anexo 1 - Repositorio Digital UTE

UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA EQUINOCCIAL
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA INGENIERÍA
CARRERA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS
DIVERSIDAD MICROBIANA ASOCIADA A LOS PROCESOS
DE FERMENTACIÓN DE LA CHICHA DE ARROZ EN LA
PROVINCIA BOLÍVAR
TRABAJO PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO
DE INGENIERA DE ALIMENTOS
DIANA ELIZABETH PAZMIÑO GARCÍA
DIRECTOR: ING. NUBIA GRIJALVA
Quito, Noviembre, 2013
© Universidad Tecnológica Equinoccial. 2013
Reservado todos los derechos de reproducción
DECLARACIÓN
Yo Diana Elizabeth Pazmiño García, declaro que el trabajo descrito aquí
es de mi autoría; que no ha sido previamente presentado para ningún grado
o calificación profesional; y, que he consultado las referencias bibliográficas
que se incluyen en este documento.
La Universidad Tecnológica Equinoccial puede hacer uso de los derechos
correspondientes a este trabajo, según lo establecido por la Ley de
Propiedad Intelectual, por su Reglamento y por la normativa institucional
vigente.
_____________________________
Diana Elizabeth Pazmiño García.
C.I. 020202144-0
CERTIFICACIÓN
Certifico que el presente trabajo que lleva por título “Diversidad microbiana
asociada a los procesos de fermentación de la chicha de arroz en la
provincia Bolívar”, que, para aspirar al título de Ingeniera de Alimentos
fue desarrollado por Diana Elizabeth Pazmiño García, bajo mi dirección y
supervisión, en la Facultad de Ciencias de la Ingeniería; y cumple con las
condiciones requeridas por el reglamento de Trabajos de Titulación artículos
18 y 25.
_____________________________
Ing. Nubia Jimena Grijalva Vallejos
DIRECTORA DEL TRABAJO
C.I. 1717665689
DEDICATORIA
A mis padres Gonzalo y Fanny por
haberme apoyado de manera
incondicional, por sus consejos, sus valores, por los ejemplos de
perseverancia y constancia que me han impuesto para cumplir mis objetivos,
pero más que nada, por su paciencia y amor.
A mi hermano Vladi, quien fue mi gran inspiración y fortaleza en los
momentos más difíciles, quien dejó como recuerdo en mi un gran ejemplo de
vida, que con esfuerzo y perseverancia se puede alcanzar lo que se
propone.
A mis hermanos Xavier y Gabriel quienes han estado a mi lado
acompañándome en todo momento, por su ayuda y gran apoyo
incondicional.
AGRADECIMIENTOS
Agradezco de manera especial a mis padres por enseñarme lo bueno y lo
malo de la vida, por el apoyo brindado a lo largo de mi vida estudiantil y por
permitirme cumplir uno de mis sueños como es ser profesional.
A mis hermanos Xavier, Gabriel, mi prima Aranza quienes me han apoyado y
me han dado ánimos en los momentos más difíciles, durante el cumplimiento
de este sueño.
A mi novio David por su amor y por estar siempre a mi lado en el
cumplimiento de esta meta.
A la Ing. Nubia Grijalva por su gran apoyo y motivación, por su paciencia, por
impulsar el desarrollo de este trabajo y por siempre estar dispuesta a ayudar.
Agradezco a la Universidad Tecnológica Equinoccial y a la Carrera de
Ingeniería en Alimentos por haberme formado durante estos años.
A mis profesores quienes me han impartido conocimientos y experiencias
que me permitirán desarrollarme como un buen profesional en esta área.
A mis compañeros por haber compartido conmigo esta etapa tan importante
de mi vida, por haber estado en las buenas y malas, sobre todo en nuestra
formación profesional: Micaela y María José
¡Gracias!
ÍNDICE DE CONTENIDO
PÁGINA
PÁGINA
RESUMEN
ix
ABSTRACT
x
1.
INTRODUCCIÓN
1
2.
MARCO TEÓRICO
5
2.1.
LA FERMENTACIÓN
2.1.1.
FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA
5
7
2.2.
BEBIDAS FERMENTADAS TRADICIONALES
10
2.3.
LA CHICHA
14
2.3.1.
SIGNIFICADO
14
2.3.2.
ORIGEN
14
2.3.3.
LA CHICHA EN AMERICA
16
2.3.4.
LA CHICHA EN ECUADOR
16
2.4.
LA CHICHA DE ARROZ
18
2.5.
MICROORGANISMOS FERMENTADORES
19
2.5.1.
LEVADURAS
19
2.5.1.1.
Características
19
2.5.1.2.
Morfología
20
2.5.1.3.
Reproducción
21
2.5.1.4.
Taxonomía
22
2.5.1.5.
Importancia en la Industria de los Alimentos
22
2.5.2.
MOHOS
23
2.5.2.1.
Características
23
2.5.2.2.
Morfología
24
2.5.2.3.
Reproducción
25
2.5.2.4.
Taxonomía
25
2.5.2.5.
Importancia en la Industria de los Alimentos
26
2.5.3.
ENTEROBACTERIAS
27
i
PÁGINA
2.5.3.1.
Características
27
2.5.3.2.
Morfología
27
2.5.3.3.
Reproducción
28
2.5.3.4.
Taxonomía
28
2.5.4.
3.
BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS
30
2.5.4.1.
Características
30
2.5.4.2.
Morfología
31
2.5.4.3.
Reproducción
31
2.5.4.4.
Taxonomía
32
2.5.4.5.
Importancia en la Industria de los Alimentos
33
METODOLOGÍA
34
3.1.
TOMA DE LA MUESTRA
34
3.2.
AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS
35
3.2.1.
AISLAMIENTO PRIMARIO Y MANTENIMIENTO DE
CULTIVOS PUROS
35
3.2.1.1.
Preparación de Diluciones Seriadas
35
3.2.1.2.
Siembra en placa en superficie
36
3.2.1.3.
Aislamiento de Enterobacterias, Levaduras y
Bacterias Lácticas
3.2.1.4.
3.3.
Aislamiento de Mohos
38
IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS GRAM
POSITIVOS Y GRAM NEGATIVOS
3.3.1.
3.4.
37
TINCIÓN GRAM
IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS
3.4.1.
38
38
39
IDENTIFICACIÍN DE ENTEROBACTERIAS POR
PRUEBAS BIOQUÍMICAS
39
3.4.1.1.
Prueba de la Catalasa
39
3.4.1.2.
Prueba SIM
40
3.4.1.3.
Prueba TSI (triple hierro azúcar)
41
ii
PÁGINA
3.4.1.4.
Prueba RMVP (rojo de metilo, voges y
42
proskauer)
3.4.1.5.
Prueba de la UREA
43
3.4.1.6.
Prueba de Simmons Citrato
44
3.4.1.7.
Prueba de LIA (lisina hierro agar)
45
3.4.1.8.
Prueba de Manitol Salt
46
3.4.2.
Identificación de Mohos
3.4.3.
IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS ÁCIDO
LÁCTICAS POR PRUEBAS BIOQUÍMICAS
47
3.4.3.1.
Prueba de la Catalasa
47
3.4.3.2.
Prueba SIM
47
3.4.3.3.
Prueba TSI (triple hierro azúcar)
47
3.4.3.4.
Prueba de Anaerobiosis
47
3.4.3.5.
Prueba de Aerobiosis
48
IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS
48
3.4.4.
4.
46
RESULTADOS YDISCUSIÓN
50
4.1.
RECUENTOS MICROBIANOS
50
4.2.
AISLAMIENTO DE CEPAS PARA IDENTIFICACIÓN
53
4.3.
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE
MICROORGANISMOS
4.3.1.
PRIMERA ETAPA
53
53
4.3.1.1.
Enterobacterias
53
4.3.1.2.
Bacterias Acido lácticas
56
4.3.1.3.
Mohos
58
4.3.1.4.
Levaduras
59
4.3.2.
SEGUNDA ETAPA
62
4.3.2.1.
Bacterias Acido lácticas
62
4.3.2.2.
Mohos
63
4.3.2.3.
Levaduras
66
4.3.3.
TERCERA ETAPA
67
iii
PÁGINA
5.
4.3.3.1.
Enterobacterias
67
4.3.3.2.
Bacterias Acido lácticas
68
4.3.3.3.
Mohos
69
4.3.3.4.
Levaduras
70
CONCLUSIONES YRECOMENDACIONES
72
5.1.
CONCLUSIONES
72
5.2.
RECOMENDACIONES
73
GLOSARIO
74
BIBLIOGRAFÍA
75
ANEXOS
92
iv
ÍNDICE DE TABLAS
PÁGINA
Tabla 2.1. Principales bebidas fermentadas en el mundo
11
Tabla 2.2. Principales bebidas fermentadas de acuerdo al
Continente
12
Tabla 2.3. Principales chichas elaboradas en el Ecuador de
acuerdo a sus provincias
17
Tabla 2.4. Taxonomía de las Levaduras
22
Tabla 2.5. Principales géneros taxonómicos de los mohos
26
Tabla 2.6. Taxonomía de las Enterobacterias
29
Tabla 2.7. Principales géneros de las bacterias ácido lácticas
32
Tabla 3.1. Medios de cultivo selectivos
36
Tabla 4.1. Recuentos microbianos
50
Tabla 4.2. Aislamiento de cepas para identificación
53
Tabla 4.3. Identificación de enterobacterias en la etapa 1
54
Tabla 4.4. Identificación de bacterias acido lácticas en la etapa 1
57
Tabla 4.5. Identificación de mohos en la etapa 1
58
Tabla 4.6. Identificación de Levaduras en la etapa 1
60
Tabla 4.7. Identificación de bacterias ácido lácticas en la etapa 2
62
Tabla 4.8. Identificación de mohos en la segunda etapa
63
Tabla 4.9. Identificación de levaduras
66
Tabla 4.10. Identificación de Enterobacterias en la etapa 3
67
Tabla 4.11. Identificación de Bacterias Lácticas en la etapa 3
68
Tabla 4.12. Identificación de Mohos en la etapa 3
69
Tabla 4.13. Identificación de Levaduras en la etapa 3
71
v
ÍNDICE DE FIGURAS
PÁGINA
Figura 2.1. Reacción de la Fermentación Alcohólica
8
Figura 2.2. Morfología de las Levaduras
21
Figura 2.3. Morfología de los mohos
24
Figura 2.4. Morfología de Enterobacterias
28
Figura 2.5.Morfología de las bacterias ácido lácticas
31
Figura 3.1. Productores de chicha de arroz
34
Figura 3.2. Aislamiento por estría
37
Figura 3.3. Tinción Gram
39
Figura 3.4. Prueba de la catalasa
39
Figura 3.5. Prueba SIM
41
Figura 3.6. Prueba TSI
42
Figura 3.7. Prueba RMVP
43
Figura 3.8. Prueba UREA
44
Figura 3.9. Simmons Citrato
45
Figura 3.10. Prueba LIA
45
Figura 3.11. Prueba Manitol Salt
46
Figura 3.12. Aislamiento por estría doble
48
Figura 4.1. Tinción Gram de Enterobacterias en la etapa 1
56
Figura 4.2. Tinción Gram de bacterias ácido lácticas en la etapa 1
57
Figura 4.3. Tinción Gram de mohos en la etapa 1
59
Figura 4.4. Tinción Gram de levaduras en la etapa 1
61
Figura 4.5. Tinción Gram de bacterias ácido lácticas en la etapa 2
63
Figura 4.6.Tinción Gram de Mohos en la etapa 2
65
Figura 4.7. Tinción Gram de levaduras en la etapa 2
67
Figura 4.8. Tinción Gram de enterobacterias en la etapa 3
68
Figura 4.9. Tinción Gram de mohos en la etapa 3
70
Figura A.1. Siembras
92
Figura A.2. Recuentos
93
Figura A.3. Aislamientos
94
Figura A.4. Aislamientos
95
vi
PÁGINA
Figura A.5. Kit de identificación de levaduras (api 20 C AUX)
96
Figura A.6. Metodología de kits de identificación de
levaduras
98
vii
ÍNDICE DE ANEXOS
PÁGINA
ANEXO 1.
RECUENTOS
92
ANEXO 2.
RECUENTOS
93
ANEXO 3.
AISLAMIENTOS
94
ANEXO 4.
IDENTIFICACIÓN DE Escherichia coli
95
ANEXO 5.
IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS
96
ANEXO 6.
METODOLOGÍA DE KITS DE IDENTIFICACIÓN DE
97
LEVADURAS
viii
RESUMEN
“Chicha” es el nombre que reciben diversas bebidas fermentadas de origen
peruano, ecuatoriano, panameño, de bajo grado alcohólico, derivadas
principalmente de la fermentación de maíz y otros cereales de origen
Americano. También puede ser obtenida de la fermentación de diferentes
frutos. En esta investigación se analizó muestras de chicha de arroz de la
provincia Bolívar de dos productores diferentes; se realizó un análisis
microbiológico
que constó de
siembras,
recuentos,
aislamientos e
identificaciones de microorganismos (mohos, levaduras, bacterias acido
lácticas y enterobacterias) en las 3 etapas del proceso fermentativo: etapa
de iniciación (elaboración de la chicha), etapa fermentativa o de burbujeo y
etapa de finalización. La siembras fueron realizadas según la norma INEN
(NTE INEN 1 529-2:99); los recuentos fueron realizados con la aplicación de
la técnica de recuento en placa; para los aislamientos se aplicó la técnica por
estría en cultivos puros, tomando en cuenta criterios morfológicos y
fenotípicos de los microorganismos de interés; las identificaciones de
enterobacterias y bacterias ácido lácticas fueron realizadas por medio de
pruebas bioquímicas, en el caso de los mohos se aplicó visualización por
tinción con azul de lactofenol y para las levaduras se usó kits de
identificación (kits api 20 C AUX) aplicando la metodología proporcionada
por la empresa BIOMÉRIEUX. En los resultados obtenidos se identificó: 19
cepas de enterobacterias, 8 cepas de bacterias ácido lácticas, 19 cepas de
mohos; en cuanto a las levaduras fueron aisladas 19 cepas, de las cuales
fueron identificadas 10. Los recuentos de los microorganismos de interés en
el estudio variaron dependiendo de la etapa en que se encontró la bebida;
según datos bibliográficos la aparición de estos se atribuye a errores en la
higiene y manipulación durante la elaboración, la etapa del proceso de
fermentación que cursaba la bebida, además se puede asociar a la carga
microbiana de los ingredientes utilizados.
ix
ABSTRACT
“Chicha” is the name given to various fermented beverages of origin
Peruvian, Ecuadorian, Panamanian, with low alcoholic content, derived
primarily from the fermentation of corn and other cereals of American origin.
It can also be made by fermenting different fruits. In this investigation,
samples of rice chicha from two different manufacturers in the Bolivar
province were analyzed. A microbiological analysis consisted of planting,
counting, isolation, and identification of microorganisms (molds, yeasts, lactic
acid bacteria and enteric bacteria) in the three stages of the fermentation
process: the initiation phase (production of the chicha), the fermentation or
bubble phase, and the finalization phase.
The planting was carried out
according to the INEN standard (NTE INEN 1 529-2:99); the countings were
carried out with the application of the plate recount technique;
for the
isolation, a groove technique was applied to pure cultures, taking
morphological and phenotype criteria of the microorganisms of interest into
account; the identification of enteric bacteria and lactic acid bacteria was
carried out through biochemical tests, in the case of the molds visualization
via lactophenol blue stain was applied, and identification kits (api 20 C AUX)
were used for the yeast, applying methodology provided by BIOMÉRIEUX
Company. In the results, the following were identified: 19 enteric bacteria
families, 8 lactic acid bacteria families, and 19 mold families. In the yeasts,
19 families were isolated, 10 of which were identified. The countings of the
microorganisms of interest in the study varied depending on the stage the
drink was in. According to bibliographic data, the appearance of these is
attributed to errors in the cleanliness and manipulation during manufacture,
the stage of the fermentation process that the drink was in, also that can
associate to the microbial load of the ingredients used.
x
1. INTRODUCCIÓN
1. INTRODUCCIÓN
El Ecuador es un país con una gran diversidad cultural y étnica, por lo que
comprende costumbres y tradiciones diversas, las mismas que han sido
transmitidas de generación en generación. Una de ellas se refiere a la
elaboración de la bebida ancestral considerada sagrada desde tiempos
pasados denominada “chicha”, bebida fermentada no destilada elaborada a
base de cereales originarios de América (Aguirre, 2009).
La chicha en el Ecuador se consume con frecuencia en la Serranía y
Amazonía, sin embargo también se lo hace en menor cantidad en la Costa.
La preparación de esta bebida representa un gran impacto cultural
principalmente a nivel de las comunidades indígenas quienes la consumen
en sus principales fiestas y celebraciones como las de la Mama Negra, la
Fiesta de la Jora, la Fiesta de los Lagos, la Fiesta del Yamor, el Carnaval,
entre otras (Rosas, 2012).
En la serranía ecuatoriana en la provincia de Bolívar, la “chicha” es la bebida
oficial del Carnaval (fiesta mayor de la provincia), en esta fecha las familias
bolivarenses preparan esta bebida con los mejores ingredientes en un
“pondo de barro” y es ofrecida a los turistas. Esta bebida es elaborada a
base de maíz en el caso de la “chicha de jora” o a base de arroz en el caso
de la “chicha de arroz”.
Esta bebida es elaborada de forma tradicional, con la aplicación de recetas
que han sido modificadas con el pasar del tiempo. Pasa por un proceso de
fermentación de 4 a 15 días dependiendo de los ingredientes utilizados
(López, Ramírez, Mambuscay & Osorio, 2010).
La “chicha de arroz” es una bebida ancestral elaborada con su principal
ingrediente el arroz, que es uno de los cereales más consumidos en el
mundo, su preparación presenta varias modificaciones de acuerdo a la zona,
1
pero fundamentalmente consiste en moler el grano, remojarlo, cocinarlo,
añadir agua y endulzarlo, también se añade especias como: canela, clavo de
olor, congona, hierva luisa; además de eso se suele adicionar frutas como la
piña, naranjilla o guayaba para posteriormente colar la mezcla; esta bebida
suele servirse en estado natural o fermentada (Ramírez,
2011; Proaño,
2009).
La fermentación es un proceso que realizan muchos microorganismos,
efectuando reacciones sobre algunos sustratos. Este proceso espontáneo
comienza con el desarrollo de microorganismos como enterobacterias,
mohos, levaduras y bacterias ácido lácticas; siendo los principales
microorganismos causantes de este fenómeno las levaduras, mohos y
bacterias ácido lácticas, que habitualmente se encuentran en las frutas y
cereales, cada uno de ellos posee una característica propia sobre la
fermentación. En algunos casos son capaces de proporcionar un sabor
característico al producto final. A veces estos microorganismos no actúan
solos, sino que cooperan entre sí para la obtención del proceso global de
fermentación (Willey, Sherwood & Woolverton 2008; Evranuz et al., 2012).
Las levaduras se definen como hongos microscópicos unicelulares que se
encuentran distribuidas en la naturaleza, en el suelo, en la superficie de las
frutas, en el néctar de las flores y en ambientes acuáticos. Las levaduras
están conformadas por 350 géneros aproximadamente, son un grupo con
características morfológicas y fisiológicas bastante heterogéneas; son
microorganismos Gram positivos que poseen formas alargadas, esféricas,
entre otras. Las levaduras son importantes por su capacidad para realizar la
fermentación de hidratos de carbono, produciendo sustancias como CO 2 y
etanol (Ingraham & Ingraham, 1998; García, 2005).
Las bacterias ácido lácticas son un grupo de microorganismos que para su
desarrollo requieren de azúcares como glucosa y lactosa, además de
aminoácidos, vitaminas; estas se encuentran aisladas en diversos alimentos,
2
como vegetales, frutas, etc. Las bacterias ácido lácticas están conformadas
por
varios
géneros
con
características
morfológicas,
fisiológicas
y
metabólicas en común. Poseen la forma de cocos o bacilos Gram positivos,
no esporulados, no móviles; son microaerofílas y anaerobias facultativas.
Debido a la síntesis de una variedad de compuestos inhibitorios evitan el
desarrollo de bacterias patógenas en los alimentos (Ramírez, Rosas,
Velázquez, Ulloa & Arce, 2011; Hidalgo, 2002).
Los mohos son microorganismos que cumplen un papel secundario en la
fermentación, estos son considerados como ubicuos por su distribución ya
que se encuentran en el suelo, agua, alimentos, plantas, etc. Los mohos son
hongos multicelulares con estructuras ramificadas extensas denominadas
hifas; algunos de ellos pueden dañar a los alimentos, otros se usan en la
elaboración de quesos principalmente, también pueden ser utilizados como
fuente de vitaminas y proteínas (Pascual & Calderón, 2000; Mossel & Struijk,
2003; Anderson, 2005).
Las enterobacterias son microorganismos también considerados como
ubicuos, además forman parte de la microbiota de algunos órganos del ser
humano y animales. Los miembros de esta familia son Gram negativas,
contiene más de 110 especies. La mayor parte de enterobacterias son
indeseables ya que causan el deterioro de los alimentos, pero pocas
especies de ellas suelen utilizarse
en la fermentación de quesos
(Schaechter, 2009; García & Zamudio, 1998; Olivas, 2001).
En la actualidad la “chicha” es una bebida típica consumida en festividades
en casi todo el Ecuador, siendo así la “chicha de arroz” una de las bebidas
fermentadas consumidas con gran frecuencia en la Provincia Bolívar en su
fiesta mayor, el Carnaval. Por esta razón se ha elegido como lugar de
referencia a esta provincia para realizar un análisis microbiológico básico
completo de la chicha de arroz, con el fin de determinar la diversidad
microbiana presente en la misma, ya que no existen estudios similares y es
3
importante conocer qué microorganismos se encuentran presentes en esta
bebida. Posteriormente, a partir del presente estudio se podría determinar
las mejores cepas de microorganismos con capacidad fermentativa y
proyectar su uso en procesos específicos para la mejora de las mismas.
OBJETIVOS
Objetivo General
Identificar la diversidad microbiana presente en la chicha de arroz de la
Provincia de Bolívar.
Objetivos Específicos
Obtener muestras de chichas de arroz de la Provincia Bolívar.
Realizar análisis microbiológicos a la muestras.
Determinar qué tipos de microorganismos (enterobacterias, bacterias
ácido lácticas, mohos y levaduras) se encuentran presentes en la
chicha de arroz.
4
2. MARCO TEÓRICO
2. MARCO TEÓRICO
2.1.
LA FERMENTACIÓN
Fue descubierta por Louis Pasteur, la palabra fermentación proviene del latín
fermentare que significa ebullir; describe la ebullición aparente que se
observa en la fabricación de vino, a causa de la producción de dióxido de
carbono que se presenta como burbujas. Se dice que desde los años 30005000 A.C. en la India, Mesopotamia y Egipto ya se conocía principios
básicos sobre la fermentación, los mismos que aún se utilizan en la
actualidad para elaborar varios alimentos fermentados. La fermentación
implica un proceso en el que las materias primas se convierten en alimentos
fermentados por el crecimiento y las actividades metabólicas de los
microorganismos deseables (Hernández, 2003; Bibek & Arun, 2008).
La fermentación agrega valor a los alimentos mediante la producción de
compuestos
de
sabor,
alternando
la
textura,
aumentando
de
biodisponibilidad de nutrientes, preservando las características de vegetales
y frutas, destruyendo toxinas que se producen naturalmente en las materias
primas y enriqueciendo productos con metabolitos microbianos deseados
(Motville, Matthews & Kniel, 2008).
La fermentación desde el punto de vista bioquímico, es un proceso en el cual
las sustancias orgánicas sufren transformaciones, entre estas: reducciones y
oxidaciones, que dan como resultado una acumulación de productos, con un
balance positivo de energía, la misma que es usada en el metabolismo de
microorganismos para dichas reacciones (Diccionario Enciclopédico, 2009;
Hernández, 2003).
5
La fermentación desde el punto de vista microbiológico es un proceso
llevado a cabo por enzimas producidas por microorganismos en presencia o
ausencia de oxígeno, en el cual se produce metabolitos o biomasa con el
uso de materia orgánica, resultando así bebidas alcohólicas o productos
lácteos ácidos. La fermentación microbiana es empleada con frecuencia
para la conservación de los alimentos. (Koolman & Rohm, 2004; Hernández,
2003).
El proceso de fermentación consta de 3 etapas: preparación del inóculo,
selección del medio de cultivo y producción de biomasa de los metabolitos
de interés. Estas etapas pueden ser modificadas con el fin de lograr la
optimización del proceso fermentativo (Ramos, 2012).
Los procesos fermentativos se clasifican de acuerdo al tipo de producto a
obtener y a la presencia o ausencia de oxígeno en el proceso. Los productos
obtenidos en la fermentación son biomasa o metabolitos microbianos como
enzimas, butanol, etanol, ácidos orgánicos, acetona, etc. (Müller, 1964;
Ramos, 2012).
Existen varias rutas bioquímicas de uso de azúcares, pero las principales
son: La Glucólisis, Ciclo de Krebs y la Cadena Respiratoria. La Glucólisis es
la ruta principal del metabolismo de la molécula de glucosa y es la vía
encargada de obtener energía para la célula. Es muy importante conocer
sobre las rutas bioquímicas de la fermentación, de esta manera también se
puede manipular el proceso de degradación de sustancias orgánicas para
obtener sustancias deseadas diferentes (Hernández, 2003).
La cantidad de oxígeno es muy importante en las fermentaciones ya que con
la manipulación de este parámetro se puede modificar el proceso y de esta
manera incrementar la sustancia de interés; es así que, cuando la
concentración de oxígeno es limitada hay mayor cantidad de etanol, y
cuando la concentración es alta se obtiene como resultado mayor cantidad
6
de biomasa. Existen microorganismos capaces de crecer en presencia o
ausencia de oxígeno, entre estos la levadura Saccharomyces cerevisiae que
es la más utilizada en la industria alimenticia, de la cual se obtienes diversos
productos (Hernández, 2003; Tortotora, Funke & Case, 2007).
La fermentación aerobia es aquella donde se degradan los productos en
presencia de oxígeno por acción de microorganismos, produciendo
principalmente dióxido de carbono. La fermentación anaerobia es el proceso
donde se desarrollan metabolitos en ausencia de oxígeno por la actuación
de microorganismos, produciendo el denominado biogas, que es una mezcla
de múltiples componentes; cabe destacar que en ocasiones al inicio del
proceso se necesita una pequeña cantidad de oxígeno para que los
microorganismos de interés se desarrollen (Hernández, 2003).
Existen varios tipos de fermentación que se difenrencian por los productos
finales obtenidos y que se forman a partir del piruvato, los tipos más
comunes de fermentación son: la fermentación alcohólica que da como
producto final el etanol; fermentación láctica que da como producto final el
ácido láctico; fermentación propiónica que da origen al ácido propiónico y
ácido acético; fermentación fórmica que origina el ácido fórmico, láctico,
butanodiol y por último la fermentación butírica que obtiene como producto
final el ácido butírico, butanol, acetona, isopropanol (Rosero, 2010).
2.1.1. FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA
La fermentación alcohólica llamada también fermentación del etanol o
fermentación etílica, es un proceso en el que se transforma el mosto o zumo
azucarado de fruta en un líquido con un determinado contenido de alcohol
etílico. La fermentación alcohólica se debe a un complejo de enzimas
llamado zimasa; el proceso de fermentación es una reacción exotérmica que
dura aproximadamente una semana a una temperatura de 20ºC, donde se
obtiene una acidez neutra y un pH de 7, en este proceso se libera moléculas
7
energéticas (ATP) que es la energía puesta a disposición para las levaduras
(Vincent, Álvarez & Zaragoza, 2006; Espinosa, 2013)
La Fermentación Alcohólica es un proceso biológico en ausencia o presencia
de oxígeno, causado por la actividad de algunos microorganismos que
procesan hidratos de carbono como la glucosa, fructosa, sacarosa, almidón
y otros, para obtener productos finales como el alcohol en forma de etanol
(CH3-CH2-OH), dióxido de carbono (CO2) en forma de gas y moléculas de
ATP (trifosfato de adenosina) que juegan un papel de intermediario en la
acumulación de energía, pues para su formación se requiere relativamente
poca energía (Rosero, 2010).
En el proceso descrito en la Figura 2.1; el piruvato (sustrato clave para la
producción de energía y de la síntesis de glucosa) se convierte en etanol,
donde como primer paso libera dióxido de carbono del piruvato y este es
convertido en un acetaldehído, como segundo paso el acetaldehído es
reducido por el NADH a etanol y así se regenera la provisión de NAD+
(nicotinamida adenina dinucleótido)
para continuar con la glucolisis
(Campbell & Reece, 2005).
Figura 2. 1. Reacción de la Fermentación Alcohólica
(Campbell & Reece, 2005)
8
Durante el proceso de fermentación el etanol va aumentando de
concentración; debido a que es un compuesto tóxico cuando su
concentración alcanza aproximadamente a un 12% las levaduras tienden a
morir. Esta es una de las razones fundamentales por las que las bebidas
alcohólicas no destiladas no alcanzan valores superiores de 20% de
concentración de etanol (Vincent et al., 2006).
Según Espinosa (2013), los factores que limitan la glicólisis fermentativa del
etanol son complejos debido a la interrelación existente y a la naturaleza de
los parámetros intervinientes durante el proceso de fermentación, entre
estos factores se destacan: 1) concentración de etanol resultante, debido a
esto las levaduras toman resistencia; 2) acidez del sustrato, de acuerdo al
pH las levaduras pueden ser afectadas por el ambiente; 3) concentración de
azúcares, la concentración excesiva o baja de hidratos de carbono puede
detener la actividad bacteriana, así como también el tipo de azúcar y la
levadura responsable de la fermentación; 4) contacto con el aire, el uso de
recipientes fermentadores herméticos ayuda a una fermentación eficiente; 5)
temperatura, el proceso debe ser exotérmico ya que las levaduras son seres
mesófilos y a temperaturas elevadas pueden morir; 6) ritmo de crecimiento
de las cepas, en condiciones favorables se incrementa la concentración de
levaduras; 7) selección del microorganismo fermentador, el microorganismo
utilizado debe poseer alta velocidad de crecimiento, libre de contaminantes,
requerimientos
nutricionales
satisfechos,
fácil
conservación,
proceso
fermentativo completo en un tiempo corto.
Los procesos industriales de fermentación alcohólica han sufrido algunas
transformaciones con el objeto de aumentar su eficiencia, uno de los
avances más estudiados es la posibilidad de realizar fermentación alcohólica
continua con el objeto de obtener mayores cantidades de etanol.
Otra
posibilidad es la mejora de las cepas de levadura para poder lograr
aumentar el rendimiento de la producción (Morcillo, Cortés & García, 2013;
Ertola, Yantorno & Mignone, s.f.).
9
2.2. BEBIDAS FERMENTADAS TRADICIONALES
El consumo de bebidas fermentadas es una de las actividades más antiguas
del
hombre,
según
antecedentes
históricos
pruebas
científicas
y
arqueológicas han demostrado que la primera bebida fermentada fue la
cerveza, realizada a base de un cereal, producida por primera vez hace
4000 a.C. al sur de Babilonia. Se dice también que los egipcios fueron
grandes productores de cerveza y sus primeros productos fueron de
consistencia densa y se los llamaba “eli”; se cree que las pirámides egipcias
fueron construidas por personas que se alimentaban a base de esta dieta ya
que esta posee un gran valor energético, con el paso del tiempo los egipcios
mejoraron sus bebidas logrando hacerlas con una consistencia ligera y las
llamaron “hekt” (Páez, 2010).
Las bebidas fermentadas tradicionales por lo general se obtienen de la
fermentación de jugos de frutas azucarados, o a la vez se elaboran por
procesos de conversión del almidón de los cereales en azúcar;
son
generalmente bebidas espesas, ácidas y efervescentes que contienen
residuos en suspensión, levaduras fermentativas y otros microorganismos
(Sánchez, 2005).
Las bebidas fermentadas se originan de la fermentación de un fruto o un
grano donde intervienen bacterias y levaduras que transforman el azúcar de
la fruta en una serie de sustancias, entre ellas el alcohol etílico o etanol; este
proceso requiere determinadas condiciones físico-químicas, el grado
alcohólico de estas bebidas es más bajo que otras. Las bebidas fermentadas
elaboradas a base de granos son muchas, pero las más conocidas son la
cerveza, el sake, la chicha, el aguamiel; así como también las bebidas
fermentadas que se encuentran en el grupo de las de gran consumo están
las elaboradas a base de frutas entre estas: vino, sidra, pulque, colonche. En
la Tabla 2.1 se describe las principales bebidas fermentadas en el mundo
(Campillo, 1997).
10
Tabla 2. 1. Principales bebidas fermentadas en el mundo
BEBIDA
Vino
Cavas y
Champaña
CARACTERÍSTICAS
Originario de Roma, se deriva del latín vinum, es una bebida alcohólica
que se obtiene a partir de la uva, después de haber sufrido un proceso
de fermentación alcohólica del mosto, posee de 5 a 12 grados
alcohólicos (Campillo, 1997).
Son vinos originarios de Francia que son sometidos a una segunda
fermentación en botella, posee de 14 a 18 grados alcohólicos (Campillo,
1997; Valencia, 2010).
Vinos
Espumosos
Llamados también de aguja, tuvo su origen en Francia, este se obtiene
de una segunda fermentación dentro de la botella tapada con un
corcho, más la adición de azúcar, tienen una gradación mínima de 14
grados alcohólicos (Whiesenthal, 2004; Valencia, 2010).
Cerveza
Originaria de Egipto, producida con granos de cebada u otros cereales
fermentados en agua y aromatizado con lúpulo. Posee una graduación
alcohólica entre los 3 y 9 grados (García, Quintero & López, 2003).
Sake
Pulque
Colonche
Chicha
Sidra
Bebida de origen japonés que se obtiene de la fermentación del almidón
de arroz, puede clasificarse de acuerdo al grado de blanqueamiento así
como su perfume y sabor, posee de 12 a 16 grados alcohólicos (García,
Gil & Ortiz, 2004).
Bebida alcohólica mexicana, producida a partir de la fermentación del
aguamiel, especialmente del maguey posee aproximadamente 40
grados alcohólicos (Cervantes & Pedroza, 2007; Galán & Setien, 1999).
Originario de México, obtenida por fermentación espontánea del jugo de
tuna, especialmente de la tuna, es una bebida de color rojo que posee
un sabor dulce y una graduación alcohólica de 2 a 4 grados (Sáenz,
2006).
Bebida originaria en América central y América del sur de pocos grados
alcohólicas, resultante de la fermentación no destilada del maíz, yuca,
mandioca u otros cereales o diferentes frutos (Diccionario de la lengua
española, 2009; Aristizabal, 2004).
Bebida europea obtenida de la fermentación alcohólica del zumo de
manzana fresca prensada, posee de 5 a 9 grados alcohólicos (Vincent
et al., 2006; Pérez, 2001).
Son vinos blancos origarios de Italia, poseen características inoloras,
incoloras e insípidos, posee alcohol rectificada neutro, endulzado con
azúcar remolachada y aromatizado con extractos de hiervas
Vermuts y
Aromatizados maceradas, posee 2 grados alcohólicos (Lira, 1973; Vincent et al.,
2006).
Patxaran
Bebida de origen Maya elaborada de maceración de anís durante 6
meses en un lugar oscuro a 20 ºC de temperatura, más la adición de
cascara de naranja, granos de café y hojas de rosa, posee 25 grados
alcohólicos (Vincent et al., 2006).
11
Las bebidas fermentadas se han investigado desde la época colonial hasta
nuestros días, al inicio se centraron en aspectos historiográficos,
antropológicos, sociales y médicos; posteriormente incluyeron la química y
microbiología de estos productos. Las bebidas fermentadas han sido
importantes en el consumo diario de las personas, así como también son
elementos ceremoniales de numerosos grupos étnicos y que en la actualidad
la tradición sigue viva, al grado de ser consumidas con gran frecuencia
alrededor del mundo. En la Tabla 2.2 se destacan las principales bebidas por
continentes (Velázquez & Aguilar, 2011).
Tabla 2. 2. Principales bebidas fermentadas de acuerdo al continente
CONTINENTE
África
BEBIDA
CARACTERÍSTICAS
“ogi”
Bebida elaborada a base de masa de maíz y
agua fermentada por de 1 a 3 días, posee un
sabor amargo y color ligero (Lupien, 1995).
“gari”
Bebida hecha a base de yuca rayada, la masa
resultante es fermentada de 2 a 3 días para
posteriormente freírla, mezclarla con agua y
especias (García et al.,2003).
“pito”
Es una especie de vino de mijo, parecida a la
cerveza, posee un sabor ácido y un color opaco
(Lupien, 1995).
“Burukutu” y
Bebidas elaboradas a partir de sorgo malteado,
el proceso consta de agriar, hervir, macerar, y
dejar fermentar, esta bebida; posee un sabor
ácido, consistencia espesa y un bajo contenido
de alcohol (Rolighedsvej & Frederiksberg, 2002).
“otika”,
Asia
“Sobia”
Bebida de sabor
agridulce elaborada con
cereales fermentados como, la malta y harina de
trigo, estos ingredientes son suspendidos en
agua, se adiciona azúcar, especias; se fermenta
a temperatura ambiente de 1 a 2 días (Gassem,
2001).
“Toddy”
Vino de palma color marrón elaborado con la
savia obtenida de varias especies de palmas, el
proceso consta en fermentar la salvia. Existen
vinos de palma en los cuales cada uno se
diferencia de otro por el tipo de palma (Kofi,
Aidoo, Rob & Prabir, 2005).
12
continuación…
Asia y Europa
América
“sake”
Bebida japonesa ancestral, elaborada con malta
de arroz, agua pura y esporas llamadas koji-kin
que son empleadas para la fermentación, el
“sake” es una bebida dulce de aspecto lechoso
de sabor fuerte ya que tiene el contenido
alcohólico más alto del mundo, es poco dulce
(Saavedra, 2012).
“tuba”
Bebida fermentada tradicional elaborada a nivel
industrial en algunos países; preparada con el
néctar o agua miel obtienida de la inflorescencia
de las palmas de coco que luego de un proceso
de fermentación y cocción queda lista para ser
consumido; si esta bebida es dejada es dejada
en reposo durante ocho días, se convierte en
vinagre o a la vez puede convertirse en
aguardiente (Velázquez & Aguilar, 2011).
“Kombucha”
Bebida fermentada tradicional obtenida de la
fermentación del té negro endulzado con un
cultivo simbiótico de levaduras y bacterias
(Greenwalt, Steinkraus & Ledford, 2000).
“Axokot”
Bebida elaborada con pasta de maíz preparada
con cal y axokotxihuit (yerba dulce), depositada
en una olla de barro y tapada con hojas de
plátano de 2 a 3 días para luego ser llevado a
cocción; posee un color verde, sabor agrio no
alcohólico y un gran valor tradicional (Sánchez et
al., 2010).
“tesgüiño”
Bebida fermentada semejante a la cerveza,
elaborada a base de maíz germinado o caña de
maíz. En su proceso se remoja la materia prima,
muele, cocinar en agua, se cola, se mezclar y
se fermenta (Páez, 2010).
“Pozol”
Bebida fermentada elaborada a base de masa de
maíz, cacao molido, leche, horchata, vainilla y
agua fría. Según la tradición este era servido en
vasijas de loza (Martínez, 2013).
“Chicha”
Bebida tradicional elaborada a base de maíz,
trigo, yuca, frutas ácidas como la piña, maní, etc.
En su preparación se mezcla y se cocina los
ingredientes ya sea el maíz, el trigo o la yuca con
agua, panela, especias y se deja fermentar de 15
a 20 días para cereales y 4 a 8 días en frutas y
tubérculos, a temperatura ambiente, posee un
alcohólico bajo (López et al., 2010).
13
2.3. LA CHICHA
2.3.1. SIGNIFICADO
La palabra “chicha” significa agriar una bebida. Según el Diccionario de la
Real Academia Española kuna chichab es un término que proviene de los
aborígenes panameños, que significa maíz. Sin embargo según otros
autores desciende del náhuatl chichiatl, que significa “agua fermentada”
(Real Academia Española, 2009; Rivera, 1878).
2.3.2. ORIGEN
La “Chicha” es una bebida fermentada de origen indígena muy importante en
América Central y América del Sur, desde épocas prehispánicas esta bebida
era consumida en rituales y festividades. “Chicha” es el nombre que reciben
diversas variedades de bebidas que poseen bajo grado alcohólico,
generalmente de 1 a 3 grados; son principalmente derivadas de la
fermentación del maíz y otros cereales de origen Americano, también puede
ser obtenida de la fermentación de diferentes frutos como la naranjilla, piña,
mora, por lo general frutas ácidas (Granada, 1980; Chavarrea, 2011).
La palabra “Chicha” ya era muy conocida un poco antes del siglo XVI, esta
bebida es muy importante por su tradición en países de América Latina
desde antes de la llegada de los españoles. Se dice que la “chicha” fue
descubierta antiguamente durante el mandato de Tupac Yupanqui, cuando
fuertes lluvias deterioraron los silos de maíz ocasionando la germinación del
maíz derivando así la malta de maíz, posterior a esto se ordenó la
distribución de estas maltas, tratando de aprovecharlas en forma de “mote”,
puesto que sus características organolépticas eran desagradables ya que
poseían un aspecto parecido al engrudo lo desecharon, pero se dice que
unos indígenas hambrientos del lugar lo consumieron y quedaron en un
estado de
extrema embriaguez, descubriendo de este modo que este
14
engrudo de maíz poseía un valor alcohólico considerable, lo ocurrido fue
transmitido por todo el lugar y empezaron a elaborar una bebida con esto
llamándola “chicha” (Rosas, 2012; Cappareli, Chevalier & Piqué, 2009).
Desde lo ocurrido se empezó a colocar el maíz remojado en vasijas de barro
y se lo enterraba en la tierra por algunos meses para lograr fermentar, en
ocasiones las mujeres del pueblo masticaban los granos de maíz para
acelerar el proceso de fermentación, posterior a esto cocinaban la bebida;
esta bebida se convirtió en la predilecta de los grandes señores de la
nobleza inca e inclusive fue utilizada para las ceremonias en honor a los
dioses. La chicha era considerada como una bebida nutritiva por lo que con
la llegada de los españoles, cuando se instaló el Virreynato, estos ordenaron
que se dé a los indios que trabajaban en las mitas para proporcionarles
energía; y fue así que su forma de preparación se extendió por toda la
América Española (Aguirre, 2009; Chavarrea, 2011).
A finales de la época de la colonia, comenzaron a crearse tiendas
especializadas en el consumo de chicha, llamados chicheríos pero cuando
llegó la época de la revuelta contra los españoles, los chicheríos fueron
cerrándose para evitar la discusión de ideas políticas, por lo cual los
pobladores se ingeniaron varios métodos para vender su chicha ( Restrepo,
2012).
Con el paso del tiempo la elaboración de la chicha ha ido mejorando, hoy en
día ya no se mastica el grano de maíz, en su lugar se utiliza una piedra de
moler grande junto con una batea donde se elabora la harina de maíz, luego
de ser molida se coloca en ollas con agua tibia adicionando hierbas entre
ellas el cedrón y la hierba luisa, dependiendo de las costumbres del lugar
también adicionan frutas ácidas, especias como la canela, el anís y para
obtener un sabor dulce colocan panela (Aguirre, 2009).
15
En la actualidad se elabora “chicha” de varios cereales como: arroz, quinua,
avena, machica, incluso de tubérculos como la yuca. Esta bebida es típica
de todos los países del callejón interandino, en especial en Perú y Ecuador
donde tuvo un papel protagónico durante casi dos mil años por lo que esta
bebida es una parte importante de la vida de los pueblos andinos. La chicha
es un elemento imprescindible de la ritualidad y la soberanía del pueblo
indígena (Rosas, 2012).
2.3.3. LA CHICHA EN AMÉRICA
En Chile se conoce por chicha a las bebidas obtenidas de la fermentación de
diversas frutas, en especial de la uva, en algunos lugares también es
mezclada con un aguardiente. En Colombia la chicha de jora es elaborada
de manera frecuente y en honor a esta se realiza el “Festival de la chicha, el
maíz, la vida y la dicha en honor a la tradición”. En Panamá es muy popular
chicha de arroz, además de esta también elaboran chicha mediante la
fermentación de piña, tamarindo, papaya, etc. En Venezuela se elabora dos
tipos de chicha, la chicha criolla que no contiene alcohol y la chicha andina
que si tiene alcohol. En Nicaragua la chicha es elaborada a partir de maíz en
su mayoría, esta posee el nombre de acuerdo al departamento, entre estas:
chicha bruja, chicha pujagua, chicha raisuda. En Perú las variedades de la
chicha peruana se encuentra la chicha blanca, chicha de cacao, chicha de
jora, chicha de maní, chicha de quinua, chicha de yuca, chicha de las siete
semillas, entre otras (Aguirre, 2009).
2.3.4. LA CHICHA EN ECUADOR
En Ecuador la chicha es una bebida típica de las comunidades indígenas, su
preparación representa un gran impacto cultural principalmente a nivel de las
comunidades indígenas quienes la consumen en sus principales fiestas y
celebraciones como las de la Mama Negra, el Carnaval , La Fiesta de los
Lagos, Inti Raymi, el Yamor, Corpus Christi, la Fiesta de la Jora y Fiestas
16
Religiosas, entre otras. La chicha generalmente se toma a temperatura
ambiente. En el Ecuador se elabora a partir de la fermentación del maíz,
quinua, arroz, cebada, harina o con la mezcla de varios granos a la vez,
acompañadas de panela o azúcar común; así como también, frutas de la
región como el tomate de árbol, mora, piña, palma de chonta, taxo y
naranjilla, etc., además de la adición de hierbas aromáticas en la mayoría de
los casos. Generalmente en este proceso se deja fermentar por períodos de
tres a veinte días hasta lograr el grado alcohólico deseado (Aguirre, 2009;
Rojas, 2013).
Cada provincia acostumbra elaborar un tipo de chicha de acuerdo a su
tradición, en la Tabla 2.3 se destaca las principales chichas elaboradas en
las provincias del Ecuador.
Tabla 2. 3. Principales chichas elaboradas en el Ecuador de acuerdo a sus
provincias
PROVINCIA
BEBIDA
CARACTERÍSTICAS
“chicha de jora”
Es elaborada con fermento de maíz de jora,
endulzada con panela, adicionada especias y
frutas de acuerdo a la preferencia.
“chicha de quinua”
Elaborada con su principal ingrediente la quinua,
endulzada con panela o azúcar y adicionada
especias.
Elaborada con su principal ingrediente el arroz,
endulzada con panela o azúcar,
adicionada
especias y frutas de acuerdo a la preferencia.
chicha de arroz”
Costa y
Sierra
“chicha
machica”
Sierra
de Elaborada con su principal ingrediente la machica,
adicionada de panela o azúcar y especias.
“chicha huevona”
Elaborada con maíz de jora, huevo y cerveza.
“chicha del Yamor”
Elaborada con 7 tipos de maíz como el: chulpi,
maíz negro, amarillo, blanco, canguil, morocho y
jora (maíz fermentado), adicionada especias y
endulzada con azúcar o panela.
17
continuación…
“chicha de yuca”
Amazonía
“chicha
chontaduro “
Elaborada en las tribus amazónicas en su
preparación las mujeres de la comunidad mastican
la yuca y la dejan fermentar en vasijas de barro.
de Elaborada con chontaduro rayado y endulzado con
panela o azúcar.
(Rosas, 2012)
2.4. LA CHICHA DE ARROZ
La chicha ha sido considerada a través del tiempo como una bebida
ancestral mágica por su sabor y tradición ya que fue inventada por nuestros
antepasados los indígenas sudamericanos. Este antiguo brebaje presenta
algunas variantes en su receta según la zona donde se prepare (Aguirre,
2009).
En los países andinos como Ecuador, Perú, Colombia, Venezuela y Bolivia,
además del maíz que es una gramínia usada como ingrediente para la
elaboración de la chicha de jora, está el arroz que es uno de los cereales
más consumidos en el mundo y que es el principal ingrediente que da origen
a la “chicha de arroz”. La “Chicha de Arroz” es una bebida de sabor dulce y
suave, considerada como una bebida histórica que puede constituirse desde
refresco hasta una especie de vino embriagante (Proaño, 2009).
Su preparación presenta varias modificaciones de acuerdo a la zona, pero
fundamentalmente consiste en moler el grano, remojarlo, cocinarlo, añadir
agua, endulzar con panela o azúcar, en algunas ocasiones se adiciona
leche, esencia de vainilla o almendras, también especias como canela, clavo
de olor, congona, hierva luisa; además de eso se puede adicionar frutas
como la piña, naranjilla o guayaba para posteriormente colar la mezcla. Esta
bebida puede ser consumida en forma instantánea o se puede dejar en
reposo en un recipiente hermético de 3 a 8 días hasta lograr la fermentación
para consumirla con un sabor más fuerte (Proaño, 2009; Ramírez, 2011).
18
2.5. MICROORGANISMOS FERMENTADORES
2.5.1. LEVADURAS
Las levaduras son microorganismos que se encuentran en las frutas, flores,
exudados de plantas; estos microorganismos fermentan los azúcares
produciendo CO2 y etanol. Las levaduras son muy importantes en la
industria de los vinos, cervezas, wisky, pan; por lo general las cepas más
utilizadas son las de Saccharomyces cerevisiae y otras que se relacionan
con ella (Ingraham & Ingraham, 1998).
La mayoría de las levaduras son saprofitas y pueden desarrollarse en
materia orgánica muerta, otras son parásitos que pueden causar
enfermedades en humanos, animales y plantas. Estos microorganismos
pueden ser facultativos u obligados por lo que pueden desarrollarse en otros
seres. Entre las levaduras saprófitas las fermentativas llevan a cabo la
fermentación alcohólica de azúcares que es la que aprovecha el hombre
(García, 2005).
2.5.1.1.
Características
Las levaduras son hongos unicelulares, están agrupados en 350 especies,
clasificadas en 39 géneros. Las levaduras son bastante heterogéneas en su
morfología y fisiología. Poseen un color blancuzco aunque hay algunas que
son de color amarillo, rojo o negro, de aspecto cremoso. Las condiciones
ambientales influyen para que algunos hongos crezcan como filamentos o
como levaduras, este fenómeno es conocido como dimorfismo y puede
presentarse en algunos hongos patógenos (Parés & Juarés, 1997; García,
2005).
Las levaduras son organismos heterótrofos por lo que necesitan carbono
orgánico para obtener energía y sintetizar sus componentes celulares, sin
19
embargo sus requerimientos nutricionales pueden variar de acuerdo a la
especie. Los azúcares son considerados como la mejor fuente energética,
además pueden obtener nitrógeno de sustancias orgánicas e inorgánicas
para sintetizar sus proteínas, aunque muchas especies pueden sintetizar el
ión amonio (NH
) (García, 2005).
Las levaduras no pueden desarrollarse en condiciones extremas como los
mohos, la mayor parte de las levaduras pueden crecer en un rango de pH de
4,5 y 8, pero el valor óptimo está en el rango de 5,5 y 7,5. Las levaduras
pueden desarrollarse a una temperatura de 25, 30, 35, 37 y 40 ºC, pero las
levaduras saprófitas crecen en un rango de 22 a 30 ºC (Lurá et al., 1997;
Mossel & Struijk, 2003).
La mayoría de las levaduras pueden crecer de manera óptima en una buena
cantidad de agua,
además de poca cantidad, también en soluciones
concentradas de azúcar o sal, o también pueden desarrollarse en cantidades
elevadas de soluto y se las llama osmófilas, que son las que deterioran los
alimentos. Diferentes especies de levaduras pueden ser diferenciadas por
su capacidad de sintetizar diferentes compuestos nitrogenados
(García,
2005).
2.5.1.2.
Morfología
Las levadura son grandes comparadas con una bacteria común, posee un
tamaño aproximado de 10 - 20 µm de diámetro, aunque la mayoría puede
estar entre 3 y 8 µm de diámetro. En cuanto a su forma como se puede
observar en la Figura 2.2, la mayoría son ovoides, también pueden ser
alargadas o esféricas con forma de limón o pera, incluso pueden ser
triangulares, en algunos casos forman cadenas de células alargadas,
adheridas de modo suelto, por lo que se las denomina seudomicelio. Otras
especies forman breves extensiones de verdadero micelio la mayor parte de
veces ramificado. (García, 2005; Pascual & Calderón, 2000).
20
Su estructura es la de una célula eucariota, no poseen flagelos, algunas
presentan un material viscoso compuesto por polisacáridos que rodea la
célula y es semejante a la cápsula bacteriana (Parés & Juarés, 1997).
Figura 2. 2. Morfología de las levaduras
(García, 2005)
2.5.1.3.
Reproducción
Las levaduras pueden reproducirse de forma asexual y sexual. La
reproducción asexual por fisión binara se da por mitosis, dando como
resultado dos células de idéntico tamaño y la reproducción asexual por
gemación se da por la formación de una yema que da origen a otra célula
igual, hay 3 tipos de gemación, entre estas: gemación polar cuando las
yemas crecen en uno de los extremos; gemación bipolar cuando las gemas
crecen en los dos extremos y gemación multipolar cuando las gemas crecen
en diferentes partes (Montoya, 2008; Jiménez, 1999; Hidalgo, 2002).
La reproducción sexual se da por medio de ascosporas o basidiosporas,
ambos tipos de esporas requieren que ocurra la unión de núcleos
compatibles y una división meiótica. Este proceso se inicia con dos células:
una positiva y una negativa que se aproximan, dándose plasmogamia, luego
la cariogamia, y dan como resultado final ocho ascosporas en un asca
(Montoya, 2008; García, 2005).
21
2.5.1.4.
Taxonomía
Las levaduras constituyen un grupo taxonómico complejo y heterogéneo que
incluye ascomicetos y basidiomicetos, que puede ser observado en la Tabla
2.4. La unidad más importante en la taxonomía de las levaduras es la
especie y se define como el conjunto de cepas que comparten numerosas
propiedades estables. La identificación de las levaduras a nivel de especie
depende de las características fisiológicas y bioquímicas (Hidalgo, 2002;
Mossel & Struijk, 2003).
Tabla 2. 4. Taxonomía de las levaduras
Familia
Ascomicetos
Género
Schizosaccharomycetaceae
Schizosaccharomyces
Metschnikowiaceae
Metschnikowia
Saccharomycetaceae
Saccharomyces,
Dekkera,
Debaryomyces,
Kluyveromyces,
Pichia,
Zygosaccharomyces, Torulaspora.
Saccharomycodaceae
Hanseniaspora y Saccharomycodes
Candidaceae
Brettanomyces,
Candida
y
Kloeckera
Basidiomicetos
Sporobolomycetacea
Rhodotorula
Cryptococcaceae
Cryptococcus
(Hidalgo, 2002)
2.5.1.5.
Importancia en la Industria de los Alimentos
Las levaduras posee gran importancia a nivel industrial ya que la mayoría se
usan en la producción de cerveza, vino y pan; las especies que se cultivan
para la producción comercial son los géneros Saccharomyces, Candida y
Kluyveromyces, pero la de mayor importancia comercial es la levadura
Saccharomyces cerevisiae por su alto contenido de vitaminas y minerales,
ya que por su funcionalidad se utiliza en la elaboración de diferentes tipos de
productos en la industria alimenticia, además a partir de ella se puede
22
obtener enzimas, glicerina, saborizantes. Las levaduras del género Candida,
en especial la C. utilis es muy utilizada para fortificar alimentos de animales,
a través de esta se puede obtener proteína microbiana (PUC) y levadura
seca. La levadura Kluyveromyces fragilis, y K. lactis son utilizadas en la
industria láctea y cárnica (García, 2005; Roberts & Daban, s.f.).
2.5.2. MOHOS
Los mohos son organismos eucariotas que se encuentran en todas partes,
en el suelo, agua, alimentos, plantas, etc., y son transportados por el aire,
materiales, envases, animales, seres humanos. La mayoría de las industrias
alimenticias poseen las condiciones ambientales y las materias orgánicas
necesarias para su desarrollo por lo que constituyen un problema. Los
mohos son hongos multicelulares que carecen de clorofila y forman
estructuras ramificadas extensas denominan hifas, por lo tanto el conjunto
de hifas se llama micelio los que al crecer sobre un alimento se hace visible
(Pascual, 2005; Mossel & Struijk, 2003).
2.5.2.1.
Características
Los mohos pueden crecer en ambientes que se consideran hostiles para las
bacterias, ya que estos son quimioheterótrofos es decir que absorben los
nutrientes en lugar de ingerirlos. Los mohos pueden crecer a una
temperatura entre 22 - 30 ºC, un pH de 5, casi la mayoría de estos son
aerobios, resistentes a la presión osmótica ya que pueden desarrollarse en
concentraciones elevadas de azúcares, sales o sustancias de baja humedad
y requieren algo de nitrógeno para crecer
(Tortora et al., 2007; García,
2005).
En ciertos casos se consideran como microorganismos que pueden dañar a
los alimentos, en ocasiones deteriora el alimento antes de que sea visible,
algunas especies producen micotoxinas en alimentos de bajo pH, harinas,
23
miel, leche concentrada y productos salados. Otros se usan en la
elaboración de alimentos como quesos y otros, también se usan como
fuente de vitaminas, proteínas; además de esto algunas especies como el
Penicillium son de gran utilidad en la elaboración de antibióticos (Anderson,
2005).
2.5.2.2.
Morfología
Las hifas de casi todos los hongos filamentosos poseen tabiques que las
dividen en unidades similares a una célula mononucleada, estas células se
llaman tabicadas o septadas, en algunas clases de mohos las hifas no
poseen tabiques, estas hifas se denominan cenocíticas, que pueden ser
observadas en la Figura 2.3. Las hifas crecen alargándose desde sus
extremos y cada parte de esta puede crecer cuando se desprende un
fragmento, este puede alargarse para formar una nueva hifa. La porción de
una hifa que obtiene nutrientes se denomina hifa vegetativa, la porción que
participa en la reproducción es la hifa reproductiva o aérea que es la que
produce esporas reproductivas. Cuando las condiciones ambientales son
adecuadas las hifas crecen hasta formar una masa filamentosa llamada
micelio que puede ser observada a simple vista (Tortora et al., 2007).
Figura 2. 3. Morfología de los mohos
a) hifas no septadas; b) hifas septadas
(García, 2005)
24
2.5.2.3.
Reproducción
Los mohos pueden reproducirse de forma sexual y asexual por medio de
esporas diferenciadas como sexuales o asexuales, estas esporas se forman
a partir de las hifas aéreas de modos diferentes, de acuerdo a la especie.
Las esporas asexuales se forman por hifas de un organismo, cuando estas
germinan se convierten en organismos genéticamente idénticos al parental.
Las esporas sexuales se forman de la unión de dos núcleos de dos cepas de
distinto sexo pero de la misma especie, este tipo de esporas son menos
frecuentes que las asexuales. En el proceso de reproducción después de
que un hongo filamentoso forma una espora, esta se separa de la célula que
le dio origen y germina para formar un nuevo hongo filamentoso. Las
esporas de los mohos pueden sobrevivir por largos períodos de tiempo en
ambientes secos y calurosos ( Mossel & Struijk, 2003; Tortora et al., 2007).
2.5.2.4.
Taxonomía
El género y especie de los mohos se determina mediante las características
morfológicas de las cepas, mediante el uso de técnicas de biología
molecular, técnicas bioquímicas, caracteres fisiológicos. De acuerdo a la
Tabla 2.5. existen 4 principales familias reconocidas en los mohos con sus
respectivas
especies,
entre
estas:
Zygomycetes,
Ascomicetes,
Deuteromicetos y Oomycetes (Mossel & Struijk, 2003; Prats, 2005).
25
Tabla 2. 5. Principales géneros taxonómicos de los mohos
Familia
Géneros.
Zygomycetes
Mucor
----Rhizopus
----Absidia
----Syncephalastrum
----Thamnidium
----Rhizomucor
----Emericela
----Eurotium
----Neosartorya
----Byssochlamys
----Aspergillus
----Penicillium
200 especies comunes
en alimentos.
Fusarium
80 especies comunes en
alimentos.
Geotrichum
----Monilia
----Alternaria
----Trichothecium
----Cladosporium
----Phytophthora
-----
Ascomycetes
Deuteromicetos
Oomycetes
Pythium
Especies Comunes
-----
(Mossel & Struijk, 2003; Ahmed & Carlstrom, 2006)
2.5.2.5.
Importancia en la Industria de los Alimentos
En la actualidad existen varios tipos de mohos empleados en la industria
alimenticia, los mohos del género Penicillium, Mucor, Rhizopus, tienen un
protagonismo primordial en la maduración de los quesos Brie, Camembert y
Roquefort. El género Aspergillus es útil en la industria de las bebidas sin
alcohol para la fabricación del ácido cítrico (Campbell & Reece, 2005).
Los mohos más utilizados en la industria de la charcutería son: Penicillium
nalgiovense y Penicillium chysogenum. Además de estos se suelen utilizar el
P. candidum, P. camembertii, P. roquefortii, P. canescens, P. simplicissimun,
P. micznski, P. olsonii, P. frecuenstans (Rodríguez, Encinas,
González,
López & Otero, 2001).
26
2.5.3. ENTEROBACTERIAS
Las Enterobacterias son microorganismos ubicuos de distribución mundial,
se encuentran en el aire, suelo, agua, tracto intestinal de personas y
animales. Por lo general son microorganismos patógenos, pero que en la
actualidad algunas especies de los mismos son importantes en la
elaboración de productos en la industria alimentaria (García & Zamudio,
1998; Olivas, 2001).
2.5.3.1.
Características
Las Enterobacterias tienen como hábitat natural el intestino del hombre y
animales. Son microorganismos aerobios y anaerobios facultativos. Se han
descrito alrededor de 27 géneros con más de 110 especies; son positivos a
la prueba de la catalasa. Las Enterobacterias fermentan la lactosa en un
periodo de 48 horas a un rango de 30-37ºC de temperatura (Koneman &
Allen, 2006; Pascual & Calderón, 2000).
2.5.3.2.
Morfología
Están formadas por bacilos gram negativos, miden de 1 a 0,6 µm, son no
esporulados, hay enterobacterias móviles y no móviles, algunas tienen
movilidad por flagelos perítricos, son microorganismos aerobios y anaerobios
facultativos; muchos forman cápsulas, producen fimbrias y pilis. Estos
microorganismos reducen nitratos o nitritos, fermentan a la glucosa con la
formación de ácido y algunos gases. A simple vista pueden tener un tamaño
relativamente grande, color gris mate; pueden ser secas o mucoides en agar
sangre ovina, hay colonias que aparecen de color rojo en agar MacConkey o
color verde brillante en agar eosina-azul de metileno, esto indica que el
microorganismo puede formar ácido a partir de lactosa en el medio. La
bacteria que más se destaca dentro de este grupo es Escherichia coli, en la
27
Figura 2.4 se puede observar la morfología de esta (Romero, 2007; Pascual
& Calderón, 2000).
Figura 2. 4. Morfología de enterobacterias
(López, 2012)
2.5.3.3.
Reproducción
Las enterobacterias se reproducen de forma asexual por fisión binaria, este
mecanismos consiste en una serie de pasos, entre estos: se produce dos
duplicados en la información hereditaria en una sola molécula de ADN, luego
el cromosoma de la célula se duplica y cada uno de estos se une a un punto
diferente de la molécula, posterior a esto esta se separa formando un septo,
luego se abre la membrana separándose las bacterias hijas (García, 2005).
Otro mecanismo de reproducción es la conjugación bacteriana que es el
proceso de transferencia de información genética desde una célula donadora
a otra receptora y requiere contacto directo entre ambas, donde intervienen
las estructuras superficiales llamados pilis (Tortora et al., 2007).
2.5.3.4.
Taxonomía
La diferenciación de las Enterobacterias se basa en la presencia o ausencia
de algunas enzimas codificadas por material genético del cromosoma
bacteriano, estas enzimas dirigen el metabolismo, pueden detectarse por
28
medio de pruebas especializadas, por lo que necesario determinar un perfil
bioquímico para la identificación de una especie, o a la vez realizar pruebas
serológicas o reacción a antibióticos. En la Tabla 2.6 se señala las tribus,
géneros y especies principales de las enterobacterias (Koneman & Allen,
2006; García & Zamudio, 1998).
Tabla 2. 6. Taxonomía de las enterobacterias
Tribu
Géneros
Especies
Escherichieae
Escherichia
6 especies
Shigella
4 especies
Salmonelleae
Salmonella
7 especies
Citrobactereae
Citrobacter
3 especies
Klebsiella
6 especies
Hafnia
1 especie
Enterobacter
13 especies
Serratia
11 especies
Pantoea
2 especies
Kluyvera
2 especies
Erwinieae
Erwinia
17 especies
Proteeae
Proteus,
4 especies
Morganella
2 especies
Providencia
5 especies
Yersinieae
Yersinia
11 especies
Edwardsielleae
Edwardsiella
3 especies
Yokonella
1 especie
Cedecea
3 especies
Pragia
1 especie
Leminorella
2 especies
Tatumella
1 especie
Xenorhabdus
5 especies
Klebsielleae
(Hensyl, 2000; Koneman & Allen, 2006; Ausina & Moreno 2005)
29
2.5.4. BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS
Las
bacterias
lácticas
o
también
bacterias
ácido
lácticas
son
microorganismos que se encuentran presentes en las plantas, crecen a
expensas de los nutrientes liberados en la descomposición de vegetales,
también están presentes en las vendimias y en los vinos pudiendo
desarrollarse o no según las condiciones del medio. Son bacterias que
generalmente
se
encuentran
en
plantas
y
productos
lácteos
en
descomposición produciendo ácido láctico como producto de la fermentación
de carbohidratos. Las bacterias ácido lácticas son inócuas para los
humanos, además sus productos metabólicos son agradables, por lo que
poseen propiedades de conservación para los alimentos de consumo diario y
materias primas en la industria alimenticia (Hidalgo, 2002; Ingraham &
Ingraham, 1998; Motville et al., 2008).
2.5.4.1.
Características
Son organismos que no forman esporas, son inmóviles. Este tipo de
bacterias abarcan tanto cocos como bacilos. Las bacterias lácticas son gram
positivas, ácido tolerantes, su pH está en el rango de 4,8 - 9,6 por lo que
pueden sobrevivir en medios donde otras bacterias no soportarían la
actividad producida por los ácidos orgánicos. Los medios de cultivo para
bacterias lácticas típicamente incluyen fuentes de carbohidratos celular
(Hidalgo, 2002; Pares & Juares, 1997).
Las bacterias ácido lácticas pueden clasificarse como: anaerobias estrictas,
anaerobias facultativas y microaerófilas. Las bacterias lácticas pueden
metabolizar un gran número de sustancias que contiene el vino entre estos
los azúcares, ácido málico, ácido cítrico, ácido tartárico, glicerina y algunos
aminoácidos (Flanzy, 2003; Academia del Área de Plantas Piloto de
Alimentos, 2004).
30
2.5.4.2.
Morfología
Las bacterias lácticas son microorganismos no esporulados, distinguidos
como cocos por su forma esférica o ligeramente ovoide, también pueden
estar
agrupados
en
parejas
(diplococos),
o
en
hileras
simples
(estreptococos), en hileras pareadas (estreptodiplococos), en grupos de
cuatro (tétradas), en forma cúbica (sarcinas), en masas irregulares
(estafilococos), etc., que puede ser observado en la Figura 2.5; además de
estas también puede presentar forma alargada como bacilos o bastones, los
mismos que pueden estar aislados o agrupados en parejas (diplobacilos), o
en hileras simples (estreptobacilos). El tamaño aproximado de los cocos es
de 0,4 a 1,0 micras de diámetro y los bacilos pueden presentar 0,5 micras de
ancho y de 2,0 a 5,0 micras de largo ( Hidalgo, 2002; Cotter & Petersen,
2007).
Figura 2. 5. Morfología de las bacterias ácido lácticas
(Hidalgo, 2002)
2.5.4.3.
Reproducción
Las bacterias ácido lácticas se reproducen de forma asexual por fisión
binaria, en este proceso se produce como resultados células hijas. Algunas
también se reproducen de forma sexual por medio de conjugación
31
bacteriana, en este proceso se transfiere una pequeña cantidad de ADN
(Tortora et al, 2007; García, 2005).
2.5.4.4.
Taxonomía
Comúnmente las bacterias ácido lácticas se clasifican en 2 familias:
Clostridium y Actimomicetos según la Tabla 2.7. En la familia Clostridium se
encuentran las bacterias lácticas enológicas. En la familia Actimomicetos
agrupa las bacterias lácticas alimentarias. Independientemente de la
clasificación común de las bacterias ácido lácticas, durante los últimos años
con el avance de la biología molecular se están incluyendo parámetros
adicionales en los esquemas de clasificación, como comparaciones
genéticas por medio de un análisis de secuencia del ADN de las bacterias.
Además de esto también se pueden clasificar de acuerdo a su naturaleza
fermentativa, o por su forma (Hidalgo, 2002; Wood & Warner, 2003; Bibek &
Arun, 2008).
Tabla 2. 7. Principales géneros de las bacterias ácido lácticas
Familia
Género
Forma
Naturaleza de
Fermentación
Clostridium
Enterococcus
Cocos
Homofermentativo
Carnobacterium
Bacilos
Heteroferrmentativo
Lactobacillus
Bacilos
Heteroferrmentativo y
Homo fermentativo
Actinomicetos
Lactococcus
Cocos
Heteroferrmentativo
Leuconostoc
Cocos
Heterofermentativo
Pediococcus
Cocos
Homofermentativo
Oenococcus
Cocos
Heterofermentativo
Streptococcus
Cocos
Homofermentativo
Vagococcus
Cocos
Homofermentativo
Bifidobacterium
Bacilo
--------
Propionibacterium
Bacilo
--------
32
continuación…
Brevibacterium
Bacilo
--------
Acetobacter
Bacilo
--------
Corynebacterium
Bacilo
--------
(Flanzy, 2003; Parés & Juarés, 1997; Hidalgo, 2002; Hutkins, 2006)
2.5.4.5.
Importancia en la Industria de los Alimentos
Varias bacterias lácticas como Streptococcus thermophilus, Streptococcus
cremoris, Streptococcus diacetilacti, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus
acidophilus,
Lactobacillus
reuteri,
Lactobacillus
casei,
además
de
Lactococcus lactis, son utilizados en la fabricación de bebidas fermentadas
a base de leche, quesos, mantequilla, maduración de embutidos, entre otros
(Gösta, 2003).
33
3. METODOLOGÍA
3.METODOLOGÍA
3.1. TOMA DE LA MUESTRA
Se utilizó 2 muestras de “chicha de arroz” obtenidas a partir de dos
productores distintos de la provincia Bolívar, como se observa en la Figura
3.1 las muestras fueron elaboradas en condiciones artesanales, sin uso de
guantes, mascarilla y cofia: el Productor 1, utilizó una cocina a gas,
recipientes y cucharones de metal; el productor 2, utilizó un fogón,
recipientes de metal y cucharones de madera. Los ingredientes para la
elaboración de la chicha básicamente fueron los mismos: arroz, naranjilla,
guayaba, yerbaluisa, congona; panela en el caso del productor 1; azúcar y
remolacha en el caso del productor 2.
Figura 3. 1. Productores de chicha de arroz, Provincia de Bolívar
a. Productor 1; b. Productor 2.
Las muestras fueron tomadas en la etapa de elaboración en botellas de
vidrio herméticas previamente etiquetadas y esterilizadas, estas fueron
trasladas el mismo día de su elaboración bajo condiciones de refrigeración a
la ciudad de Quito al laboratorio de Microbiología de la Universidad
Tecnológica Equinoccial. Posterior a esto las muestras fueron depositadas
en recipientes de plástico donde permanecieron a temperatura ambiente
34
(condiciones
tradicionales
de
preparación,
recomendables
por
los
productores).
3.2. AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS
Los análisis microbiológicos fueron realizados en tres etapas fermentativas:
etapa de elaboración, etapa de burbujeo y etapa de finalización.
3.2.1. AISLAMIENTO PRIMARIO Y MANTENIMIENTO DE CULTIVOS
PUROS
3.2.1.1.
Preparación de Diluciones Seriadas
La preparación de las diluciones para el recuento de los microorganismos en
estudio (enterobacterias, mohos, levadura y bacterias ácido lácticas) se
realizó según la norma NTE 1 529 – 299 (INEN, 1998).
Se tomó 10cm3 de la muestra con la ayuda de una micropipeta marca
SUMEDIX, esta fue mezclada con 90cm3 de diluyente y se agitó en un vortex
hasta que se logró homogeneidad, obteniendo así la dilución
obtener la dilución
Para
se transfirió 1cm3 de la suspensión inicial (dilución
a un tubo de ensayo que contenía 9cm 3 de diluyente, se agitó en un
vortex hasta lograr homogeneidad. Se repitió el mismo proceso para la
dilución
y siguientes diluciones hasta que se obtuvo la dilución
,
logrando obtener el número adecuado de microorganismos por cm 3. Este
proceso fue realizado en una cámara de flujo laminar.
Las diluciones fueron preparadas mezclando una parte de la muestra inicial
con nueve partes del diluyente (agua peptonada). El factor de dilución para
esa muestra es 1/10 ó
y se calcula mediante la siguiente ecuación:
35
(3.1)
3.2.1.2.
Siembra en placa en superficie
La siembra en placa en superficie para el recuento de los microorganismos
(enterobacterias, mohos, levaduras y bacterias ácido lácticas) se realizó
según la metodología de Yousef & Carlstrom (2006).
Se sembró por triplicado 0,1 ml de muestra a partir de 3 diluciones sobre el
medio de cultivo solidificado; para lograr una siembra homogénea se usó
perlas de vidrio por dispersión. Todo el proceso fue realizado en una cámara
de flujo laminar para lograr esterilidad total; posterior a esto se llevó las
placas petri a incubación en forma invertida. El tiempo y temperatura fue de
acuerdo al tipo de microorganismos que se deseaba aislar, en la Tabla 3.1
se encuentran los medios de cultivo selectivos.
Tabla 3. 1. Medios de cultivo selectivos.
Microorganismo
Enterobacterias
Mohos y Levaduras
Bacterias ácido
lácticas
Medio de cultivo
Agar MacConkey
Agar PDA + 40 ppm
de gentamicina
Agar MRS
Condiciones de incubación
37ºC; 18 a 24 horas.
25ºC; 24 horas.
Cámara de anaerobiosis; 37ºC; 24 a
48 horas.
Una vez transcurrido el tiempo de incubación se procedió a realizar el
recuento microbiano con la ayuda de una lupa. Para determinar el número
de colonias se aplicó la siguiente ecuación.
(3.2)
36
3.2.1.3
Aislamiento de Enterobacterias, Levaduras y Bacterias
Lácticas
Para el aislamiento de cultivos puros de cada grupo de microbiano se
analizó las características físicas y morfológicas de cada colonia
(enterobacterias, levaduras y bacterias lácticas). Se procedió a aislarlos
aplicando la técnica por estría siguiendo la metodología según Koneman &
Allen (2006); Gamazo, López & Díaz (2005).
Se esterilizó el asa flameándola en el mechero hasta que la punta dio un
color rojo incandescente, se enfrió el asa en la proximidad de la llama.
Manteniendo el radio de protección del mechero, se tomó una porción del
microorganismo y se transfirió el inóculo a un extremo de la placa, se
extendió formando estrías muy juntas; se flameó el asa y se enfrió por
segunda vez, luego se tomó una muestra de los microorganismos
depositados en la última zona de las estrías y se extendió realizando una
segunda serie de estrías; se flameó y se enfrió el asa por tercera vez, se
volvió a tomar una muestra de los microorganismos depositados en la última
zona de las estrías y se extendió realizando una tercera serie de estrías, por
último se realizó un pequeño rasgo en el medio de las estrías realizadas, en
la Figura 3.2 se puede observar el aislamiento por estría.
Figura 3. 2. Aislamiento por estría
37
3.2.1.4
Aislamiento de Mohos
De acuerdo a las características físicas y morfológicas de los mohos se aisló
los mismos, aplicando la técnica de depósito.
Con un asa de punta de aguja se rozó en forma leve la superficie del moho y
se tocó con esta 2 puntos extremos de la placa petri.
3.3.
IDENTIFICACIÓN
DE
MICROORGANISMOS
GRAM
POSITIVOS Y GRAM NEGATIVOS
3.3.1. TINCIÓN GRAM
Para la identificación de microorganismos gram positivos y gram negativos
se aplicó el método de tinción gram siguiendo la metodología propuesta por
Toro, (2005).
Se tomó una pequeña cantidad de microorganismo de la placa petri con la
ayuda de un asa previamente esterilizada, se realizó un frotis con la adición
de una gota de agua en un porta objetos, se llevó a secado a lado de la
llama del mechero y se flameó 3 veces hasta que se logró fijar la muestra. A
continuación se puso 1 gota de cristal violeta sobre la fijación y se dejó
actuar por 1 minuto, después se lavó con agua destilada con la ayuda de
una piseta hasta eliminar excesos; luego se puso 1 gota de lugol, se dejó
actuar por 1 minuto y se lavó. Posterior a esto se agregó 2 gotas de alcohol
cetona, se lavó y por último se añadió 2 gotas de safranina, se volvió a lavar
y se llevó el porta objetos al microscopio con 1 gota de aceite de inmersión
sobre la muestra para ser observada, en la Figura 3.3 se puede observar
este método.
38
Figura 3. 3. Tinción Gram
3.4.
IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS
3.4.1. IDENTIFICACIÓN
DE
ENTEROBACTERIAS
POR
PRUEBAS
BIOQUÍMICAS
3.4.1.1.
Prueba de la Catalasa
Para la realización de la prueba de la catalasa se siguió la metodología
propuesta por Forbes, Sahm & Weissfeld (2009).
Se tomó una pequeña muestra con la ayuda de un asa y se colocó sobre un
porta objetos, luego se añadió 1 gota de peróxido de hidrógeno (H2O2) al
30% sobre el inóculo y se observó la producción de burbujas de oxígeno en
la Figura 3.4 se puede observar el resultado de esta prueba.
Figura 3. 4. Prueba de la catalasa.
Las pruebas SIM, TSI, RMVP, UREA, Manitol Salt, Simmons Citrato y LIA
fueron realizadas siguiendo la metodología propuesta según MERCK, sf.
39
3.4.1.2.
Esta
Prueba SIM
prueba
fue
realizada
para
determinar
la
motilidad
de
los
microorganismos, además de su capacidad para formar indol y sulfuro de
hidrógeno. Se utilizó tubos con 3 ml de medio SIM, se sembró por la técnica
de picadura y se incubó a una temperatura de 37°C por un tiempo de 18 a
24 horas.
a. Indol.- Esta prueba determinó la capacidad de los microorganismos para
producir la enzima triptofanasa que degrada el aminoácido triptófano a indol.
Una vez transcurrido el tiempo de incubación se añadió 1 gota de reactivo de
Kovacs y se observó la reacción. La reacción es positiva cuando se observa
la formación de un alo rojo; la reacción es negativa cuando no hay cambios,
en la Figura 3.5 puede observarse la reacción.
b.
H2S.- Esta prueba determinó la capacidad de los microorganismos para
producir sulfuro de hidrógeno. Una vez transcurrido el tiempo de incubación
se observó la reacción. La reacción es positiva cuando se observa una
coloración negra en la base del tubo; la reacción es negativa cuando no
existen cambios, en la Figura 3.5 se puede observar la reacción.
c. Motilidad.- Esta prueba determinó la capacidad de los microorganismos
para generar movimiento. Una vez transcurrido el tiempo de incubación se
observó la reacción. La reacción es positiva cuando se observa una
diseminación de los microorganismos a lo largo de la picadura, esta puede
ser observada en la Figura 3.5.
40
Figura 3. 5. Prueba SIM
a. Indol b. H2S. c. Motilidad
(Zurieta, 2011)
3.4.1.3.
Esta
Prueba TSI (triple hierro azúcar)
prueba
fue
realizada
para
determinar
la
capacidad
de
los
microorganismos para fermentar la glucosa, lactosa, sacarosa, además de
su producción de gas y ácido sulfhídrico. Se utilizó tubos con 6 ml de medio
TSI, se sembró por la técnica de cola de pez y se incubó a una temperatura
de 37°C por un tiempo de 48 horas.
a.
Fermentación.- Esta
prueba
determinó
la
capacidad
de
los
microorganismos para fermentar la glucosa, lactosa, sacarosa. Una vez
transcurrido el tiempo de incubación establecido se observó la reacción. La
reacción es positiva cuando el medio toma un color amarillo; la reacción es
negativa cuando el permanece de color rojo, esta puede ser observada en la
Figura 3.6.
b.
H2S.- Esta prueba determinó la capacidad de los microorganismos para
generar sulfuro de hidrógeno a partir de glucosa, sacarosa, lactosa. Una vez
transcurrido el tiempo de incubación se observó la reacción. La reacción es
positiva cuando la base del tubo tomó una coloración negra; la reacción es
negativa cuando no se observa ninguna reacción; esta puede ser observada
en la Figura 3.6.
41
c.
Gas.- Esta prueba determinó la capacidad de los microorganismos para
producir gas a partir de glucosa, sacarosa, lactosa. Una vez transcurrido el
tiempo de incubación se observó
la reacción. La reacción es positiva
cuando el medio se cuartea o cuando se forma burbujas; la reacción es
negativa cuando no se observa cambios, en la Figura 3.6 se puede observar
la reacción.
Figura 3. 6. Prueba TSI.
a. Producción de gas (+). b. Fermentación (+). c. Producción
de H2S
(Zurieta, 2011)
3.4.1.4.
Esta
Prueba RMVP (rojo de metilo, voges y proskauer)
prueba
fue
realizada
para
determinar
la
capacidad
de
los
microorganismos para generar y mantener productos finales ácidos estables
por fermentación de la glucosa. Se utilizó tubos con 3 ml de medio RMVP, se
sembró por la técnica depósito y se incubó a una temperatura de 37°C por
un tiempo de 24 horas.
a.
RM (rojo de metilo).- Esta prueba determinó la capacidad de los
microorganismos para producir, mantener estables los productos ácidos de
la fermentación de la glucosa. Una vez transcurrido el tiempo de incubación
se añadió 5 gotas de reactivo rojo de metilo y se observó la reacción. La
reacción es positiva cuando se observa la formación de un alo color
42
anaranjado a rojo; la reacción es negativa cuando se observa un color de
anaranjado a amarillo; en la Figura 3.7 se puede observar los cambios.
b. VP (voges y proskauer).- Esta prueba determinó la capacidad de los
microorganismos para generar un producto final neutro a partir de la
fermentación de la glucosa. Una vez transcurrido el tiempo de incubación se
añadió 5 gotas de solución alfa naftol y 5 gotas de KOH al 40% y se observó
la reacción. La reacción es positiva cuando existe un cambio de color a rojo;
la reacción es negativa cuando no se observa cambios, estos pueden ser
vistos en la Figura 3.7.
Figura 3. 7. Prueba RMVP
a. Rojo de metilo. b Voges y Proskauer
(Zurieta, 2011)
3.4.1.5.
Esta
Prueba de la UREA
prueba
fue
realizada
para
determinar
la
capacidad
de
los
microorganismos para hidrolizar la urea contenida en el medio con
producción de amoniaco. Se utilizó tubos con 6ml de medio UREA inclinado,
se sembró con la técnica de cola de pez y se incubó a una temperatura de
37°C por 48 horas. Después del tiempo de incubación establecido se
observó la reacción. La reacción es positiva si el medio cambió de color a
43
rojo; la reacción es negativa si el medio toma un color amarillo; los cambios
de que se producen esta reacción pueden ser observados en la Figura 3.8.
Figura 3. 8. Prueba UREA
(Zurieta, 2011)
3.4.1.6.
Esta
Prueba de Simmons Citrato
prueba
fue
realizada
para
determinar
la
capacidad
de
los
microorganismos para utilizar el citrato. Se utilizó tubos con 6ml de medio
Simmons Citrato inclinado, se sembró con la técnica cola de pez y se incubó
a una temperatura de 37°C por un tiempo de 24 a 48 horas. Después del
tiempo de incubación establecido se observó la reacción. La reacción es
positiva cuando el medio toma un color azul oscuro; la reacción es negativa
cuando no se observa cambios; los cambios producidos en esta reacción
pueden ser observados en la Figura 3.9.
44
Figura 3. 9. Simmons Citrato
(Zurieta, 2011)
3.4.1.7.
Esta
Prueba de LIA (lisina hierro agar)
prueba
fue
realizada
para
determinar
la
capacidad
de
los
microorganismos para producir dos enzimas: lisina descarboxilasa y lisina
desaminasa, además de la producción de hierro. Se utilizó tubos con 6ml de
medio LIA inclinado, se sembró con la técnica cola de pez y se incubó a una
temperatura de 37°C por 24 horas. Una vez transcurrido el tiempo de
incubación se observó la coloración del medio. La reacción es positiva
cuando el medio toma un color violeta. Negativo si el medio toma un color
amarillo; los cambios producidos en esta reacción pueden ser observados en
la Figura 3.10.
Figura 3. 10. Prueba LIA
(Zurieta, 2011)
45
3.4.1.8.
Esta
Prueba de Manitol Salt
prueba
fue
realizada
para
determinar
la
capacidad
de
los
microorganismos para crecer en concentraciones elevadas de sal. Se utilizó
tubos con 6ml de medio Manitol Salt inclinado, se sembró por la técnica de
cola de pez y se incubó a una temperatura de 37°C por 72 horas. Una vez
transcurrido el tiempo de incubación se observó la coloración del medio. La
reacción es positiva cuando se observa un crecimiento intenso y la
formación de un halo amarillo luminoso; la reacción es negativa cuando se
observa crecimiento débil y no existe un cambio de color; los cambios
producidos en esta reacción pueden ser observados en la Figura 3.11.
Figura 3. 11. Prueba Manitol Salt
(Cortés, 2001)
Los resultados obtenidos de las pruebas bioquímicas fueron comparados
con el Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (Hensyl, 2000).
3.4.2. Identificación de Mohos
Para la identificación de mohos se siguió la metodología propuesta por
López, García & Urbano (2012).
46
Se tocó la superficie de la colonia con la cinta adhesiva y se colocó sobre un
porta objetos en el que fue depositado 1 gota de azul de lactofenol; luego se
procedió a observar en el microscopio, de acuerdo a sus características
físicas y morfológicas se comparó los resultados con el Manual Introduction
to Food-Borne Fungi (Merck, sf).
3.4.3. IDENTIFICACIÓN
DE
BACTERIAS
ÁCIDO
LÁCTICAS
POR
PRUEBAS BIOQUIMICAS
3.4.3.1.
Prueba de la catalasa
Esta prueba fue realizada con la misma metodología del apartado 3.4.1.1
3.4.3.2.
Prueba SIM
Esta prueba fue realizada con la misma metodología del apartado 3.4.1.2.
3.4.3.3.
Prueba TSI (triple hierro azúcar)
Esta prueba fue realizada con la misma metodología del apartado 3.4.1.3.
3.4.3.4.
Prueba de Anaerobiosis
Se tomó una porción de microorganismo y se aisló por estría doble con la
ayuda de un asa previamente esterilizada en una placa petri con medio
MRS, posterior a esto se colocó una pequeña capa de medio MRS sobre la
superficie sembrada. Este proceso fue realizado a lado de un mechero
manteniendo el radio de protección. Una vez solidificado el medio se llevaron
en la jarra de anaerobiosis las placas a incubación a una temperatura de
37°C por 48 horas. Después del tiempo de incubación establecido se
observó los resultados.
47
3.4.3.5.
Prueba de Aerobiosis
Se tomó una porción de microorganismo y se aisló por estría doble con la
ayuda de un asa previamente esterilizada en una placa petri con medio
MRS. Este proceso fue realizado a lado de un mechero manteniendo el radio
de protección. A continuación la caja petri se incubó a una temperatura de
37°C por 48 horas. Después del tiempo de incubación establecido se
observó los resultados; en la Figura 3.12 se puede observar el aislamiento
por estría doble.
Figura 3. 12. Aislamiento por estría doble
Una vez obtenidos los resultados de las pruebas bioquímicas se comparó
con el Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (Hensyl, 2000).
3.4.4. IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS
Se aplicó la metodología proporcionada por la empresa BIOMÉRIEUX para
la utilización de los kits api 20 C AUX; en el Anexo 6 se puede observar esta
metodología en forma detallada.
Se realizó una suspensión de levaduras con la adición de NaCl al 0,85%
sobre el inóculo hasta que se logró un grado de turbidez de 2 McFarland, a
48
esta suspensión se la llamó API Suspension Medium , luego se depositó
100µl de API Suspension Medium en una ampolla de API C Medium y se
homogenizó con una micropipeta. A continuación se llenó las cúpulas del kit
con API C Medium evitando excesos, la formación de burbujas y cuidando
que el horizonte sea ligeramente convexo; para lograr un ambiente húmedo
en la cámara se llenó las cúpulas adversas con agua destilada, luego se
cerró la cámara de incubación y se incubó a 29 ºC por un tiempo de 48 a 72
horas. Después de haber transcurrido el tiempo de incubación se observó
los resultados. Si las cúpulas fueron turbias el resultado fue positivo (+);
negativo (-) si las cúpulas fueron transparentes; estos resultados fueron
anotados en la respectiva hoja de resultados, luego se sumó los signos,
dando una cifra de resultado por cada colonia, estas cifras fueron insertadas
en un programa proporcionado por BIOMÉRIEUX y así se determinó el
nombre de la levadura.
49
4.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1. RECUENTOS MICROBIANOS
Los microorganismos aislados de la chicha de arroz definieron un consorcio
de enterobacterias, bacterias ácido lácticas, mohos y levaduras. Los valores
de los recuentos de la etapa de recolección de las muestras y finalización del
proceso fermentativo difirieron de la etapa de fermentación, los cuales son
mostrados en la Tabla 4.1.
Tabla 4. 1. Recuentos microbianos
Etapas de
Fermentación
Productores
1
1
2
1
2
1
2
2
3
Enterobacterias
7,39
8,44
nd
nd
5,07
nd
log UFC/ml
Acido
Mohos
Lácticas
4,0
4,04
4,0
5,17
5,59
5,59
5,38
5,43
4,72
4,0
4,0
nd
Levaduras
4,47
5,04
5,11
5,04
5,55
5,57
nd: no detectable con la técnica de recuento en placa.
De acuerdo con Swapan & Sanjay (2007); López et al. (2010); las bebidas
fermentadas preparadas a base de sustratos como frutas,
cereales,
tubérculos son de gran valor cultural y nutricional en diferentes lugares del
mundo, a pesar de que la microbiota de estos productos es compleja y
desconocida. Las bebidas fermentadas alcohólicas tradicionales pueden
variar considerablemente sus ingredientes y su forma de preparación de
acuerdo al lugar de ubicación.
Según Sánchez et al. (2010), en una bebida fermentada se recrea un
ecosistema con una amplia diversidad microbiana, las relaciones entre los
microorganismos desarrollados en ella y su metabolismo ejercen una
50
influencia en las propiedades organolépticas de la bebida, así como en su
duración y mejoramiento de su calidad nutritiva.
Las muestras de chicha
de
arroz indicaron
altos contenidos de
enterobacterias en la etapa inicial del proceso fermentativo, mientras que no
se encontró la presencia de ellas en la etapa fermentativa; según Jiménez,
González, Magaña & Corona (2010), las bacterias patógenas reaccionan de
maneras diferentes ante la presencia de bacterias ácido lácticas, lo que hace
difícil que dichos microorganismos puedan sobrevivir, haciendo a los
alimentos fermentados más seguros para su consumo. En la tercera etapa
de fermentación (finalización del proceso) se detectó una pequeña cantidad
de enterobacterias en la chicha del productor 1 ya que en esta etapa las
bacterias lácticas dejan de actuar y se puede producir una recolonización por
condiciones ambientales.
La cantidad de bacterias ácido lácticas encontradas fue considerable en las
3 etapas fermentativas notándose una pequeña diferencia en la segunda
etapa del proceso en donde el recuento fue mayor (Productor 1 - 5,59
log
UFC/ml) vs (Productor 2 – 5,38 log UFC/ml); en una investigación realizada
por Giles et al. (2001) con Pulque, bebida de origen mexicano, se reportaron
recuentos superiores 8,50 log UFC/ml de bacterias ácido lácticas en la etapa
de fermentación, y en la etapa de finalización del proceso fermentativo se
encontró 8,17 log UFC/ml. En el trabajo realizado por Sánchez et al. (2010),
el Axokot una bebida fermentada tradicional de origen mexicano presentó
2,91 log UFC/ml de bacterias ácido lácticas en la etapa de fermentación, lo
que indica que la cantidad de bacterias ácido lácticas depende de la etapa
de fermentación que cruza el sustrato, las condiciones de fermentación,
además de los ingredientes y los utensilios utilizados en la elaboración.
En relación a la cantidad UFC/ml de mohos presentes en las muestras de
chicha;
en
la
etapa
1
y
2
del
proceso
fermentativo
no
varía
considerablemente dichas valores, sin embargo se nota que en la tercera
51
etapa del proceso, incluso en las muestras del productor 2 no se encontró
valores detectables de los mismos. Los valores reportados en la presente
investigación en relación a la etapa fermentativa (Productor 1 – 5,59 log
UFC/ml) vs. (Productor 2 – 5,43 log UFC/ml) son cantidades elevadas
comparadas con el estudio microbiológico realizado en chicha de arroz de
venta ambulante en Venezuela
donde se reportó un total de 2,93
log
UFC/ml (Arroyo, Bencomo & Bianco, 2011).
Los recuentos en relación a las levaduras durante las 3 etapas no varía en
forma considerable; en la segunda etapa se detectó (Productor 1 - 5,11 log
UFC/ml) vs. (Productor 2 – 5,04 log UFC/ml), son cantidades elevadas
comparado con el estudio microbiológico realizado en chicha de arroz de
venta ambulante en Venezuela
UFC/ml
donde se reportó un total de 3,16 log
(Arroyo, Bencomo & Bianco, 2011); así como también la cantidad
reportada casi no difiere en forma notable de acuerdo a un estudio
microbiológico realizado con pulque ya que se reportó un valor de 5,78 log
UFC/ml (Cervantes & Pedroza, 2007).
La carga microbiana de la bebida es la manifestación del perfil
microbiológico, por lo que en esto influyen los ingredientes utilizados y las
fuentes contaminantes en su elaboración.
En el Ecuador no existen normas que indiquen los valores máximos
permisibles de enterobacterias, bacterias ácido lácticas, mohos y levaduras
en bebidas fermentadas tradicionales como es el caso de la chicha de arroz,
por lo que no se puede verificar el cumplimiento o incumplimiento de un
criterio microbiológico sino más bien se puede determinar la aplicación de
buenas prácticas de higiene durante la elaboración de esta bebida.
52
4.2.
AISLAMIENTO DE CEPAS PARA IDENTIFICACIÓN
A partir de las placas de los recuentos se seleccionaron cepas de acuerdo a
criterios morfológicos y fenotípicos del grupo microbiano que se deseaba
identificar (enterobacterias, bacterias ácido lácticas, mohos y levaduras). En
la Tabla 4.2 se detalla el número de cepas aisladas a partir de la chicha de
cada productor.
Tabla 4. 2. Aislamiento de cepas para identificación
Etapa
Productor
Enterobacterias
Ácido
Mohos
Levaduras
Lácticas
1
2
3
1
8
1
2
3
2
9
0
5
2
1
0
2
5
4
2
0
2
5
3
1
2
2
2
5
2
0
1
0
2
4.3. AISLAMIENTO
E
IDENTIFICACIÓN
DE
MICROORGANISMOS
4.3.1. PRIMERA ETAPA
4.3.1.1. Enterobacterias
En la Tabla 4.3 se detalla las cepas de enterobacterias identificadas en la
primera etapa del proceso fermentativo.
53
Tabla 4. 3. Identificación de enterobacterias en la etapa 1
Colonia
Características Fenotípicas
Resultados
1.1
Pequeña, de forma redonda con un diámetro Kluyvera
ascorbata
aproximado de 0,5 mm, color rojo intenso con ,Providencia stuartii
un halo blanco al alrededor.
1.2
Pequeña, de forma redonda con un diámetro Edwardsiella hoshinae
aproximado de 0,5 mm, color fucsia con un
halo blanco al alrededor.
1.3
Pequeña, de forma redonda con un diámetro Enterobacter asburiae
aproximado de 0,2 mm, color rosado.
1.4
Pequeña, de forma redonda con un diámetro Buttiauxella agrestis
aproximado de 0,5 mm color rojo leve sin halo
blanco al alrededor.
1.5
Pequeña, de forma redonda con un diámetro Kluyvera ascorbata
aproximado de 0,5 mm, posee un color rojo con
un centro rosado y halo blanco al alrededor.
1.6
Forma redonda con un diámetro aproximado de Obesumbacterium
1 cm, color crema con un centro rosa brillante. proteus
1.7
Forma redonda con un diámetro aproximado de
0,7 mm, color crema con un centro brillante y al
alrededor posee un color rosa.
Forma de puntos con un diámetro aproximado
de 0,1 mm, color rosa.
1.8
Escherichia fergusonii,
Escherichia coli
Escherichia fergusonii,
Kluyvera ascorbata
2.1
Forma redonda, con un diámetro aproximado Serratia
fonticola,
de 0,5 cm, color rojo intenso con un con un Yokonella
(koserella
centro crema.
trabulsii regensburgei)
2.2
Forma redonda, con un diámetro aproximado
de 1 cm, color crema con puntos rosados y
halo blanco al alrededor.
Forma redonda, con un diámetro aproximado
de 0,2 mm, color rosado brillante.
2.3
2.4
2.5
Proteus
penneri,
Yersinia rohdei
,
Enterobacter persicinus,
Erwinia persicinus
Forma redonda, con un diámetro aproximado Yersinia aldovae
de 0,5 cm, color rojo intenso.
Forma redonda, con un diámetro aproximado Enterobacter aerogenes,
de 0,3 cm, color crema con un centro brillante. Serratia fonticola
2.6
Forma redonda, con un diámetro aproximado Edwardsiella
ictaluri,
de 1,2 cm, color rosa.
Enterobacter aerogenes
2.7
Forma redonda, con un diámetro aproximado Citrobacter
de 0,5 mm, color crema y centro rojo brillante.
amalonaticus, Klebsiella
oxytoca
54
continuación…
2.8
Forma de puntos, color rojo en toda la placa.
Erwinia mallotivora
2.9
Forma de puntos, color fucsia en toda la placa.
Obesumbacterium
proteus
1. Productor 1.
2. Productor 2.
La mayor parte de enterobacterias encontradas, correspondieron a los
microorganismos: Escherichia fergusonii, Enterobacter asburiae, Buttiauxella
agrestis, Kluyvera ascorbata, Escherichia coli, Proteus penneri, Enterobacter
aerogenes y Enterobacter persicinus, los mismos que se desarrollan en
hábitats como el suelo, agua fresca, aguas residuales, agua de río, agua
natural, agua contaminada, heces fecales, además de estos medios ya
nombrados en ocasiones pueden desarrollarse en la piel y en la mucosa de
las personas como es el caso de Klebsiella oxytoca, Providencia stuartii,
Serratia fonticola y Yokonella (Koserella trabulsii regensburge)i; o en medios
dulces como Edwardsiella hoshinae; cabe destacar que Escherichia
fergusonii, Enterobacter asburiae, Kluyvera ascorbata, Yersinia rohdei,
Yersinia aldovae, Erwinia mallotivora, Klebsiella oxytoca, Enterobacter
aerogenes y Enterobacter persicinus
también pueden estar presente en
algunos tipos de alimentos como frutas, vegetales y alimentos fermentados;
así como también Erwinia persicinus es un tipo de enterobacteria de plantas
patógenas; lo que sugiere que dicha contaminación podría deberse a errores
en la higiene y manipulación de los ingredientes durante la elaboración.
Obesumbacterium proteus, es un tipo de enterobacteria que predomina en
los procesos fermentativos de bebidas a base de cereales, en especial
cuando se cultiva el mosto de cerveza, lo que concuerda con los resultados
de esta investigación (Hensyl, 2000; Dworkin, Falkow, Rosenberg, Schleifer
& Stackebrandt, 2006; Grimont & Grimont, 2006; Bagley, 1985; Noriha,
Hamidum & Indu, 2011; Downws, 2001; Koneman & Allen, 2006).
Todas las cepas aisladas fueron Gram - , algunas de ellas se puede
observar e n la Figura 4.1.
55
a.
b.
c.
d.
Figura 4.1. Tinción Gram de enterobacterias en la etapa 1
a. Escherichia fergusonii, Escherichia coli; b. Serratia fonticola, Yokonella
(koserella trabulsii regensburgei); c. Erwinia mallotivora;
d. Obesumbacterium proteus
La presencia de enterobacterias en los alimentos son la principal causa de
enfermedades provocadas por el consumo de alimentos contaminados, esto
se debe a las malas prácticas sanitarias aplicadas en la elaboración y a los
aspectos socioeconómicas que se ven reflejados en la calidad final del
producto.
4.3.1.2. Bacterias Acido lácticas
En la Tabla 4.4 se detalla la bacteria ácido láctica identificada en la primera
etapa del proceso fermentativo.
56
Tabla 4. 4. Identificación de bacterias acido lácticas en la etapa 1
Productor 1
Colonias
Características Fenotípicas
Resultados
1.1
Forma redonda, con un diámetro aproximado
Sporolacobacillus
de 1cm, color crema brillante.
1. Productor 1.
En la muestra del productor 1 se encontró una bacteria láctica identificada
con la especie de
Sporolacobacillus, mientras que en la muestra del
productor 2 no se identificó ninguna cepa de este grupo. Sporolacobacillus
es un tipo de bacteria ácido láctica que tiene como hábitat productos
fermentados y salmueras; además de los medios anteriormente nombrados
se ha comprobado que también se desarrollan en las heces de los animales
herbívoros, aguas residuales, por lo que indica su posible asociación con
alimentos. Lo que sugiere que dicho microorganismo podría deberse a la falta
de precaución en la elaboración de la bebida, por lo que esta etapa
corresponde a la elaboración de la bebida (Sanders, Morelli & Tompkins,
2003; Stanier, Ingraham, Wheelis & Painter, 2005; García, Arrázola &
Durango, 2010).
La cepa aislada fue Gram +, esta puede ser observa en la Figura 4.2.
a.
Figura 4. 2. Tinción Gram de bacterias ácido lácticas en la etapa 1.
a. Sporolacobacillus
57
4.3.1.3. Mohos
En la Tabla 4.5 se detalla los mohos identificados en la primera etapa del
proceso fermentativo.
Tabla 4. 5. Identificación de mohos en la etapa 1
Colonias
Características Fenotípicas
Resultados
1.1
Forma redonda, diámetro aproximado de 0,5 cm, Absidia corymbifera
aspecto lanoso, color blanquecino. Al reverso es gris- (Cohn) Sacc &
verdoso, tiende a crecen toda la caja petri.
Trotter).
1.2
Forma redonda, con un tamaño aproximado de 3 cm, Penicillum
color gris con funiculis pronunciados en el centro color funicolosum Tom.
crema. Al reverso posee un color anaranjado un tanto
café.
2.1
Forma redonda un tanto estrellada, con un diámetro Aspergillus
aproximado de 1,5 cm, apariencia de algodón, color penicillioides Spag
blanco.
2.2
Forma redonda, con un diámetro aproximado de 2 cm, Penicillum
color gris con funiculis pronunciados en el centro color funicolosum Thom.
crema. Al reverso posee un color anaranjado un tanto
café.
2.3
Forma redonda, con un diámetro aproximado de 3,5 Penicillum glabrum
cm, posee un aspecto aterciopelado color verde claro (Wehmer Westling).
un tanto gris con centro estrellado de aspecto rugoso y
bordes blancos. Al reverso posee un color anaranjado.
2.4
Forma redonda no tan definida, con un diámetro
aproximado de 4 cm, color amarillo verdoso, aspecto
liso, bordes color blanco. Al reverso posee un color
gris.
Forma un tanto redondeada no tan definida, con un
diámetro aproximado de 3,5 cm, aspecto aterciopelado
color verde claro un tanto amarillo, alo blanco. Posee
un reverso color verde pálido y amarillo-verde pálido en
el centro.
2.5
1. Productor 1.
Emericella nidulans
(Eidam) Vuill.
Aspergillus flavus
link.
2. Productor 2.
Los mohos encontrados fueron identificados como: Absidia corymbifera,
Emericella nidulans (Eidam) Vuill, Aspergillus flavus link, Penicillum glabrum
(Wehmer Westling), Penicillum funicolosum Tom, los mismos que son
58
considerados ubicuos por su distribución mundial, principalmente están
asociados con la tierra, aire, cereales, vegetales y frutas en descomposición;
cabe especificar que Emericella nidulans (Eidam) Vuill, Penicillum glabrum
(Wehmer Westling) y Penicillum funicolosum Tom se desarrollan de manera
especial en frutas cítricas, semillas (maíz, arroz, trigo), zumo de frutas,
harinas; así como Aspergillus penicillioides Spag es propio de cereales como
el arroz con cáscara; por lo que dichos microorganismos pueden estar
asociados a los ingredientes y por ende a la forma de elaboración de la
bebida (Reiss, Shadomy & Lyon, 2012; Sarnsc, Hoekstr, Frisrad &
Filtenborg, 1995).
Algunas de las cepas pueden ser observadas en la Figura 4.3.
a.
b.
c.
Figura 4. 3. Tinción de mohos con azul de lactofenol en la etapa 1
a. Absidia corymbifera (Cohn) Sacc & Trotter); b. Aspergillus
penicillioides Spag; c. Penicillum funicolosum Thom
4.3.1.4. Levaduras
En la Tabla 4.6 se detalla las levaduras identificados en la primera etapa del
proceso fermentativo.
59
Tabla 4. 6. Identificación de levaduras en la etapa 1
Colonias
Características:
Resultados
1.1
Forma redonda, con un diámetro aproximado
de 0,5 mm, color rojo salmón y borde crema.
Rhodotorula
mucilaginosa 2
1.2
Forma redonda, con un diámetro aproximado
de 0,5 mm, color blanco, aspecto cremoso.
Saccharomyces
cerevisiae
2.2
Forma redonda, con un diámetro aproximado de
0,3 mm, color rosa y transparente.
Candida
guilliermondii
2.2
Forma redonda, con un diámetro aproximado de Candida
guilliermondii
0,5 mm, color crema brillante.
1. Productor 1.
Las
levaduras
2. Productor 2.
encontradas
fueron
identificadas
como:
Rhodotorula
mucilaginosa, Saccharomyces cerevisiae y Candida guilliermondii.
La especie de levadura pigmentada Rhodotorula mucilaginosa se caracteriza
por la coloración rojo salmón de sus colonias, lo cual es el resultado de la
acumulación de pigmentos carotenoides de gran interés en la industria. Esta
levadura se considera ubicua debido a su distribución mundial en el agua,
suelo, agua dulce y
hábitats marinos. Posee una gran capacidad de
colonizar una gran variedad de sustratos (Libkind, Gadanho & Broock, 2007).
Saccharomyces cerevisiae, considera como una especie modelo para
estudios biológicos y genómicos, se encuentra sobre sustratos ricos en
azúcares o en los exudados y savias dulces de algunas plantas. Es muy
importante por su funcionalidad en la industria alcohólica, panadera,
cervecera; además de que forma compuestos aromáticos, mejora del valor
nutritivo de los alimentos, posee efectos probióticos, inhibición de
microorganismos no deseados (Jespersen, 2002).
Candida guilliermondii, es un tipo de microorganismo que se encuentra
aislada en la piel normal de las personas, en el agua de mar, en el suero de
60
leche, productos fermentados y en especial la cerveza (Rippon, 1988; Pfaller
et al., 2006).
Las cepas identificadas en esta etapa pueden estar asociadas a los
ingredientes utilizados y al proceso fermentativo que atraviesa.
La cepas aisladas fueron Gram +, algunas de ellas pueden ser observas en
la Figura 4.4.
a.
b.
c.
.Figura 4. 4. Tinción Gram de levaduras en la etapa 1
a. Rhodotorula mucilaginosa; c. Saccharomyces cerevisiae; d. Candida
guilliermondii
La primera etapa del proceso fermentativo corresponde al día elaboración de
la bebida, por lo que se detectó: enterobacterias, mohos, bacterias lácticas y
levaduras, su presencia se atribuye a la forma de preparación de la bebida y
a los ingredientes utilizados, por lo que la bebida todavía no cursaba por la
etapa de fermentación.
61
4.3.2. SEGUNDA ETAPA.
4.3. 2.1. Bacterias Acido Lácticas.
En la Tabla 4.7 se detalla las bacterias ácido lácticas identificadas en la
segunda etapa del proceso fermentativo.
Tabla 4. 7. Identificación de bacterias ácido lácticas en la etapa 2
Colonias
Características:
Resultados
1
Forma redonda no tan definida, con un
diámetro aproximado de 0,5 mm, color crema
opaco.
Sporolactobacillus
2
Forma redonda, con un diámetro aproximado
de 1cm, color café.
Bacillus
2.1
Forma
redonda,
con
un
diámetro
aproximadamente de 0,5 mm, color crema.
Bacillus
2.2
Forma redonda, color crema brillante con un
diámetro aproximadamente de 1 cm.
Bacillus
1. Productor 1.
2. Productor 2.
Las especies de bacterias ácido lácticas fueron identificadas como: Bacillus
y Sporolactobacillus que ya fue descrita en la primera etapa del proceso.
La especie Bacillus es considerada como ubicua por su distribución,
comúnmente se encuentra en el suelo, agua, polvo y aire; en los alimentos
como harinas, cereales, frutas, vegetales; en ocasiones puede desempeñar
un papel en el deterioro de los alimentos; además tiene un gran uso en la
industria alimenticia, en especial en los lácteos; lo que sugiere que esta
especie podría deberse a los ingredientes utilizados y al proceso de
fermentación que cruza (Sanders et al,. 2003; Stanier, Ingraham, Wheelis &
Painter, 2005).
62
La cepas aisladas fueron Gram +, estas pueden ser observas en la Figura
4.5.
a.
b.
Figura 4. 5. Tinción Gram de bacterias ácido lácticas en la etapa 2
a. Bacillus; b. Sporolactobacillus
Es Importante la presencia de las bacterias lácticas ya que con la producción
de ácido láctico durante la fermentación de los azúcares protege al alimento
del deterioro causado por otro tipo de bacterias.
4.3.2.2. Mohos
En la Tabla 4.8 se detalla los mohos identificados en la segunda etapa del
proceso fermentativo.
Tabla 4. 8. Identificación de mohos en la segunda etapa
Colonias
Características:
Resultados
1.1
Forma redonda, con un diámetro aproximado de 4 cm, Fusarium
color durazno un tanto café, centro rugoso café claro, semitectum sensu
Wollenw.
bordes crema. Al reverso posee un color café.
1.2
Forma redonda, con un diámetro aproximado de 4 cm, Penicillium
posee un aspecto aterciopelado color verde claro un glabrum (Wehmer)
tanto gris con centro estrellado de aspecto rugoso y Westling.
bordes blancos. Al reverso posee un color anaranjado.
1.3
Forma redonda no tan definida, con un diámetro Penicillium
aproximado de 1 cm, aspecto aterciopelado, color gris brevicompactum
verdoso, centro blanquecino con aspecto rugoso borde Dierckx.
blanco. Al reverso posee un color gris verdoso.
63
continuación…
1.4
Forma redonda, con un diámetro aproximado de 2 cm, Penicillium
color verde claro un tanto gris, borde blanco. Al reverso italicum Wehmer.
posee un color anaranjado un tanto café.
1.5
solani
Forma redonda, con un diámetro aproximado de 2 cm, Fusarium
aspecto liso color verde grisáceo, centro un tanto café (Mart) Sacc.
de aspecto rugoso. Al reverso posee un color verdoso.
2.1
Forma redonda no tan definida, con un diámetro Penicillium
aproximado de 1 cm, aspecto aterciopelado, color gris brevicompactum
verdoso, centro blanquecino con aspecto rugoso borde Dierckx.
blanco. Al reverso posee un color gris verdoso.
2.2
Forma redonda, con un diámetro aproximado de 2 cm, Penicillum
aspecto aterciopelado, color gris con funiculis Funicolosum
pronunciados en el centro color crema. Al reverso Thom.
posee un color café claro.
2.3
Forma redonda, con un diámetro aproximado de 1 cm, Aspergillus
color blanco grisáceo, centro verde oscuro, aspecto de versicolor (Vuill).
Tiraboschi.
algodón. Al reverso posee un color verde claro.
2.4
Forma un tanto redondeada no tan definida, con un Aspergillus Flavus
diámetro aproximado de 3,5 cm, aspecto aterciopelado link.
color verde claro un tanto amarillo, alo blanco. Posee
un reverso color verde pálido y amarillo-verde pálido en
el centro.
2.5
Forma redonda no tan definida, con un diámetro Emericella
aproximado de 4 cm, color amarillo verdoso, aspecto nidulands (Eidam)
liso, bordes color blanco. Al reverso posee un color Vuill.
gris.
1.
Productor 1.
2. Productor 2.
Las especies de mohos encontrados fueron identificados como: Fusarium
semitectum sensu Wollenw, Penicillium glabrum (Wehmer) Westling,
Penicillium
brevicompactum
Dierckx,
Penicillium
italicum
Wehmer,
Penicillium italicum Wehmer, Emericella nidulans (Eidam) Vuill, Aspergillus
flavus link, Aspergillus versicolor (Vuill) Tiraboschi y Penicillum funicolosum
Tom, los mismos que en su mayoría tienen como hábitat la tierra, polvo,
además se pueden desarrollar en alimentos como: cereales (maíz, trigo,
arroz), semillas, harinas, frutas frescas, frutas en descomposición, frutas
secas, zumos de frutas, nueces; Cabe destacar que los mohos Emericella
64
nidulans (Eidam) Vuill, Penicillum glabrum (Wehmer Westling), Penicillum
funicolosum Tom y Penicillium italicum Wehmer se desarrollan de manera
especial en frutas ácidas; la especie Fusarium solani (Mart) Sacc tiene como
hábitat el agua. La presencia de estos microorganismos puede estar
asociada a los ingredientes utilizados y a errores en la higiene durante la
elaboración de la bebida (Sarnsc et al., 1995; Cole & Kendrick, 1981;
Motville, Matthews, & Kniel, 2008).
Algunas de las cepas pueden ser observas en la Figura 4.6.
a.
b.
c.
d.
Figura 4. 6 Tinción de mohos con azul de lactifenol en la etapa 2
a. Fusarium semitectum sensu Wollenw; b. Penicillium italicum Wehmer;
c. Penicillium brevicompactum Dierckx; d. Emericella nidulands
(Eidam) Vuill
65
4.3.2.3. Levaduras
En la Tabla 4.9 se detalla las levaduras identificadas en la segunda etapa del
proceso fermentativo.
Tabla 4. 9 Identificación de levaduras en la segunda etapa
Colonias
1.1.
Características:
Forma
redonda,
con
Resultados
un
aproximadamente de 1 cm,
diámetro
Rhodotorula
color crema
mucilaginosa
brillante.
1.2.
Forma redonda, color blanco pequeña con un
Saccharomyces
cerevisiae
diámetro aproximadamente de 0,1 mm.
2.1.
Forma
redonda,
con
un
diámetro Candida sphaerica
aproximadamente de 0,5 mm, color crema
brillante.
1. Productor 1.
Las
levaduras
2. Productor 2.
encontradas
fueron
identificadas
como:
Rhodotorula
mucilaginosa, Saccharomyces cerevisia y Candida sphaerica. Rhodotorula
mucilaginosa, Saccharomyces cerevisia que ya fueron descritas en la
primera etapa.
Candida sphaerica, un tipo de levadura que tiene como hábitat vegetales,
productos fermentados como el queso, cereales remojados; también puede
estar presente en la piel de humanos y animales; por lo que la presencia de
esta puede atribuirse a los ingredientes utilizados, como también al proceso
fermentativo por el que cruza (Luna, Rufino, Campos, & Sarubbo, 2012).
La cepas aisladas fueron Gram +, una de ellas puede ser observa en la
Figura 4.7.
66
a.
Figura 4. 7. Tinción Gram de levaduras en la etapa 2
a) Candida sphaerica
Esta etapa corresponde a la fermentación o burbujeo de la bebida, donde no
se detectó enterobacterias debido a la producción de alcohol, CO2 y ácidos
orgánicos, por lo que en esta etapa se inhiben los microorganismos
patógenos. En esta etapa los microorganismos como bacterias lácticas,
mohos
y
levaduras
interactúan
para
mejorar
las
características
organolépticas de la bebida.
4.3.3. TERCERA ETAPA
4.3. 3.1. Enterobacterias
En la Tabla 4.10 se detalla las enterobacterias identificadas en la tercera
etapa del proceso fermentativo.
Tabla 4. 10. Identificación de enterobacterias en la etapa 3
Colonias
Características:
Resultados
1.1
Forma redonda, con un diámetro aproximadamente de
Buttiauxella
1cm, color rosado, centro rojo, alo crema.
1.2
Forma redonda, con un diámetro aproximadamente de
0,5cm, color rosado, alo crema.
agrestis
Edwardsiella
hoshinae
1. Productor 1.
67
En esta etapa ya existe la presencia de enterobacterias debido a que el
proceso de fermentación ya terminó, por lo que se encontró dos
enterobacterias Buttiauxella agrestis y Edwardsiella hoshinae, las cuales
fueron encontradas y descritas en la primera etapa del proceso.
La cepas aisladas fueron Gram - , estas pueden ser observas en la Figura
4.8.
a.
Figura 4. 8. Tinción Gram de enterobacterias en la etapa 3
a. Buttiauxella agrestis.
4.3.3.2. Bacterias Acido Lácticas
En la Tabla 4.11 se detalla las bacterias ácido lácticas identificadas en la
tercera etapa del proceso fermentativo.
Tabla 4. 11. Identificación de bacterias ácido lácticas en la etapa 3
Colonias
Características:
Resultados
1.1
Forma de trébol, color crema, tamaño pequeño.
1.2
Forma
redonda,
con
un
Bacillus
diámetro Sporolactobacillus
aproximadamente de 1 cm, color crema un poco
café.
2.1
Color crema brillante, forma como de un trébol , Sporolactobacillus
con un diámetro aproximado de 1 cm.
1.
Productor 1.
2. Productor 2.
68
En la tercera etapa del proceso fermentativo se identificó: en la muestra 1,
dos bacterias lácticas de especie: Bacillus y Sporolactobacillus, las mismas
que fueron encontradas en la segunda etapa; en la muestra 2 se identificó la
especie Sporolactobacillus demostrándose así que las especies Bacillus
encontadas en la segunda etapa desaparecieron y apareciendo la especie
Sporolactobacillus, lo cual su presencia puede atribuirse a condiciones
ambientales ya que el proceso fermentativo ha finalizado.
4.3.3.3. Mohos
En la Tabla 4.12 se detalla los mohos identificadas en la segunda etapa del
proceso fermentativo.
Tabla 4. 12. Identificación de mohos en la etapa 3
Colonias
1.1
Características:
Resultados
Forma redonda no tan definida, con un diámetro Penicillium
aproximado de 1 cm, aspecto aterciopelado, color brevicompactum
gris verdoso, centro blanquecino con aspecto Dierckx.
rugoso borde blanco. Al reverso posee un color
gris verdoso.
1.2
Forma redonda no tan definida, con un diámetro Aspergillus
aproximado de 3,5 cm, color gris verdoso, borde (Bain)
blanco. Al reverso posee un color verde claro.
Thom
ustus
and
Church.
1. Productor 1.
En la tercera del proceso, en la muestra 1 se identificó dos tipos de mohos:
Penicillium brevicompactum Dierck y Aspergillus ustus (Bain) Thom and
Church; mientras que en la muestra 2 no se encontró la presencia de estos.
Penicillium brevicompactum Dierck ya fue identificado en la etapa 1 y 2.
Aspergillus ustus (Bain) Thom and Church, es un moho que tiene como
hábitat el suelo, también puede desarrollarse de manera especial en semillas
69
de arroz y maíz; su aparición puede atribuirse a uno de los ingredientes
utilizados como es el arroz (Sarnsc et al., 1995).
Algunas de las cepas aisladas pueden ser observa en la Figura 4.9.
a.
Figura 4. 9. Tinción de mohos con azul de lactofenol en la etapa 3
a) Aspergillus ustus (Bain) Thom and Church
Determinar la presencia de mohos en la bebida estudiada fue importante ya
que así se pudo determinar que estos en su mayor parte procedieron de los
ingredientes utilizados y por la falta de precaución en la elaboración de la
bebida.
4.3.3.4. Levaduras
En la Tabla 4.13 se detalla las levaduras identificadas en la tercera etapa del
proceso fermentativo.
70
Tabla 4. 13. Identificación de levaduras en la etapa 3
Colonias
Características:
Resultado
1.1
Color crema, aspecto cremoso, forma redonda con
un diámetro aproximado de 1,5 cm.
Trichosporon
mucoides
1.2
Forma de puntos, color crema brillante.
Candida utiis
2.1
Forma redonda con un diámetro aproximadamente
de 0,5 cm, color crema con un alo transparente.
Rhodotorula
mucilaginosa
1. Productor 1.
2. Productor 2.
Las levaduras encontradas fueron Trichosporon mucoides y Candida utilis,
en la muestra 1; en la muestra 2, se identificó la levadura Rhodotorula
mucilaginosa descrita en las etapas anteriores.
Trichosporon mucoides, es un tipo de levadura tiene como habitat natural el
suelo, agua de río, agua de mar, agua de lagos, plantas y alimentos
fermentados. Candida utilis se encuentra aislada en flores, pero también
puede desarrollarse en alimentos fermentados; lo que sugiere que la
presencia de dichos microorganismos se pueden atribuir a la etapa
fermentativa que atraviesa (Kurtzman, Fell & Boekhout, 2011; Richardson &
Warnock, 2011).
La tercera etapa del proceso corresponde a la finalización del proceso
fermentativo, en esta etapa ya se detectó la presencia de enterobacterias ya
que pudo haber una recolonización de microorganismos patógenos por
condiciones ambientales, ya que en esta etapa los alimentos empiezan a
deteriorarse debido a que los microorganismos responsables de la
fermentación (mohos, enterobacterias y levaduras) dejan de actuar
(Richardson & Warnock, 2011).
71
5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
5.CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
5.1. CONCLUSIONES
La bebida fermentada tradicional “chicha de arroz” en la provincia
Bolívar es elaborada artesanalmente y presenta variación debido al
modo de preparación y a las cantidades de los ingredientes utilizados,
ya que no existe un control estricto en cuanto a los parámetros de
elaboración de la misma.
La chicha de arroz es una bebida cuyo perfil microbiológico, en este
estudio, podría atribuirse a las características y la calidad de sus
ingredientes además de su forma de elaboración ya que los tipos de
enterobacterias y mohos encontrados en la misma según datos
bibliográficos son propios de los ingredientes utilizados, además los
recipientes deficientemente higienizados y por ende la forma de
preparación de la bebida.
Los valores de los recuentos de enterobacterias, bacterias lácticas
mohos y levaduras presentes en las chichas son similares en las
muestras de los 2 productores.
Se ha determinado que en la bebida tradicional “chicha de arroz” se
encuentran las siguientes cepas representativas: enterobacterias
(Kluyvera ascorbata, Escherichia fergusonii, Escherichia coli, Serratia
fonticola,
Enterobacter
aerogenes,
Obesumbacterium
Proteus),
bacterias ácido lácticas (Sporolactobacillus y Bacillus), mohos
(Penicillium glabrum (Wehmer Westing), Penicillium funicolosum
Thom, Aspergillius flavus link, Penicillium brevicompactum Dierck) y
levaduras (Saccharomyces cerevisiae, Rhodotorula mucilaginosa,
Trichosporon
mucoides,
Candida
utilis,
Candida
guilliermondii,
Candida sphaerica), lo cual indica la posibilidad de que estas sean
obtenidas por medio de esta bebida como fuente natural.
72
Las poblaciones microbianas presentes en la “chicha de arroz”
cambiaron según la etapa fermentativa en la que esta se encontraba:
en la etapa inicial las poblaciones promedio fueron: 7,91 log UFC/ml
de enterobacterias, 4,0 log UFC/ml de bacterias ácido lácticas, 4,60
log UFC/ml de mohos y 4,75 log UFC/ml de levaduras; en la etapa
fermentativa o de burbujeo no se detectó la presencia de
enterobacterias, mientras que las poblaciones promedio de bacterias
ácido lácticas fueron de 5,48 log UFC/ml, 5,51 log UFC/ml de mohos y
5,07 log UFC/ml de levaduras; en la etapa de finalización del proceso
las poblaciones promedio fueron: 2,53 log UFC/ml de enterobacterias,
4,36 log UFC/ml de bacterias ácido lácticas, 2,0 log UFC/ml de mohos
y 5,56 log UFC/ml de levaduras.
5.2.
RECOMENDACIONES
Se recomienda indagar y estudiar otro tipo de bebidas fermentadas
tradicionales de nuestro país ya que, al identificar la diversidad
microbiana presente en estas, se podría en un futuro, industrializar las
cepas que presenten una importante capacidad fermentativa.
Es recomendable preservar como potenciales inóculos las cepas
nativas encontradas en las bebidas tradicionales del Ecuador para
estudios posteriores.
Realizar estudios donde se compare la calidad microbiológica de las
bebidas fermentadas tradicionales debido a que son de consumo
masivo en países latinos, por lo que se necesita rangos establecidos.
73
GLOSARIO
Inóculo: suspensión de microorganismos a un medio de cultivo.
Anaerobiosis: capacidad que poseen algunos organismos para vivir sin
oxígeno molecular.
Aerobiosis: ambiente que contiene oxígeno molecular.
Recuento: cuenta realizada por segunda vez.
Dilución en serie: forma común de realizar una reducción de la
concentración.
Cultivo puro: aquel que mantiene sólo un tipo de microorganismos.
Medio de cultivo: solución que cuenta con los nutrientes necesarios para
permitir el crecimiento de microorganismos.
74
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91
ANEXOS
ANEXO 1
SIEMBRAS
a.
b.
Figura A.1. Siembras
a. Preparación de materiales. b. Etiquetado de cajas
92
ANEXO 2
RECUENTOS
a.
b.
c.
d.
Figura A.2. Recuentos.
a. Enterobacterias. b. Mohos. c. Levaduras. d. Bacterias ácido lácticas.
93
ANEXO 3
AISLAMIENTOS
a.
b.
c.
d.
Figura A.3. Aislamientos.
a. Enterobacterias. b. Mohos. c. Levaduras. d. Bacterias ácido lácticas .
94
ANEXO 4
IDENTIFICACIÓN DE Escherichia coli.
a.
d.
b.
c.
e.
f.
g.
Figura A.4. Aislamientos.
a. Prueba Simmons citrato. b. Prueba RMVP. c. Prueba LIA. d. Prueba
UREA. e. Prueba manitol salt. d. Prueba TSI. e. Prueba SIM.
95
ANEXO 5
IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS
Figura A.5. Kit de identificación de levaduras (api 20 C AUX)
96
ANEXO 6
METODOLOGÍA DE KITS DE IDENTIFICACIÓN DE
LEVADURAS
a.
97
b.
Figura A.6. Metodología de kits de identificación de levaduras.
a. Explicación básica con diagrama. b. Explicación detallada
98