a nitritos (fig. 9) Fig.5.- Prueba de rojo de metilo positivo Fig. 6.- Placa de agar citrato de Simmons donde no se observa crecimiento bacteriano. ) + ) Fig. 7.- Escherichia coli en un placa de agar EMB. Fig.9.- Prueba para la reducción de nitratos (derecha negativa, izquierda positiva). Fig. 8.- Prueba de la oxidasa positiva. Determinación de bacterias patógenas De este manantial se obtuvieron cepas en prácticamente todos los meses. En el mes de Abril también se observó la presencia de hongos. Los géneros encontrados en el manantial se muestran en la tabla 5. El género Pseudomona se observa en la mayoría de los muestreos excepto el mes de Enero. Tabla 5.- Géneros bacterianos presentes en el manantial Ocotita de Banderilla, Veracruz. Géneros bacterianos Enero Marzo Enterobacter Enterobacter spp. spp. Abril Salmonella spp. Mayo Proteus spp. Junio Enterobacter spp. Pseudomona Pseudomona Pseudomona Pseudomona spp. spp. spp. spp. Escherichia spp. Escherichia coli Providencia Eschericha coli spp. Citrobacter spp. Citrobacter spp. Providencia spp. Aeromona spp. Serratia spp. Aeromona spp. 4.3.- Álamos 1 Determinación de coliformes totales y fecales Este manantial es uno de los más usados por los habitantes y se encuentra en una zona de fácil acceso, sin embargo, en todos los meses se observa la presencia de coliformes totales y en los meses de Marzo, Mayo y Junio se encontraron coliformes fecales, presentándose en mayor cantidad el último mes (Tabla 6). Tabla 6.- Presencia de coliformes totales y fecales en el manantial Álamos 1 de Banderilla, Veracruz. Organismos Coliformes totales Enero Marzo Abril Mayo Junio 3 11 7 7 93 0 4 0 3 23 (NMP/ 100 ml) Coliformes fecales (NMP/ 100 ml) Una de las primeras pruebas diferenciales que se realizó para la identificación de las enterobacterias fue sembrar las cepas en agar de hierro y triple azúcar (TSI) debido a los cambios de color que producen en este medio. La especie Escherichia coli produce un viraje de color del medio a amarillo y producción de gas (fig. 10), especies pertenecientes al género Enterobacter pueden solo producir acidez en la parte inferior del tubo y permanecer alcalina la parte superior (fig. 11), mientras que el grupo de las no fermentadoras solo hacen que se alcalinice el medio de manera que se observe un color rojo (fig. 12) o simplemente no hay cambio de color del medio. Fig. 10.- Tubo de agar TSI con producción de ácidez Fig. 11.- Tubo de agar TSI donde se observa una reacción alc- ác Fig. 12.- Tubo de agar TSI sembrado con una cepa del género Pseudomona Determinación de bacterias patógenas En todos los meses se observó la presencia de enterobacterias como se muestra en la tabla 7. Tabla 7.- Géneros bacterianos presentes en el manantial Álamos de Banderilla, Veracruz. Enero Marzo Escherichia spp. Escherichia coli. Citrobacter spp. Escherichia coli Eschercichia coli Enterobacter spp. Enterobacter spp. Enterobacter spp. Enterobacter spp. Serratia spp. Serratia spp. Aeromona spp. Aeromona spp. Géneros bacterianos Escherichia spp. Abril Mayo Junio Providencia spp. Pseudomona spp Edwarsiella spp.. Vibrio spp. Salmonella spp 4.4.- La fragua Determinación de coliformes totales y fecales Este manantial es el más usado por los habitantes del municipio y su aspecto refleja el cuidado que se le tiene. Fue el único manantial que no presentó coliformes totales o fecales en ningún mes (Tabla 8). Tabla 8.- Presencia de coliformes totales y fecales en el manantial La fragua de Banderilla, Veracruz. Organismos Enero Marzo Abril Mayo Junio 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Coliformes totales (NMP/ 100 ml) Coliformes fecales (NMP/ 100 ml) El género Pseudomona es uno de los géneros que no suele ser exigente ante las condiciones ambientales que le rodean por lo que tiene una amplia distribución. Cuando se sembró en agar TSI se distinguió por darle un color rojo a todo el tubo, característico de las no fermentadoras (fig. 13), el crecimiento en agar PIA (fig. 14) así como la movilidad (fig. 15) y la reducción de nitratos a nitritos y la desnitrificación (fig. 16), indicaba que correspondía al género Pseudomona, además de ser capaz de utilizar el citrato como única fuente de carbono (fig. 17). Fig. 13.- Cepa del género Pseudomona sembrada en agar TSI Fig. 14.- Cepa bacteriana sembrada en agar PIA Fig. 15.- Medio MIO donde se observa la movilidad del organismo. Fig. 16.- Prueba para observar la reducción del nitrato (a la izquierda el nitrato se redujo a nitrito y a la derecha hay desnitrificación). Fig. 17.- Placa de agar citrato de Simmons donde se observa el cambio de color por el crecimiento de la bacteria. Determinación de bacterias patógenas No se aislaron cepas bacterianas en los meses de Enero y Mayo, y solo se obtuvieron cepas pertenecientes al género Pseudomona, las cuales fueron encontradas en los meses de Marzo, Abril y Junio (Tabla 9). bacterianos Géneros Tabla 9.- Género bacteriano encontrado en el manantial La fragua de Banderilla, Veracruz Enero Marzo Abril Pseudomona Pseudomona Pseudomona spp. spp. spp. Mayo Junio 4.5.- La mistela Determinación de coliformes totales y fecales Este manantial presenta condiciones deplorables, ya que no esta cubierto y se encuentra en el suelo sin que algo lo proteja, además de que una corriente de aguas domésticas pasa a su lado. Por ello, es evidente la presencia de coliformes totales y fecales en la mayoría de los muestreos, a excepción del mes de Enero donde no se encontraron coliformes fecales (Tabla 10). Tabla 10.- Presencia de coliformes totales y fecales en el manantial La mistela, municipio de Banderilla, Veracruz. Organismos Coliformes totales Enero Marzo Abril Mayo Junio 7 7 14 15 23 0 3 4 4 15 (NMP/ 100 ml) Coliformes fecales (NMP/ 100 ml) Aparte de los géneros bacterianos que se encontraron en los muestreos, se observó la presencia de hongos, esto en las cajas de agar EMB (fig. 18), el cual sirvió como un medio selectivo para las enterobacterias al igual que el agar TSI (fig. 19) y poderlas aislar. Fig 18.- Placa de agar EMB, donde se observa crecimiento de hongos. Fig 19.- Tubo de agar TSI en el cual se observa la presencia de gas causando la separación del medio. Determinación de bacterias patógenas En todos los meses se encontraron géneros pertenecientes a la familia de las enterobacterias y Pseudomona spp. se encontró en los 2 últimos muestreos. También se encontró hongo en los meses de Abril y Junio (Tabla 11). Géneros bacterianos Tabla 11.- Géneros bacterianos encontrados en el manantial La mistela de Banderilla, Veracruz. Enero Marzo Abril Mayo Junio Enterobacter spp. Enterobacter spp. Enterobacter spp. Salmonella spp. Enterobacter spp. Escherichia spp. Escherichia coli Escherichia spp. Escherichia coli Escherichia coli Aeromona spp. Aeromona spp. Aeromona spp. Providencia spp. Edwarsiella spp. Citrobacter spp. Serratia spp. Vibrio spp. Pseudomona spp Pseudomona spp. Proteus spp. Proteus spp. Vibrio spp. 4.6.- Poza verde Determinación de Coliformes totales y fecales. Los resultados para observar la calidad del agua no varían mucho. Es uno de los manantiales con más uso en la ciudad por que es el encargado de proporcionar el agua a los lavaderos que se encuentran junto a él y siendo también fuente de abasto a muchas personas que la consumen. En el mes de Mayo no hubo agua, por lo que no se pudo obtener una muestra y en los meses de Marzo, Abril y Junio, se observó la presencia de hongos (Tabla 12). Tabla 12.- Presencia de coliformes totales y fecales en el manantial Poza verde de Banderilla, Veracruz. Organismos Enero Marzo Abril Mayo Junio Coliformes totales 3 7 3 -------- 21 0 3 3 -------- 7 (NMP/ 100 ml) Coliformes fecales (NMP/ 100 ml) Existen géneros, como Proteus, que poseen características relevantes que ayudaron mucho a su identificación. Este género posee una gran movilidad (fig. 20) además de ser uno de los géneros que posee la enzima ureasa (fig. 21) y la degrada con rapidez. Otras pruebas para su identificación es la negatividad para la prueba de Voges- Proskauer (fig. 22) y la utilización del citrato (fig. 23). - + Fig. 20.- Tubos de medio MIO (a la derecha organismo móvil, a la izquierda organismo inmóvil) - + Fig. 21.- tubos con agar urea de Christensen (a la izquierda tubo negativo y a la derecha postivo). + - - Fig. 22.- Prueba de Voges - Proskauer + Fig. 23.- Utilización del citrato Determinación de géneros bacterianos Los géneros que más predominaron en los muestreos de este manantial fueron los géneros Escherichia spp. y Pseudomona spp. Solo en el mes de Abril se encontró el género Vibrio spp. en el agua de este manantial (Tabla 13). Tabla 13.- Géneros bacterianos encontrados en el manantial Poza verde de Banderilla, Veracruz. Géneros bacterianos Enero Marzo Abril Mayo Junio Enterobacter spp. Enterobacter spp. Proteus spp. Citrobacter spp. Escherichia spp. Escherichia spp Escherichia spp. Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Pseudomona spp. Pseudomona spp. Pseudomona spp. Aeromona spp. Aeromona spp. Providencia spp. Edwarsiella spp. Vibrio spp. Serratia spp. No hubo agua en el manantial. Enterobacter spp. Salmonella spp. 4.7.- Boquerón 2 Determinación de coliformes fecales y totales El manantial Boquerón 2 presentó en todos los muestreos coliformes fecales y totales, en diferentes cantidades (Tabla 14), sin embargo, esto es predecible debido a que se encuentra a la orilla de la carretera que lleva a Jilotepec, y esta a cielo abierto. Algunas personas que consumían el agua dejaron de hacerlo por las enfermedades que les ocasiono, sin embargo, no dejan de utilizarla para otras actividades. Tabla 14.- Presencia de coliformes totales y fecales en el manantial Boquerón 2 de Banderilla, Veracruz. Organismos Coliformes totales Enero Marzo Abril Mayo Junio 9 15 28 32 93 7 9 14 22 28 (NMP/ 100 ml.) Coliformes fecales (NMP/ 100 ml.) Las pruebas realizadas a las cepas que probablemente pertenecían al género Vibrio, fueron basadas en que no fermentan la lactosa (fig.24) y que crecen en concentraciones no muy elevadas de sal (fig. 25). + - Fig. 24.- Agua peptonada con sal (a la izquierda concentración de 0%, a la derecha del 11%). - + Fig. 25.- Tubos de agar inclinado con lactosa. Para la determinación del género Salmonella se realizaron las cuatro pruebas básicas para los géneros pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae, la utilización del citrato (fig. 26), la positividad al rojo de metilo (fig. 27), la negatividad al indol (fig. 28) y la movilidad (fig. 29). El agar Sulfito y Bismuto sirvió como complemento a los resultados arrojados por las pruebas, ya que las cepas que de acuerdo a las pruebas pertenecían al género Salmonella, fueron sembradas en este medio, confirmando el resultado y observando un medio negruzco por la producción de ácido sulfhídrico (fig. 30). Fig. 26.- Placa de agar citrato de Simmons. C + - Fig. 27.- Tubos caldo RM-VP con Fig. 29.- Tubo con medio MIO sembrado con una bacteria móvil. Fig. 28.- Prueba de Indol negativa Fig. 30.- Placa de agar Sulfito y Bismuto con una cepa del género Salmonella. Determinación de géneros bacterianos Como se mostró en el cuadro pasado, es el manantial que posee mayor cantidad de bacterias, en cuanto a géneros, se observa una gran diversidad. Los géneros con mayor incidencia fueron Pseudomona spp., Escherichia spp., Citrobacter spp. y Enterobacter spp.( Tabla 15). Géneros bacterianos Tabla 15.- Géneros bacterianos presentes en el manantial El boquerón 2 de Banderilla, Veracruz. Enero Marzo Abril Mayo Junio Enterobacter spp. Enterobacter spp. Enterobacter spp. Enterobacter spp. Enterobacter spp. Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli . Escherichia coli Escherichia coli Escherichia spp. Providencia spp. Escherichia spp Citrobacter spp Escherichia spp. Pseudomona spp. Pseudomona spp. Pseudomona spp. Pseudomona spp. Pseudomona spp. Aeromona spp. Aeromona spp. Aeromona spp. Aeromona spp. Citrobacter spp. Klebsiella spp. Klebsiella spp. . Providencia spp. Providencia spp Salmonella spp. Salmonella spp. Vibrio spp. Vibrio spp. Tabla 16.- Concentrado de los géneros presentes en los manantiales de Banderilla, Ver. Meses Enero Manantiales 1M No se obtuvieron bacterias Marzo Abril Mayo Junio 2M 3M 4M No se obtuvieron bacterias No se obtuvieron bacterias 5M 6M No hubo muestra de agua Géneros bacterianos 7M Enterobacter spp. Escherichia spp Escherichia coli. Citrobacter spp. Proteus spp. Aeromona spp. Salmonella spp. Pseudomona spp. Providencia spp. Serratia spp. Vibrio spp. Edwarsiella spp. Klebsiella spp. Hongo ) V.- DISCUSIÓN De acuerdo a los estudios realizados a través de análisis bacteriológicos a los manantiales Palenquillo, Ocotita, Álamos 1, La fragua, La mistela, Poza verde y El boquerón 2, del municipio de Banderilla, Veracruz y siguiendo los lineamientos establecidos por la Norma Oficial Mexicana NOM -127-SSA1-1994, el agua de los manantiales no cumple con los mismos, por lo que debe considerarse que su calidad en la mayoría de los casos no es apta para consumo humano. Lo anterior es coincidente con lo reportado por Ramírez (2004) quien llevó a cabo análisis en estos cuerpos de agua y reporta para los mismos, la presencia de coliformes totales y fecales a niveles mayores a los permitidos. De igual manera, Landa (2006) señala en su estudio realizado en la misma zona, la presencia de coliformes totales en todos los manantiales en los diferentes muestreos y coliformes fecales, como en el caso de La mistela y Álamos, a niveles no aceptables en el agua y por lo mismo, no es apta para consumo humano, lo cual reafirma los resultados que se reportan a la fecha en nuestros análisis realizados, sumándose a ello el reporte de la presencia de bacterias patógenas oportunistas como es el caso de los géneros Klebsiella spp., Proteus spp., Providencia spp., Enterobacter spp., Serratia spp., Citrobacter spp., Pseudomona spp y Aeromona spp., no reportados en ningún trabajo realizado para el mismo, y que pueden ser causantes de daños a la salud de quienes las consuman, lo que denota la importancia de poder reportar estos géneros. Lo anterior guarda coincidencia con trabajos realizados por investigadores en otros países, quienes llevaron acabo estudios sobre calidad del agua, como los presentados por Powell et al. (2003) en acuíferos del Reino Unido y Close y Dann (2005) en aguas subterráneas en zonas de Nueva Zelanda y en nuestro país por Isaac et al. (1994) en suministros de agua para consumo humano en Campeche y de igual manera Mazari et al. (1997) en la zona geohidrológica del sur de la ciudad de México, los cuales muestran concentraciones elevadas de coliformes tanto totales como fecales, que ponen en riesgo la salud de quien las consume, lo que tiene similitud con los resultados que se reportan en este trabajo. En la mayoría de las muestras tomadas en nuestros estudios a los 7 manantiales, se observó la presencia de bacterias pertenecientes a los géneros Enterobacter spp., Escherichia spp., Providencia spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Pseudomona spp. y Aeromona spp., así como la especie Escherichia coli, situación similar a lo reportado por Lamka et al. (1980) en su estudio a agua de consumo humano en una zona rural cercana a Oregón, donde no solo encontró coliformes totales y fecales, también determinó la existencia de diversas especies, entre las que destacan Citrobacter freundii, Klebsiella pneumonie y Escherichia coli, además de otros géneros bacterianos como Pseudomona spp, Aeromona spp, Sthaphylococcus y Moraxella spp, entre otros; resultados similares presenta Pacheco et al. (1999) en aguas subterráneas de Yucatán, mostrando la presencia de coliformes totales y fecales que sobrepasaban los límites permisibles para una buena calidad del agua, así como los géneros bacterianos Citrobacter spp., Enterobacter spp., Serratia spp., Klebsiella spp. y Escherichia spp., considerados dentro de los coliformes totales y que son considerados microorganismos oportunistas demostrando que dañan la salud de quienes consumen estas aguas provocando gastroenteritis, septicemias y diversas infecciones. Por otro lado, Pac Sa et al. (1998) en su estudio sobre un brote de gastroenteritis aguda en una zona rural de Castellón, España, el cual se asoció al consumo de agua de una acequia; mostró, por medio de análisis químicos y bacteriológicos, la presencia de contaminación fecal y se evidenció la presencia de especies pertenecientes al género Salmonella, cuyos resultados confirman nuestro estudio, ya que también se logró aislar cepas pertenecientes al género Salmonella spp. en los manantiales Palenquillo, Álamos 1, La mistela, Poza verde y El boquerón. En los manantiales, objeto de estudio, los análisis permitieron identificar cepas pertenecientes al género Pseudomona, lo cual es semejante a lo reportado por Vendrell et al. (1998) en los estudios realizados a manantiales de aguas termales en O´Tinteiro en Oruense, España, que muestran la existencia de contaminación por coliformes totales y fecales, así como por Pseudomona spp. y Enterococcus, en más de un punto muestreado; así también Soto et al. (2006) en estudios realizados en nuestro país a aguas subterráneas que surten a través de pozos a zonas de Navolato y Culiacán, Sinaloa, observaron la presencia de coliformes totales y fecales que sobrepasan de manera negativa su presencia en esta agua, las cuales por estos motivos, no son aptas para consumo humano, del mismo modo, obtuvieron los géneros Pseudomona spp. y Aeromona spp., considerados como patógenos oportunistas, causantes de diversas infecciones en niños, adultos mayores y personas enfermas. De manera similar, el estudio realizado por García et al. (2006) a aguas subterráneas en pozos tubulares (extraída por bombas manuales) y con reservorio en las localidades de Santa y Coishco en la Costa Central del Perú, muestra la presencia de especies como Vibrio cholerae No 01, Aeromona caviae y Aeromona hidrophyla en más de un pozo, estas últimas en mayor cantidad, lo que coincide con el presente trabajo, ya que también se lograron identificar los géneros a los que pertenecen estas especies en los manantiales analizados. Finalmente, Marchand (2002) concluye en su estudio en Lima, Perú con la importancia de la determinación del género Pseudomona spp. y los Estreptococos fecales, como indicadores complementarios de la calidad del agua para consumo humano debido a los daños en la salud que pueden causar, específicamente Pseudomona, ya que el no detectar coliformes totales o fecales, no indica totalmente la buena calidad del agua, lo cual reafirma el resultado obtenido en nuestro estudio del manantial La fragua, ya que en ningún muestreo se observó la presencia de coliformes totales o fecales, sin embargo, se obtuvieron cepas pertenecientes al género Pseudomona spp. en los meses de Marzo, abril y Junio. Como lo muestran nuestros resultados, la ubicación en la que se encuentran las tomas de agua de los manantiales se ve reflejada en la calidad del agua, ya que se observa una mayor cantidad de coliformes totales y fecales así como diversidad de géneros en aquellos donde la protección es deficiente, como La mistela y El boquerón 2, en este último, lográndose aislar el género Klebsiella, el cual no se registro en otro manantial y los cuales se encuentran protegidos y limpios sus alrededores. Las temporadas estacionales también influyen en los resultados, ya que a pesar de la seguridad en la que se encuentra el manantial Álamos 1, en el mes de mayo se disminuyo la cantidad de agua regularizándose en el mes de junio, en el cual se observó un aumento considerable de organismos coliformes, lo que hace pensar que posibles bacterias se adhieren a las tuberías y crecen al presentarse condiciones adecuadas, al incrementarse el nivel del agua del manantial las bacterias son arrastradas, reflejándose en los resultados obtenidos. Por otro lado, las temperaturas registradas en el agua de los manantiales representa una variante de importancia, ya que se observa que a menor temperatura, menor cantidad de géneros presentes así como menores concentraciones de organismos coliformes, por otro lado, el pH registrado en el agua de los manantiales no muestra gran variación durante las estaciones muestreadas, por lo que no marca influencia alguna para la presencia o no de los géneros reportados. Vl.- CONCLUSIONES 1. Los resultados obtenidos de los análisis bacteriológicos realizados en los manantiales Palenquillo, Ocotita, Álamos 1, La fragua, La mistela, Poza verde y El boquerón 2, permiten determinar que más del 85% de los mismos, se encuentran contaminados con la presencia de coliformes totales y fecales. 2. Conforme a los resultados obtenidos y de acuerdo a lo establecido por la Norma oficial mexicana NOM-127-SSA1-1994, la calidad bacteriológica del agua es deficiente en los manantiales Palenquillo, Ocotita, Álamos 1, La mistela, Poza verde y El boquerón 2, del municipio de Banderilla, Ver., debido a la presencia de coliformes totales y fecales, los cuales deben estar ausentes en cada 100 ml. de agua para consumo humano. 3. El manantial La fragua no presentó en ningún muestreo coliformes totales o fecales, sin embargo, cultivos realizados de las muestras de aguas de este manantial permitieron obtener cepas pertenecientes al género Pseudomona spp. en los meses de Marzo, Abril y Junio. El género Pseudomona, esta compuesto por diversas especies que son consideradas patógenos oportunistas, por lo que se concluye que su presencia en las aguas de este manantial, por ser consumido por población asentada en sus cercanías, representa un riesgo para su salud. 4. Aún cuando el grupo de los coliformes totales no tiene una importancia clínica relevante comparado con otros géneros, los géneros reportados en este trabajo como Citrobacter spp., Klebsiella spp., Enterobacter spp. Proteus spp., Providencia spp. y Serratia spp., (considerados patógenos oportunistas) pueden ocasionar bacteriemia o septicemia, diarreas, gastroenteritis, infecciones en heridas, piel y principalmente en vías urinarias, siendo los más susceptibles a adquirir estas enfermedades niños, adultos mayores y personas enfermas. 5. Los géneros reportados como Salmonella spp., Vibrio spp., y la especie Escherichia coli, fueron identificados en más de la mitad de las muestras motivo de análisis, mismos que son considerados como patógenos causantes de diversas enfermedades como diarreas que van de leves a moderadas, gastroenteritis, infecciones en piel, en el tracto respiratorio y urinario, bacteriemia, etc., por lo tanto, dichas aguas no son aptas para consumo humano. 6. Se observa un incremento de coliformes totales y fecales en los meses en los cuales las temperaturas son más elevadas, lo que supone que las bacterias se mantienen en un ambiente adecuado para su crecimiento. 7. Debido a la importancia que tienen los manantiales de Banderilla para la población, antes de consumir el agua, se sugiere sea sometida a diferentes procesos que puedan garantizar una calidad en las mismas y que pongan a salvo a la población que las consume de cualquier tipo de enfermedad que atente contra su salud. VII.- ANEXOS Agar Eosina y azul de metileno (EMB) En un medio que se utiliza para el aislamiento y diferenciación de coliformes de otras enterobacterias de interés médico y sanitario. Agar de Soya y Tripticaseína (TSA) Es un medio sólido muy rico en nutrientes. Permite la multiplicación abundante y satisfactoria de gérmenes de desarrollo difícil y exigentes. Agar de Hierro y Triple Azúcar (TSI) Este medio diferencial es utilizado para la diferenciación e identificación de enterobacterias patógenas y saprófitas en los análisis bacteriológicos. Este medio se usa como clave para iniciar la identificación de enterobacterias. Agar Sulfito y Bismuto Es un medio de Wilson y Blair* modificado y altamente selectivo para aislar Salmonella typhi, así como otros bacilos entéricos. Caldo RM- VP Es un medio líquido empleado para efectuar las reacciones indicadas de rojo de metilo y acetil metil- carbinol (Voges- Proskauer). La prueba del rojo de metilo sirve para distinguir entre aquellos microorganismos que producen y mantienen una concentración alta de ácidos, de aquellos que producen inicialmente una menor cantidad y que además son capaces de atacar a estos mismos ácidos, volviendo al medio neutro o alcalino, como Enterobacter. La prueba de Voges- Proskauer muestra la oxidación del acetil- metil- carbinol a diacetilo, el cual a su vez reacciona con la peptona del medio dando un color rojo. Para la realización de esta prueba, se necesita agregar el Indicador rojo de metilo y el reactivo de Voges- Proskauer, compuesto por una solución A y una B . Caldo de triptona Se utiliza para observar la presencia de indol. La prueba requiere que se le agregue el reactivo de Kovacs. Agar Citrato de Simmons. Se utiliza para diferenciar las bacterias entéricas gram negativas basándose en la utilización del citrato. Medio Movilidad- Indol- Descarboxilación de la Ornitina (MIO). El medio MIO se utiliza para la identificación de enterobacterias sobre la base de movilidad, la producción de ornitina descarboxilasa y de indol. Agar Urea de Christensen Es un medio utilizado para la determinación de la presencia de la enzima ureasa. El medio se compone de dos partes, que se esterilizan por diferentes métodos y luego se mezclan de forma aséptica que se distribuye en tubos estériles a 10 ml por tubo. Se solidifica en posición inclinada. Caldo Nitratado Este es un caldo que se realiza para probar la capacidad de las bacterias para reducir los nitratos a nitritos y posiblemente hasta llegar a nitrógeno gaseoso. Para realizar esta prueba, se le agrega el reactivo de Griess, el cual esta compuesto por 2 soluciones, A y B. Agar PIA Este agar es utilizado para el aislamiento de Pseudomonas. Agar TECH Es similar al agar PIA, ya que solo varía en la cantidad de glicerol que se agrega, sin embargo, tienen el mismo fin y sirve para observar fluorescencia. Gráficas de temperatura y pH de los manantiales muestreados. La gráfica 1 muestra la temperatura que tenían los manantiales a la hora de ser muestreados, se observa que la temperatura en general, no varía mucho en todos los manantiales, solo el Boquerón presento una alza importante en el mes de Mayo con 23.3ºC, y la temperatura mínima registrada, fue de 17ºC, presentadas en Enero. 25 23.3 1M 2M 3M 4M 5M 6M 7M Temperatura °C 20 17 15 10 5 0 Enero Marzo Abril Mayo Junio Meses La gráfica 2 muestra el pH en los manantiales durante los meses muestreados, se observa que no hay mucha variación, sin embargo, en el mes de Junio se nota un alza en el pH que llega arriba de los 9 en los manantiales Palenquillo y La mistela. 10 9.27 9 8 7 pH 6 1M 6.3 2M 5 4M 4 5M 3 6M 2 7M 1 0 Enero Marzo Abril Meses Mayo Junio VIII.-REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Aguado García, J. M. y Lumbreras Bermejo C. (1998). Infecciones por enterobacterias. Rev. Med. Vol. 7, No. 78: 3622- 3628. Almirante Gragera, B. (2002). Infecciones por enterobacterias. Rev. Med. 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