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Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 46, No. Especial, pp. 353-359, septiembre-diciembre, 2015.
COMUNICACIÓN CORTA
LPA0311: cepa de Bordetella pertussis modificada
genéticamente para la producción del toxoide pertúsico
PT-S1-9K/129G
Lourdes Lisbet Proenza-Alfonzo*, Ernesto Marcos-López, Karen Marrero-Domíngez,
Edith Suzarte-Portal, Beatriz Ferrán-Pérez, Celso Pérez-Bolaños y Rafael FandoCalzada.
Departamento de enfermedades Infecciosas, Centro Nacional de Investigaciones Científicas, Apartado Postal
6412, La Habana, Cuba. [email protected]
Recibido: 15 de septiembre de 2015.
Aceptado: 24 de septiembre de 2015.
Palabras clave: Bordetella pertussis, toxoide pertúsico, B165, vacuna acelular anti pertussis.
Key words: Bordetella pertussis, pertussis toxoid, B165, acellular anti pertussis vaccine.
INTRODUCCIÓN
La tos ferina es una enfermedad del tracto respiratorio humano causada por la infección con el cocobacilo Gramnegativo Bordetella pertussis. Esta etiología provoca anualmente más de 40 millones de casos y más de 250 000
muertes.1 Las vacunas anti-tos ferina tradicionales (vacunas celulares) contienen células completas inactivadas de la
bacteria B. pertussis como ingrediente activo,2 sin embargo, la inducción frecuente de reacciones adversas reduce
continuamente su aceptación pública internacional.3,
4
Paralelamente, el desarrollo de las vacunas anti pertúsicas
acelulares, de composición subunitaria definida y mayor inocuidad, ha estimulado la sustitución definitiva de las
vacunas celulares por las acelulares.5
El componente principal de las vacunas acelulares es el toxoide pertúsico que se obtiene por modificación química o
genética de la toxina pertúsica (PT), el principal factor de virulencia de B. pertussis. La exotoxina natural posee una
estructura del tipo A-B compuesta por los polipéptidos S1, S2, S3, S4 y S5, codificados por los genes ptxA, ptxB,
ptxC, ptxD y ptxE, respectivamente, que constituyen el operón Optx. El polipéptido S1 es la subunidad
enzimáticamente activa de la PT y cataliza la transferencia de una molécula de ADP-ribosa del NAD hacia la
subunidad α inhibidora de la proteína G en la célula eucariota. 6 Los métodos químicos de desactivación de la actividad
enzimática de la PT permiten que retenga una actividad tóxica residual, son reversibles y reducen la inmunogenicidad
del toxoide;7 mientras que, la inactivación genética es más segura y económica para el desarrollo de nuevas vacunas.2
Las variantes estudiadas hasta la fecha sustituyen o eliminan aminoácidos esenciales para la actividad enzimática de la
subunidad S1.8, 9 Así, el toxoide que tiene sustituidos los residuos de arginina nueve por lisina y glutámico 129 por
glicina del gen ptxA (PT-S1-9K/129G) ha sido el de elección para el desarrollo de nuevas vacunas acelulares contra la
tos ferina.10
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El programa ampliado de inmunizaciones de Cuba aún emplea una vacuna celular cuya composición farmacéutica
contiene una mezcla en suspensión de bacterias completas químicamente inactivadas de las cepas de producción B.
pertussis 165, 134 y 509. Cada una de estas cepas cuenta con un banco maestro y la producción a partir de ellas está
debidamente certificada y calificada por la OMS. Entre ellas, la cepa B165 11 es reconocida como cepa de producción
de vacunas celulares, por su empleo en la clonación de los genes de la PT 12 y en el estudio de mutaciones genéticas
atenuadoras de la toxicidad de la PT.13 Estas características hacen de la cepa B165 un candidato elegible para la
obtención de una cepa recombinante para la producción de un toxoide pertúsico.
El presente estudio tuvo como objetivos obtener una cepa genéticamente modificada a partir de la cepa B165 en la que
el gen ptxA del operón codificante de la PT fuera remplazado con el gen que codifica para PT-S1-9K/129G, así como
evaluar la morfología celular, la producción de la PT y el perfil proteico en la cepa genéticamente modificada.
Obtención de una cepa genéticamente modificada derivada de B165 mediante el remplazo del gen ptxA por
ptxA-S1-9K/129G. La estrategia diseñada para modificar genéticamente la cepa derivada de B165 consistió
primeramente, en la obtención de un mutante espontáneo resistente a estreptomicina que permitiera la contraselección
de E. coli durante los experimentos de conjugación. Dicho mutante se obtuvo a partir de la cepa B 165 y se denominó
B165 StrR-414. Luego se procedió a remplazar el gen ptxA en el cromosoma de B165 StrR-4 por ptxA::kn (Fig.1 A) y
luego se sustituyó ptxA::kn por ptxA-S1-9K/129G (Fig.1 B).
Fig. 1. Estrategia para la construcción de una cepa de B. pertussis mediante reemplazo de ptxA por ptxA-S19K/129G. A. Sustitución del gen ptxA salvaje por el gen que confiere resistencia a Kn mediante recombinación
homóloga por las regiones flanqueantes 5’ y 3’ del gen ptxA. B. Segundo remplazamiento donde se intercambió el gen
ptxA::kn por ptxA-S1-9K/129G. Las cruces en líneas discontinúas finas muestran el sitio de recombinación. Las líneas
discontinuas gruesas representan parte del plasmidio pSS1129. Se muestran los sitios de restricción así como las
sondas utilizadas en la realización de la hibridación por Southern blot para analizar los segregantes obtenidos.
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Para esto, primeramente se introdujo el plasmidio suicida pSS1129-flanqsS1-Kn (plasmidio suicida, GenR AmpR StrS,
vector de intercambio alélico, que contiene el gen de resistencia a Kn entre las regiones flanqueantes de ptxA) en la
cepa B165 StrR-4 mediante conjugación bacteriana. El análisis del ADN cromosómico de siete de los transformantes
obtenidos, denominados B165-OptxS1::Kn-1 a Kn-7 y digeridos con la enzima SalI, mediante hibridación de tipo
Southern blot15 con la sonda S1 (correspondiente a una banda de 2,8 kb que contiene el gen ptxA y comprende además
un fragmento de 1,0 kb cadena arriba del codón de inicio traduccional de ptxA y otro de 1,5 kb cadena abajo del codón
de parada traduccional de ptxA), reveló dos fragmentos de restricción, uno por debajo de la banda de 2,0 kb del patrón
de peso molecular y otro entre las bandas de 6,5 y 9,4 kb. Estas bandas se corresponden con las bandas de 1,3 kb y 7,7
kb esperadas para los transformantes que tuvieran el gen ptxA interrumpido con el gen que confiere resistencia a
kanamicina (Fig 2 A, carrileras 2- 8). Ambos fragmentos eran de menor talla que los encontrados en la cepa parental
B165 StrR-4 que debía contener dos fragmentos SalI de hibridación, de aproximadamente 8,1 y 1,7 kb (Fig. 2 A, carril
9) y se corresponden con los fragmentos en que escinde la enzima al operón Optx al cortar el gen ptxA. La existencia
de dos fragmentos SalI de estas tallas en la cepa B165 StrR-4 coincide con lo reportado anteriormente para la cepa
10536 de B. pertussis.16
Fig. 2. Hibridación de ácidos nucleicos tipo Southern blot para la detección del remplazo alélico de ptxA por
ptxA::kn en Bp165-StrR-4. A. Sonda de hibridación S1 y B. Sonda de hibridación Kn. Carril 1, Marcador de talla
molecular Lambda HindIII (Promega); carril 2 – 8, ADN de cada uno de siete mutantes digeridos con la enzima SalI;
carril 9, ADN de la cepa Bp165StrR-4 digerido con SalI.
Por su parte, el análisis del ADN cromosómico de los clones obtenidos con la sonda Kn, que corresponde a un
fragmento de restricción BamHI de 1,3 kb extraído del plasmidio pUC4K (GE-Healthcare, código 27-4958-01;
número de acceso de Gene Bank, X06404), mostró que los siete clones presentaron un fragmento SalI de hibridación
menor que el de la banda de 2,0 kb del patrón de peso molecular utilizado que se corresponde con el esperado de 1,3
kb (Fig. 2B carrileras 2- 8). En cambio en el ADN de la cepa B165 StrR-4 no se encontró ningún fragmento de
restricción SalI que hibridara con la sonda Kn (Fig 2 B, carril 9). Los resultados obtenidos en los clones analizados son
coherentes con la sustitución del gen ptxA por el gen marcador de resistencia a kanamicina en cuyos extremos hay
ubicados sitios de corte para la enzima SalI.
Posteriormente, se seleccionó al azar el clon resistente a kanamicina B165-OptxS1::Kn-1 y se le transfirió mediante
conjugación el plasmidio pSS1129-flanqsS1-OptxS1Mut (plasmidio suicida pSS1129 que contiene el gen ptxA
mutado entre sus regiones flanqueantes), lo que generó múltiples clones cuyo ADN se analizó mediante hibridación
por Southern blot. El análisis con la sonda S1 del ADN de ocho de los segregantes a los que se les denominó LPA0311
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al LPA0318, digeridos con la enzima SalI, identificó dos bandas una de talla menor que la banda de 2,0 kb del patrón
de peso molecular y otra entre las bandas de 6,5 y 9,0 kb, correspondiente a las bandas teóricas esperadas de 8,1 y 1,7
kb. Este resultado permitió comprobar el intercambio del marcador de Kn por el gen ptxA-S1-9K/129G, ya que se
restableció el sitio SalI del gen ptxA que permite también la identificación de dos bandas de igual talla molecular en el
caso de la cepa B165 StrR-4 (Fig. 3 A). En el caso de la cepa parental, B165-OptxS1::Kn-1, el patrón de bandas
coincidió con el observado en el experimento anterior. El Soutehrn blot realizado con la sonda Kn reveló solamente un
fragmento de hibridación de aproximadamente1,3 kb (Fig. 3 B, carril 2), correspondiente a la cepa B165-OptxS1::Kn1, lo que confirma que los segregantes obtenidos escindieron del cromosoma el marcador de Kn e incorporaron el gen
ptxA-S1-9K/129G.
Fig. 3 Hibridación de ácidos nucleicos tipo Southern blot para la detección del remplazo alélico del marcador de
resistencia a Kanamicina por el gen ptxA-S1-9K/129G en B165-OptxS1::Kn-1. A. Sonda de hibridación S1 y B. Sonda
de hibridación Kn. Carril 1, Marcador de talla molecular Lambda HindIII (Promega); carril 2, ADN de la cepa
B165-OptxS1::Kn-1, que muestra un patrón de bandas diferentes ya que solo se reconocen las regiones flanqueantes
de ptxA a ambos lados del gen kn; en B la sonda hibridó con la región correspondiente al gen kn; carril 3– 10, ADN
de cada uno de los ocho segregantes digeridos con la enzima SalI; carril 11, ADN de la cepa Bp165StrR-4 digerido
con SalI.
La presencia de las mutaciones introducidas en el gen ptxA en los clones se verificó mediante secuenciación
nucleotídica
de
un
fragmento
GCTACTGCAATCCAACACG-3´)
de
este
gen
amplificado
con
los
oligonucleótidos
PT3
(5´-
y PT8 (5´-CTGTTCAATTACCGGAGTTG-3´). El alineamiento de las
secuencias nucleotídicas obtenidas con la secuencia publicada de la cepa Tohama I (tipo salvaje, serotipo 2) 17
evidenció la inserción de los tripletes codificantes de arginina 9 y glutámico 129, mientras que el resto de la secuencia
se mantuvo idéntica. Ello confirmó que los clones contienen la secuencia codificadora de ptxA-S1-9K/129G.
Análisis de las características morfológicas, bioquímicas, producción de toxoide y perfil proteico de los
mutantes obtenidos. Para confirmar que las características morfológicas y bioquímicas de los mutantes con respecto a
la cepa parental no se afectaron durante los eventos de recombinación, se observaron en placas de Agar de Bordet
Gengou colonias pequeñas menores de 1 mm de diámetro, lisas, convexas, brillantes, blanquecinas y de aspecto
perlado, representativas de B. pertussis. Tanto en las cuñas para la detección de actividad ureasa como en las de agar
hierro de Kliger se observó crecimiento en toda la profundidad de la punción sin cambio de coloración del colorante
indicador. En Agar de MacConkey, ninguna de las cepas creció. Estos resultados indicaron que los mutantes y la cepa
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parental no degradan la urea, la lactosa, ni la glucosa y que no producen gas ni ácido sulfhídrico, en correspondencia
con lo reportado en la literatura para B. pertussis.18 Por su parte, la tinción de Gram de los mutantes mostró la
existencia de cocobacilos Gram-negativos, característicos de B. pertussis.
Al microscopio electrónico de transmisión, los cortes ultrafinos de B. pertussis de los mutantes así como de las cepas
B165 y B165 StrR-4, se observan como cocobacilos de pared celular íntegra y con contenido protoplasmático denso
(Fig. 4 A, B y C). En todas las muestras se observa que hay concordancia morfológica entre las cepas de partida y las
obtenidas por modificación genética en este trabajo.
Fig. 4. Microscopia electrónica de transmisión de cepas de B. pertussis. A. B. pertussis B165. Las flechas gruesas y
blancas, indican bacterias de aspecto normal. Las flechas delgadas y negras, muestran bacterias dañadas. B. B165
StrR-4. C. LPA0311 como ejemplo representativo de todos los mutantes analizados.
Por su parte, el contenido de la PT o PT-S1-9K/129G en las suspensiones bacterianas de B. pertussis cosechadas de
placas de Agar de Bordet Gengou que se analizó mediante ELISA de captura con el anticuerpo policlonal de carnero
anti PT (NIBSC, código 97/572), mostró que los mutantes produjeron niveles similares de la PT-S19K/129G que los
de la PT expresados por la cepa parental (aproximadamente1,0 μg·ml -1). La cantidad de esta proteína se considera
homogénea entre los mutantes y las cepas progenitoras de partida B165, B165 Str R-4 y se corresponde con el rango de
concentración obtenida por las cepas empleadas actualmente en la manufactura de vacunas acelulares. Para obtener el
ingrediente farmacéutico activo, la toxina se purifica y luego se destoxifica por métodos químicos. 7 Ello significa que
las cepas construidas pudieran emplearse como cepas de producción en la obtención de toxoide como ingrediente
farmacéutico activo, ya que además de producir el toxoide en rango de concentración similar se eliminaría el paso de
la desactivación química.
Para evaluar si ocurrió alguna modificación a nivel genómico, se comparó el patrón de proteínas totales de los
mutantes obtenidos con el de la cepa parental B165 Str R-4 y se observó la presencia de cuatro bandas mayoritarias de
tallas de aproximadamente 60, 35, 25 y 17 kDa, estos resultados sugieren que no ocurrió ningún cambio evidente en el
patrón de proteínas de los mutantes de S1 con respecto al de la cepa B165 Str R-4 que expresa S1 tipo salvaje.
La importancia de este estudio consiste en haber logrado la modificación genética de B165 StrR-4 y en disponer de un
sistema modular funcional para la modificación genética de cepas de B. pertussis especialmente en relación con los
genes codificantes de la toxina pertússica. Ya que los mutantes obtenidos en este estudio mantuvieron las
características morfológicas de la cepa parental, así como la capacidad de producir toxoide a niveles similares a los
obtenidos por cepas utilizadas en la producción de vacunas anti-tos ferina. Ello significa que las cepas construidas
pudieran emplearse como cepas de producción en la obtención de toxoide como ingrediente farmacéutico activo ya
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que la ventaja de producir la PT atenuada genéticamente significa mejor economía y seguridad que la inactivación
química, debido a que no hay pérdida por tratamiento químico del antígeno, reducción de inmunogenicidad asociada,
ni actividad tóxica residual por reversión,19 característica que tributa a los severos efectos adversos atribuidos a las
vacunas celulares.2 Además, las modificaciones genéticas no son reversibles, lo que no ocurre en el caso de la PT
inactivada químicamente.7 La localización cromosomal del gen codificante del toxoide PT-S1-9K/129G se considera
también una ventaja en cuanto a la estabilidad genética y la robustez de la cepa en el proceso de manufactura. Todo
esto hace a los mutantes obtenidos buenos candidatos para posteriores estudios para su introducción en la producción
de vacunas tanto celulares como a celulares. No obstante, la elección de estos mutantes para la producción de vacunas
estaría favorecida si estas cepas poseyeran un nivel de producción del toxoide mayor. Actualmente se desarrollan otras
construcciones genéticas destinadas a incrementar el rendimiento de la PT-S1-9K/129G.
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