universidad católica de cuenca unidad académica de ingeniería
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UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA UNIDAD ACADÉMICA DE INGENIERÍA QUÍMICA, BIOFARMACIA, INDUSTRIAS Y PRODUCCIÓN FACULTAD DE BIOFARMACIA TEMA: ESTUDIO DE STREPTOCOCCUS PYOGENES EN INFECCIONES RESPIRATORIAS. Monografía previa a la obtención del título de Químico Farmaceuta. DIRECTOR: Dra. PAOLA ORELLANA BRAVO. INVESTIGADOR: MÓNICA SUSANA FLORES GARCÍA. CUENCA - ECUADOR 2014 UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA DECLARACIÓN Yo, Mónica Susana Flores García declaro bajo juramento que el trabajo aquí descrito es de mí autoría; que no ha sido presentado para ningún grado o calificación profesional; y, que he consultado las referencias bibliográficas que se incluyen en este documento. --------------------------------Mónica Susana Flores García 2 UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA CERTIFICACIÓN Certifico que el presente trabajo fue desarrollado por Mónica Susana Flores García, bajo mi supervisión. --------------------------------Dra. Paola Orellana Bravo 3 UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA DEDICATORIA La culminación de este trabajo está dedicada a Dios porque ha estado conmigo en todo momento, a mis padres quienes a lo largo de mi vida han velado por mi bienestar y educación siendo mi apoyo en todo momento, y es por ellos que he podido realizar mis sueños y llegar a la meta. A mis amigas quienes a lo largo de mi carrera han sido como mis hermanas y ti mi Alex que desde el cielo nos cuidas siempre. 4 UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA AGRADECIMIENTO Agradezco a Dios por haberme dado la vida, porque ha estado conmigo en todo momento guiándome, cuidándome y dándome fortaleza para seguir adelante. A mi padre Luis por ser mi ejemplo a seguir, que con sus consejos y gran cariño siempre ha estado a mi lado apoyándome a cumplir una meta más en mi vida. A mi madre Norma por ser mí mejor amiga, que con su gran amor y ternura siempre ha estado a mi lado cuidándome. A mis hermanos que han estado conmigo en todo momento apoyándome siempre, a mi pequeña hermanita que con su sonrisa alegra nuestras vidas. A mis profesores que a lo largo de mi carrera siempre me han brindado sus conocimientos, a mi directora, la Dra. Paola Orellana que con su gran apoyo y motivación me ha guiado para la culminación de este trabajo. 5 UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA INDICE INDICE............................................................................................................................. 6 INTRODUCCIÓN ............................................................................................................ 8 OBJETIVO GENERAL ................................................................................................... 9 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................................... 9 CAPÍTULO I .................................................................................................................. 10 STREPTOCOCCUS ....................................................................................................... 11 1.1 GENERALIDADES ............................................................................................. 11 1.2 CLASIFICACIÓN CIENTÍFICA. ........................................................................ 12 1.3 CLASIFICACIÓN DE LANCEFIELD. ............................................................... 12 1.4 CLASIFICACIÓN DE PATRONES HEMOLÍTICOS. ....................................... 14 1.5 CLASIFICACIÓN POR SUS PROPIEDADES BIOQUÍMICAS. ...................... 15 CAPÍTULO II ................................................................................................................. 20 STREPTOCOCCUS PYOGENES ................................................................................. 21 2.1 CONCEPTO. ........................................................................................................ 21 2.2 FISIOLOGÍA ........................................................................................................ 21 2.3 ESTRUCTURA .................................................................................................... 22 2.4 FACTORES DE VIRULENCIA .......................................................................... 24 2.5 PATOGÉNESIS .................................................................................................... 27 2.5.1 Faringitis Estreptocócica ................................................................................ 27 2.5.2 Inmunidad....................................................................................................... 29 2.6 EPIDEMIOLOGIA ............................................................................................... 30 2.7 CUADRO CLÍNICO. ........................................................................................... 31 2.8 ESTUDIOS BIOMOLECULARES ...................................................................... 35 2.8.1 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).................................................. 35 2.8.2 Sonda de ADN ............................................................................................... 36 CAPÍTULO III ............................................................................................................... 37 3.1 PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN ..................................................................... 38 3.2 DETECCIÓN DIRECTA. .................................................................................... 39 3.3 CULTIVO ............................................................................................................. 40 3.4 PRUEBAS BIOQUÍMICAS ................................................................................. 43 6 UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA 3.4.1 Sensibilidad a la Bacitracina. ......................................................................... 43 3.4.2 Hidrólisis de L-pirrolidonil β-naftilamida (PYR) .......................................... 44 3.5 PRUEBAS SEROLÓGICAS ................................................................................ 46 3.5.1 Antiestreptolisina O (ASTO) ......................................................................... 46 3.5.2 Prueba Streptococcus Latex Group. ............................................................... 47 3.6 BIOLOGÍA MOLECULAR ................................................................................. 50 CAPÍTULO IV ............................................................................................................... 51 4.1 TRATAMIENTO. ................................................................................................. 52 4.2 PREVENCIÓN ..................................................................................................... 54 4.3 CONTROL............................................................................................................ 55 4.4 RECOMENDACIONES ....................................................................................... 55 CONCLUSIONES .......................................................................................................... 56 BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................ 57 GLOSARIO .................................................................................................................... 59 7 UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA INTRODUCCIÓN Los Streptococcus son bacterias esféricas Gram positivas que se distribuyen ampliamente en la naturaleza; algunos son miembros de la flora humana normal y otros se asocian con enfermedades humanas importantes. Streptococcus pyogenes o Streptococcus beta-hemolítico del grupo A es la causa bacteriana de una gran variedad de infecciones cutáneas y sistémicas que por su estructura es muy virulenta originando diversas enfermedades supurativas y no supurativas, constituyendo la causa más frecuente de faringitis bacteriana y de enfermedades potencialmente mortales. Las personas pueden contagiarse de esta infección por gotitas en el aire y por contacto de persona a persona con las secreciones nasales o la saliva, se propaga con frecuencia entre miembros de la familia o personas que habitan en la misma casa y presenta con síntomas de fiebre, exudado faríngeo, glándulas inflamadas y malestar general. Para el diagnóstico de esta bacteria existen varios pruebas de diagnóstico como son: técnicas microscópicas a partir de tinciones de tejidos para la observación de las células infectadas, también el cultivo para el aislamiento del mismo, pruebas de detección de antígenos, pruebas serológicas las cuales son de mucha importancia para lograr una identificación en estadios tempranos de la infección evitando cuadros clínicos graves y la muerte del paciente. 8 UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA OBJETIVO GENERAL: Estudiar a Streptococcus pyogenes mediante el análisis bibliográfico para poder dar una alternativa de tratamiento, prevención y control que mejoren la calidad de vida del paciente. OBJETIVOS ESPECÍFICOS: • Estudiar las características generales y clasificación de los Streptococcus. • Identificar las características morfológicas, fisiológicas, factores de virulencia, para así poder analizar el grado de patogenicidad y gravedad de las enfermedades causadas en el tracto respiratorio por Streptococcus pyogenes. • Profundizar acerca de las técnicas de laboratorio para la identificación de la bacteria. • Conocer el tratamiento, medidas de prevención y control, evitando la propagación de la bacteria. 9 UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA CAPÍTULO I 10 UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA STREPTOCOCCUS 1.1 GENERALIDADES. Los Streptococcus son bacterias Gram positivas de forma esférica, agrupadas en pares o cadenas de longitudes variadas condicionada por factores ambientales durante su multiplicación. Los miembros de esta cadena con frecuencia presentan un aspecto diplococico y en ocasiones se observan formas parecidas a bacilos. Estas bacterias son Oxidasa y Catalasa negativos, no forman esporas, generalmente son inmóviles. Algunas especies producen hemólisis en agar sangre, otras producen hemolisinas y algunas especies son no hemolíticas. Muchas especies son aerobias o anaerobias facultativas y las de un pequeño grupo son obligadamente anaerobias. La mayor parte de los Streptococcus elaboran una sustancia llamada hidrato de carbono C que cuando es lisado por enzimas forma un antígeno empleado para su agrupación serológica. Los Streptococcus tienen una amplia distribución en la naturaleza, algunos son miembros de la flora humana normal y existen más de 25 especies identificadas que incluyen Streptococcus pyogenes (grupo A), Streptococcus agalactiae (grupo B) y Enterococcus (grupo D); algunas de estas especies son patógenas para los seres humanos, principalmente el Streptococcus pyogenes y el Streptococcus pneumoniae. Gráfico 1: Streptococcus Fuente: http://www.deimagenesyfotos.com/streptococcus-pyogenes/ 11 UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA Las especies de Streptococcus que producen enfermedades importantes en el humano: Streptococcus del grupo A: Streptococcus pyogenes producen amigdalitis e impétigo. Streptococcus del grupo B: Streptococcus agalactiae producen meningitis en neonatos y trastornos del embarazo en la mujer. Streptococcus pneumoniae: es la principal causa de neumonía adquirida en la comunidad. Streptococcus viridans: es una causa importante de endocarditis y de abscesos dentales. Streptococcus mutans: causa importante de caries dental. 1.2 CLASIFICACIÓN CIENTÍFICA. Cuadro: 1 Clasificación científica de los Streptococcus. Fuente: http://es.wikipedia.org/wiki/Streptococcus Jerarquía taxonómica Filo: Firmicutes Clase: Bacilli Orden: Lactobacillales Familia: Streptococcaceae Género: Streptococcus Especies Streptococcus Pyogenes Streptococcus Agalactiae Streptococcus Pneumoniae Streptococcus Viridans Streptococcus Bovis Streptococcus Mutans Streptococcus Salivarius Streptococcus Thermophilus 1.3 CLASIFICACIÓN DE LANCEFIELD. En el año 1933 Rebecca Craighill Lancefield logro el sistema de clasificación serológica de bacterias del género Streptococcus por medio de las diferencias antigénicas en los 12 UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA hidratos de carbono en la pared celular en las especies; esta especificidad serológica del carbohidrato específico de grupo está determinada por un amino-azúcar. Mediante este sistema se designó serogrupos de la A – H y de la K – V, siendo son los más frecuentes los grupos A, B, C, D encontrados en los seres humanos. Las Streptococcus que carecen de un antígeno de grupo reconocible se identifican por pruebas fisiológicas que incluyen reacciones de fermentación, crecimiento a 10°C y 45°C, crecimiento en caldo con elevado contenido de sal, los requerimientos nutricionales de estas bacterias son complejos de manera que los medios de cultivo deben ser los adecuados para su desarrollo. Cuadro 2: Serogrupos estreptocócicos más frecuentemente aislados en seres humanos. Fuente: Jawetz, Melnick y Adelberg, Microbiología médica pág. 241 Serogrupo Lancefield A Antígeno de la pared Características clínicas celular especifico al grupo. Polisacárido ramnosaFaringitis, amigdalitis, otitis media, N-acetilglucosamina sinusitis, escarlatina, erisipela, celulitis, impétigo, neumonía, septicemia, secuelas no supuradas tardías, fiebre reumática aguda. B Polisacárido ramnosa-glucosamina Corioamnionitis. Sepsis puerperal, Sepsis. Meningitis neonatales. C Polisacárido ramnosaN-acetilgalactosamina Infecciones respiratorias altas. D Glicerol ácido teicoico Infecciones del tracto genitourinario. Infecciones de heridas, endocarditis. G Polisacárido ramnosa- galactosamina Infecciones respiratorias altas. Celulitis, Septicemia. Infecciones de tejidos profundos. 13 UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA 1.4 CLASIFICACIÓN DE PATRONES HEMOLÍTICOS. β -Hemolisis. α –hemolisis. ﻻ-hemolisis o Streptococcus no hemolíticos. Las características de hemólisis observadas al cultivar Streptococcus en placas de agar sangre se observan diferencias en las características morfológicas de superficie entre las cepas. La mayoría de estas bacterias tiene la capacidad de causar hemólisis en las placas de agar-sangre dentro de las cuales los eritrocitos han sido lisados en forma completa este patrón se designa β hemolisis. Gráfico 2: B-hemolisis de Streptococcus pyogenes en cultivo de agar sangre. Fuente: Laboratorio clínico Santa Sofía Otro grupo de microorganismos producen la lisis incompleta de eritrocitos con reducción de la hemoglobina y la formación de pigmento verde a este patrón se designa α hemólisis. Las cepas que no producen hemólisis se designa ﻻhemólisis o Streptococcus no hemolíticos. 14 UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA Cuadro 3: Características de Streptococcus de importancia médica. Fuente: Jawetz, Melnick y Adelberg, Microbiología médica pág. 196 Nombre Streptococcus pyogenes Streptococcus agalactiae Sustancia de grupo. A especifica Hemolisis B Β Hábitat Faringe, piel. Β Streptococcus dysgalactiae C,G Enterococcus faecalis. Grupo de Streptococcus bovis Grupo de Streptococcus anginosus, S. intermedius, S. constellatus, grupo S. milleri Streptococcus viridans (muchas especies) Streptococcus Pneumoniae. D Aparato femenino, digestivo bajo. Β (infecciones Faringe. humanas), α, ninguno. Ninguna, α. Colon. D Ninguna F (A, C, G) y no α, Β, ninguna. tipificable. Por lo general tipificado. Ninguna no α, ninguna. α, genital tubo Colon, árbol biliar. Faringe, colon, aparato genital femenino. Boca, faringe, colon, aparato genital femenino. Nasofaringe. 1.5 CLASIFICACIÓN POR SUS PROPIEDADES BIOQUÍMICAS. Las pruebas bioquímicas incluyen reacciones de fermentación de azúcar, pruebas para determinar la presencia de enzimas y pruebas de susceptibilidad o resistencia a ciertos agentes químicos, utilizadas para clasificar los streptococcus después de observar el crecimiento de la colonia y las características hemolíticas de las especies que no reaccionan con las preparaciones de anticuerpos utilizadas para las sustancias específicas de grupo, de los grupos A, B, C, F y G. 15 UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA Sensibilidad a la Bacitracina. La bacitracina es un antibiótico que inhibe la síntesis de pared celular bacteriana, y a la concentración que se encuentra en los discos (0.04 U), inhibe el crecimiento de los estreptococos beta hemolíticos del grupo A de Lancefield pero no inhibe el desarrollo de otros estreptococos beta hemolíticos. - El objetivo de esta prueba es separar el Streptococcus pyogenes de los demás estreptococos beta hemolíticos. - Esta prueba se realiza utilizando un hisopo estéril e hisopar un cultivo puro en una placa de agar sangre; luego se coloca el disco de Bacitracina de 0.04 U sobre la superficie de la placa y se incuba durante 24 horas, a 35-37 º C. - En la interpretación de resultados examinar la placa y observar la presencia del halo de inhibición del desarrollo alrededor del disco de bacitracina y se considera la prueba sensible con la aparición de cualquier diámetro de halo de inhibición de crecimiento alrededor del disco. Prueba de CAMP (Christie, Atkins, Munch-Petersen). La prueba de CAMP se utiliza para la identificación presuntiva de S. agalactiae (grupo B de Lancefield). En esta prueba se observa un efecto sinérgico que se produce al interactuar el factor CAMP producido por cepas de S. agalactiae. - Esta prueba se basa en que los estreptococos del grupo B producen un factor llamado CAMP (factor de monofosfato de adenina cíclica) que aumenta la zona de hemólisis producida por un estafilococo productor de ß- lisina. - Se realiza estriando un cultivo de estreptococo ß-hemolítico en forma perpendicular a una estría de un estafilococo productor de ß-lisina en agar sangre. Se incuba 18-24 horas a 37ºC. 16 UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA - La prueba positiva se evidencia por la presencia de una zona de potenciación de la hemólisis en forma de puntas de flecha en el lugar donde se contactan las dos estrías. Sensibilidad a la Optoquina. El objetivo de esta prueba es identificar y diferenciar Streptococcus pneumoniae ya que los discos embebidos en clorhidrato de etilhidrocupreína (Optoquina). - Esta prueba se basa en que las colonias de Streptococcus pneumoniae son inhibidas por 5 µg de Optoquina contenida en un disco de papel de filtro aplicado sobre la superficie de una placa de agar sangre. Las colonias de S. pneumoniae son mucoides o crateriformes. - El procedimiento de esta prueba es estriar un cuadrante de una placa de agar sangre en varias direcciones con una suspensión Mc Farland 0,5. Colocar luego un disco de Optoquina en el centro del área estriada. Incubar 18-24 horas a 37ºC. - Esta prueba es positiva cuando presenta halos de inhibición mayores de 15mm que son característicos de Streptococcus pneumoniae. Gráfico 3: Prueba de Camp, Prueba de Optoquina, Prueba de Bacitracina. Fuente: http://www.djibnet.com/photo/agar/test-de-camp-prueba-de-optoquina-y-prueba-de-bacitracina-2043677857.html 17 UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA Prueba de Hidrólisis de Esculina o Bilis Esculina. El objetivo de esta prueba es separar los estreptococos del grupo D de los demás grupos de estreptococos. Es un medio de cultivo nutritivo por la presencia de extracto de carne y peptona de carne que aportan nutrientes para el desarrollo microbiano, los streptococcus del grupo D crecen rápidamente en el agar bilis esculina e hidrolizan la esculina, que en presencia de iones hierro forman un compuesto de color verde oliva hasta negro. - El tiempo de incubación es de 18-24 horas a 35-37 °C. - La concentración de bilis es fundamental, ya que existen estreptococos del grupo Viridans que son capaces de crecer a concentraciones menores de bilis. - Se realiza sembrando en superficie tubos de agar bilis esculina inclinado. Una reacción positiva se evidencia como ennegrecimiento del medio. Grafico 4: Prueba de Hidrólisis de Esculina. Fuente:https://www.google.com.ec/search?q=hidrolisis+de+esculina&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ei=wI75UuHsFYfLkQecu oDYDA&sqi=2&ved=0CAcQ_AUoAQ&biw=1366&bih=643#q=BILIS+esculina&tbm=isch&facrc=_&imgdii=jNxeBX6HqBsFR M%3A%3BYfLxHTSOjl4rPM%3BjNxeBX6HqBsFRM%3A&imgrc=jNxeBX6HqBsFRM%253A%3BuzAvJB4po7oohM%3Bhttp%25 3A%252F%252Fupload.wikimedia.org%252Fwikipedia%252Fcommons%252Fthumb%252F3%252F30%252FListeria_monocytog enes_-_Oxford_Listeria_Agar.jpg%252F120px-Listeria_monocytogenes_ _Oxford_Listeria_Agar.jpg%3Bhttp%253A%252F%252Fes.wikipedia.org%252Fwiki%252FListeria_monocytogenes%3B120%3B9 0 18 UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA Hidrólisis del PYR (pirridonil ß-naftilamida). El objetivo de esta prueba es separar Streptococcus pyogenes y Enterococcus de los demás estreptococos β-Hemolíticos. Estas bacterias poseen la capacidad de hidrolizar el substrato PYR (pirridonil ß-naftilamida) debido a que poseen la enzima l-piroglutamil aminopeptidasa. Esta prueba se revela por un cambio de color. - Esta prueba se realiza a partir de un cultivo puro, hacer una suspensión densa en 50 µl de solución fisiológica estéril, y agregar un disco de PYR. La incubación se debe realizar durante 2 horas a 35–37 ºC, agregar una gota de reactivo revelador y dejar a temperatura ambiente, hasta 5 minutos. - En la interpretación de resultados se considera positivo si se observa de color rosa-rojo en el disco, y la prueba es negativa si la suspensión o el disco permanecen incoloros o de color amarillo. Cuadro 4: Especies y pruebas de laboratorio para Streptococcus. Fuente: Bailey&Scott, Diagnóstico médico pág. 320 Especie A A B C C F G G Especie S. pyogenes S. grupo anginosus S. agalactiae S. dysgalactiae S. grupo anginosus S. grupo anginosus S. dysgalactiae S. anginosus Tamaño de la colonia Grande Pequeña Grande Grande Pequeña Pequeña Grande Pequeña PYR + - VP + + + + CAMP - 19 UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA CAPÍTULO II 20 UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA STREPTOCOCCUS PYOGENES 2.1 CONCEPTO. El Streptococcus pyogenes es la causa bacteriana más frecuente de faringitis aguda y de una gran variedad de infecciones cutáneas y sistémicas debido a que produce varios factores como las estreptolisinas O y S que contribuyen a su virulencia y además dan origen al patrón beta hemolítico en las placas de agar sangre. Es conocido también como Streptococcus beta hemolítico del grupo A y ocupa un lugar importante en el estudio de la microbiología médica por ocasionar dos secuelas no supurativas: fiebre reumática (FR) y glomerulonefritis difusa aguda postestreptocócica (GNDA). 2.2 FISIOLOGÍA. Las infecciones causadas por Streptococcus pyogenes pueden ser localizadas y sistémicas con trastornos inmunitarios después de la infección, la más frecuente es la faringitis aguda. Cuando las infecciones permanecen localizadas pueden liberarse exotoxinas pirógenas estreptocócicas (SPE) y causar escarlatina que cursa asociada con faringitis estreptocócica y se manifiesta por una erupción cutánea en el rostro y la parte superior del tronco. Las enfermedades posestreptocócicas como la fiebre reumática y la glomerulonefritis son otras complicaciones causadas por esta bacteria. - Son bacterias Gram positivas, inmóviles, no formadores de esporas, son catalasa negativa y facultativamente anaerobias. - Microscópicamente son células esféricas u ovoides de 0.6-1.0 um de diámetro y se agrupan en pares o cadenas de longitud variable en muestras clínicas o cuando crecen en medios líquidos enriquecidos con suero o sangre. - Requieren de medios complejos enriquecidos con sangre para su desarrollo óptimo. 21 UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA Estas bacterias cuando crecen en medios sólidos con sangre se observan alrededor de las colonias grises un halo de β-hemólisis de 1-2 mm de diámetro a las 24 horas de incubación, pero cuando contienen una concentración elevada de glucosa se ve inhibido. La mayor parte de las cepas del grupo A producen cápsulas compuestas de ácido hialurónico que impiden la fagocitosis y son más notables en los cultivos jóvenes. En pared está constituida por carbohidratos que son específicos de cada grupo, proteínas (antígenos M, T, R), y peptidoglucanos. Poseen pilis que son semejantes a vellosidades que se prolongan a través de la cápsula de los streptococcus del grupo A que contienen en parte proteína M y están cubiertos de ácido lipoteicoico importante para la adhesión de los Streptococcus a las células epiteliales. En su morfología se pueden observar colonias distintas que pueden ser de color mate por lo que producen mucha proteína M y son virulentos. Los Streptococcus de colonias brillantes producen poca cantidad de proteína M y no suelen ser virulentos. Estas bacterias son positivas a la prueba de PYR (Hidrolisis de L-pirrolidonilnaftilamida) y son susceptibles a la prueba de la Bacitracina. 2.3 ESTRUCTURA. En la estructura del Streptococcus pyogenes se ha identificado un gran número de componentes estructurales que determinan su virulencia. 2.3.1 Pared Celular. La pared celular está constituida por una capa de péptidoglicanos gruesa, polisacáridos, proteínas y ácido teicoico, los polisacáridos y proteínas antigénicas se encuentran en la superficie de las células y que es fundamental para mantener su integridad; son permeables a los compuestos nutritivos necesarios para su desarrollo y a la capacidad del organismo para infectar e inducir estados patológicos. - En la pared celular de esta bacteria se encuentran los antígenos específicos que constituye la base de los grupos serológicos. - La especificidad serológica de los carbohidratos específicos de grupo se determina mediante el azúcar ramnosa-N- acetilgalactosamina, el cual representa el 10% del peso en seco de la célula. 22 UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA Las superficies de las células están cubiertas por proyecciones vellosas denominadas fimbrias que se extienden dentro de la cubierta de ácido hialurónico y son las responsables de la unión de la célula estreptocócica a las células epiteliales, un paso inicial esencial para la colonización y el establecimiento de la infección. 2.3.2 Proteína M. Esta sustancia tiene la apariencia de prolongaciones semejantes a pelos de la pared celular, es un factor importante de virulencia para el Streptococcus pyogenes cuando la proteína M está presente los streptococcus son virulentos y cuando está ausente no presentan virulencia. - En ausencia de anticuerpos específicos tipo M pueden resistir a la fagocitosis efectuada por los leucocitos polimorfonucleares. - La inmunidad a la infección con Streptococcus del grupo A se relaciona con anticuerpos de tipo específico a la proteína M, dado que existen más de 80 tipos de proteína M una persona puede sufrir infecciones repetidas de streptococcus pyogenes del grupo A de diferentes tipos M. - La molécula de la proteína M tiene una estructura de espiral enrollada parecida a un bastoncillo que separa los dominios funcionales y permite una serie de cambios en las secuencias y mantienen la función, por lo que los inmunodeterminates de la proteína M pueden cambiar con facilidad. 2.3.3 Sustancia T. Este antígeno es ácido lábil y termolábil. No tiene relación con la virulencia de los Streptococcus del grupo A, se obtiene mediante la digestión proteolítica que destruye con rapidez a la proteína M. Son de utilidad para completar la tipificación de los Streptococcus especialmente en las cepas no identificables de la proteína M, 2.3.4 Nucleoproteínas. La extracción de los Streptococcus con un álcali débil produce mezclas de proteínas y otras sustancias con escasa especificidad serológica denominada sustancia P que talvez puede estar constituida por la mayor parte del cuerpo de las células estreptocócicas. 23 UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA 2.3.5 Proteína F. La proteína F cumple un papel importante en el primer paso de la colonización, que es la adherencia del Streptococcus pyogenes a la molécula de fibronectina, glucoproteina situada en la superficie de las células epiteliales humanas. El ácido lipoteicoico formado por unidades de poliglicerol fosfato unidas a lípidos cumple también un papel importante en la adherencia en asociación con las proteínas de la superficie. 2.4 FACTORES DE VIRULENCIA. 2.4.1 Estreptocinasa. La mayor parte de cepas del estreptococo hemolítico β del grupo A producen estreptocinasa, esta sustancia transforma el plasminógeno del plasma humano en plasmina, una enzima proteolítica que digiere la fibrina y otras proteínas. Este proceso de digestión puede interferirse mediante inhibidores inespecíficos del suero y con un anticuerpo específico, la antiestreptocinasa. La estreptoquinasa puede administrarse por vía intravenosa para el tratamiento de embolia pulmonar y de trombosis de la arteria coronaria y de trombos venosos. 2.4.2 Estreptodornasa. La estreptodornasa o desoxirribonucleasa estreptocócica, despolimeriza el DNA. La actividad se puede cuantificar por la disminución de la viscosidad de las soluciones de DNA con viscosidad conocida. - Los exudados purulentos deben su viscosidad principalmente a la desoxirribonucleoproteína, en el desbridamiento enzimático se emplean mezclas de estreptodornasa y estreptoquinasa que son útiles para licuar exudados y retirar con mayor facilidad pus y tejido necrosado; así los antimicrobianos tienen mejor acceso y las superficies infectadas se recuperan con mayor rapidez. - Después de las infecciones por estreptococo se desarrolla un anticuerpo ADNasa (límite normal=100 unidades), en especial después de las infecciones de la piel. 24 UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA 2.4.3 Hialuronidasa. La hialuronidasa desdobla el ácido hialurónico, un componente importante de la sustancia fundamental del tejido conectivo y ayuda a la propagación de los microorganismos infectantes (factor de propagación). Las hialuronidasas son antigénicas y específicas de cada bacteria o fuente tisular, después de la infección con microorganismos productores de hialuronidasa aparecen en el suero anticuerpos específicos. 2.4.4 Exotoxinas pirógenas. Los estreptococos del grupo A elaboran exotoxinas pirógenas, existen tres exotoxinas pirógenas estreptocócicas: A, B y C antigénicamente distintas. La exotoxina A es la más estudiada y la producen los estreptococos del grupo A que portan un fago lisogénico y es un superantígeno. Las exotoxinas pirógenas estreptocócicas se han vinculado con el síndrome de shock tóxico estreptocócico y con la fiebre escarlatina, la mayoría de las cepas de estreptococos del grupo A aisladas de los pacientes con síndrome de shock tóxico estreptocócico producen exotoxina A pirógena estreptocócica o poseen el gen que la codifica; por el contrario aproximadamente el 15% de los estreptococos del grupo A aislados de otros pacientes poseen dicho gen. 2.4.5 Difosfopiridina nucleotidasa. Esta sustancia puede vincularse con la capacidad de los organismos para matar los leucocitos y algunos estreptococos producen esta enzima en el ambiente. Ciertas cepas producen proteinasa y amilasa. 25 UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA 2.4.6 Hemolisinas. El Streptococcus pyogenes β-hemolítico del grupo A elabora dos hemolisinas (estreptolisinas). A) Estreptolisina O. La estreptolisina O (SLO streptolysin O) es una proteína hemolíticamente activa en estado reducido, pero en presencia de oxígeno se inactiva rápidamente. La estreptolisina O es causa de parte de la hemólisis observada cuando el crecimiento ocurre en cortes profundos dentro del medio en placas de agar sangre. B) Antiestreptolisina O. Se combina cuantitativamente con la antiestreptolisina O, un anticuerpo que aparece en humanos luego de la infección con cualquier estreptococo que produzca estreptolisina O, este anticuerpo impide la hemólisis por la estreptolisina O que constituye la base de una prueba cuantitativa para el anticuerpo. Un título de antiestreptolisina O en suero (ASO) mayor de 160 a 200 unidades se considera anormalmente elevado y sugiere infección reciente por estreptococos o concentraciones persistentemente grandes del anticuerpo a causa de la respuesta inmunitaria excesiva a una exposición temprana por parte de la persona hipersensible. C) Estreptolisina S. La estreptolisina S (SLS streptolysin S) es el agente causante de las zonas hemolíticas alrededor de las colonias de estreptococos que crecen sobre la superficie de placas agar sangre. Se elabora en presencia de suero y no es antigénica, pero puede inhibirse mediante un inhibidor específico casi siempre presente en el suero de los humanos y animales y es independiente de experiencias anteriores con estreptococos. 26 UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA Gráfico 5: Estructura Antigénica. Fuente:https://www.google.com.ec/search?q=estructura+antigenica+de+streptococcus+pyogenes&source=lnms&tbm=isch&sa= X&ei=gxrxUuysAoqkQfGwYCABg&ved=0CAcQ_AUoAQ&biw=1366&bih=643#facrc=_&imgrc=I3afy7AmQkRP3M%253A%3ByZlKh88da7cIM%3Bhttp%253A%252F%252Fwww.losmicrobios.com.ar%252Fmicrobios%252Fimagenes%252Fstreptobetahemolitic o.jpg%3Bhttp%253A%252F%252Fwww.losmicrobios.com.ar%252Fmicrobios%252F%253Fpage_id%253D1262%3B597%3B414 2.5 PATOGÉNESIS. El Streptococcus pyogenes está asociado a diferentes procesos patológicos en las cuales intervienen las propiedades biológicas de los microorganismos infectantes, la naturaleza de la respuesta del huésped y la puerta de ingreso de la infección. Las infecciones se pueden dividir en categorías: A) Enfermedad atribuible a infección local con Streptococcus pyogenes βhemolítico del grupo A. 2.5.1 Faringitis Estreptocócica. La faringitis o amigdalitis estreptocócica es la infección más frecuente causada por el Streptococcus pyogenes β-hemolítico del grupo A y puede causar daño por acción 27 UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA superficial, diseminación por contigüidad a través del torrente sanguíneo o por producción de toxinas, y para su infección tiene que adherirse a la mucosa faríngea en el cual hay interacción entre el ácido lipoteicoico de su pared y la fibronectina de la célula epitelial humana. Su capsula de ácido hialurónico tiene propiedades antifagociticas por su similitud con el ácido hialurónico humano, entre las propiedades de mayor importancia es que tiene la proteína M que le confiere resistencia a la fagocitosis. Esta es una infección que causa el 37% de los dolores de garganta en niños y el 5% 15% en adulto; afecta a la faringe incluyendo las amígdalas y en ocasiones a la laringe. Los estreptococos virulentos de esta bacteria se adhieren al epitelio faríngeo por medio de pili de ácido lipoteicoico que cubren su superficie, la glucoproteina fibronectina que se encuentra sobre las células epiteliales probablemente sirve como ligando para el ácido lipoteicoico. Las causas de esta infección: Se disemina por gotitas en el aire y por contacto de persona a persona con las secreciones nasales o la saliva. La tos y los estornudos de personas que padecen de faringitis estreptocócica. Tocar una superficie que esté contaminada y después tocarse los ojos, la nariz o la boca Se propaga con frecuencia entre miembros de la familia o personas que habitan en la misma casa. El periodo de incubación y el el inicio de los síntomas de esta enfermedad ocurre de 24 a 72 horas después del contagio. Los síntomas más comunes: Dolor de garganta Dolor al tragar Fiebre Dolor de cabeza Exudado amigdalar Dolor muscular Malestar general Ganglios inflamados, sensibles o dolorosos al tacto. 28 UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA Gráfico 6: Faringitis Estreptocócica. Fuente: http://www.childrensdayton.org/cms/kidshealth/97cb822b3c15db45/index.html En los lactantes y niños de corta edad la faringitis se presenta: Nasofaringitis subaguda con secreción serosa liquida. Poca fiebre pero la infección puede extenderse al oído medio, mastoides, meninges y los ganglios linfáticos cervicales están hipertrofiados. La enfermedad puede persistir durante semanas y un 20% de las infecciones son asintomáticas, puede aparecer un cuadro clínico similar en la mononucleosis infecciosa, difteria, infección gonocócica y en la infección por adenovirus. Sin tratamiento, el estreptococo puede llevar a complicaciones graves como: Infección del oído Absceso periamigdalino Glomerulonefritis Fiebre reumática Psoriasis en gotas Escarlatina Mastoiditis Sinusitis Los síntomas mejoran en un período de tres a cinco días del tratamiento y los antibióticos reducen el riesgo de complicaciones. 2.5.2 Inmunidad. Un huésped restablecido de una infección por algún estreptocócico tipo M del grupo A es relativamente poco susceptible a una nueva infección por el mismo tipo M. 29 UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA En los anticuerpos específicos anti tipo M los estreptococos mueren rápidamente después de ser fagocitados y la proteína M interfiere con la fagocitosis, pero en presencia de anticuerpo especifico a proteína M, los leucocitos humanos matan a los estreptococos. Después de la infección se desarrollan anticuerpos a estreptolisina O; estos anticuerpos impiden la hemolisis por estreptolisina O pero no indican inmunidad, los títulos altos señalan infecciones recientes o repetidas se observan con mayor frecuencia en pacientes reumáticos en comparación con infecciones estreptocócicas no complicadas. 2.6 EPIDEMIOLOGÍA. Streptococcus pyogenes tiene como único huésped conocido el hombre, puede encontrarse en las vías respiratorias altas y es raro que integren la flora normal. Esta bacteria coloniza con frecuencia la orofaringe de los adultos jóvenes pero es más frecuente en niños. Su transmisión es por secreciones nasales que son la fuente más peligrosa de diseminación de estos microrganismos o por la saliva, el contagio es mayor en la etapa aguda es decir en las dos primeras semanas y su periodo de incubación es de 2 a 5 días. La colonización con Streptococcus pyogenes es transitoria, regulada tanto por la capacidad de la persona para desarrollar una inmunidad específica frente a la proteína M de la cepa colonizadora, como a la presencia de microorganismos competitivos en la orofaringe. Los pacientes no tratados producen anticuerpos frente a la proteína M bacteriana específica, lo que puede dar como resultado una inmunidad que dure toda la vida; sin embargo, en los pacientes tratados, esta respuesta de anticuerpos está disminuida. La portación faríngea en la población general es del 15 al 30 % y no se asocia a riesgo apreciable de fiebre reumática y aunque los seres humanos pueden ser portadores asintomáticos de streptococcus pyogenes en la nasofaringe o perineo, el microorganismo se debe considerar importante si se detecta mediante cultivo u otros medios. 30 UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA 2.7 CUADRO CLÍNICO. Infecciones Supurativas - Faringitis Estreptocócica - Escarlatina - Pioderma - Erisipela - Celulitis - Fascitis Necrosante - Síndrome del shock tóxico estreptocócico Es una infección en la cual los estreptococos virulentos del grupo A se adhieren al epitelio faríngeo y se manifiesta con fiebre, ganglios inflamados, exudado amigdalar y malestar general. Es un exantema eritematoso difuso que comienza en el tórax y se extiende posteriormente a las extremidades, suele ser una complicación de la faringitis estreptocócica. Es una infección cutánea localizada con vesículas que avanzan a pústulas sin indicios de enfermedad sistémica. Si la puerta de entrada es la piel se produce erisipela con edema masivo indurado y la infección avanza con rapidez. Es una infección aguda de la piel y tejidos subcutáneos con rápida diseminación, se presenta con dolor, hipersensibilidad, tumefacción y eritema. Es una infección de los tejidos subcutáneos y de la facia, se presenta una necrosis extensa de la piel que se disemina muy rápidamente. Es una infección sistémica, semejante al síndrome del shock tóxico estafilocócico provocado por Staphylococcus Aureus. Los pacientes suelen presentar bacteremia e indicios de fascitis. Infecciones no Supurativas - Fiebre Reumática - Glomerulonefritis Aguda Es la secuela más grave de la infección por el estreptococo hemolítico puesto que daña el miocardio y las válvulas cardiacas, el inicio de la fiebre reumática va precedido por infección con estreptococo del grupo A por semanas aunque la infección puede ser leve y a veces indetectable. Esta infección se desarrolla a veces tres semanas después de la infección por estreptococos y algunas cepas son particularmente nefritógenas, se caracteriza por la súbita aparición de proteinuria, hematuria, edema de cara y piernas, hipertensión y disfunción renal. 31 UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA Gráfico 7: Faringitis Estreptocócica. Fuente: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Pos_strep.JPG Gráfico 8: Escarlatina. Fuente: http://cuidatusaludcondiane.com/wordpress/wp-content/uploads/2011/06/escarlatina.jpg Gráfico 9: Pioderma. Fuente: http://photos1.blogger.com/blogger/5041/3181/1600/ScreenHunter_043.jpg 32 UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA Gráfico 10: Erisipela. Fuente: http://photos1.blogger.com/blogger/5041/3181/1600/ScreenHunter_044.jpg Gráfico 11: Celulitis. Fuente: http://www.dermapixel.com/2012_11_01_archive.html Gráfico 12: Fascitis Necrosante. Fuente: http://cuidatusaludcondiane.com/wordpress/wp-content/uploads/2012/01/fascitis.jpg 33 UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA Gráfico 13: Síndrome del Shock Toxico Estreptocócico. Fuente: http://yasalud.com/sindrome-de-shock-toxico/sindrome-del-shock-toxico/ Gráfico 14: Fiebre Reumática. Fuente: http://www.lookfordiagnosis.com/mesh_info.php?term=Cardiopat%C3%ADa+Reum%C3%A1tica&lang=2 Gráfico 15: Glomerulonefritis Aguda. Fuente: http://www.sanar.org/enfermedades-renales/glomerulonefritis 34 UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA 2.8 ESTUDIOS BIOMOLECULARES Los ácidos nucleicos son las moléculas de la clave de la vida, de la estabilidad del ADN y de la duplicación exacta del ADN, de su traducción a una proteína depende es estado de salud normal. El estudio biomolecular busca determinar los mecanismos básicos de la función y estructura de cada una de las células ya que muchas de las enzimas asociadas con la reparación, degradación y la síntesis de ácidos nucleicos in vivo se han convertido en herramientas básicas del laboratorio. 2.8.1 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La reacción de la cadena de polimerasa (PCR) es una reacción química in vitro que permite generar una gran cantidad de copias de un fragmento de DNA (ácido desoxirribonucleico) partiendo de una única copia de ese fragmento original. El desarrollo de esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN y su utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad el virus o bacterias causantes de una enfermedad. A) Fundamento. La técnica se basa en la propiedad natural de los ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual se emplean ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que las hebras de ADN vuelvan a unirse para poder duplicarlas nuevamente, este proceso de la PCR está automatizado mediante un aparato llamado termociclador, que permite calentar y enfriar los tubos de reacción para controlar la temperatura necesaria para cada etapa de la reacción. La PCR es una técnica común e indispensable por su gran variedad de aplicaciones: Clonación de ADN para la secuenciación. Análisis funcional de genes. Diagnóstico de trastornos hereditarios. Identificación de huellas genéticas. Detección y diagnóstico de enfermedades infecciosas. 35 UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA Existen muchas variantes de la PCR convencional: PCR en tiempo real o PCR cuantitativa que permite cuantificar la cantidad de producto amplificado. PCR por transcripción inversa mediante la cual se obtiene una copia de DNA complementario. 2.8.2 Sonda de ADN. Esta técnica es un fragmento de ADN o raramente ARN de pequeño tamaño normalmente entre 100 y 1000 bases usado en biología molecular como herramienta para detectar la presencia de ADN o ARN de secuencia complementaria parecida o igual. - Es un método molecular que consta de una secuencia de ADN de un microorganismo de interés, que puede ser utilizada para detectar un ADN homólogo o secuencias de ARN. - El ADN de la sonda se hibrida con el ADN del organismo que se quiere detectar, esta unión se establece porque ambas moléculas tienen secuencias complementarias, formándose así pares de bases complementarias y que determinan la predisposición a padecer enfermedades. 36 UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA CAPÍTULO III 37 UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA 3.1 PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN 3.1.1 Muestras. El hisopado faríngeo de cualquier aérea de inflación, ulceración o exudado con abscesos, para el diagnóstico de la faringitis bacteriana cultivado en agar sangre de carnero es el método de referencia que realizado en forma correcta tiene una sensibilidad del 90% al 95%. A) Obtención de la muestra. - Se utiliza un baja lenguas par deprimir la lengua con el fin de tener una buena visualización de la faringe y amígdalas - Con un hisopo se frota con firmeza ambas amígdalas, la faringe posterior y se toma la muestra de todo el exudado purulento si existe. - Al introducir y retirar el hisopo se debe realizar con cuidado de no tocar las paredes laterales de la cavidad bucal o la lengua para reducir al mínimo la contaminación con bacterias de la flora comensal. Luego de la recolección de la muestra se introduce el hisopo en un tubo estéril con solución fisiológica. Gráfico 16: Hisopado Faríngeo. Fuente:https://www.google.com.ec/search?q=faringitis+estreptoc%C3%B3cica&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ei=79_xUpjBM MjbkQfpp4DIAw&sqi=2&ved=0CAcQ_AUoAQ&biw=1366&bih=643#q=faringitis+estreptoc%C3%B3cica&tbm=isch&facrc=_ &imgdii=_&imgrc=FAWIi9FDpBro1M%253A%3BmzUjsDvtb4zt5M%3Bhttp%253A%252F%252Frafabravo.files.wordpress.com %252F2011%252F06%252F9950.jpg%3Bhttp%253A%252F%252Frafabravo.wordpress.com%252Ftag%252Festreptococo%252 F%3B400%3B320 38 UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA 3.2 DETECCIÓN DIRECTA. 3.2.1 Examen microscópico. En esta técnica permite la observación de la morfología de la célula para la cual las muestras pueden ser teñidas con la coloración de Gram, con esta técnica se observa cocos Gram positivos agrupados en cadenas. Hay que tener en consideración que el Streptococcus pyogenes es parte de la flora microbiana normal de la orofaringe y si la muestra es aislada de la orofaringe para un pronóstico. 3.2.2 Coloración de Gram. En esta técnica se realiza un frotis del exudado faríngeo, se fija a la porta objetos mediante el calor y luego se realiza la coloración en el siguiente orden: 1. Violeta de cristal o violeta de genciana: Este colorante es captado en forma similar por todas las bacterias se deja actuar por un minuto. Enjuagar con agua. 2. Lugol: Actúa como reactivo de fijación del violeta de cristal, dejar actuar por un minuto y enjaguar con agua. 3. Alcohol-acetona: Este reactivo decolora únicamente a las bacterias Gram negativas. Las bacterias Gram positivas no se decoloran por lo que quedan del color del violeta de cristal. 4. Fucsina o safranina: Este reactivo colorea solo a las células que se decoloraron con el alcohol-acetona es decir a las bacterias Gram negativas. Resultado: - Streptococcus pyogenes se observa como cocos Gram positivos de 0.6 a1.0 um de diámetro que se agrupan en forma de cadenas de longitud variable. 39 UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA Gráfico 17: Coloración de Gram de Streptococcus pyogenes. Fuente:https://www.google.com.ec/search?q=tincion+de+gram+exudado+faringeo&tbm=isch&tbo=u&source=univ&sa=X&ei= VWPyUrGFMI_IkAeC44HQAw&ved=0CDsQsAQ&biw=1366&bih=643#q=tincion+de+gram+streptococcus+pyogenes&tbm=isc h&facrc=_&imgdii=_&imgrc=zK6zvBrlODtczM%253A%3Bl76HvV3lqlnmvM%3Bhttp%253A%252F%252Ffundacionio.org%252 Fimg%252Fbacteriology%252Fimg%252FStreptococcus_pyogenes_04.jpg%3Bhttp%253A%252F%252Ffundacionio.org%252Fim g%252Fbacteriology%252Fcont%252FStreptococcus_pyogenes.html%3B491%3B445 3.3 CULTIVO 3.3.1 Agar Sangre El agar sangre es una combinación de un agar base o agar nutritivo con el agregado de 5% de sangre ovina o también puede usarse sangre humana, aporta muchos factores de enriquecimiento. Es un medio utilizado para el aislamiento y cultivo de numerosos microorganismos aerobios y anaerobios nutricionalmente exigentes a partir de una gran variedad de muestras y permite ver la capacidad hemolítica de los microorganismos patógenos que es un factor de virulencia. Observando los halos hemolíticos alrededor de las colonias se determina el tipo de hemólisis que posee: - Alfa: halos verdosos por la reducción de la hemoglobina de los glóbulos rojos a metahemoglobina en el medio. - Beta: halos incoloros por la hemólisis total. - Gamma: inexistencia de halos o sin hemólisis Este medio de cultivo también, puede utilizarse como base para preparar el medio agar chocolate. 40 UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA • Fundamento La infusión de músculo de corazón y la peptona, otorgan al medio un alto valor nutritivo, que permite el crecimiento de una gran variedad de microorganismos, aún de aquellos nutricionalmente exigentes, el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, el agregado de sangre al medio de cultivo, en concentración final de 5-10 %, aporta nutrientes para el crecimiento bacteriano, y permite detectar hemólisis. Formula en gramos por litro: • - Infusión de musculo de corazón. - Peptona: 10.0 - Cloruro de sodio: 5.0 - Agar: 15.0 Preparación - Suspender 40 g de polvo en un litro de agua destilada. - Dejar reposar 5 minutos y mezclar hasta obtener una suspensión homogénea. • - Calentar con agitación frecuente y hervir 1 minuto. - Esterilizar 20 minutos a 121°C. - Enfriar a 45-50°C agregar sangre desfibrinada al 5%. - Homogeneizar y distribuir en placas. Siembra - Se realiza por inoculación directa en estudio, sobre la superficie del medio de cultivo. - El aislamiento de Streptococcus pyogenes se realiza mediante cultivo en una placa de agar sangre, una vez tomada la muestra de la faringe se realiza por inoculación directa estriando por toda la placa de agar sangre. 41 UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA Gráfico 18: Placa de Agar Sangre. Fuente:https://www.google.com.ec/search?q=agar+sangre+fundamento&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ei=yeD6UtubOdKFkQ eShIGgBA&sqi=2&ved=0CAcQ_AUoAQ&biw=1366&bih=643#facrc=_&imgdii=_&imgrc=fWAFKkP_GswgeM%253A%3BeEtr Di5MMFAMWM%3Bhttp%253A%252F%252Fwww.trensa.com%252Fcedivet%252Fimages%252Fagar_sangre_ss.jpg%3Bhttp%2 53A%252F%252Fwww.trensa.com%252Fcedivet%252F%3B427%3B336 • Incubación - El tiempo, temperatura y atmósfera de incubación, dependerán del microorganismo que se quiera aislar. • Streptococcus de se incuba a 37 °C durante 48 horas. Resultado - Streptococcus pyogenes produce una lisis completa de los glóbulos rojos y se observa como un halo transparente variable de 0.3 a 05 mm de diámetro alrededor de las colonias. - El aspecto de las colonias en al agar son blancas grisáceas, transparentes a translucidas, mate o brillantes. 42 UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA Gráfico 19: Streptococcus pyogenes en una placa de agar sangre. Fuente: Laboratorio Clínico Santa Sofía. 3.4 PRUEBAS BIOQUÍMICAS 3.4.1 Sensibilidad a la Bacitracina. Esta prueba permite la diferenciación de estreptococos beta-hemolíticos del grupo A de otros estreptococos beta hemolíticos. Fundamento. La bacitracina es un antibiótico que inhibe la síntesis de pared celular bacteriana, y a la concentración que se encuentra en los discos de 0.04 U, inhibe el crecimiento de los estreptococos beta-hemolíticos del grupo A de Lancefield. Un resultado sensible, es presuntivo de la presencia de estreptococo grupo A, y se puede incrementar además el valor diagnóstico mediante la realización de la prueba del PYR. - Siembra. Realizar una suspensión densa del microorganismo en estudio de turbidez igual a la del estándar 0.5 de la escala de Mac Farland. Utilizando un hisopo estéril, hisopar una placa de agar sangre. - Aplicar un disco de Bacitracina de 0.04 U sobre la superficie de la placa y se incuba a 35-37 ºC durante 24 horas. 43 UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA Interpretación de resultado. - Examinar la placa para observar cualquier zona de inhibición del desarrollo alrededor del disco de bacitracina. - Sensible: presencia de halo de inhibición del desarrollo alrededor del disco, informar: estreptococos beta hemolíticos presuntivamente del grupo A por la prueba de bacitracina. Gráfico 20: Sensibilidad a la Bacitracina Fuente:https://www.google.com.ec/search?q=bacitracina+fundamento&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ei=G_H0Up6pB_TTsAS z8YHgBA&ved=0CAcQ_AUoAQ&biw=1366&bih=643#q=orueba+de+la+bacitracina&tbm=isch&facrc=_&imgdii=_&imgrc=5J ZLf7pMXvhKXM%253A%3BoVn2cEkr94voiM%3Bhttp%253A%252F%252Fdata5.blog.de%252Fmedia%252F316%252F3353316 _52b9b25fa8_m.jpeg%3Bhttp%253A%252F%252Fmicromarravilla.blog.com.es%252F2009%252F03%252F25%252Ftrabajo-decampo-parte-iii-5832077%252F%3B500%3B375 3.4.2 Hidrólisis de L-pirrolidonil β-naftilamida (PYR). Es una prueba rápida, utilizada fundamentalmente para la identificación de Streptococcus pyogenes. Fundamento. Los discos contienen el sustrato pirrolidonil-beta-naftilamida, y la prueba consiste en determinar la presencia de la enzima l-pirrolidonil arilamidasa, los microorganismos que contienen dicha enzima, pueden hidrolizar el sustrato presente en los discos en 44 UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA forma rápida, con liberación del grupo pirrólico, el cual, reacciona con el reactivo revelador: N-N dimetilamino cinamaldehído. Esta es una prueba presuntiva, altamente sensible y permite diferenciar los estreptococos del grupo A de otras especies de Streptococcus. Siembra. - Hacer una suspensión densa en 50 µl de solución fisiológica estéril a partir de un cultivo puro y agregar un disco de PYR. - Se incubación durante 30 minutos a 35-37 °C, en aerobiosis, luego agregar una gota de reactivo revelador y dejar a temperatura ambiente, hasta 5 minutos. Interpretación de resultados. - Positivo observación de color rosa-rojo en el disco. - Negativo la suspensión o el disco permanecen incoloros o de color amarillo. Gráfico 21: Hidrólisis de L-pirrolidonil β-naftilamida (PYR). Fuente:https://www.google.com.ec/search?q=HIDROLISIS+DE+PYR+FUNDAMENTO&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ei=n_f 0UsusEZbUsATGv4DgDA&ved=0CAcQ_AUoAQ&biw=1366&bih=643#q=HIDROLISIS+DE+PYR&tbm=isch&facrc=_&imgdii =_&imgrc=afy3GtwSppKzM%253A%3B42ThyGACC8NobM%3Bhttp%253A%252F%252Fcdn.slidesharecdn.com%252Fss_thumbnails%252Fcocos3 -110617195701-phpapp02-thumbnail4.jpg%25253Fcb%25253D1308358865%3Bhttp%253A%252F%252Fwww.slideshare.net%252Fmaitrompiz%252Fcocos-grampositivos%3B768%3B576 45 UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA 3.5 PRUEBAS SEROLÓGICAS. 3.5.1 Antiestreptolisina O (ASTO). Esta es una prueba de sangre para medir los anticuerpos contra estreptolisina O, una sustancia producida por las bacterias estreptococos del grupo A. Los estreptococos tipo A producen una enzima denominada Estreptolisina O que tiene la capacidad de lisar los hematíes comportándose como antígenos. El organismo reacciona produciendo un anticuerpo neutralizante (ASO), el que aparece entre 8-30 días después del comienzo de la infección por Streptococcus. - ASO Látex: Los anticuerpos antiestreptolisina O se detectan en suero por su reacción con la estreptolisina O adsorbida sobre soporte inerte de látex, los anticuerpos antiestreptolisina reaccionan con la estreptolisina produciendo una aglutinación visible macroscópicamente. Técnica cualitativa. - Llevar los reactivos y la muestra a temperatura ambiente. - Agitar el Reactivo A antes de usar, vaciando previamente la pipeta del gotero. - En la carta de látex colocar 1 gota o 025 ul del Reactivo y 25 ul de la muestra (suero). - Mezclar con un palillo descartable (uno para cada muestra) hasta obtener una suspensión uniforme, disparar un cronómetro, y balancear suavemente carta y observar macroscópicamente el resultado dentro de los 2 minutos. Interpretación de los resultados. - Negativo: suspensión homogénea. - Positivo: aglutinación que aparece dentro de los 2 minutos. 46 UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA Gráfico 22: Aglutinación de ASTO. Fuente:https://www.google.com.ec/search?q=antiestreptolisina+o&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ei=rI37UobVA ZGEkQfT_IDwBA&ved=0CAkQ_AUoAQ&biw=1366&bih=643#facrc=_&imgdii=JKQM3CRaz8y8M%3A%3BeodPB4AWdUzB2M%3BJKQM-3CRaz8y8M%3A&imgrc=JKQM3CRaz8y8M%253A%3ByyWzvwJYz3W0tM%3Bhttp%253A%252F%252Fwww.centerlabsp.com.br%252Ffotos%252 Ffa6c0ceff08666660552cf08dab3cfcc.jpg%3Bhttp%253A%252F%252Fwww.centerlabsp.com.br%252F%253Fa%25 3DdetalheProduto%2526id%253D26%3B250%3B164 3.5.2 Prueba Streptococcus Latex Group. La prueba Streptococcus Latex Group es una prueba rápida para el serotipado estreptocócico de los grupos A, B, C, D, F y G. Partículas de látex revestidas con antisuero estreptocócico de conejo. Fundamento La prueba Streptococcus Latex Group es una prueba rápida de aglutinación por látex para el serotipado estreptocócico mediante la extracción química de los antígenos específicos del grupo con reactivos de extracción de ácido nitroso. La extracción y el serotipado se realizan a temperatura ambiente. Reactivos La prueba Streptococcus Latex Group consiste en: 47 UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA 1. Suspensiones de látex: Seis viales (A, B, C, D, F y G) que contienen partículas de látex revestidas con antisuero del grupo estreptocócico de conejo al 0,0975 % de azida de sodio como conservante. 2. Reactivo de extracción 1: Dos viales que contienen 2 ml cada uno de una solución de nitrito de sodio al 0,0975 % de azida de sodio como conservante. El reactivo está clasificado como peligroso y se ha etiquetado como nocivo en caso de ingestión. 3. Reactivo de extracción 2: Dos viales que contienen 2 ml cada uno de una solución ácida al 0,0975 % de azida de sodio como conservante. 4. Reactivo de neutralización 3: Dos viales que contienen 2 ml cada uno de una solución neutralizante al 0,0975 % de azida de sodio como conservante. Contenido del kit Cada vial contiene partículas de látex revestidas con antisuero: A, B, C, D, F y G. - 2 viales de reactivo 1 (tapón rojo). - 2 viales de reactivo 2 (tapón amarillo). - 2 viales de reactivo 3 (tapón azul). - 25 tarjetas reactivas desechables. - Varillas de mezcla. El kit contiene reactivo para aproximadamente 75 pruebas. Procedimiento No realice más de tres reacciones simultáneamente antes de leer el resultado. 1. El reactivo de látex antes de utilizar es muy importante que las botellas estén a temperatura ambiente y agitar antes de usar. 48 UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA 2. Añadir una gota de reactivo 1 (tapón rojo) en un tubo. 3. Suspender 1 μl de cultivo de bacterias en un asa bacteriológica de una placa de agar sangre de 5 - 10 % en reactivo 1 en un tubo. 4. Añadir una gota de reactivo 2 (tapón amarillo) en el tubo, mezclar y esperar 10 minutos como mínimo y 60 minutos como máximo. 5. Añadir una gota de reactivo 3 (tapón azul) en el tubo y mezclar. 6. Añadir una gota de reactivo de látex por cada reacción en la tarjeta de prueba, aproximadamente 10 μl. 7. Por cada reacción, añadir 10 μl de extracto bacteriológico en la tarjeta de prueba. Para un control negativo utilice una mezcla de una gota de reactivo 1, 2 y 3 respectivamente. 8. Mezclar la gota de látex y la gota de extracto bacteriológico con la varilla de mezcla. Utilizar varillas diferentes para cada una de las reacciones. 9. Extienda hasta abarcar el área del círculo. 10. Mover la tarjeta lentamente y observar si se produce aglutinación en 30 segundos. Cualquier aglutinación que se produzca una vez transcurridos más de 30 segundos, no será una reacción positiva. Interpretación de resultados Un resultado positivo en uno de los reactivos de látex identifica el grupo. - Si sólo se da una reacción positiva con el reactivo de látex del grupo B, se trata de una cepa de estreptococos del grupo B. - El grupo D de antígeno es conocido por su reacción cruzada y por ello puede darse más de una reacción positiva, pero si hay una reacción positiva en el producto de látex del grupo D, la cepa es un estreptococo del grupo D o una especie de Enterococcus (la cual tiene un antígeno del grupo D). 49 UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA Gráfico 23: Prueba Streptococcus Latex Group. Fuente:https://www.google.com.ec/search?q=PRUEBA+DE+STREP+GROUPING&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ei=JIf8Uqq PI4ma0QHIj4GYAQ&ved=0CAcQ_AUoAQ&biw=1366&bih=643#facrc=_&imgdii=xqVKLnD9Sf1aM%3A%3BZqz4FE12QXKTvM%3BxqV-KLnD9Sf1aM%3A&imgrc=xqVKLnD9Sf1aM%253A%3BD4sNa2efOkNePM%3Bhttp%253A%252F%252Fwww.biorad.com%252Fwebroot%252Fweb%252Fimages%252Fcdg%252Fproducts%252Fmicrobiology%252Fproduct_detail%252Fgloba l%252Fcmd_latex_agglutination_pdp.jpg%3Bhttp%253A%252F%252Fwww.bio-rad.com%252Fenca%252Fproduct%252Fpastorex-strep%3B470%3B302 3.6 BIOLOGÍA MOLECULAR. En las últimas décadas se ha utilizado varias pruebas de Biología molecular para detectar Streptococcus pyogenes y se caracterizan por su mayor sensibilidad, especificidad y rapidez que las técnicas clásicas de cultivo celular. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Real time PCR. 50 UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA CAPÍTULO IV 51 UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA 4.1 TRATAMIENTO. Streptococcus pyogenes es altamente sensible a la penicilina que es un antibióticos del grupo de los betalactámicos. El mecanismo de acción es la inhibición de la síntesis de la pared bacteriana especialmente en la región peptidoglucano produciendo substancias que dañan su misma pared dando como resultado la autolisis de la bacteria. Existe una gran diversidad de penicilinas y difieren entre sí según su espectro de acción es así que la Bencilpenicilina es eficaz contra bacterias Gram positivas como estreptococos y su vía de administración es por vía parenteral debido a su sensibilidad al pH ácido del estómago. Las penicilinas son los antibióticos menos tóxicos pero pueden causar alergias, en ocasiones severas que pueden desarrollar un shock anafiláctico y provocar la muerte del paciente. Antes de iniciar el tratamiento es necesario preguntar el paciente si existe algún tipo de alergia. En los pacientes alérgicos a la penicilina se puede utilizar otros tipos de antimicrobianos como: Eritromicina. Azitromicina. Claritromicina El tratamiento antibiótico de los pacientes con faringitis acelera la recuperación de los síntomas y previene la fiebre reumática cuando se instaura durante los primeros 10 días del inicio de la enfermedad. 4.4.1 Fármacos Antibacterianos. Afectan la síntesis de la pared celular. Inhiben la síntesis de proteínas. Bloquean la replicación y transcripción de la bacteria. 52 UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA Se clasifican en: A.- Fármacos Bactericidas. • Su mecanismo de acción se centra en la pared de la bacteria, haciendo que se liberen los metabolitos celulares de la bacteria al exterior y esta muera. B.- Farmacos Bacteriostáticos. • Fármacos que actúan sobre la síntesis proteica. • Bloquean el crecimiento y multiplicación de la bacteria. CLASIFICACIÓN SEGÚN SU MECANISMOS DE ACCIÓN PENICILINAS 1.- PENICILINAS DE ESPECTRO REDUCIDO Penicilina G-Sódica Penicilina G-Procaínica Penicilina Benzatina DESCRIPCIÓN Acción bactericida. Actúa debilitando la pared bacteriana y favoreciendo la lisis osmótica de la bacteria durante el proceso de multiplicación. 2.- PENICILINAS PENICILINASA RESISTENTES Dicloxacilina Inhiben la síntesis de la pared celular bacteriana y su multiplicación. 3.- PENICILINAS DE AMPLIO ESPECTRO. Ampicilina Inhiben la síntesis de la pared celular. Amoxicilina Interfiere con la síntesis de la pared celular durante la replicación celular. BETALACTÁMICOS Amoxicilina/Ac. Clavulánico Inhiben la síntesis de la barrera de peptidoglicanos de la pared celular bacteriana. Ampicilina/sulbactam Inhibidor de la enzima bacteriana betalactamasa. 53 UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA TETRACICLINAS Cloranfenicol Doxiciclina Minociclina Tetraciclina Acción bacteriostática. Inhiben la síntesis proteica de la bacteria. MACRÓLIDOS Eritromicina Claritromicina Azitromicina Acción bacteriostática. Inhiben la síntesis proteica de la bacteria. 4.2 PREVENCIÓN Los seres humanos pueden ser portadores asintomáticos de Streptococcus pyogenes en la nasofaringe, una persona que alberga este microorganismo puede ser un portador que distribuya los estreptococos directamente a las demás personas a través de goticulas del sistema respiratorio. - Las secreciones nasales de una persona que alberga Streptococcus pyogenes son la fuente más peligrosa de diseminación de estos microoganismos por lo que debe evitar el contacto con personas que presenten estos síntomas. - Lavarse las manos con frecuencia evitara que al tocar una superficie que esté contaminada y después tocarse los ojos, la nariz o la boca se de una infección. - Evitar compartir alimentos y utensilios ya que esta infección se propaga con frecuencia entre miembros de la familia o personas que habitan en la misma. La clasificación, la tipificación inmunitaria de los estreptococos son herramientas valiosas para un seguimiento y prevención eficaz de la cadena de transmisión. Con la administración de penicilina o eritromicina que son fármacos que producen concentraciones tisulares eficaces durante diez días previniendo de esta manera enfermedades posestreptocócicas y una reinfección con streptococcus β-hemolítico del grupo A en pacientes con fiebre reumática. 54 UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA 4.3 CONTROL Los Streptococcus pyogenes son susceptibles a la Penicilina, Eritromicina y algunos son resistentes a las Tetraciclinas con la administración de estos fármacos en la infección estreptocócica aguda se debe tratar de erradicar con rapidez la bacteria. Al erradicar con prontitud los estreptococos de las infecciones iniciales puede prevenir de modo eficaz el desarrollo de la enfermedad postestreptocócica Los procedimientos de control se dirigen principalmente a la fuente humana sobre todo si los portadores se encuentran en áreas como salas de parto, quirófanos, aulas o guarderías, es difícil erradicar el estreptococo β-hemolítico de los portadores permanentes y en ocasiones estos pacientes deben abandonar por algún tiempo las áreas sensibles de propagación de la infección. 4.4 RECOMENDACIONES Es posible determinar una infección por Streptococcus pyogenes con la realización del cultivo de hisopado faríngeo ante un diagnóstico clínico de faringoamigdalitis evitando: Tratamiento antimicrobiano inadecuado o innecesario y de esta forma minimizar los afectos adverso de los antibacterianos administrados y de esta manera evitar la posible resistencia que pueden desarrollar y prevenir complicaciones posteriores de la infección por Streptococcus pyogenes. Adoptar medidas de precaución con la manipulación de secreciones; en las áreas médicas realizar una desinfección concurrente de la misma. Todo paciente mayar de 3 años de edad que tenga los criterios clínicos de faringitis estreptocócica aguda se realicen pruebas de detección rápida y cultivo de exudado faríngeo para descartar la enfermedad. Priorizar acciones en la comunidad e informar sobre las medidas de higiene que se debe adoptar y evitar la automedicación. 55 UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA CONCLUSIONES: • Se conoció que los Streptococcus tienen una amplia distribución en la naturaleza, algunos son miembros de la flora humana normal son bacterias Gram positivas de forma esférica, agrupadas en pares o cadenas de longitudes variadas condicionada por factores ambientales durante su multiplicación, algunas especies producen hemolisis en agar sangre, otras producen hemolisinas y otras especies son no hemolíticas. • Se describió que el Streptococcus pyogenes es la causa bacteriana más frecuente de faringitis aguda y de una gran variedad de infecciones cutáneas como erisipela, celulitis, fascitis necrosante y sistémicas como fiebre reumática y glomerulonefritis aguda, debido a que produce varios factores como las estreptolisinas O y S que contribuyen a su virulencia y además dan origen al patrón beta hemolítico en las placas de agar sangre. • Se analizó que para el diagnóstico de laboratorio de Streptococcus pyogenes se utilizan técnicas de cultivo, técnicas de identificación de GAS, diagnóstico serológico y existen nuevas técnicas de Reacción de la cadena de polimerasa (PCR), Real time PCR, que son las pruebas más utilizadas para un diagnóstico temprano de la infección. • Se describió que los fármacos como la Penicilina, Azitromicina y Eritromicina son los antibióticos más utilizados para contrarrestar la infección por Streptococcus pyogenes, ya que con un tratamiento, control y prevención adecuado se puede evitar que la infección se propague en la población sobre todo con frecuencia entre miembros de la familia o personas que habitan en la misma casa. 56 UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA BIBLIOGRAFÍA 1. 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Antígeno: Un antígeno es una sustancia que desencadena la formación de anticuerpos y puede causar una respuesta inmunitaria. ASTO: Antiestreptolisina O. Azida de sodio: NaN3, es una sal que generalmente se emplea como generador de gas nitrógeno. B Bacitracina: Es el nombre de un antibiótico producido por una mezcla de polipéptidos cíclicos relacionados unos con los otros y producidos por cepas de la variedad Tracy de la bacteria Bacillus subtilis aislado en 1945 en contra de bacterias Gram positivas, especialmente en heridas y mucosas, porque inhibe la formación de la pared celular de estos microorganismos. C CAMP: Christie, Atkins, Munch-Petersen. Cepa: Es una variante fenotípica de una especies bacteriana que comparten, al menos, una característica. F FR: Fiebre reumática. 59 UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA G GNDA: Glomerulonefritis difusa aguda postestreptocócica. H Hemolisis: Es el fenómeno de la desintegración de los eritrocitos que carecen de núcleo y orgánulos, por lo que no puede repararse y muere cuando se desgasta. Hemoglobina: Es una proteína de estructura cuaternaria, que consta de cuatro subunidades, de color rojo característico y su función principal es el transporte de oxígeno. I Impétigo: El impétigo es una enfermedad infecciosa superficial de la piel producida por bacterias, que se presenta con mayor frecuencia en los niños. L L-PCR: Long PCR. M MR-VP: Rojo de metilo y voges proskauer, es el medio utilizado para la clasificación de enterobacterias. O Optoquina: Discos embebidos en clorhidrato de etilhidrocupreína utilizados para diferenciar Streptococcus pneumoniae de Streptococcus viridans. P Pili: Son estructuras en forma de pelo, más cortas y finos que los flagelos que se encuentran en la superficie de muchas bacterias. 60 UNIVERSIDAD CATOLICA DE CUENCA Pfu: Pyrococcus furiosus es una especie extremófila de Archaea. Se destaca por tener una temperatura de crecimiento óptimo de 100 °C y por ser uno de los pocos organismos identificados como poseedores de enzimas que contienen tungsteno, un elemento que rara vez se encuentra en las moléculas biológicas. PCR: Reacción en cadena de la polimerasa. PYR: Pirridonil ß-naftilamida R RFLP: Restricción Polimorfismo de Longitud. S SPE: Exotoxinas pirógenas estreptocócicas. T Taq: Thermus aquaticus es una bacteria termófila, Gram negativa, aerobia y heterótrofa que vive en la proximidad de manantiales de agua caliente. La describió por primera vez Thomas Brock en 1969. V Virulencia: Es el grado de patogenicidad de un serotipo, de una cepa o de una clona microbiana en un huésped susceptible. 61
