LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA POR LABORATORIO DE

LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA POR LABORATORIO DE
ENFERMEDAD DIARREICA AGUDA BACTERIANA
DGE-InDRE–RNLSP
2013
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PRIMERA EDICIÓN, 2013
EDA BACTERIANA–RNLSP
Este documento fue avalado por los representantes de las instituciones que conforman el Grupo
Técnico Interinstitucional del Comité Nacional de Vigilancia Epidemiológica (CoNaVE).
TODOS LOS DERECHOS RESERVADOS CONFORME A LA LEY,
© INDRE-DGE-SECRETARÍA DE SALUD
SE PERMITE LA REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL SI SE CITA LA FUENTE: “LINEAMIENTOS
PARA LA VIGILANCIA POR LABORATORIO DE ENFERMEDAD DIARREICA AGUDA
BACTERIANA” VERSIÓN NO. 01. INDRE, 2013.
COLECCIÓN PUBLICACIONES TÉCNICAS DEL INDRE:
ISBN: EN PROCESO
INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICO.
PROLONGACIÓN DE CARPIO 470, COL. SANTO TOMÁS DEL. MIGUEL HIDALGO, C. P. 11340,
MÉXICO, D. F.
TEL. (55)53-42-75-50
WWW.INDRE.SALUD.GOB.MX
LA EDICIÓN ESTUVO A CARGO DE:
EL DISEÑO ESTUVO A CARGO DE:
IMPRESO EN MÉXICO. PRINTED IN MEXICO
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SECRETARÍA DE SALUD
DRA. MERCEDES JUAN LÓPEZ
SECRETARIA DE SALUD
DR. PABLO KURI MORALES
SUBSECRETARIO DE PREVENCIÓN Y PROMOCIÓN DE LA SALUD
DR. CUITLÁHUAC RUÍZ MATUS
DIRECTOR GENERAL DE EPIDEMIOLOGÍA
DR. JOSÉ ALBERTO DÍAZ QUIÑONEZ
DIRECTOR GENERAL ADJUNTO DEL INDRE
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INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICOS
DR. JOSÉ ALBERTO DÍAZ QUIÑONEZ
DIRECTOR GENERAL ADJUNTO
DRA. MA. DEL CARMEN GUZMÁN BRACHO
DIRECTORA DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA
QFB. LUCÍA HERNÁNDEZ RIVAS
DIRECTORA DE SERVICIOS Y APOYO TÉCNICO
LIC. DIANA ALEX FLORES ROMERO
SUBDIRECTORA DE OPERACIÓN
M EN C IRMA LÓPEZ MARTÍNEZ
JEFA DEL DEPARTAMENTO DE VIROLOGÍA
QFB. ROBERTO VÁZQUEZ CAMPUZANO
JEFE DEL DEPARTAMENTO DE ENFERMEDADES EMERGENTES Y URGENCIAS
M EN C MAYRA GISELA MELÉNDEZ HERNÁNDEZ
JEFA DEL DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGÍA
DRA. CLARA GORODEZKY LAUFERMAN
JEFA DEL DEPARTAMENTO DE INMUNOLOGÍA
M EN C JUDITH ESTÉVEZ RAMÍREZ
JEFA DEL DEPARTAMENTO DE CONTROL DE MUESTRAS Y SERVICIOS
DR. ERNESTO RAMÍREZ GONZÁLEZ
JEFE DEL DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y
VALIDACIÓN DE TÉCNICAS
QBP. IRMA HERNÁNDEZ MONROY
JEFA DEL DEPARTAMENTO DE BACTERIOLOGÍA
Q.F.B. MARÍA ASUNCIÓN MORENO PÉREZ
JEFA DEL LABORATORIO DE CÓLERA Y ENTEROBACTERIAS
COORDINADORA DE LA RED DE CÓLERA Y ENTEROBACTERIAS
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LINEAMIENTOS PARA LA
VIGILANCIA POR LABORATORIO
DE ENFERMEDAD DIARREICA
AGUDA BACTERIANA
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ÍNDICE
INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................ 7
ANTECEDENTES DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD PÚBLICA
(RNLSP) PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA ENFERMEDAD DIARREICA AGUDA
BACTERIANA ............................................................................................................................. 7
RED NACIONAL DE LABORATORIOS PARA LA VIGILANCIA DE LA ENFERMEDAD
DIARREICA AGUDA BACTERIANA ...................................................................................... 9
MARCO LEGAL DEL LABORATORIO ................................................................................. 10
OBJETIVOS ............................................................................................................................... 10
ORGANIZACIÓN DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE ENFERMEDAD
DIARREICA AGUDA (EDA) BACTERIANA......................................................................... 11
FUNCIONES DE LOS INTEGRANTES DE LA RED DE EDA BACTERIANA................... 12
DEFINICIÓNES OPERATIVAS ............................................................................................... 14
TOMA, MANEJO Y ENVÍO DE MUESTRA ........................................................................... 16
ALGORITMO DIAGNÓSTICO ................................................................................................ 17
ESTÁNDARES DE CALIDAD ................................................................................................. 18
CAPTURA DE DATOS Y RESULTADOS .............................................................................. 19
PROGRAMA DE EVALUACIÓN EXTERNA DEL DESEMPEÑO (PEED) ......................... 19
CRITERIOS PARA LA LIBERACIÓN DEL DIAGNÓSTICO ............................................... 20
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES ..................................................................................... 20
BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................................ 21
ANEXO 1. TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS ............................................................................... 23
ANEXO 2. INTERPRETACIÓN Y RESULTADOS DE PRUEBAS BIOQUÍMICAS ........... 44
ANEXO 3. RESULTADO DE PRUEBAS DE AGLUTINACIÓN........................................... 51
Grupo somático ................................................................................................................... 51
Antisuero flagelar ............................................................................................................... 51
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INTRODUCCIÓN
Las enfermedades diarreicas constituyen un problema de salud pública. Son una de las
principales causas de mortalidad y morbilidad de la niñez en el mundo y generalmente son
consecuencia de la exposición a alimentos y agua contaminados. En países industrializados, los
niños menores de tres años presentan en promedio tres episodios de diarrea al año. Esta alta
incidencia hace necesario que la población, esté sujeta a vigilancia epidemiológica para
identificar de forma oportuna eventos que signifiquen un riesgo de salud para la población y
con base en los hallazgos, tomar decisiones para las acciones de planeación, control y
prevención de las enfermedades sujetas a vigilancia. En México, las acciones de vigilancia se
apoyan en el Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiológica (SINAVE), el cual cuenta con el
subsistema de laboratorio para llevar a cabo las actividades de vigilancia de manera oportuna y
uniforme para el diagnóstico de cólera, salmonelosis, shigelosis y otras enfermedades
bacterianas transmitidas por alimentos.
El presente documento establece los lineamientos de operación para la vigilancia basada en los
hallazgos de laboratorio de la enfermedad diarreica aguda bacteriana incluyendo las funciones
por niveles; la toma, manejo y envío de muestras; la metodología para el análisis de muestras
(métodos tradicionales y métodos moleculares); la evaluación del desempeño así como los
estándares de calidad.
ANTECEDENTES DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD
PÚBLICA (RNLSP) PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA ENFERMEDAD DIARREICA
AGUDA BACTERIANA
El Laboratorio de Cólera y Enterobacterias, de forma conjunta con la Dirección General
Adjunta de Epidemiología (DGAE) y el Programa de Cólera y Urgencias, son responsables de
la vigilancia epidemiológica del cólera en México. A nivel internacional, la Organización
Mundial de la Salud (OMS) ha desarrollado una estrategia creando una red de vigilancia de las
Enfermedades Transmitidas por Alimentos (ETA). El objetivo primario de esta red es apoyar la
vigilancia de los patógenos transmitidos por alimentos, con base en el orden de prioridades y de
acuerdo al impacto y severidad de enfermedad que ocasiona cada uno de los patógenos
asociados. Este proyecto es coordinado por la (Organización Panamericana de Salud y la
Organización Mundial de la Salud) OPS-OMS, la Administración Nacional de Laboratorios e
Institutos de Salud (ANLIS) “Dr. Carlos G. Malbran” de Argentina a través del Instituto
Nacional de Enfermedades Infecciosas y los Centros de Control de Enfermedad y Prevención
[Centers for Disease Control and Prevention (CDC), por sus siglas en ingles].
En 1939 fue creado en México el Instituto de Salubridad y Enfermedades Tropicales (ISET) y
al interior de éste el Centro de Salmonelas. Años más tarde, en 1971, se incorporan nuevos
diagnósticos para dar origen al Laboratorio de Bacteriología Entérica como una necesidad para
tener un sitio destinado al estudio de patógenos entéricos con fines de apoyo a la vigilancia
epidemiológica. Este nuevo laboratorio inició su trabajo analítico con el aislamiento e
identificación de Shigella dysenteriae tipo 1 y en 1972 tuvo una participación muy importante
en el estudio de los brotes de tifoidea.
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Debido a la inminente llegada al Continente Americano de la séptima pandemia de cólera que
inició en 1961 en Indonesia, en 1990 se fundó en el Instituto Nacional de Diagnóstico y
Referencia Epidemiológicos (InDRE) el Laboratorio de Cólera para identificar al agente
etiológico en los casos compatibles con este padecimiento.
A partir de junio de 1991, cuando se reportó el primer caso de cólera en México, se creó
paulatinamente la Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública en apoyo a la vigilancia
epidemiológica y desde entonces, el InDRE coordina a los laboratorios que realizan la
búsqueda de patógenos entéricos como Vibrio cholerae, Salmonella spp y Shigella spp. En
1992 se creó el Laboratorio de Bacteriología Entérica II y se dio inicio a la realización de
estudios moleculares para Escherichia coli y posteriormente para Vibrio cholerae.
En la actualidad, el InDRE es el Laboratorio Nacional de Referencia (LNR) para Vibrio
cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Salmonella spp y Shigella spp. Realiza pruebas serológicas,
pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos y pruebas moleculares para la búsqueda de genes
de toxigenicidad, determinación de patotipos o el análisis de clonas. Proporciona los reactivos
para la caracterización de Vibrio cholerae y la identificación de grupo de Salmonella spp y
Shigella spp, imparte cursos de capacitación y capacitaciones en servicio al personal del sector
salud y lleva a cabo el aseguramiento de la calidad de la red a través de programas de
evaluación del desempeño.
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RED NACIONAL DE LABORATORIOS PARA LA
ENFERMEDAD DIARREICA AGUDA BACTERIANA
PRUEBA
Autosuficiencia Aislamiento e
en el
identificación.
diagnóstico Pruebas
moleculares (PCR)
2009
31
LESP
2010
31
LESP
2011
31
LESP
0
0
0
VIGILANCIA
DE
LA
2012 META
31
31 y D.F.
LESP
0
31 y D.F.
Estados de la República Mexicana que realizan el aislamiento y la identificación de
agentes causantes de Enfermedad Diarreica Aguda Bacteriana (Salmonella spp, Shigella
spp, Vibrio cholerae y Vibrio parahaemolyticus).
Fig. 1. Conformación de la red para el diagnóstico de EDA Bacteriana.
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MARCO LEGAL DEL LABORATORIO
1. Constitución Política de los Estados Unidos Mexicanos. Artículo 4. DOF 05/02/1917,
Última Reforma D.O.F. 15/02/2012.
2. Ley General de Salud. Artículo 3, XV; 59; 64, III; 133; 134, I; 136, 138, 139 y 141. DOF
7/02/1984, Última Reforma DOF 07/06/2012.
3. NORMA Oficial Mexicana NOM-017-SSA2-2012, Para la vigilancia epidemiológica.
DOF: 19/02/2013
4. Norma Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002. Protección ambiental-salud
ambiental-residuos peligrosos biológico-infecciosos-clasificación y especificaciones de
manejo.
5. NORMA Oficial Mexicana NOM-052-SEMARNAT-2005, Que establece las
características, el procedimiento de identificación, clasificación y los listados de los
residuos peligrosos. DOF: 23/06/2006.
6. PROYECTO de Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-016-SSA2-2009. Para la
vigilancia, prevención, control, manejo y tratamiento de cólera. DOF 21/02/2012.
7. Reglamento Interior de la Secretaría de Salud, publicado en el Diario Oficial de la
Federación el 19 de enero de 2004.
OBJETIVOS
Objetivo general
Instaurar los procedimientos para la aplicación del algoritmo de diagnóstico de cólera y
enterobacterias y establecer el manejo adecuado de la información generada por laboratorio, a
través de la Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública (RNLSP), en apoyo a la Vigilancia
Epidemiológica de la enfermedad diarreica aguda bacteriana.
Objetivos específicos





Detectar la circulación de los principales agentes bacterianos causantes de enfermedad
diarreica aguda.
Realizar la caracterización de los aislamientos de Salmonella spp, Shigella spp, Vibrio
cholerae y Vibrio parahaemolyticus.
Mantener la vigilancia de la circulación de Vibrio cholerae O1 y Vibrio cholerae O139.
En situaciones de brote, realizar estudios de electroforesis de campos pulsados (PFGE) del
agente bacteriano relacionado.
Proporcionar datos relevantes sobre estos patógenos en la Enfermedad Diarreica Aguda,
que sean útiles para estudios epidemiológicos de vigilancia bacteriológica.
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ORGANIZACIÓN DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS
ENFERMEDAD DIARREICA AGUDA (EDA) BACTERIANA
DE
La Red Nacional de Laboratorios de Diagnóstico de Enfermedad Diarreica Aguda Bacteriana la
encabeza el Laboratorio de Cólera y Enterobacterias, adscrito al Departamento de Bacteriología
del InDRE, integrada por los Laboratorios Estatales de Salud Pública (LESP) a través de los
componentes de cólera y enterobacterias y los laboratorios locales, aunado a los laboratorios
públicos y privados que realicen el diagnóstico de EDA bacteriana.
LABORATORIO DE CÓLERA Y ENTEROBACTERIAS InDRE
[(Laboratorio Nacional de Referencia (LNR)]
Muestras
Resultados
Laboratorios de Diagnóstico de EDA Bacteriana (LESP)
(Redes Estatales de Diagnóstico)
Laboratorios Locales de Diagnóstico de EDA Bacteriana
(Redes Locales de Diagnóstico)
Redes de Apoyo Jurisdiccionales
Laboratorios Locales de Diagnóstico públicos y
privados que realicen el diagnóstico de EDA Bacteriana
Fig. 2. Flujo de trabajo de la Red Nacional de Laboratorios para el diagnóstico de
Enfermedad Diarreica Aguda Bacteriana
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FUNCIONES DE LOS INTEGRANTES DE LA RED DE EDA BACTERIANA
FUNCIONES DEL LABORATORIO NACIONAL DE REFERENCIA
El laboratorio de cólera y enterobacterias del InDRE, es el Laboratorio Nacional de Referencia
y la pieza normativa para el diagnóstico. Se considera que entre sus funciones que competen al
área de la Red de Laboratorios, se encuentran:
 Realizar el análisis de muestras y confirmación inmediata de las cepas que por su naturaleza
se consideren urgentes.
 Mantener algoritmos de referencia y criterios de interpretación de resultados preestablecidos.
 Realizar el control de calidad de la red mediante el programa de evaluación del desempeño
a los LESP a través de:
o Monitorear el desempeño de la Red de Laboratorios de Diagnóstico de EDA Bacteriana.
o Aplicar el programa de evaluación externa del desempeño (PEED).
 Proveer capacitación en servicio para la formación de recursos humanos con base a las
necesidades detectadas.
 Supervisar a los laboratorios estatales.
 Proporcionar apoyo técnico a los laboratorios que lo requieran y lo soliciten.
 Realizar investigación operativa en apoyo a la vigilancia epidemiológica.
 Generar información de orden nacional en materia de diagnóstico, control de calidad,
formación de recursos humanos e investigación en la vigilancia epidemiológica que
coadyuve a la toma de decisiones en el control y prevención de la enfermedad en el marco
del programa nacional de salud.
FUNCIONES DE LOS LABORATORIOS ESTATALES DE SALUD PÚBLICA
Para el diagnóstico
 Realizar los estudios analíticos básicos para el diagnóstico de enfermedad diarreica aguda
bacteriana de importancia en salud pública: aislamiento e identificación de Vibrio cholerae,
Vibrio parahaemolyticus, Salmonella spp y Shigella spp.
 Realizar la búsqueda de Escherichia coli sólo en situación de brote o cuando se trate de
menores de cinco años que presenten evacuaciones con sangre y moco.
 Enviar de 3 a 5 aislamientos en cualquier caso, de cada paciente al InDRE.
 Asegurar la calidad del diagnóstico en el laboratorio de cólera y enterobacterias.
o Enviar al InDRE el 100% de los aislamientos de Vibrio cholerae O1, Vibrio
parahaemolyticus, Salmonella spp y Shigella spp.
o Enviar al InDRE del 100% de los aislamientos de Vibrio cholerae no O1 aislados de
seres humanos.
o Enviar al InDRE del 30% de los aislamientos de Vibrio cholerae no O1 aislados de
muestras ambientales y de alimentos.

Emitir en tiempo y forma los resultados de los exámenes de laboratorio.
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


Generar evidencia y notificar al órgano normativo estatal correspondiente los casos
confirmados.
Participar como mecanismo de apoyo técnico, proporcionando la información relacionada y
requerida por el Programa de Cólera y Urgencias de su entidad federativa.
Determinar la resistencia a los antimicrobianos ajustándose a los lineamientos vigentes
del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI).
Para el monitoreo del desempeño
 Coordinar a los laboratorios locales que realicen el análisis de muestras para la vigilancia
epidemiológica de EDA Bacteriana.
 Asegurar que se lleven a cabo los procedimientos, métodos y técnicas estandarizadas.
 Seleccionar las muestras para referencia del área de influencia del LESP.
 Compilar las muestras de los laboratorios locales o jurisdiccionales y realizar el control de
calidad indirecto de los mismos.
 Reportar inmediatamente las incongruencias encontradas.
 Realizar el análisis de la información generada.
 Recabar y analizar la información sobre la prestación de servicios de diagnóstico de los
laboratorios locales para el aseguramiento de la calidad de la red.
Para el Programa de Evaluación Externa del Desempeño
 Participar en la evaluación del desempeño del InDRE, a través de los programas oficiales
correspondientes.
 Realizar la evaluación del desempeño en los componentes de cólera y enterobacterias a los
laboratorios locales.
 Generar la evidencia de la evaluación para la red y enviar copia de resultados al laboratorio
evaluado y al InDRE.
 Organizar la información de estas actividades y proporcionarla cuando sea requerida por las
instancias evaluadoras.
Para capacitación
 Capacitar en el área de EDA Bacteriana al personal de los laboratorios locales y demás
instituciones del Sector Salud que lo requieran en su entidad de acuerdo con las necesidades
detectadas para la participación en estrategias especiales de vigilancia como son los
Núcleos Trazadores de Vigilancia Epidemiológica.
Apoyo técnico
 Participar en las urgencias epidemiológicas en el área de su competencia.
 Podrán colaborar y/o elaborar trabajos de investigación operativa que proporcione
información prioritaria estatal, una vez que los protocolos sean aceptados por los comités de
investigación.
 Apoyar con la preparación y/o evaluación de los reactivos que utilizan los integrantes de la
red.
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

Apoyar en la selección para la adquisición y en el suministro de materiales y reactivos
requeridos por los laboratorios de la red estatal de acuerdo a la evaluación proporcionada
por el InDRE.
Participar en la elaboración y actualización de los manuales técnicos referentes a
diagnóstico y temas especializados (bioseguridad, manejo de residuos peligrosos biológicoinfecciosos, etc.) para uso en el ámbito estatal y local.
FUNCIONES DE LOS LABORATORIOS A NIVEL LOCAL









Recepción e identificación de las muestras recibidas.
Realizar los estudios analíticos para el diagnóstico de enfermedad diarreica aguda
bacteriana de importancia en salud pública de acuerdo con los lineamientos preestablecidos: Aislamiento e identificación de Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus,
Salmonella spp y Shigella spp.
Realizar la búsqueda de Escherichia coli sólo en situación de brote o cuando se trate de
menores de cinco años que presenten evacuaciones con sangre y moco. Enviar de 3 a 5
aislamientos de cada paciente al InDRE.
Participar como mecanismo de apoyo técnico, proporcionando la información relacionada y
requerida por el Programa de Cólera y urgencias de su jurisdicción sanitaria.
Reportar los casos encontrados diariamente a la instancia correspondiente.
Aplicar las recomendaciones del nivel estatal.
Cumplir con el programa de control de calidad indirecto que establece el nivel estatal.
Participar en la evaluación del desempeño que organice el nivel estatal.
Recibir capacitación y asesoría del nivel estatal.
DEFINICIÓNES OPERATIVAS (Salud, 2012)
Caso de EDA: Todo paciente de cualquier edad que demande atención médica por presentar
cinco o más evacuaciones diarreicas en 24 horas durante no más de cinco días con o sin signos
de deshidratación.
Definición de caso EDA sin deshidratación: Paciente que presenta menos de cuatro
evacuaciones líquidas en 24 horas, con o sin presencia de vómito, sin pérdida de peso y sin
signos clínicos de deshidratación.
Caso de EDA moderada: Paciente de cualquier edad que demande atención médica por
presentar cuadro diarreico con cinco o más evacuaciones en 24 horas, cuya evolución sea
menor a cinco días y que presente datos de deshidratación moderada: Inquietud o irritabilidad,
ojos hundidos (llanto sin lágrimas), mucosas secas, sed aumentada, polipnea o taquipnea,
taquicardia, llenado capilar mayor a tres segundos y menor de cinco, oliguria.
Caso de EDA grave: Paciente de cualquier edad que demande atención médica por presentar
cuadro diarreico con cinco o más evacuaciones en 24 horas, cuya evolución sea menor a cinco
días y que tenga dos o más de los siguientes signos o síntomas: Vómito de más de cinco en 24
horas, cuadro disentérico, temperatura mayor a 38° C, datos de deshidratación moderada a
grave; letargo o inconsciencia, incapacidad para beber, pulso débil o no perceptible, llenado
capilar igual o mayor de cinco segundos.
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Caso sospechoso de cólera, a todo enfermo de diarrea que presente las siguientes
características:


Que en su lugar de residencia no se haya demostrado o se desconozca la circulación de
Vibrio cholerae O1 y/o O139 toxigénicos, a todo enfermo de diarrea que tenga cinco años
de edad o más, que presente cinco evacuaciones o más en 24 horas y cuyo cuadro diarreico
tenga una evolución menor a cinco días.
Que en su lugar de residencia donde se ha demostrado la circulación de Vibrio cholerae O1
y/o O139 toxigénicos en los últimos 90 días o en las comunidades ubicadas dentro del área
de los cercos epidemiológicos, se considerará como sospechosa a toda persona con diarrea
no mayor a cinco días de evolución, independientemente de su edad y en situación de
desastres.
Brote de cólera, a la presencia de dos o más casos confirmados relacionados
epidemiológicamente entre sí o la presencia de un caso en un área donde no se ha demostrado
la existencia previa del padecimiento.
Caso confirmado de cólera, a todo enfermo en el que se aísle, mediante cultivo bacteriológico,
en materia fecal o contenido gastrointestinal, Vibrio cholerae O1 y/o O139 toxigénicos, así
como los que por asociación epidemiológica se determinen.
Caso hospitalizado por cólera, a toda persona a la que se brinde atención médica en un
establecimiento de salud, fijo o móvil y que permanezca en el mismo 24 horas y en quien se
aísle o demuestre Vibrio cholerae O1 y/o O139 toxigénicos, mediante cultivo bacteriológico.
Contacto, a toda persona que en el hogar, lugar de trabajo o sitio de reunión haya compartido,
preparado o manipulado alimentos, agua o hielo o que haya realizado cambio de pañal de los
casos sospechosos o confirmados en los cinco días previos al inicio de la enfermedad.
Defunción por cólera, al fallecimiento de un caso confirmado que ocurra hasta dos semanas
posteriores al inicio de las manifestaciones clínicas y en cuyo certificado de defunción
aparezcan como causa básica o asociada los siguientes términos: Gastroenteritis o diarrea más
deshidratación; gastroenteritis; diarrea más desequilibrio hidroelectrolítico.
Enfermedad del cólera, la infección intestinal aguda causada por el Vibrio cholerae O1 y O139
toxigénicos que se transmite al hombre por la ingesta de agua y alimentos contaminados por
este microorganismo.
Fuente de infección de cólera, a todo alimento, agua, bebida, hielo, heces o vómito donde se
aísle Vibrio cholerae O1 y/o Vibrio cholerae O139 toxigénicos.
Portador, a la persona que alberga al agente infeccioso en ausencia de enfermedad clínica
aparente y en quien se aísle Vibrio cholerae O1 y/o O139 toxigénicos en materia fecal o
contenido gastrointestinal.
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TOMA, MANEJO Y ENVÍO DE MUESTRA
Las muestras de materia fecal se deben obtener en los primeros estadios de cualquier
enfermedad entérica, cuando los agentes patógenos están en mayor número y antes de que se
haya iniciado el tratamiento antibiótico. Una excepción a esta regla es el caso de las heces
obtenidas de pacientes con enfermedad febril y se sospeche de fiebre tifoidea ya que el agente
etiológico, Salmonella ser. typhi, puede estar presente en las heces en mayor cantidad, entre la
segunda y la tercera semana de la enfermedad por lo que si se sospecha de este padecimiento se
debe tomar muestra para hemocultivo durante la primera semana de evolución.
El número de hisopos fecales o rectales que se tomen por paciente debe ser igual al número de
análisis que se realizarán. Para la búsqueda de Vibrio spp y enterobacterias se deben tomar dos
hisopados fecales o rectales y deben ser enviados al laboratorio en medio de transporte de
Cary-Blair.
La toma de materia fecal se realiza con un hisopo estéril con punta de algodón, pudiendo ser
hisopo fecal (obtenido a partir de una muestra directa de materia fecal), o bien mediante hisopo
rectal, el cual se obtiene introduciendo el hisopo en el esfínter anal más de un centímetro y
girando el hisopo, el cual debe salir manchado con materia fecal.
Cuando se trata de un cuadro característico de cólera, la muestra se toma de las heces en forma
de agua de arroz. El hisopo se introduce en el tubo de Cary-Blair, tapando bien el tubo e
identificándolo al menos con el nombre del paciente y la fecha de la toma de la muestra.
El transporte de las muestras diagnósticas y de agentes patógenos (cepas) se debe hacer en
sistema de triple básico de triple embalaje [1] para reducir al mínimo el riesgo para los seres
humanos, para el medio ambiente y para proteger la viabilidad de los microorganismos.
Las cepas deben ser enviadas en tubos herméticamente cerrados, preferentemente con medio de
cultivo Base de Agar Sangre (BAB) o algún otro medio apropiado que no contenga azúcares.
1
El sistema básico de triple embalaje consiste en la utilización de un recipiente primario, en el cual está
contenida la muestra biológica (exudado faríngeo, exudado nasofaríngeo, lavado bronquio alveolar, biopsia, suero,
etc.), el recipiente primario (p. ej. criotubos, tubos o frascos con tapa de rosca) debe ser hermético para evitar que
la muestra se derrame y tiene que estar perfectamente etiquetado con el nombre o número de muestra del paciente.
El recipiente primario deberá rodearse de material absorbente como gasa o papel absorbente y colocarse en un
recipiente secundario hermético a prueba de derrames y golpes. Si se colocan varios recipientes primarios dentro
de un recipiente secundario se deberá usar una gradilla y material absorbente para evitar algún derrame. Es
importante mencionar que dentro del recipiente secundario (hielera) tiene que haber suficientes refrigerantes para
mantener una temperatura de 4 a 8° C. Los recipientes secundarios deberán llevar las etiquetas de riesgo biológico
y señal de orientación del recipiente, a su vez el recipiente secundario deberá ir contenido en un paquete externo
de envío (caja de cartón o hielera) que proteja el contenido de elementos externos del ambiente y debe estar
etiquetado con los datos del remitente, destinatario y señal de orientación. La documentación que se integre al
triple embalaje deberá colocarse en la parte interior del paquete.
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ALGORITMO DIAGNÓSTICO
Materia
fecal
*Medio de baja
selectividad
Enriquecimiento
para Salmonella
spp
Aislamiento en 2
medios de alta
selectividad
Enriquecimiento
(APA)
Aislamiento en
TCBS
**Identificación
Bioquímica
**Identificación
Bioquímica
Aglutinación para
grupo y serotipo
Aglutinación para grupo
Aglutinación para
serotipo
Prueba de
susceptibilidad
antimicrobiana
Pruebas moleculares
PFGE
(Solo en caso de brote)
* En caso de brote y se
sospeche de Escherichia
coli picar cinco colonias
e identificar.
Prueba de
susceptibilidad
antimicrobiana
Identificación de
genes de
toxigenicidad
Pruebas moleculares
PFGE
(Solo en caso de urgencia)
** Se pueden emplear
métodos automatizados o
semi automatizados para
la identificación.
Fig. 2. Algoritmo para el diagnóstico de EDA Bacteriana
Clave de Tabulador: 1B2547012, 1B2542002
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ESTÁNDARES DE CALIDAD
Con la finalidad de verificar el cumplimiento de los objetivos de la vigilancia por laboratorio de
las diarreas agudas bacterianas se definen los siguientes estándares.
ESTÁNDARES DE EVALUACIÓN DE LA CALIDAD
Indicador
Estándar
Cálculo
Acción
La define el
laboratorio local o
(Muestras
estatal. Puede ser
aceptadas/muestras
capacitación dirigida
recibidas) X 100
u oficio de
notificación
(Muestras
La define el
aceptadas hasta 5
laboratorio local o
días posteriores a
estatal. Puede ser
su fecha de
capacitación dirigida
toma/total de
u oficio de
muestras
notificación
aceptadas) X 100
Evaluación
Calidad de las
muestras
90% de las
muestras cumplen
con los criterios
de aceptación
Oportunidad en el
envío de la muestra
90% de las
muestras
aceptadas se
recibieron hasta 5
días posteriores a
su fecha de toma
Concordancia
analítica
90% de
concordancia de
las cepas enviadas
al InDRE
(Cepas
concordantes/Total
de cepas aceptadas
en el InDRE) X
100
La define el
laboratorio con base
en el análisis de
causas que deberá
enviar al InDRE
Trimestral
Evaluación del
desempeño
Al menos 80% de
cumplimiento en
cada uno de los
componentes
(cólera y
enterobacterias)
Se realiza con base
en los criterios que
se especifican en
el informe del
análisis de
resultados
El laboratorio
realizará un análisis
de causas y enviará su
plan de acciones al
InDRE
Semestral
Cumplimiento del
envío de cepas
Envío de los
aislamientos de
Vibrio cholerae
O1, Vibrio
parahaemolyticus,
Salmonella spp y
Shigella spp.
(Cepas aceptadas
en el InDRE/cepas
informadas en el
Sistema de
Información en
Salud) X 100
El laboratorio de
referencia nacional
enviará oficio de
notificación
Trimestral
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Mensual
Mensual
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CAPTURA DE DATOS Y RESULTADOS
Las actividades de captura de datos y resultados la realizará cada Laboratorio Estatal de Salud
Pública con sus recursos disponibles. Para el informe de resultados se deberá cumplir con lo
siguiente:
 El laboratorio es responsable de la realización del formato de informe. Este formato (ya sea
electrónico o en papel) y la manera en que va a ser comunicado por el laboratorio, deben ser
determinados en acuerdo con los usuarios de los servicios del laboratorio.
 El laboratorio comparte la responsabilidad con el solicitante para asegurar que los informes
son recibidos por las personas apropiadas dentro del intervalo de tiempo acordado.
 Los resultados deben ser legibles, sin errores de trascripción e informados a las personas
autorizadas para recibir y utilizar la información médica.
 El informe también debe incluir, sin estar limitado a la siguiente información:
 Identificación clara y sin ambigüedad del examen.
 Identificación del laboratorio que emite el informe.
 Identificación única, ubicación del paciente cuando sea posible y destino del informe.
 Nombre u otra identificación única del solicitante y la dirección del mismo.
 Fecha y hora de la toma de la muestra primaria, cuando esté disponible y sea pertinente
para el cuidado del paciente, así como la hora de recepción en el laboratorio.
 Fecha y hora de la liberación del informe, las cuales si no están en el informe, deben
estar fácilmente accesibles cuando sea necesario.
 Tipo de muestra primaria.
 Resultados de los exámenes.
 Otros comentarios (calidad de la muestra primaria condiciones que puedan haber
comprometido el resultado).
 Identificación de la persona que autoriza la liberación del informe.
 Si es pertinente, los resultados originales y los corregidos.
 Firma o autorización de la persona que verifica o libera el informe, cuando sea posible.
PROGRAMA DE EVALUACIÓN EXTERNA DEL DESEMPEÑO (PEED)
El InDRE enviará a los Laboratorios Estatales de Salud Pública un panel de cepas o muestras
cada seis meses, el cual deberá ser procesado con la metodología establecida en el laboratorio y
remitirá los resultados obtenidos al InDRE.
El InDRE analizará los resultados de la red de laboratorios y elaborará un informe con el
resultado global y particular de los participantes de la red.
Con base en los resultados obtenidos, se evaluará el desempeño de cada participante y se
definirán las acciones a seguir. Estas pueden ser desde reconocer el esfuerzo realizado hasta de
ser necesario, establecer un plan de acciones correctivas y/o preventivas, evaluar si se requiere
capacitación o si amerita una visita de supervisión.
Los laboratorios locales serán evaluados por el Laboratorio Estatal de Salud Pública que le
corresponda bajo los lineamientos anteriormente descritos.
Análisis de la informa
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Envío de plan
de
Acciones
(<80)
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Evaluación Externa de la Calidad
Actividades a realizar durante el ciclo anual del Programa de Evaluación Externa del
Desempeño
Fig. 4. Ciclo PEED en los componentes de Cólera y Enterobacterias
CRITERIOS PARA LA LIBERACIÓN DEL DIAGNÓSTICO
La liberación del diagnóstico de enfermedad diarreica aguda bacteriana se realiza únicamente
cuando el LESP obtiene más del 90% en los indicadores: "Concordancia analítica" y
"Evaluación del desempeño" sin embargo, deben seguir enviando las cepas al InDRE para
realizar la vigilancia de susceptibilidad a los antimicrobianos, la vigilancia de circulación de
cepas de Vibrio cholerae O139 y la realización de pruebas moleculares de alta complejidad
para el estudio de brotes y atención de urgencias nacionales e internacionales.
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DIC
NOV
OCT
SEP
AGO
JUL
JUN
MAY
ABR
MAR
FEB
ACTIVIDAD
ENE
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
Capacitación en
A programar, previa solicitud a través del Departamento de Control
servicio
de Muestras y Servicios del InDRE
Envío del primer panel
a los Laboratorios
x
Estatales de la Red de
EFES
Recepción de
resultados del Panel en
x
el InDRE
Envío de resultados a la
x
RNLSP
Envío del segundo
panel a los
x
Laboratorios Estatales
de la Red de EFES
Recepción de
resultados del Panel en
x
el InDRE
Envío de resultados a la
x
RNLSP
BIBLIOGRAFÍA
1. Organización Panamericana de la Salud. Organización Mundial de la Salud. Manual de
procedimientos para la serotipificación de V. cholerae. Washington, D. C. 2004.
2. Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades: Centro Nacional para las
Enfermedades Infecciosas y Organización Mundial de la Salud, Enfermedades
Transmisibles: Vigilancia y Respuesta. Manual de Laboratorio para la Identificación y
Prueba de Susceptibilidad a los antimicrobianos de Patógenos Bacterianos de Importancia
para la Salud Pública en el Mundo en Desarrollo. Atlanta, Georgia: CDC; 2004.
3. Organización Panamericana de la Salud. Organización Mundial de la Salud. Manual de
procedimientos para la serotipificación de Salmonella y Shigella. Washington, D. C. 2004.
4. Antigenic Formulae Of The Salmonella Serovars, 2007, 9th edition WHO Collaborating
Centre for Reference and Research on Salmonella Patrick A.D. Grimont, François-Xavier
Weill, Institute Pasteur, 28 rue du Dr. Roux, 75724 Paris Cedex 15, France.
5. Ewing, W.H, Edwards and Ewing's Identification of Enterobacteriaceae, 4th Edition.
Elsevier Science Publishing Co., Inc., New York 1986:135-172.
6. Aidara A. Koblavi S, Boye CS, Raphenon G, Gassama A, Girmoni E, Grimont PAD.
Phenotypic and genotypic characterization of Vibrio cholerae isolates from a recent
outbreak in Senegel: Comparison with isolates from Guinea-Bissau. Am J Trop Med Hyg
1988; 58: 163-7.
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7. Fields PI, Popovic T, Wachsmuth K, Olsvik O, 1992. Use of Polymerase Chain Reaction
for Detection of Toxigenic Vibrio cholerae O1 strains from the Latin American cholera
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8. Albert M, Islam D, Nahar S, Qadri F, Falklind S, Weintraub A, 1997. Rapid Detection of
Vibrio cholerae O139 Bengal from Stool Specimens by PCR. J Clin Microbiol 35: 16331635.
9. Raja N, Nor-Shamsudin M, Somarny W, Rosli R, Rahim RA, Radu S, 2001. Detection and
molecular characterization of the zot gene in Vibrio cholerae and V. alginolyticus isolates.
Southeast Asian J Trop Med Public Health 32: 100-104.
10. Sarkar A, Nandy RN, Nair BG, Ghose AC, 2002. Vibrio Pathogenicity Island and Cholera
Toxin Genetic Element-Associated Virulence Genes and Their Expression in Non-O1 NonO139 Strain of Vibrio cholera. American Society for Microbiology 70: 4735-4742.
11. Cabrera-García ME, Vázquez-Salinas C, Quiñones-Ramírez EI, Serologic and Molecular
Characterization of Vibrio parahaemolyticus Strains Isolated from Seawater and Fish
Products of the Gulf of Mexico, 2004. American Society for Microbiology 70: 6401-6406.
12. Tadaa J, Ohashia T, Nishimuraa N, Shirasakia Y, Ozakia H, Fukushima S, Takanoa J,
Nishibuchib M, Takedab Y. Detection of the thermostable direct hemolysin gene (tdh) and
the thermostable direct hemolysin-related hemolysin gene (trh) of Vibrio parahaemolyticus
by polymerase chain reaction. Department of Microbiology, Faculty of Medicine, Kyoto
University. 1992.
13. Vibrio cholerae and Cholera molecular to global perspectives, Edited by I. Kaye
Wachsmuth, Paula Blake and Orjan Olsvik. ASM PRESS, Washington D.C. American
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14. Miller MJ, et al. Guidelines for safe work practices in human and animal medical diagnostic
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15. Guidelines for Biosafety Laboratory Competency. MMWR. Supplement / Vol. 60; 2011.
16. World Health Organization. Guidance on regulations for the Transport of Infectious
Substances 2013-2014; Geneva: WHO Press; 2012.
17. Chosewood C & Wilson DE. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories –
5th ed. CDC-NIH; 2009.
18. European Committee for Standardization. CWA 15793:2011 Laboratory biorisk
management standard. Brussels: CEN; 2011.
19. World Health Organization. Laboratory Biosafety Manual – 3rd ed. Geneva: WHO Press;
2004.
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ANEXO 1. TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS
1. Aislamiento e identificación de Vibrio cholerae y Vibrio parahaemolyticus
1.1.
Principio del método
El método se fundamenta en la capacidad de Vibrio spp para crecer en medios alcalinos y de
sus diferentes capacidades metabólicas para descarboxilar aminoácidos como la lisina, ornitina
y arginina; fermentar azúcares como sacarosa, lactosa y glucosa; producir indol a partir del
triptófano; de ser móvil y poseer la enzima citocromo oxidasa. La serotipificación de Vibrio
cholerae se fundamenta en la detección de antígenos específicos del lipopolisacárido
bacteriano a través de una reacción antígeno-anticuerpo.
1.2.
Sistema de muestra primaria
Muestra de materia fecal o cepas de Vibrio spp.
1.3.
Tipo de contenedor y aditivos
La muestra de materia fecal deberá recolectarse con hisopo de algodón (hisopo rectal o hisopo
fecal) e introducirse en un tubo con medio de transporte de Cary Blair; las cepas de Vibrio spp
deberán estar sembradas en un medio de cultivo de soporte (base de agar sangre).
1.4.





Equipos
1.5.
Incubadora a 36 +1° C
Refrigerador de 4 a 8° C
Lámpara de luz blanca
Termómetro de -5 a 15° C
Termómetro de 20 a 50° C










Materiales
Mechero Bunsen, cuadro básico número 533.604.0042
Manguera de látex para la conexión del gas al mechero, cuadro básico número
080.909.5383
Asas de nicromel con punta recta, cuadro básico número 537.085.0018
Placa Petri de 100 x 15 mm cuadro básico número 080.148.0120
Tubo de 16 x150 mm con tapón de rosca de baquelita
Tubo de 13 x 100 mm con tapón de rosca de baquelita
Gradillas para 72 tubos, cuadro básico número 533.461.0507
Pipetas graduadas de vidrio de 5 mL, cuadro básico número 080.709.2606
Portaobjetos 12 x 75 x 0.8 mm, cuadro básico número 080.729.0010
Aplicadores de madera sin algodón, cuadro básico número 060.082.0054
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





1.6.
Jeringa desechable para tuberculina de 1 mL, cuadro básico número 060.550.0636
Bulbo de seguridad de tres vías
Gasa simple, cuadro básico número 060.436.0669
Pinzas de disección de acero inoxidable, de 12.7 cm. cuadro básico número 535.701.0056
Pizeta con solución desinfectante de hipoclorito de sodio dilución 1:100 (1%)
Frasco con solución salina formalinizada 0.6%

Reactivos y material biológico

Agar tiosulfato citrato bilis sacarosa (TCBS), cuadro básico número 080.610.2448, 30 mL
en placa Petri.
Base de agar sangre (BAB), cuadro básico número 080.610.1200, 4.0 mL de medio
inclinado en tubo de 13 x 100 mm con tapón de hule.
Base de agar sangre (BAB), cuadro básico número 080.610.1200, 30 mL de medio en placa
Petri.
Medio de movilidad indol ornitina (MIO), cuadro básico número 080.610.1770, 4.0 mL de
medio sin inclinar en tubo de 13 x 100 mm con tapón de rosca.
Agar de hierro y triple azúcar (TSI), cuadro básico número 080.610.2364, 4.0 mL de medio
inclinado en tubo de 13 x 100 mm con tapón de rosca.
Agar de hierro y lisina (LIA), cuadro básico número 080.610.0269, 4.0 mL de medio
inclinado en tubo de 13 x 100 mm con tapón de rosca.
Peptona de caseína, cuadro básico número 080.610.1879, cloruro de sodio, cuadro básico
número 080.830.0677, para preparar agua peptonada alcalina pH 9 (APA) 10 mL en tubo
de 16x150 mm con tapón de rosca.
Peptona de caseína, cuadro básico número 080.610.1879, cloruro de sodio, cuadro básico
número 080.830.0677, para preparar caldo peptonado (CP), 4 mL.0 en tubo de 13x100 mm
con tapón de rosca.
Base descarboxilasa de Möeller, cuadro básico número 080.610.2455, L-arginina, cuadro
básico número 080.832.4107, para preparar caldo arginina 4.0 mL en tubo de 13x100 mm
con tapón de rosca.
Reactivo de Kovac, cuadro básico número 080.783.1557.
Reactivo de oxidasa, cuadro básico número 080.889.0172.
Vaselina líquida.
Cloruro de sodio, cuadro básico número 080.830.0677.
Formaldehido, cuadro básico número 080.830.1311.
Hipoclorito de sodio.
Agua destilada.
Todos los medios de cultivo se deben preparar siguiendo las especificaciones del fabricante.
Suero polivalente Vibrio cholerae O1.
Suero monovalente Vibrio cholerae Inaba.
Suero monovalente Vibrio cholerae Ogawa.


















1.7.
Pasos del método
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Aislamiento
La muestra de materia fecal debe ser fresca y estar en medio de transporte de Cary-Blair y
deberá ser procesada lo antes posible una vez que llega al laboratorio.
Depositar el hisopo del Cary-Blair en tubo de Agua Peptonada Alcalina (APA), incubar a 36
+1° C durante 6-8 h.
Con una asa redonda previamente quemada y enfriada en el agar depositar 3 asadas de la
superficie del APA en una placa de agar TCBS, sembrar por estría cruzada sin quemar el asa
entre cuadrantes. Incubar a 36+1° C durante 18 a 24 h.
Las cepas de origen clínico, alimentos o ambientales para referencia o control de calidad se
siembran directo en agar TCBS por estría cruzada quemando el asa entre el primer o segundo
cuadrante. Incubar a 36+1° C durante 18 a 24 h.
Identificación
Seleccionar del agar TCBS colonias, sacarosa positivas (colonias amarillas, planas de 2 mm,
generalmente pegajosas) y/o sacarosas negativas (colonias verdes, de 2 mm, generalmente
pegajosas).
Quemar una asa en punta y enfriar en un extremo de la placa donde no haya crecimiento, tomar
la colonia sin extender en el agar (con esta única colonia se siembran todas las pruebas
bioquímicas), inocular en tubo de caldo arginina (CA) y caldo peptonado (CP), depositando el
inóculo, MIO picadura hasta el fondo, TSI, LIA y tubo de BAB, picadura hasta el fondo y
estría en la superficie (las bioquímicas que se utilicen para identificar las colonias verdes se
deben adicionar con 1% de cloruro de sodio; adicionalmente se deben sembrar caldos
nutritivos con 0%, 1%, 3%, 6%, 8% y 10% de cloruro de sodio.
Sellar con vaselina líquida estéril el caldo arginina; sembrar también una placa de BAB por
estría cerrada. Incubar a 36+1° C durante 18 a 24 h.
De la placa de BAB hacer la prueba de oxidasa, depositar un inóculo con asa desechable o
aplicador de madera en la zona reactiva de la tira o en el papel impregnado con el reactivo, leer
el resultado en un tiempo máximo de 10 segundos.
Antes de leer las pruebas bioquímicas agregar 0.5 mL de reactivo de Ehrlich o Kovac en el
caldo peptonado, interpretar los resultados de las pruebas bioquímicas utilizando la tabla 1, e
identificar el patrón bioquímico de V. cholerae o V. parahaemolyticus con la tabla 2.
Serotipificación
Si bioquímicamente se identificó Vibrio cholerae, realizar la serotipificación a partir de la
placa de BAB.
En un portaobjetos limpio y desengrasado depositar 5 gotas de solución salina formalinizada
en el extremo superior del portaobjetos, separadas lo suficiente para evitar que se mezclen. En
el extremo inferior colocar una gota de solución salina (testigo negativo), una gota de suero
polivalente Vibrio cholerae O1, una gota de suero monovalente Vibrio cholerae O1 Ogawa,
una gota de suero monovalente Vibrio cholerae O1 Inaba y una gota de suero monovalente
Vibrio cholerae O: 139.
Con un asa estéril o aplicador de madera tomar crecimiento de la placa de BAB y depositar en
cada una de las gotas de solución salina formalinizada, mezclar las gotas de suspensión con
cada antisuero, agitar por 1 minuto e interpretar. Registrar los resultados.
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1.8.
Interpretación por laboratorio
Para emitir un resultado positivo a Vibrio cholerae O1 (Ogawa o Inaba), N O1 u O139 de una
muestra procesada, se considera la identificación bioquímica que debe corresponder al patrón
bioquímico de dicha especie, así como los resultados de serotipificación del antígeno somático.
Para emitir un resultado positivo a Vibrio parahaemolyticus de una muestra procesada, se
considera la identificación bioquímica que debe corresponder al patrón bioquímico de dicha
especie.
Un resultado negativo corresponde a la ausencia de Vibrio cholerae y Vibrio parahaemolyticus
en la muestra fecal o cepa recibida.
Realizar pruebas moleculares a las cepas identificadas como Vibrio parahaemolyticus, Vibrio
cholerae O1 y Vibrio cholerae O139.
1.9.
Medidas de bioseguridad
El nivel de bioseguridad requerido es nivel 2 por lo que se recomienda:
 Usar bata de laboratorio blanca, limpia y abotonada, esta vestimenta no debe ser usada
fuera de las áreas de trabajo.
 Limpiar y desinfectar la mesa de trabajo antes y después de procesar muestras.
 Mantener cerrada la puerta del laboratorio.
 Lavarse las manos antes y después de trabajar.
 No hablar, estornudar ni toser durante el sembrado de la muestra.
 No pipetear directamente con la boca.
2. PCR punto final para la detección de cepas toxigénicas de Vibrio cholerae
2.1.
Principio del método
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica mediante la cual se replican de
forma exponencial miles de copias de un gen o segmento de ADN específico. Esta técnica
molecular utiliza dos iniciadores (oligonucleótidos) específicos y complementarios a la
secuencia buscada en la bacteria y consiste en separar con calor ambas cadenas de ADN,
posteriormente cada iniciador se hibrida complementariamente a una cadena de DNA,
interviniendo en ese momento la ADN polimerasa que utiliza los desoxioligonucleotidos
(dNTPs) presentes para sintetizar a su vez dos cadenas complementarias a las del molde. Este
proceso se repite varias veces, hasta obtener cantidades detectables y visibles del ADN presente
originalmente en las muestras.
2.2.
Sistema de muestra primaria
Cultivo puro de Vibrio cholerae O1 o Vibrio cholerae O139.
2.3.
Tipo de contenedor y aditivos
Las cepas deben estar sembradas por aislamiento en medio de Agar Base Sangre sin aditivos.
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2.4.












Equipo
2.5.
Termociclador-PCR
Gabinete de bioseguridad tipo II clase 2A
Cabina para PCR
Cámara de electroforesis horizontal
Fotodocumentador
Fuente de poder
Congelador vertical
Refrigerador vertical
Termoagitador
Sistema de purificación de agua
Balanza analítica
Aire acondicionado












Materiales
2.6.
Micropipetas de: 1-10, 2-20, 20-200 y 100-1000 µL
Micropipeta
Guantes de nitrilo
Tubos tipo eppendorf de: 0.2, 0.5 y 1.5 mL
Puntas para micropipeta de: 10, 200 y 1000 µL
Tubos para centrifuga de: 50 mL
Pipetas desechables de 5.0 y 10 mL
Marcadores indelebles
Gradillas para tubos eppendorf
Bolsas de polipropileno
Contenedores para desecho de puntas
Gasas
Reactivos y material biológico
Reactivos y materiales biológicos
dNTP´s (A, T, C, G) 100µM
Taq polimerasa 5U/µL
CTX2
5’ CGG GCA GAT TCT AGA CCT CCT G 3’ (1,2)
CTX3
5’ CGA TGA TCT TGG AGC ATT CCC AC 3’ (1,2)
CTX7
5’ GGT TGC TTC TCA TCA TCG AAC CAC 3' (5)
CTX9
5’ GAT ACA CAT AAT AGA ATT AAG GAT 3' (5)
ACE1
5´-TAA GGA TGT GCT TAT GAT GGA CAC CC 3´ (1)
ACE2
5´-CGT GAT GAA TAA AGA TAC TCA TAG-3’ (1)
ZOT1
5’ TGG CTT CGT CTG CTG CCG GCG ATT 3' (1,4)
ZOT2
5’ CAC TTC TAC CGA CAG CGC TTG CG 3' (1,4)
1-39Vc
5’ GCG TTA TAG GTA TCA TCA AGA GA 3’ (3)
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Fabricante
Roche
Roche
Applied biosystems
Applied biosystems
Applied biosystems
Applied biosystems
Applied biosystems
Applied biosystems
Applied biosystems
Applied biosystems
Applied biosystems
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2-39Vc
5’ GTC ATT ATT AAA ACT GCT CCA TT 3’ (3)
MgCl2, 25mM
Regulador 10 X
Solución amortiguadora TBE
Agarosa
Bromuro de etidio
Agua destilada y desionizada
Marcador de peso molecular
Naranja de acridina
Alcohol etílico al 70%
2.7.
Applied biosystems
Applied biosystems
Applied biosystems
Sigma
MILLIPORE
Pasos del método
Re-suspender una colonia de una cepa aislada y caracterizada como Vibrio cholerae en 200 µL
de agua destilada para obtener el ADN molde.
Hervir la suspensión durante 15 minutos e inmediatamente colocar en baño de hielo.
Consideraciones antes de iniciar la PCR
 Antes de empezar a trabajar descontaminar el gabinete de bioseguridad.
 Usar el equipo de seguridad.
 Mantener las suspensiones de las muestras en hielo listas para PCR.
 Descongelar previamente los reactivos para PCR.
 Rotular los tubos de acuerdo al número y tipo de muestra a trabajar.
Preparación de la mezcla de reacción.
La mezcla de reacción se prepara en el ÁREA BLANCA del laboratorio.
El volumen de los reactivos se calculará de acuerdo al número de muestras a analizar,
siguiendo el formato de trabajo para PCR. Una vez preparada la mezcla de reacción,
homogenizar suavemente con pipeta aproximadamente 30 veces (aspirando y expulsando con
ayuda de la pipeta), finalmente adicionar 22 µL de esta mezcla en el fondo de cada tubo.
En el ÁREA DE TEMPLADOS, adicionar 3.0 µL del ADN extraído de cada muestra en el tubo
correspondiente.
Formato de trabajo para PCR
REACTIVOS
VOLUMEN (L)
H2O
Reg 10X
MgCl2 25mM
dNTP´s 1µM
Iniciador 1 (ctx 2, ctx 7, ace 1, zot 1, 1-39Vc)
Iniciador 2(ctx 3, ctx 9, ace 2, zot 2, 2-39Vc)
9.35
2.5
4.0
4.0
1.0
1.0
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Taq 5U/µL ROCHE
ADN
1 ciclo
35 ciclos
1 ciclo
0.15
3.0
Programa
94oC–1 min
94oC–30 s
55oC–30 s
72oC–1 min
72oC–2 min
Controles
En el ÁREA DE CONTROLES adicionar 3.0 µL de control positivo y negativo
respectivamente.
Control negativo: Colocar una muestra de ADN confirmada como negativa a V. cholerae.
Control positivo: Colocar ADN extraído de una cepa caracterizada como V. cholerae O139
toxigénica bajo el resguardo del InDRE.
Control de reactivos: utilizar 3.0 µL de agua inyectable o calidad Milli-Q.
NOTA: Asegurarse de que todos los tubos queden bien tapados para evitar que el contenido se
evapore.
Colocar los tubos en el termociclador, seleccionar el programa para Vibrio cholerae y dar inicio
a la corrida. Los productos de ADN obtenidos se someten a 120 V por 30 minutos a
electroforesis en un gel de agarosa al 2% en regulador Tris-EDTA-ácido acético. Finalizada la
electroforesis evidenciar la presencia de las bandas (productos) con luz UV.
2.8.
Interpretación por laboratorio
Presencia de una banda de aproximadamente 564 pb indica la presencia del gen de la subunidad
A de la toxina colérica.
Presencia de una banda de aproximadamente 460 pb indica la presencia del gen de la subunidad
B de la toxina colérica.
Presencia de una banda de aproximadamente 314 pb indica la presencia del gen de la toxina
accesoria ace.
Presencia de una banda de aproximadamente 1083 pb indica la presencia del gen de la toxina
accesoria zot.
2.9.



Medidas de bioseguridad
Todas las muestras y controles deben manejarse como potencialmente infecciosos y
analizarse en un laboratorio de bioseguridad Nivel 2 (BSL-2) dentro de un gabinete de
bioseguridad tipo II 2A.
El analista debe usar equipo de protección personal, bata (una para cada área del proceso),
guantes desechables (un par para cada proceso) y lentes de seguridad.
Disponer de los contenedores y bolsas correspondientes para los desechos de Residuos
Peligrosos Biológico-Infecciosos (RPBI) en cada área.
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Descontaminar las micropipetas, gabinetes y cabinas antes y después de trabajar con etanol
al 70% o benzal-metanol 1:1 v/v.
Todo el material a utilizar deberá ser estéril.
El personal que realice la electroforesis no podrá hacer mezcla para PCR en la misma
jornada.
El área limpia o ÁREA BLANCA está libre de toda contaminación por ADN por lo que
solo podrán manejarse reactivos.
El ÁREA DE TEMPLADOS será la única en donde se podrán abrir los tubos que contienen
el DNA de las muestras.
El ÁREA DE CONTROLES será la única permitida para la colocación del ADN control.
Solo en el ÁREA SUCIA o de electroforesis se podrán abrir los tubos con cADN y cargarse
en los geles.
Cada área deberá estar separada físicamente para evitar contaminaciones.
Es muy importante que cada área cuente con su propio material (puntas, guantes, agua,
etc.), y éste no deberá compartirse entre áreas.
Los equipos deberán descontaminarse antes de una reparación, mantenimiento o antes de
ser removidos del laboratorio.
El analista debe lavar sus manos antes y después de trabajar.
La prueba se realizará en un laboratorio entre 18-25° C. Las diferentes áreas deberán estar
separadas y selladas para evitar el paso de aire con polvo y evitar así la contaminación.







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
3. PCR punto final para la detección de genes de patogenicidad en cepas de Vibrio
parahaemolyticus
3.1.
Principio del método
Como ya se mencionó, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica mediante la
cual se replican de forma exponencial miles de copias de un gen o segmento de ADN
específico. Esta técnica molecular utiliza dos iniciadores (oligonucleótidos) específicos y
complementarios a la secuencia buscada en la bacteria y consiste en separar con calor ambas
cadenas de ADN, posteriormente cada iniciador se hibrida complementariamente a una cadena
de ADN, interviniendo en ese momento la ADN polimerasa que utiliza los
desoxioligonucleotidos (dNTPs) presentes para sintetizar a su vez dos cadenas
complementarias a las del molde. Este proceso se repite varias veces, hasta obtener cantidades
detectables y visibles del ADN presente originalmente en las muestras.
3.2.
Sistema de muestra primaria
Cultivo puro de Vibrio parahaemolyticus
3.3.
Tipo de contenedor y aditivos
Las cepas deben estar sembradas por aislamiento en medio de Agar Base Sangre sin aditivos.
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3.4.
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Equipo
3.5.
Termociclador
Gabinete de bioseguridad tipo II clase 2A
Cabina para PCR
Cámara de electroforesis horizontal
Fotodocumentador
Fuente de poder
Congelador vertical
Refrigerador vertical
Sistema de purificación de agua
Balanza analítica
Aire acondicionado
Horno de microondas
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Materiales
3.6.
Micropipetas de: 1-10, 2-20, 20-200 y 100-1000 µL
Guantes desechables
Tubos tipo eppendorf de: 0.2, 0.5 y 1.5 mL
Puntas para micropipeta de: 10, 200 y 1000 µL
Tubos para centrifuga de 50 mL
Pipetas desechables de 5 y 10 mL
Marcadores indelebles
Gradillas para tubos eppendorf
Bolsas de polipropileno
Contenedores para desecho de puntas
Gasas
Reactivos y material biológico
Reactivos y Materiales biológicos
dNTP´s (A, T, C, G) 100µM
Taq polimerasa 5U/µL
Tdh1
5'-GGT ACT AAA TGG CTG ACA TC-3' (1,2)
Tdh2
5'-CCA CTA CCA CTC TCA TAT GC-3' (1,2)
Trh1
5'-GGC TCA AAA TGG TTA AGC G-3' (1,2)
Trh2
5'-CAT TTC CGC TCT CAT ATG C-3' (1,2)
MgCl2, 25mM
Regulador 10 X
Solución amortiguadora TBE
Agarosa
Bromuro de etidio
Agua destilada y desionizada
Marcador de peso molecular
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Marca
Roche
Roche
Applied biosystems
Applied biosystems
Applied biosystems
Applied biosystems
Applied biosystems
Applied biosystems
Sigma
MILLIPORE
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Naranja G
Alcohol etílico al 70%
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3.7.
Pasos del método
Resuspender una colonia de la cepa aislada y caracterizada como Vibrio parahaemolyticus en
200 µL de agua destilada.
Hervir 15 minutos la suspensión e inmediatamente colocar en baño de hielo.
Consideraciones antes de iniciar la PCR

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


Antes de empezar a trabajar descontaminar el gabinete de bioseguridad utilizando el
sanitizante asignado.
Colocarse el equipo de seguridad.
Mantener las suspensiones de las muestras en hielo listas para la PCR.
Descongelar previamente los reactivos para la PCR.
Rotular los tubos de acuerdo al número y tipo de muestra a trabajar.
Preparación de la mezcla de reacción



Esta se hará en el ÁREA BLANCA del laboratorio.
El volumen de los reactivos se calculará de acuerdo al número de muestras a diagnosticar,
siguiendo el formato de trabajo para PCR. Una vez preparada la mezcla de reacción
homogenizar suavemente con la pipeta (aspirando y expulsando con ayuda de la pipeta)
aproximadamente 30 veces, finalmente adicionar 22 µL de esta mezcla en el fondo de cada
tubo.
En el ÁREA DE TEMPLADOS, adicionar 3.0 µL del DNA extraído de cada muestra en el
tubo correspondiente.
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Formato de trabajo para PCR de Vibrio parahaemolyticus
Reactivos
H2O
Reg 10X
MgCl2 25mM
dNTP’s 1µM
tdh 1 1:80
tdh 2 1:80
Taq 5U/µL
DNA
Volumen (L)
4.35
2.5
10
3
1
1
0.15
3
Reactivos
Volumen (L)
H2O
Reg 10X
MgCl2 25mM
dNTP’s 1µM
trh 1 1:80
trh 2 1:80
Taq 5U/µL
DNA
12.35
2.5
2
3
1
1
0.15 L
3
Programa
1 ciclo
94o C–1 min
94o C–20 s
25 ciclos
55o C–20 s
72o C–30 s
1 ciclo
72o C-2 min
Controles
En el ÁREA DE CONTROLES, adicionar 3.0 µL de control positivo y negativo
respectivamente en el tubo que corresponda.
Control negativo para tdh: Colocar una muestra de ADN confirmada como V.
parahaemolyticus trh positivo.
Control negativo para trh: Colocar una muestra de ADN confirmada como V. parahaemolyticus
tdh positivo.
Control positivo para tdh: Colocar una muestra de ADN confirmada como V. parahaemolyticus
tdh positivo.
Control positivo para trh: Colocar una muestra de ADN confirmada como V. parahaemolyticus
trh positivo.
Control de reactivos: utilizar 3.0 µL de agua inyectable o agua calidad Milli-Q.
NOTA: Asegurarse de que todos los tubos queden bien tapados, para evitar que el contenido se
evapore.
Colocar los tubos en el termociclador, seleccionar el programa para Vibrio parahaemolyticus y
dar inicio a la corrida.
Los productos de ADN obtenidos se someten a 120 V por 30 minutos a electroforesis en un gel
de agarosa al 2% en regulador Tris-EDTA-ácido acético.
Finalizada la electroforesis evidenciar la presencia de las bandas (productos) con luz UV.
3.8. Interpretación por laboratorio
Positivo:
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Presencia de una banda de aproximadamente 251 pb indica la presencia del gen tdh que
codifica para la hemolisina termoestable directa.
Presencia de una banda de aproximadamente 250 pb indica la presencia del gen trh que codifica
para la termolisina relacionada a la directa.
Negativo:
Ausencia de los genes que codifican para las termolisinas, ausencia de bandas tdh (251 pb) y
trh (250 pb).
3.9.
Medidas de bioseguridad
Todas las muestras y controles deben manejarse como potencialmente infecciosos y trabajarse
en un Laboratorio de Bioseguridad Nivel 2 (BSL-2) dentro de un gabinete de bioseguridad tipo
II 2A.
 El analista debe usar su equipo de protección personal, bata (una para cada área del
proceso), guantes desechables (un par para cada proceso) y lentes de seguridad.
 Disponer de los contenedores y bolsas correspondientes para los desechos RPBI en cada
área.
 Descontaminar las micropipetas, gabinetes y cabinas antes y después de trabajar con etanol
al 70% o benzal-metanol 1:1 v/v.
 Todo el material a utilizar deberá estar estéril.
 El personal que realice la electroforesis no podrá hacer mezcla para PCR en la misma
jornada.
 El área limpia o ÁREA BLANCA está libre de toda contaminación por ADN por lo que
solo podrán manejarse reactivos.
 El ÁREA DE TEMPLADOS será la única en donde se podrán abrir los tubos que contienen
el DNA de las muestras.
 El ÁREA DE CONTROLES será la única permitida para la colocación del ADN control.
 Solo en el ÁREA SUCIA o de electroforesis se podrán abrir los tubos con cADN y cargarse
en los geles.
 Cada área deberá estar separada físicamente para evitar contaminaciones.
 Es muy importante que cada área cuente con su propio material (puntas, guantes, agua, etc.)
y éste no deberá compartirse entre áreas.
 Los equipos deberán descontaminarse antes de una reparación, mantenimiento o antes de
ser removidos del laboratorio.
 El analista debe lavar sus manos antes y después de trabajar.
 La prueba se realizará en un laboratorio entre 18-25° C. Las diferentes áreas deberán estar
separadas y selladas para evitar el paso de aire con polvo y evitar así la contaminación.
4. Producción de toxina colérica
En toda cepa aislada de Vibrio cholerae O1 se determina su capacidad para producir toxina
colérica a través de la técnica de ELISA descrita en el Manual de Técnicas de Laboratorio Vol.
I, 1995 del InDRE.
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Se preparan placas sensibilizadas con el receptor GM1 y se agrega el sobrenadante del cultivo
donde podría estar la toxina. La presencia de interacción receptor-toxina se determina
agregando un anticuerpo de conejo antitoxina. La reacción se pone en evidencia al adicionar
anticuerpos contra las inmunoglobulinas de conejo conjugados a una enzima. Al agregar el
sustrato específico el desarrollo de color significa que el cultivo de prueba es productor de
toxina colérica.
5. Diferenciación de Vibrio cholerae O1 en biotipos Clásico o el Tor
Después de identificar el grupo y el serotipo, se procede a la caracterización del biotipo
(Clásico o El Tor). Se siembra la cepa en BAB y se incuba 24 h a 36 + 1° C. Se realizan las
pruebas siguientes que se interpretan de acuerdo con lo que se indica.
Reacción
Biotipo
Vp
(modificado con 1%
NaCl)
Inhibición de
crecimiento
polimixina b (50 u)
Hemólisis
Aglutinación de
eritrocitos de pollo
o carnero
Classical
El tor
N
P
P
N
N
P
N
P
6. Aislamiento, identificación y serotipificación de Salmonella spp y Shigella spp.
6.1.
Principio del método
El método se fundamenta en el uso de técnicas bacteriológicas de aislamiento e identificación
de las propiedades fenotípicas de Salmonella y Shigella, así como en la técnica inmunológica
de aglutinación en placa para ambos géneros y aglutinación en tubo para Salmonella.
6.2. Sistema de muestra primaria
Muestra de materia fecal o cepas de Salmonella spp y Shigella spp.
6.3. Tipo de contenedor y aditivos
La muestra de materia fecal deberá recolectarse con hisopo de algodón (hisopo rectal o hisopo
fecal) e introducirse en un tubo con medio de transporte de Cary Blair. Las cepas de Salmonella
spp y Shigella spp deben sembrarse en un medio de cultivo de soporte.
6.4.




Equipo
Incubadora a 36 + 1° C
Refrigerador a 4 a 8° C
Agitador vortex
Lámpara de luz blanca
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


6.5.
Baño María a 50 + 1° C
Termómetro de -10 a 100° C
Termómetro de -5 a 15° C
Termómetro de 15 a 50° C


Materiales








Mechero Bunsen, cuadro básico número 533.604.0042
Manguera de látex para la conexión del gas al mechero, cuadro básico número
080.909.5383
Asas de nicromel con punta redonda, cuadro básico número 537.085.0018
Asas de nicromel con punta recta, cuadro básico número 537.085.0018
Placa Petri de 100 x 15 mm, cuadro básico número 080.148.0120
Tubo de 16 x150 mm, con tapón de rosca de baquelita
Tubo de 13 x 100 mm, con tapón de rosca de baquelita
Gradillas para 72 tubos cuadro, básico número 533.461.0507
Pipetas graduadas de vidrio de 5.0 mL, cuadro básico número 080.709.2606
Pipetas graduadas desechables de 1.0 o 2.0 mL, cuadro básico número 080.709.0311 o
080.709.0329
Tubo de vidrio de 12x75 mm, cuadro básico número 080.909.0525
Portaobjetos de 25 x75 x0.8 mm, cuadro básico número 080.729.0010
Aplicadores de madera cuadro básico número 060.082.0054
Vaso de precipitados de vidrio de 500 mL, cuadro básico número 080.951.0639
Tubo cónico de polipropileno para centrífuga de 50 mL, cuadro básico número
080.909.1648
Placa Petri de 60x15 mm, cuadro básico número 080.148.0195
Jeringa desechable para tuberculina de 1.0 mL, cuadro básico número 060.550.0636
Unidad de filtración tipo pirinola para jeringa desechable con membrana de acetato de
celulosa de 0.22 micras, cuadro básico número 080.421.0714
Contenedor para RPBI punzocortantes de 3.70 a 4.75 L, cuadro básico número
060.218.0093
Bulbo de seguridad de tres vías
Gasa simple, cuadro básico número 060.436.0669 para limpieza de mesas
Tripie de acero fundido, cuadro básico número 533.898.0021
Pinzas de disección de acero inoxidable de 12.7 cm, cuadro básico número 535.701.0056
Contenedor plástico con solución desinfectante de hipoclorito de sodio dilución 1:10 (10%)
Pizeta con solución desinfectante de hipoclorito de sodio dilución 1:100 (1%)
Frasco con solución salina formalinizada 0.6%




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




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

6.6.
Reactivos y material biológico
Reactivos
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

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









Base de agar sangre (BAB), cuadro básico número 080.610.1200, 4.0 mL de medio
inclinado en tubo de 13 x 100 mm con tapón de hule.
Base de agar sangre (BAB), cuadro básico número 080.610.1200, 30 mL de medio en placa
Petri.
Agar Mac Conkey, cuadro básico número 080.610.1531, 30 mL de medio en placa Petri.
Agar verde brillante, cuadro básico número 080.610.2497, 30 mL de medio en placa Petri.
Agar sulfito de bismuto, cuadro básico número 080.610.0574, 30 mL de medio en placa
Petri.
Medio de movilidad indol ornitina (MIO), cuadro básico número 080.610.1770, 4.0 mL de
medio sin inclinar en tubo de 13 x 100 mm con tapón de rosca.
Agar de hierro y triple azúcar (TSI), cuadro básico número 080.610.2364, 4.0 mL de medio
inclinado en tubo de 13 x 100 mm con tapón de rosca.
Agar de hierro y lisina (LIA), cuadro básico número 080.610.0269, 4.0 mL de medio
inclinado en tubo de 13 x 100 mm con tapón de rosca.
Ácido músico, peptona de caseína cuadro básico número 080.610.1879 y azul de
bromotimol, cuadro básico número 080.830.4893, para preparar caldo mucato 4.0 mL de
medio en tubo de 13 x 100 mm con tapón de rosca.
L-sorbitol, peptona de caseína, cuadro básico número 080.610.1879, 4.0 mL de medio en
tubo de 13 x 100 mm con tapón de rosca.
Rojo de fenol, cuadro básico número 080.830.3408.
Cloruro de sodio, cuadro básico número 080.830.0677, 4.0 mL de medio en tubo de 13 x
100 mm con tapón de rosca.
Caldo malonato, cuadro básico número 080.610.9559, 4.0 mL de medio en tubo de 13 x
100 mm con tapón de rosca.
Base agar urea de Christensen, cuadro básico número 080.610.1432, agar, cuadro básico
número 080.610.8254 para preparar 4.0 mL de medio inclinado en tubo de 13 x 100 mm
con tapón de rosca.
Agar citrato de Simmons, cuadro básico número 080.610.7454, 4.0 mL de medio inclinado
en tubo de 13 x 100 mm con tapón de rosca.
Base caldo tetrationato, cuadro básico número 080.610.2265, 5.0 mL de medio en tubo de
16 x 150 mm con tapón de rosca.
Caldo soya tripticasa (TSB), 10 mL de medio en tubo de 16 x 150 mm con tapón de rosca.
Caldo infusión cerebro corazón, cuadro básico número 080.610.1317, agar, cuadro básico
número 080.610.8254.
Reactivo de Kovac, cuadro básico número 080.783.1557.
Cloruro de sodio, cuadro básico número 080.830.0677.
Formaldehido, cuadro básico número 080.830.1311.
Yodo metálico, cuadro básico número 080.830.5304.
Yoduro de potasio, cuadro básico número 080.830.5312.
Hipoclorito de sodio.
Agua destilada.
Todos los medios de cultivo se deben preparar siguiendo las indicaciones del fabricante.
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Material biológico:
 Antisueros somáticos para Salmonella (B, C1, O:6, O:8, O:20, D1, E polivalente [Epol], E1,
E2, E3, E4, F, G1, G2, H, I, J, K, L, M, N, O, P, Q, R, S, T, U, W, X, Y, Z, 51 al 67).
 Antisueros flagelares para Salmonella (f, g, s, h, r, i, 2, v, m, t, 7, z4, z23, b, 5, d, enx, x, z15,
z10, k, q, z28, 6, w, z6, y, z13, z24, a, c, p, z29, z32, z51, z41).
 Antisuero somático polivalente Shigella dysenteriae (A1-7).
 Antisuero somático polivalente Shigella flexneri (B1-6).
 Antisuero somático polivalente Shigella boydii (A1-7).
 Antisuero somático monovalente Shigella sonnei I.
 Antisuero somático monovalente Shigella sonnei II.
 Antisueros somáticos monovalentes para Shigella A (1-15), B (1-6), C (1-18).
 Todos los antisueros son hidratados y diluidos como se indica en los marbetes de los viales
y se conservan a temperatura de refrigeración de 4 a 8° C.
6.7.
Pasos del método
Aislamiento
La muestra de materia fecal deberá ser procesada lo antes posible una vez recibida en el
laboratorio.
Si la muestra de materia fecal viene en envase estéril, tomar un poco de heces con un hisopo de
algodón estéril y hacer una impronta en un cuadrante de agar Mac Conkey, si la muestra está en
medio de transporte de Cary-Blair, extraer el hisopo y hacer una impronta en un cuadrante de
agar Mac Conkey. Sembrar por estría cruzada, quemar y enfriar el asa entre el segundo y el
tercer cuadrante.
El hisopo con el que se inóculo la placa de Mac Conkey se introduce en un tubo con base caldo
tetrationato adicionado con 0.2 mL de solución de yodo. Incubar la placa y el tubo a 36 + 1° C
de 18 a 24 h.
Las cepas de Salmonella y Shigella para referencia o control de calidad se siembran en agar
Mac Conkey por estría cruzada. Incubar las placas a 36 + 1° C de 18 a 24 h.
Tomar el hisopo del caldo tetrationato y hacer una descarga en un extremo de una placa de agar
verde brillante y en una placa de sulfito de bismuto.
La placa de verde brillante se siembra con asa redonda por estría cruzada, quemar y enfriar el
asa entre el segundo y el tercer cuadrante. La placa de sulfito de bismuto se siembra con una
asa redonda por estría cruzada sin quemar el asa entre cuadrantes. El agar verde brillante se
incuba de 18 a 24 h y el agar sulfito de bismuto se incuba durante 48 h, ambos a 36 + 1° C.
Identificación bioquímica

De la placa de agar Mac Conkey, seleccionar colonias lactosa negativas (colonias incoloras,
probables Salmonella o Shigella), quemar una asa en punta y enfriar en un extremo de la
placa donde no haya crecimiento, tomar una colonia sin extender en el agar y sembrar los
siguientes medios: Caldo sorbitol y caldo mucato, depositar inóculo; medio MIO, introducir
el asa hasta el fondo en posición vertical; TSI y LIA, picadura hasta el fondo y estriar la
superficie; citrato y urea, estriar en la superficie; BAB, picadura hasta el fondo y estriar la
superficie del agar.
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
Incubar los tubos a 36 + 1° C de 18 a 24 h.
Antes de leer las pruebas bioquímicas adicionar al medio MIO 0.5 mL de reactivo de
Ehrlich o Kovac, interpretar los resultados de las pruebas bioquímicas utilizando la Tabla 1
e identificar los patrones bioquímicos de Salmonella y Shigella con las Tablas 3-5, registrar
los resultados.
Del agar verde brillante seleccionar colonias lactosa negativas (colonias rojas). Quemar un
asa en punta y enfriar en un extremo de la placa donde no haya crecimiento, tomar una
colonia sin extender en el agar y sembrar las pruebas bioquímicas como se indicó
previamente.
De la placa de agar de sulfito de bismuto hacer una selección de colonias características a
Salmonella, las cuales se observan negras con halo y brillo metálico, tomar una colonia sin
extender en el agar y sembrar las pruebas bioquímicas como se indicó previamente.
Serotipificación del antígeno somático “O” de Shigella









Si la cepa se identifica bioquímicamente como Shigella, conservar los tubos de TSI y BAB;
a partir del crecimiento bacteriano del tubo de TSI sembrar en condiciones de esterilidad
una placa de BAB por estría cerrada e incubar de 18 a 24 horas a 36 + 1° C.
En un portaobjetos limpio y desengrasado colocar 6 gotas de solución salina formalinizada
(SSF) en el extremo superior separándolas lo suficiente para evitar que las gotas se
mezclen; en el extremo inferior del portaobjetos colocar en forma correspondiente una gota
de SSF y una gota de cada uno de los siguientes antisueros somáticos polivalentes y
monovalentes de Shigella A (1-7), B (1-6), C (1-7), DI y DII.
Con un asa desechable o aplicador de madera tomar crecimiento de la placa de BAB e ir
depositando en cada una de las gotas superiores de SSF para tener una suspensión
bacteriana, mezclar cada gota de suspensión con la gota inferior correspondiente utilizando
asa desechable o aplicador de madera y evitando contaminación cruzada.
Rotar suavemente el portaobjeto y observar a contra luz una reacción de aglutinación
utilizando una lámpara de luz blanca, la observación se hace durante un minuto; después de
ese tiempo la prueba se invalida. Interpretar el resultado usando la Tabla 6.
Si la cepa aglutina con cualquiera de los antisueros polivalentes A, B o C; se realiza la
prueba de aglutinación en portaobjetos con los antisueros monovalentes correspondientes al
grupo somático con el cual se observó la aglutinación.
Si la cepa aglutina con los antisueros monovalentes DI o DII, se reportará como Shigella
sonnei I Shigella sonnei II.
En el caso de que la cepa no aglutine con ninguno de los antisueros polivalentes ni
monovalentes sonnei, será necesario aglutinar con los antisueros monovalentes A (8-15) y
C (8-18).
Si la cepa no aglutina con ninguno de los antisueros polivalentes o monovalentes en
existencia, se reportará como Shigella spp.
Cualquiera que sea el resultado de las pruebas serológicas, éste deberá ser registrado.
Serotipificación del antígeno somático “O” de Salmonella
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Si se identifica bioquímicamente una cepa como Salmonella, separar los tubos de TSI y BAB;
tomar crecimiento del tubo de TSI con un asa de punta estéril y sembrar en placa de BAB por
estría cerrada para obtener un crecimiento masivo, incubar de 18 a 24 horas a 36 + 1° C.
En un portaobjetos limpio y desengrasado colocar 6 gotas de solución salina formalinizada en
el extremo superior separándolas lo suficiente para evitar que se mezclen, en el extremo
inferior colocar en forma correspondiente a las gotas superiores una gota de SSF y una gota de
cada uno de los antisueros somáticos de Salmonella B, C1, O: 8, D y E pol.
Con un asa desechable o aplicador de madera tomar crecimiento de la placa de BAB e ir
depositando en cada una de las gotas superiores de SSF para tener una suspensión bacteriana,
mezclar cada gota de suspensión con la gota inferior correspondiente utilizando un asa
desechable o aplicador de madera evitando contaminación cruzada. Rotar suavemente el
portaobjeto y observar a contra luz una reacción de aglutinación utilizando una lámpara de luz
blanca, la observación se hace durante un minuto. Interpretar el resultado utilizando la Tabla 6
y reportarlo.
Si la cepa aglutina con el antisuero O: 8, aglutinar con los antisueros O: 6 y O: 20; si como
resultado de la aglutinación la cepa aglutina con el antisuero E pol aglutinar con los antisueros
E1, E2, E3 y E4.
Si el resultado de la aglutinación es negativo repetir la prueba utilizando los antisueros
somáticos del grupo F al 67 hasta identificar el grupo somático al que corresponde la cepa y
registrar.
Si después de aglutinar con todos los antisueros somáticos en existencia no se logra identificar
el grupo somático, debe hacerse la búsqueda de la especie arizona. Inocular un tubo de caldo
malonato con la cepa problema e incubar de 18 a 24 horas a 36 + 1° C.
Interpretar el resultado y consultar la Tabla 5. Si la prueba es positiva, reportar como
Salmonella arizona. Si la prueba es negativa reportar como Salmonella spp.
Serotipificación del antígeno flagelar “H” de Salmonella






Inocular la cepa problema identificada bioquímicamente como Salmonella en un tubo con
caldo soya tripticasa (TSB), incubar de 18 a 24 horas a 36 + 1° C.
Adicionar v/v solución salina formalinizada (SSF) al tubo de TSB. Dejar reposar a
temperatura ambiente de 2 a 24 horas.
De acuerdo al grupo somático de la cepa a probar, consultar la Tabla 9 para identificar los
antisueros flagelares de prueba correspondiente a ese grupo. Colocar en una gradilla tubos
de 12x75 mm sin labio, marcarlos y depositar 0.1 mL de cada antisuero flagelar, adicionar
0.9 mL de antígeno formalinizado.
Incubar los tubos en baño María a 50° C por una hora y revisarlos (al sacar las gradillas del
baño es importante no sacudirlas ni agitarlas, de lo contrario se podría perder la
aglutinación). Interpretar los resultados utilizando la Tabla 7.
Considerando el antígeno somático y las fases flagelares identificadas, buscar en el
esquema de Kauffman-White el serotipo correspondiente y registrar.
Si como resultado de la aglutinación flagelar, se detecta solo una fase flagelar, realizar la
técnica de inducción de fase. Si no se detecta ninguna fase flagelar, realizar un pase en
medio GARD para inducir movilidad como se menciona a continuación.
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





Poner en baño María un tubo de medio GARD, cuando el medio se haya licuado y alcance
una temperatura aproximada de 40° C, verterlo en una placa Petri estéril y dejar solidificar
en condiciones de esterilidad. Con un asa en punta, tomar crecimiento de un cultivo fresco
en BAB de la cepa problema e inocular el agar al centro de la placa. Incubar de 18 a 24
horas a 36 + 1° C.
Revisar la placa de GARD. Si la bacteria muestra una zona de crecimiento circundante al
inoculo, tomar con una asa en punta crecimiento del área más lejana al centro de la placa e
inocular un tubo de caldo TSB, incubar de 18 a 24 horas a 36 + 1° C.
Formalinizar el cultivo de TSB, con solución salina formalinizada, y realizar la técnica de
aglutinación flagelar, considerando para ello el grupo somático de la cepa.
Leer aglutinación, si se detectan las dos fases flagelares, reportar como lo indica el punto
9.5.5.
Si solo se detecta una fase flagelar, realizar la técnica de inducción de fase (ver más
adelante).
Si en la placa de GARD no se observa ninguna zona de crecimiento circundante al inóculo,
reportar el género bacteriano y el grupo somático correspondiente.
Inducción de fase para Salmonella









Sembrar la cepa problema por estría cerrada en medio de BAB. Incubar de 18 a 24 horas a
36 + 1° C.
Licuar utilizando baño María, un tubo con medio de GARD y dejar enfriar a 40° C
aproximadamente.
Adicionar en condiciones de esterilidad con jeringa para insulina, 0.1 mL del antisuero
concentrado correspondiente a la fase flagelar identificada, agitar en vortex, verter el medio
en placa Petri estéril y dejar solidificar en condiciones de esterilidad.
Con un asa estéril en punta, tomar crecimiento de la placa de BAB e inocular la placa de
GARD justo al centro. Incubar de 18 a 24 horas a 36 + 1° C.
Revisar la placa al término de este tiempo o en el intervalo de este tiempo. Si la bacteria
muestra una zona de crecimiento circundante al inoculo, tomar con una asa en punta
crecimiento del área más lejana al centro de la placa e inocular un tubo de caldo TSB,
incubar de 18 a 24 horas a 36 + 1° C.
Formalinizar el crecimiento del tubo de TSB, empleando solución salina formalinizada,
dejar reposar de 2 a 24 horas. Revisar el esquema de Kauffman-White (4) para seleccionar
los antisueros correspondientes a las posibles combinaciones flagelares con la fase ya
detectada. Realizar la prueba de aglutinación flagelar como se indicó con anterioridad.
Si el resultado de la aglutinación es la detección de la segunda fase flagelar, registrar. Si
como resultado de la aglutinación no se detecta la segunda fase flagelar, reportar la cepa
como monofásica.
Si se observa nuevamente aglutinación de la fase inicialmente encontrada es necesario
repetir el procedimiento de inducción de fase hasta tres veces, para lo cual se tomará
crecimiento de la placa de GARD anterior para inocular la segunda y de la segunda para
inocular la tercera.
Si como resultado de la última aglutinación, se identifica la segunda fase, registrar; si por el
contrario persiste la aglutinación de la primera fase, reportar la cepa con género y grupo
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somático, otra posibilidad es que se logre inhibir la primera fase pero no se expresa la
segunda, reportar entonces género, grupo somático y la leyenda monofásica.
6.8.
Interpretación por laboratorio
Para emitir un resultado positivo a Salmonella o Shigella de una muestra procesada, se
considera la identificación bioquímica que debe corresponder a los patrones bioquímicos de
dichos géneros, así como a los resultados de serotipificación de los antígenos somáticos para
ambos géneros bacterianos y antígenos flagelares de Salmonella.
Un resultado negativo corresponde a la ausencia de Salmonella spp y Shigella spp en la
muestra fecal o cepa recibida.
6.9.
Medidas de bioseguridad
El nivel de bioseguridad es 2 por lo que se recomienda:
 Usar bata de laboratorio blanca, limpia y abotonada en las áreas de trabajo y nunca fuera de
ellas.
 Dejar fuera del laboratorio artículos personales.
 Mantener cerrada la puerta del laboratorio.
 Limpiar y desinfectar la mesa de trabajo antes y después de procesar muestras.
 Lavarse las manos antes y después de trabajar.
 No hablar, toser o estornudar durante la inoculación y el sembrado de las muestras.
 Evitar pipetear directamente con la boca (usar bulbo de seguridad).
 Mantener las manos lejos de la boca, nariz, ojos y cara.
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ANEXO 2. INTERPRETACIÓN Y RESULTADOS DE PRUEBAS BIOQUÍMICAS
TABLA 1. INTERPRETACIÓN DE PRUEBAS BIOQUÍMICAS
MIO
PRUEBA POSITIVA
Medio turbio,
Movilidad
crecimiento en todo
el medio
El reactivo de Ehrlich
Producción de indol o Kovac toma una
coloración roja
Descarboxilación de Color púrpura en el
ornitina
fondo del medio
TSI
PRUEBA POSITIVA
Fermentación de
Fondo del medio
glucosa
amarillo (A)
Fermentación de
Inclinación del medio
lactosa y sacarosa
amarillo (A)
Burbujas o
Producción de gas
rompimiento del
medio
Precipitado negro en
Producción de H2S
el fondo o en todo el
medio
LIA
PRUEBA POSITIVA
PRUEBA NEGATIVA
INDICADOR DE pH
Crecimiento sólo a lo Púrpura de bromocresol
largo de la picadura
pH neutro = morado
No cambia la
pH alcalino = K = púrpura =
coloración del
descarboxilación positiva
reactivo
pH ácido = amarillo =
Color amarillo en el
descarboxilación negativa
fondo del medio
PRUEBA NEGATIVA
INDICADOR DE pH
Fondo del medio sin Rojo de fenol
cambio
pH neutro = naranja
Inclinación del medio pH alcalino = K = rojo
pH ácido = A = amarillo
roja (K)
Sin formación de
Gas = producto de la
burbujas ni ruptura
fermentación de la glucosa
del medio
H2S = reacción enzimática con el
Sin precipitado negro tiosulfito de sodio y citrato férrico
para formar un precipitado negro
PRUEBA NEGATIVA INDICADOR DE pH
Púrpura de bromocresol
pH neutro = morado
pH alcalino = K = púrpura =
Descarboxilación de Fondo del medio
Fondo del medio
descarboxilación positiva
lisina
color púrpura
color amarillo
pH = ácido = A = amarillo =
descarboxilación negativa
Púrpura de bromocresol
pH neutro = morado
Desaminación de
Inclinación del medio Inclinación del medio pH alcalino= R = rojo =
lisina
color rojo o vino
color morado
desaminación positiva
pH ácido = A = amarillo =
desaminación negativa
Burbujas o
Ausencia de burbujas
Gas = producto de la
Producción de gas
rompimiento del
o rompimiento del
fermentación de la glucosa
medio
medio
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TABLA 1. INTERPRETACIÓN DE PRUEBAS BIOQUÍMICAS (CONTINUACIÓN)
Producción de H2S
Caldo Arginina
Descarboxilación de
la arginina
Caldo peptonado
Producción de indol
Oxidasa
UREA DE
CHRISTENSEN
Hidrólisis de la urea
CITRATO DE
SIMMONS
Ausencia de
Precipitado negro en
precipitado en el
el fondo o en todo el
fondo o en todo el
medio
medio
PRUEBA POSITIVA
PRUEBA NEGATIVA
Color del medio
púrpura
PRUEBA POSITIVA
PRUEBA NEGATIVA
No cambia la
El reactivo toma una
coloración del
coloración roja
reactivo
Color azul en la tira Ausencia de
reactiva
coloración
PRUEBA POSITIVA
Inclinación del
medio
color rosa
PRUEBA POSITIVA
Utilización del citrato Inclinación del
como única fuente de medio
carbono
color azul
CALDO SORBITOL
Fermentación del
sorbitol
Color del medio
amarillo
PRUEBA POSITIVA
Color amarillo
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PRUEBA NEGATIVA
Inclinación del
medio
sin cambio de color
o
amarillo
PRUEBA NEGATIVA
Inclinación del
medio
color verde
PRUEBA NEGATIVA
Color rojo o sin
cambio
INDICADOR DE pH
Púrpura de bromocresol
pH = neutro = ámbar
pH = alcalino = púrpura =
descarboxilación (+)
pH = ácido = amarillo
INDICADOR DE pH
Presencia de la enzima citocromo
oxidasa
INDICADOR DE pH
Rojo de fenol
pH neutro = amarillo o
ligeramente rosa
pH alcalino = rosa = hidrólisis de
la urea positiva
pH ácido = amarillo o sin cambio
= hidrólisis de la urea negativa
INDICADOR DE pH
Azul de bromotimol
pH neutro = verde
pH alcalino = azul = utilización del
citrato como única fuente de
carbono
INDICADOR DE pH
Rojo de fenol
pH neutro = anaranjado
pH ácido = amarillo
pH alcalino = anaranjado
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TABLA 1. INTERPRETACIÓN DE PRUEBAS BIOQUÍMICAS (CONTINUACIÓN)
CALDO MUCATO
Utilización del
mucato
CALDO
MALONATO
Utilización del
malonato
PRUEBA POSITIVA
Color amarillo
PRUEBA POSITIVA
Azul
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PRUEBA NEGATIVA
Sin cambio o verdoso
PRUEBA NEGATIVA
Verde
INDICADOR DE pH
Azul de bromotimol
pH neutro = azul menta
pH ácido = amarillo
pH alcalino = azul menta verdoso
INDICADOR DE pH
Azul de bromocresol
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TABLA 2. IDENTIFICACIÓN DE DIFERENTES ESPECIES DEL GÉNERO VIBRIO
MICROORGANISMO
COLONIA
TSI
Vibrio cholerae
Vibrio alginolyticus
Vibrio charchariae
Vibrio cincinnatiensis
Vibrio damsella **
Vibrio fluvialis
Vibrio furnissi
Amarilla
Amarilla
Vibrio hollisae
Verde
Vibrio metschnikovii
Vibrio mimicus
Vibrio parahaemolyticus *
Vibrio vulnificus
Amarilla
A/A
Verde
A (K)/A
Azul-verde
K/A
Azul-verde A (K)/A
Amarilla
Amarilla
Amarilla
Amarilla
LIA
A (K)/A K/K
A/A
K/K
A (K)/A K/K
A (K)/A K/K (A)
K/A K/K (A)
A/A
K/A
A (K)/A K/A
K/A
K/A
K/A
K/K
K/K
K/K
M
I
O
+
+
+
-/+
+
+
+ (7
días)
+
+
+
+
+
+/+
-/+
-/+
+
V
-
+
+
+
+
+
+
-/+
+
+
+
ROJO
DE
METILO
+/+
V
+
+
-
+
-
+
-
-/+
+
+
+
+
+
V
+
+
+
+
+/-
CALDO
ARGININA
PEPTONADO
CALDO NUTRITIVO CON NaCl (%)
V.P OXIDASA
0
1
3
6
8
10
12
+
+/+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
V
+
+
+
+
+
+
+
+/+/+/-
+/-
-/+
-
+
-
-
+
-
+
+
+
-
-
-
-
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+ +
+ V
+ +
+ +/-
V
+
-
-
-
-
* : Ureasa positivo
- : 0 a 10 % de positividad
-/+ : 11 a 39 % de positividad
V : 40 a 60 % de positividad
+/- : 61 a 90 % de positividad
+ : 91 a 100 % de positividad
Fuente: Giono Cerezo S, Escobar Gutiérrez A, Valdespino Gómez JS, Diagnóstico de Laboratorio de Infecciones
Gastrointestinales, 1994. InDRE, SSA, pp 310-315, Zinsser, Microbiología, 1998, 20ª edición, Edit. Panamericana, pp 771 A
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GAS
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TABLA 3. RESULTADOS DE PRUEBAS BIOQUÍMICAS DE ENTEROBACTERIAS QUE DAN PRUEBA
DE INDOL NEGATIVA
MICROORGANISMO
Salmonella spp
Shigella spp
A,B,C,D
Citrobacter freundii
Proteus mirabilis
Proteus vulgaris
Klebsiella pneumoniae
Klebsiella
rhinoscleromatis
Enterobacter aerogenes
Enterobacter cloacae
Enterobacter sakasakii
Pantoea agglomerans
Serratia marcescens
Providencia heimbachae
CITRATO
+(95)
-(100)
-(100)
+(78)
+(65)
-(85)
+(98)
-(100)
UREA
-(99)
-(100)
-(100)
-(56)
+(98)
+(95)
+(95)
-(100)
LIA
K/K(98)
K/A(100)
K/A(100)
K/A(100)
R/A(100)
R/A(100)
K/K(98)
K/A(100)
H2S
TSI
M
I
O
+(95) K/A(99) +(95) -(99) +(97)
-(100) K/A(100) -(100) -(50) -(99)
-(100) K/A(98) -(100) -(100) +(98)
+(78) K/A(78) +(89) -(77) -(100)
+(98) K/A(98) +(95) -(98) +(99)
+(95) K/A(98) +(95) +(98) -(100)
-(100) A/A(98) -(100) -(100) -(100)
-(100) K/A(100) -(100) -(100) -(100)
+(95)
+(100)
+(99)
+(50)
+(98)
-(100)
-(98)
+(65)
-(99)
-(80)
-(85)
-(100)
K/K(98)
K/A(100)
K/A(100)
K/A(100)
K/K(99)
R/A
-(100) A/A(95)
-(100) A/A(93)
-(100) A/A(99)
-(100) K/A(60)
-(100) K/A(98)
-(100) K/A(100)
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+(97) -(100) +(98)
+(95) -(100) +(96)
+(96) -(88) +(91)
+(85) -(80) -(100)
+(97) -(99) +(99)
-(54) -(100) -(100)
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MUCATO
+(90)
-(100)
-(90)
+(100)
-(100)
-(100)
+(90)
-(100)
SORBITOL
+(95)
-(70)
-(98)
+(100)
-(100)
-(100)
+(99)
+(100)
+(90)
+(75)
-(99)
-(60)
-(100)
-(100)
+(100)
+(95)
-(100)
-(70)
+(99)
-(100)
TABLA 4 RESULTADOS DE PRUEBAS BIOQUÍMICAS DE ENTEROBACTERIAS QUE DAN PRUEBA DE INDOL
POSITIVA
MICROORGANISMO CITRATO UREA
LIA
H2S
TSI
M
I
O
MUCATO
SORBITOL
E. coli
-(99)
-(99)
K/K (90)
-(99)
A/A (95)
+(95) +(98) +(65)
+(95)
+(94)
K/A (60)
E. coli (inactiva)
-(99)
-(99)
-(99)
K/A(75)
-(95)
+(80)
-(80)
-(70)
-(75)
Klebsiella oxytoca
+(95)
+(90)
K/K(99)
-(100) A/A(100) -(100) +(99) -(100)
+(93)
+(99)
Citrobacter diversus
+(99)
+(75) K/A(100) -(100) K/A o A/A +(95) +(99) +(99)
+(95)
+(99)
(50)
Citrobacter
+(95)
+(85) K/A(100)
-(95)
K/A(65)
+(95) +(100) +(95)
+(96)
+(99)
amalonaticus
Morganella
-(100)
+(95)
R/A(99)
-(80)
K/A(99)
+(95) +(95) +(95)
-(100)
-(100)
morganii
Morganella
-(100)
+(100) K/K(100)
-(85)
K/A(100) -(100) +(100) +(80)
-(100)
-(100)
morganii biogrupo 1
Edwarsiella tarda
-(99)
-(100) K/K(100) +(100) K/A(100) +(98) +(99) +(100)
-(100)
-(100)
Edwarsiella tarda
Hafnia alvei
Providencia rettgeri
-(100)
-(100)
+(95)
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-(100)
-(96)
+(98)
K/K(100)
K/K(100)
R/A
-(100)
-(100)
-(100)
K/A(100)
K/A(95)
K/A(95)
+(100)
+(85)
+(94)
+(99)
-(100)
+(99)
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+(100)
+(98)
-(100)
-(100)
-(100)
-(100)
-(100)
-(100)
-(99)
TABLA 5. Diferenciación de Salmonella atípica
CARACTERÍSTICA
Salmonella
Salmonella
Salmonella Salmonella Salmonella
typhi
paratyphi A
sp
arizona
choleraesuis
Movilidad
+
+
+
+
+
Producción de indol
Descarboxilación de la
+
+
+
+
ornitina
Fermentación de la
+
+
+
+
+
glucosa
Fermentación de
sacarosa
Fermentación de
lactosa
Producción de gas
+
+
+(-)
+
Producción de H2S
+*
+
+(-)
+/Descarboxilación de la
+
+
+
+
lisina
Uso del malonato
+
Utilización de citrato
+
+
Hidrólisis de la urea
Caldo mucato
+(-)
+(-)
Caldo sorbitol
+
+
+
+
+
+ :Reacción positiva
- :Reacción negativa
( - ):Reacción ocasionalmente negativa
+/- reacción al 50 %
* se produce en poca cantidad
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ANEXO 3. RESULTADO DE PRUEBAS DE AGLUTINACIÓN
TABLA 6. Prueba de aglutinación en portaobjetos
PRUEBA POSITIVA
PRUEBA NEGATIVA
CONTROL NEGATIVO
Formación de grumos
Suspensión homogénea
Suspensión homogénea
TABLA 7. Lista de antisueros para la prueba de aglutinación flagelar de Salmonella en tubo
O:2
O:4
O:7
O:8
O:9
O:3,10
O:3,19
O:11
O:13,22
O:13,23
O:6,14
O:16
O:17
O:18
O:21
O:28
O:30
O: 35
O:40
O:44
O:47
Grupo somático
(A)
(B)
(C1 )
(C2 )
(D1 )
(E1-E3 )
(E4 )
(F)
(G1 )
(G2 )
(H)
(I)
(J)
(K)
(L)
(M)
(N)
(O)
PRUEBA POSITIVA
Formación de grumos
Antisuero flagelar
a, g, m, p, v, 5
f, g, s, h, r, i, 2, v, m, t, 7, z4, z23, b, 5, d, enx, x, z15
b, g, m, s, t, r, w, 5, z10, d, h, k, z29, enx, x, z15
d, h, r, 2, z4, z24, k, 5, enx, z10, i, z6,
g, d, m, v, q, s, t, 5, 2, p, z28
h, v, 5, 6, 7, w, z10, z6, r, y
g, s, t, i, 2
a, r, 5, enx, z28, z13, x, z15, z29
z, 6
f, g, z, w, b, 5, 6, s
7, d, y
c, 5, y
d, 5
z23, z4
b, enx, y
7, y
b, enx
f, g, z4, z23
b, enx, x, z15
7, c, z10, enx, x, z15
i, enx, x, z15
TABLA 8. Prueba de aglutinación en tubo
PRUEBA NEGATIVA
CONTROL NEGATIVO
Suspensión homogénea
Suspensión homogénea
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TABLA 9. DETERMINACIÓN DE ANTÍGENOS SOMÁTICOS DE VIBRIO CHOLERAE
POR AGLUTINACIÓN EN PORTAOBJETOS
Control
Interpretación del resultado
O1
Poliv O1
O1 Ogawa
O:139
negativo
Inaba
+
+
V. cholerae O1 Inaba
-
+
-
+
-
V. cholerae O1 Ogawa
-
-
-
-
-
V. cholerae No O1 Neg a O:139
-
-
-
-
+
V. cholerae No O1 Pos a O:139
+
+
+
+
+
V. cholerae No O1 Neg a O:139
-
+
-
-
-
V. cholerae No O1 Neg a O:139
-
-
+
-
-
V. cholerae No O1 Neg a O:139
-
+
+
débil
+
-
V. cholerae O1 Ogawa
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