ME-711.04-185 (V4) Determinación de Ocratoxina A HPLC

Emisión:
10.08.2007
DETERMINACIÓN DE OCRATOXINA A
Método HPLC (Columna inmunoafinidad)
Sección Química de
Alimentos
1.
ME-711.04-185
Versión: 4
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OBJETIVO
Detectar y cuantificar la presencia de ocratoxina A en alimentos
2.
CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE
El método es aplicable a cereales y sus derivados, café verde, café tostado, cacao, merquen y
pasas
3.
FUNDAMENTO
Se basa en la extracción de la micotoxina con distintos solventes de acuerdo a la matriz,
purificación en columnas de extracción en fase sólida (inmunoafinidad) y cuantificación por
HPLC usando detector de fluorescencia
4.
DOCUMENTOS DE REFERENCIAS
4.1
The comparison of two clean-up procedures, multifunctional column and inmunoaffinity
column, for HPLC determination of ochratoxin A in cereals, raisins and green coffee
beans. Sugita- Konishi et.al. Talanta 69(2006) 650-655
4.2
Aflatoxin and Ochratoxin A contamination of retail food and intake of these mycotoxins in
Japan. Kumagai et.al. Food Additives and Contaminants Vol 25 nº9 , September 2008,
1101-1106
4.3
Co-occurrence of ochratoxin A and aflatoxins in chocolate marketed in Brazil. Copeti et.al.
Food Control 26 (2012) 36-41
5.
TERMINOLOGÍA
5.1
Ocratoxina A: Micotoxina que se origina principalmente de dos especies fúngicas,
Aspergillus ochraceus y Penicillium verrucosum. Su ingesta crónica puede provocar
cancer hepático y renal.
5.2
LC/MSMS: Cromatografía líquida acoplada a detección por masas-masas.
DUEÑO DE PROCESO:
Encargada de laboratorio
de Toxinas Marinas y
Micotoxinas
APROBADO:
ESTE DOCUMENTO FUERA DE LA INTRANET
O IMPRESO SIN TIMBRE DE “DOCUMENTO
CONTROLADO” SE CONSIDERA COPIA NO
CONTROLADA
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Alimentos y Nutrición
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REACTIVOS, INSUMOS Y EQUIPOS
REACTIVOS
Antes de comenzar a trabajar con las muestras, asegurarse de que todos los reactivos
mencionados a continuación están disponibles, además preparar las soluciones descritas antes
de comenzar y disponerlas en el mesón de trabajo:
6.1.1
Estándar de Ocratoxina A (OTA) (crítico)
6.1.2
Acetonitrilo, grado HPLC (crítico)
6.1.3
Metanol, grado HPLC (crítico)
6.1.4
Ácido acético glacial (crítico)
6.1.5
Bicarbonato de sodio p.a. (crítico)
6.1.6
PBS (Solución de fosfato de buffer salino): Ver preparación en punto 7.2
6.1.7
Cloruro de Sodio p.a.
6.1.8
Acetato de Amonio 10 mM
6.1.9
Polietilenglicol 800 (PGE 800)
6.1.10
Solución Tolueno-Ácido acético 99:1
6.1.11
Agua desionizada (crítico)
6.1.12
Tween 20 (crítico)
6.1.13
Nitrógeno
6.2
INSUMOS
Antes de comenzar a trabajar con las muestras, asegurarse de que todo lo mencionado a
continuación esté disponible e idealmente disponer de los materiales en el mesón de trabajo:
6.2.1
Columnas de inmunoafinidad (OchraTest WB Vicam o similar)
6.2.2
Erlenmeyer ámbar con tapa de 250 mL
6.2.3
Viales ámbar de 2 mL para autosampler.
6.2.4
Papel filtro Whatman Nº 4 o equivalente, y filtro Whatman 934 AH
6.2.5
Micropipetas de 200 y 1000 µL.
6.2.6
Matraces de aforo 10 mL ámbar.
6.2.7
Viales ámbar silanizados de 4 mL
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EQUIPOS
6.3.1
Balanza analítica 0.1 mg
6.3.2
Balanza de precisión 0.01g
6.3.3
Equipo HPLC con detector de fluorescencia.
6.3.4
Equipo LC/MSMS 3200 Q Trap
6.3.5
Blender / shaker / juguera
6.3.6
Sistema Manifold para columnas SPE
6.3.7
Sonicador
6.3.8
Sistema concentrador a base de nitrógeno
6.3.9
Baño termoregulado
6.3.10
Agitador orbital
7.
DESCRIPCIÓN DE ACTIVIDADES
Antes de comenzar a trabajar las muestras, asegurarse de que todo lo mencionado en punto
reactivos e insumos esté disponible.
A continuación se describe el método analítico, es crucial si no dispone de práctica con el
método, leer completo este procedimiento antes de comenzar a trabajar.
Es necesario utilizar guantes para este trabajo como medida de bioseguridad.
7.1
MUESTREO / MUESTRA:
Chequear que antecedentes de la muestra en guía de ingreso coincidan con los
rotulados en la muestra. Registrar la recepción de la muestra en el cuaderno
“Registro de análisis de toxinas marinas y micotoxinas” RG-711.00-080
 Almacenar la muestra a temperatura ambiente, evitando lugares húmedos, para
conservar características originales de la muestra
 Al finalizar el trabajo y una vez informada la muestra, si la cantidad restante lo
permite, almacenar aproximadamente 10g de contramuestra y eliminar lo restante.

7.2
PREPARACIÓN DE REACTIVOS
7.2.1
PBS (Solución de fosfato de buffer salino): Disolver 8 g de NaCl, 1.16g de Na 2HPO4
y 0.2g de KCl en 1 litro de agua. Ajustar pH a 7.4 con NaOH 0.2 M. Este reactivo
también existe en tabletas y se prepara según las instrucciones del fabricante.
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PREPARACIÓN DE CURVA DE CALIBRACIÓN
Preparar soluciones de trabajo a partir de la solución intermedia de 100 ppb. Utilizar
al menos 3 puntos.
 Tomar las alícuotas correspondientes, evaporar con nitrógeno y reconstituir en fase
móvil
 Registrar preparación de estándares en RGG-700.00-034 Registro preparación de
soluciones estándares puras

7.4

PREPARACIÓN DE CONTROLES
Se recomienda preparar un fortificado a partir de una muestra con adición de
estándar a 5 ug/Kg o bien utilizar un material de referencia (Remanente de ensayo
de interlaboratorio por ejemplo)
7.5
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA O ETAPAS PREVIAS A REALIZAR MEDICION
7.5.1
7.5.2
Homogenizar la muestra
Según la tabla N°1, elegir el peso y la solución extractante de acuerdo a la matriz a
analizar. Si la cantidad de muestra no permite pesar lo indicado, pesar mínimo 5g en
un tubo de centrífuga de 50 mL y agregar el proporcional de solución extractante
(Ejemplo: Café tostado 2.5 g, solución extractante 10 mL)
TABLA N°1
Matriz
Café verde
Peso (g) – Volumen (mL)
25 g
Solución extractante
MeOH – 1% NaHCO3 (7:3) 100 mL
Cacao, merquén
25g
MeOH – 1% NaHCO3 (7:3) 200 mL
Café tostado
25 g
1% NaHCO3 (7:3) 200 mL
Avena, Arroz, Maíz y
derivados
Trigo, Harina de
centeno
Pasas
25 g
NaCl 5 g a la muestra – MeOH-H2O (8:2) 100 mL
25 g
CH3CN – H2O (6:4) 100 mL
45 g hidratados (25 g de pasas
molidas con 20 mL de agua)
MeOH – 1% NaHCO3 (7:3) 80 mL
7.5.3
7.5.4
7.5.5
Pesar en matraz ámbar con tapa de 250 mL y agitar por 30 minutos o mezclar a alta
velocidad por 3 minutos en juguera. Para muestras pequeñas (2.5g) agitar 30
minutos en agitador orbital.
Filtrar a través de filtro Whatman N°4 o equivalente. Recolectar el filtrado en matraz
ámbar con tapa. En el caso de pesar 2.5g. centrifugar el extracto a 3000 RPM por 15
minutos.
En el caso de muestras de café verde, pasas y cereales, tomar 10 mL del filtrado y
llevar a 50 mL con la solución de fosfato de buffer salino (PBS). Si no fuese posible
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tomar 10 mL, tomar 5 mL y llevar a 25 mL con PBS. Para muestras de cacao, café
tostado y merquén, tomar 10 mL del filtrado y llevar a 50 mL con solución de fosfato
de buffer salino (PBS) más Tween 20 al 0.01%. Si no fuese posible tomar 10 mL,
tomar 5 mL y llevar a 25 mL con PBS más Tween 20 al 0,01%.
Filtrar por filtro Wathman 934 AH glass filter. Si las soluciones no son transparentes,
volver a filtrar.
Preparar columnas de inmunoafinidad previo a su instalación en el manifold, para
ello, hacer una pequeña perforación con una aguja en la tapa superior de la columna
(para eliminar burbujas), luego retirar las tapas (inferior y superior) de la columna y
conectar en el manifold.
Permitir la salida del líquido que contiene la columna (comenzará a bajar). Detener el
flujo cerrando la llave del manifold cuando el menisco alcance el tope del relleno
(evitar que el relleno de la columna se seque)
Agregar 2 veces el volumen de columna de PBS y dejar pasar todo el volumen para
retirar los conservantes que ésta contiene. Agregar una tercera vez PBS pero cortar
su paso en la mitad de la columna.
Colocar adaptador a entrada de columna y conectar reservorio de muestra
Llenar reservorio con 20 mL de muestra y dejar pasar por la columna a flujo
constante (Por gravedad). Evitar que el relleno de la columna se seque. Si se utilizan
columnas Ochratest 1 mL de volumen, agregar sólo 10 mL de muestra.
Lavar la columna 10 veces con PBS manteniendo el flujo constante. La cantidad de
veces que se lave la columna dependerá de que se logre observar que el color del
relleno disminuya
Lavar con 3 mL de acetato de amonio 10 mM por tres veces, saltar este paso para el
cacao y el merquén.
Con una jeringa, usando adaptador, hacer pasar aire en forma suave para compactar
el relleno de la columna.
Colocar los viales ámbar de 4 mL silanizados bajo cada columna. Eluir la ocratoxina
con 1 mL de MeOH-CH3COOH 98+2, esperar 5 minutos luego de eluida.
Repetir el proceso dos veces más. No es necesario esperar 5 minutos.
Evaporar a sequedad los 3 mL bajo corriente de Nitrógeno en un baño a 45°C.
Reconstituir con 1 mL de fase móvil
Colocar en viales de autosampler para su determinación y cuantificar por HPLC.
7.5.6
7.5.7
7.5.8
7.5.9
7.5.10
7.5.11
7.5.12
7.5.13
7.5.14
7.5.15
7.5.16
7.5.17
7.5.18
7.5.19
7.6
ANALISIS DE LA MUESTRA O REALIZACIÓN DE LA MEDICIÓN. CONDICIONES
INSTRUMENTALES





Condiciones cromatográficas:
Columna Purospher STAR RP-18e (5um), 250 mm, 4,6 mm
Flujo 1 mL/minuto
Excitación : 333 nm
Emisión 460 nm
Temperatura horno de columna: 45°C
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

Volumen inyectado : 100 uL
Fase móvil: CH3CN – H2O – CH3COOH (55:43:2)

CÁLCULO DE RESULTADOS
Para obtener el resultado de Ocratoxina A en la muestra en ng/g (ppb) proceder a
aplicar la siguiente fórmula de cálculo:
7.7
Cmta ng/g = ConcHPLC * (Vsolext/Pmta) * (V final dilución/ V inicial dilución) * (Vfinal reconst/VIAC)
Donde:
Cmta ng/g
= Concentración de Ocratoxina A en la muestra en ppb
ConcHPLC
= Concentración entregada por el HPLC en ng/mL
Vsolext
= Volumen de solución extractante utilizado en mL
Pmta
= Peso de la muestra en gramos
V final dilución = Volumen final de la dilución con PBS (o PBS y tween 20) (50 mL)
V inicial dilución = Alícuota de extracto a diluir (10 mL)
Vfinal reconst = Volumen final de reconstitución (1 mL)
VIAC
= Volumen de extracto en mL pasado por la columna de inmunoafinidad
7.8
ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD DEL ENSAYO
Se efectuarán controles sistemáticos y periódicos para comprobar la validez de los ensayos
realizados con el método de ensayo recogido en este procedimiento. Los controles de calidad
quedan agrupados en tres niveles de control:
a. Nivel I: Ensayos de intercomparación, utilización de materiales de referencia
certificados y patrones de referencia certificados, según disponibilidad.
b. Nivel II: Materiales de referencia sin certificación externa y muestras
fortificadas por el analista.
CONFIRMACIÓN
En el caso de determinar que una muestra contiene una cantidad de ocratoxina superior a la
permitida por el Codex Alimentarius (5 ppb) se deberá confirmar su presencia si es posible por
medio de LC/MSMS. Para ello se deberá reconstituir la muestra luego de evaporada en 250 uL
de la mezcla de la Fase móvil para LC/MSMS 1+1 B+A y filtrar antes de inyectar por filtro 0.22
um
Cromatógrafo Líquido:
- Temperatura del horno de columna: 40ºC
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- Temperatura de la muestra: 10ºC
- Flujo: 0.250 mL/min
- Volumen de inyección: 25 uL
- Tiempo de análisis: 10 min.
- Columna: XDB Agilent 3.5*150*2.1
- Fase móvil:
Acuosa: 0.5% Ácido acético en Agua HPLC
Orgánica: 0.5% Ácido acético en Acetonitrilo HPLC
-Gradiente:
Tiempo (min)
A%
0,0
100
1,0
100
0,1
100
0.4
0
1,5
0
2,0
100
10,0
100
B%
0
0
0
100
100
0
0
Espectrómetro de masas:
El método tiene los siguientes parámetros fuente de iones:
Tipo de scan:
ESI:
CUR:
CAD:
IS (Volt):
GS1:
GS2:
Temp (ºC):
Interface:
MRM
Positivo
20.00
6.00
5000.00
45.00
50.00
650.00
ON
Método de Masas:
Se monitorizan 2 canales o transiciones para cada compuesto. En la siguiente tabla se
incluyen el dwell (dwell time en segundos), DP, EP, CEP, CE y CXP.
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Método de masas
Transición
404/239
404/358
7.9
Dwell
250
250
DP
36
36
EP
5
5
CEP
27
27
CE
33
22
CXP
3
3
Compuesto
Ocratoxina A
Ocratoxina A
EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS
La forma como se expresan los resultados en el informe de ensayo es en ppb de
Ocratoxina A.
8.
CONTROL DE REGISTROS
IDENTIFICACION
RESPONSABLE
TIEMPO
RGG-700.00-034
Registro
preparación de
soluciones
estándares puros
Técnico y
profesional del
laboratorio
5 años
Técnico y
profesional del
laboratorio
5 años
RG-711.00-080
Registro de
análisis de Toxinas
marinas y
micotoxinas
9.
ALMACENAMIENTO
LUGAR
MEDIO
RESPONSABLE/
SOPORTE
RECUPERACION
Papel
Laboratorio de Toxinas
marinas y micotoxinas/
Carpeta de estándares
Papel
Laboratorio de Toxinas
marinas y micotoxinas/
Cuaderno foliado
DISPOSICION
Picado en
trozos, basura
normal
Picado en
trozos, basura
normal
CONTROL DE CAMBIOS
VERSION
FECHA
PRINCIPALES
PUNTOS
MODIFICADOS
RESUMEN DE MODIFICACIONES
3
3
05-05-2014
05-05-2014
--Referencias
Se modifica documento a nuevo formato institucional
Se incluye nueva referencia
3
05-05-2014
Preparación de
la muestra
Se incluye tratamiento para nuevas matrices (Cacao, café
tostado y merquén)
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CUADRO DE RESPONSABILIDADES
Responsabilidades con la ejecución del Método
Ejecuta el método
(Cargo)
Técnico o
Laboratorio
11.
No Aplica
Encargado
ANEXOS
Elabora el informe de
resultados
(Cargo)
de Encargado de Laboratorio
Aprueba el informe de
resultados
(Cargo)
Jefe de Sección