PROCEDIMIENTO NMP PARA LA DETERMINACION DE COLIFORMES FECALES EN AGUAS POR METODO A-1 Sección Microbiología de Alimentos 1. PRT-712.02-006 Fecha emisión: 1992 Revisión: 5 Fecha revisión: 23-05-2011 Página 1 de 6 OBJETIVO Este análisis se realiza para estimar la densidad de coliformes fecales en agua, con una incubación de 24 hrs. por lo cual se obtienen resultados en menor tiempo que el método tradicional. 2. CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE Este procedimiento se aplica a muestras de aguas crudas y agua de mar. 3. FUNDAMENTO El caldo A-1 puede ser usado para aislamiento directo de coliformes fecales desde agua, no requiere una etapa de preenriquecimiento. 4. REFERENCIAS 4.1 Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 21 ª Ed. 2005 .Capítulo 9. 9221 E.2 pag 9-57. 5. TERMINOLOGÍA 5.1 Grupo coliformes fecales: Coliformes fecales se definen como bacilos Gram negativos aerobios y anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa formando ácido y gas dentro de 24 hrs. a 44,5 ± 0,2ºC. En la actualidad se utiliza el grupo coliformes fecales, especialmente para calificar sanitariamente la calidad del agua. 6. MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS 6.1 EQUIPOS 6.1.1 Incubadora a 35º ± 0,5ºC 6.1.2 Baño de agua termorregulado a 44,5º ± 0,2º C 6.1.3 Termómetros calibrados con graduaciones de 0,1ºC 6.2 MATERIALES 6.2.1 Pipetas graduadas de 1, 5 y 10 mL. 6.2.2 Placas Petri de 100 mm de diâmetro PROCEDIMIENTO NMP PARA LA DETERMINACION DE COLIFORMES FECALES EN AGUAS POR METODO A-1 Sección Microbiología de Alimentos PRT-712.02-006 Fecha emisión: 1992 Revisión: 5 Fecha revisión: 23-05-2011 Página 2 de 6 6.2.3 Tubos o botellas de dilución, de vidrio borosilicato con tapas herméticas 6.2.4 Tubos de fermentación de 18 x 180 mm y 16 x 160 mm 6.2.5 Asa de 3 mm de diámetro 6.2.6 Propipeta 6.3 MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS 6.3.1 Medio A1 doble concentración 6.3.2 Medio A1 concentración simple 6.3.3 Agua de dilución buffer fosfato estéril o agua peptonada estéril 0.5% 6.4 CEPAS CONTROL 6.4.1 Cepa control positivo: Escherichia coli 6.4.2 Cepa control negativo: Enterobacter aerogenes 7. DESARROLLO 7.1 SIEMBRA 7.1.1 Se utiliza caldo A-1 en tubos de fermentación y como diluyente, agua de dilución buffer fosfato estéril o agua peptonada estéril 0.5%. 7.1.2 Agitar la muestra y diluciones, vigorosamente 25 veces en 7 segundos en un arco de 45º con movimientos de arriba a abajo, para asegurar la homogeneidad de la muestra; este procedimiento debe repetirse antes de inocular cada serie de diluciones. 7.1.3 Inocular 5 tubos de caldo A-1 doble concentración con 10 mL de muestra cada tubo. 7.1.4 Inocular 5 tubos de caldo A-1 concentración simple con 1 mL de muestra cada tubo. 7.1.5 Transferir 1 mL de muestra a un tubo que contenga 9 mL de agua de dilución buffer fosfato o agua peptonada 0.5 % para obtener la dilución 1:10. 7.1.6 Inocular 5 tubos de caldo A-1 concentración simple con 1 mL de la dilución 1:10 cada tubo. 7.1.7 Transferir 1 mL de muestra a un tubo que contenga 9 mL de agua de dilución buffer fosfato o agua peptonada 0.5 % para obtener la dilución 1:100. 7.1.8 Inocular 5 tubos de caldo A-1 concentración simple con 1 mL de la dilución 1:100 cada tubo. PROCEDIMIENTO NMP PARA LA DETERMINACION DE COLIFORMES FECALES EN AGUAS POR METODO A-1 Sección Microbiología de Alimentos 7.1.9 PRT-712.02-006 Fecha emisión: 1992 Revisión: 5 Fecha revisión: 23-05-2011 Página 3 de 6 Inocular un tubo de medio con A-1 con control positivo utilizando una cepa de Escherichia coli y otro con el control negativo utilizando una cepa de Enterobacter aerogenes. Incluir tubos de medios de cultivo sin inocular para controlar la esterilidad de los medios de cultivo y placas Petri abiertas y cerradas para control de ambiente. 7.1.10 Agitar la gradilla suavemente para mezclar la muestra y el medio de cultivo e incubar los tubos inoculados en incubadora a 35º ± 0,5º C por 3 hrs para resucitación. 7.1.11 Luego transferir la gradilla a un baño de agua a 44,5º ± 0,2ºC durante 21 horas ± 2 horas. 7.1.12 Al término del período de incubación se observa la formación de gas en los tubos de fermentación. Se considera un test positivo para coliformes fecales la presencia de gas, cualquiera sea la cantidad producida o la efervescencia que se produce al agitar suavemente el tubo. Ausencia de gas o ausencia de efervescencia se considera un test negativo para coliformes fecales. 7.1.13 Anotar los resultados de las muestras en el registro RG-712.00-025 y de las cepas control en el registro RG-712.00-005, de la esterilidad de los medios en el registro RG712.00-006 y los controles ambiente en el registro RG-712.00-009. 7.2 CALCULO 7.2.1 La combinación de tubos positivos obtenidos se refiere a la Tabla NMP (Tabla 9221: IV St. Mt. 2005 Pag. 9-54), y los resultados se expresan como NMP por 100 mL. de muestra. 7.2.2 Si en lugar de las porciones de muestra de 10-1-0,1 mL, se utiliza 1-0,1-0,01, se lee el resultado en la Tabla NMP y se multiplica por 10, y si las porciones de muestra son 0,10,01-0,001, el resultado de la Tabla NMP se multiplica por 100. 7.2.3 Cuando se utilizan más de 3 series de diluciones decimales, se considera el resultado de 3 series, eligiendo la dilución más alta que da resultados positivos en los 5 tubos ensayados y las dos diluciones siguientes. Utilizando el resultado de estas 3 series, leer en la Tabla de NMP (Ver Ejemplos). PROCEDIMIENTO NMP PARA LA DETERMINACION DE COLIFORMES FECALES EN AGUAS POR METODO A-1 Sección Microbiología de Alimentos PRT-712.02-006 Ejemplos de determinación de NMP en series de 5 tubos Ejemplo Volumen de muestra (mL) 10 1 0,1 0,01 a 5 5 1 0 b 4 5 1 0 c 0 0 1 0 d 5 4 4 1 e 5 4 4 0 f 5 5 5 5 7.3 Fecha emisión: 1992 Revisión: 5 Fecha revisión: 23-05-2011 Página 4 de 6 Lectura 0,001 0 0 0 0 1 2 510 451 001 441 441 552 NMP 330 48 1,8 400 400 54000 EXPRESION DE RESULTADOS Los resultados se expresan como NMP Coliformes fecales/100 mL de muestra. 8. REGISTROS 8.1 RG-712.00-005 Registro cepas control baños de agua para análisis de Coliformes fecales. 8.2 RG-712.00-006 Registro control de esterilidad de medios de cultivo utilizados en el análisis de Coliformes, Coliformes fecales y Escherichia coli. 8.3 RG-712.00-025 Registro de resultados análisis de coliformes, coliformes fecales y E. coli en muestras de agua. 8.4 RG-712.00-009 Registro control de ambiente. 9. ANEXOS Anexo Nº 1 Registro cepas control de baños de agua para análisis de coliformes fecales, RG712.00-005. Anexo Nº 2 Registro control de esterilidad de medios de cultivo utilizados en el análisis de coliformes, RG-712.00-006. Anexo Nº 3 Registro de resultados análisis de coliformes y coliformes fecales en muestras de agua coliformes fecales y Escherichia coli, RG-712.00-025. Anexo Nº 4 Registro control de ambiente laboratorio, RG-712.00-009. PROCEDIMIENTO NMP PARA LA DETERMINACION DE COLIFORMES FECALES EN AGUAS POR METODO A-1 Sección Microbiología de Alimentos PRT-712.02-006 Fecha emisión: 1992 Revisión: 5 Fecha revisión: 23-05-2011 Página 5 de 6 Anexo Nº 1 Registro cepas control de baños de agua para análisis de coliformes fecales, RG-712.00-005 FECHA Baño Nº inventario Baño Nº inventario Baño Nº inventario Baño Nº inventario ---------------------- ---------------------- ---------------------- ---------------------- CONTROLES CONTROLES CONTROLES (+) (-) (+) (-) (+) (-) CONTROLES (+) INIC: (-) Anexo Nº 2 Registro control de esterilidad de medios de cultivo utilizados en el análisis de coliformes, RG-712.00-006 FECH A Caldo Lauril Sulfato Triptosa concentra d Caldo Lauril Sulfato Triptosa simple Agar Caldo Rojo Bilis Neutro Verde Cristal Brillant Violeta e (VRB) Cald o EC Cald o A-1 Agar Rojo Neutro Cristal Violeta Glucosa (VRBG) Agar MacConke y Sorbitol Agar glucosa (enterobacteria) INIC Fecha emisión: 1992 Revisión: 5 PROCEDIMIENTO NMP PARA LA DETERMINACION DE COLIFORMES FECALES EN AGUAS POR METODO A-1 Sección Microbiología de Alimentos Fecha revisión: 23-05-2011 Página 6 de 6 PRT-712.02-006 Anexo Nº 3 Registro de resultados análisis de coliformes y coliformes fecales en muestras de agua coliformes fecales y Escherichia coli, RG-712.00-025 Nº:.......................Tipo de muestra:.......................................... Analista............................................ Fecha /hora recolección...............................Fecha/hora análisis:...................Tº Ambiental……………. Medios CLST (C) # CLST (S) # Endoles # Diluyente # CBCB # Caldo EC # Caldo MUG # EC- Pipeta 1mL / 5 mL # Incubadora/ Baño term. PORCION DE MUESTRA (mL) PRESUNTIVO CLST 24 - 48 hrs 35ºC Endo Les 24 hrs. COLIFORMES CONFIRMATIVO CBVB 48 hrs. a 35 ºC E.C./E.C.-MUG 24 h/44,5+/- 0,2ºC N.M.P. Coliformes /100 mL :..............germ / 100 mL Rcto Coliformes:................................. N.M.P. Coliformes Fecales :...............germ /100 mL P/A E.coli:…………............................. Anexo Nº 4 Registro control de ambiente laboratorio, RG-712.00-009 LABORATORIO:...............................................................MES :.....................................AÑO :.............................. FECHA/ LOTE CONTROL AMBIENTE MESON DE TRABAJO Lado izquierdo Placa abierta Placa cerrada Lado derecho Placa abierta Placa cerrada