maceración de estrujados de uvas en atmosfera hiperbarica de co2

MACERACIÓN DE ESTRUJADOS DE UVAS EN ATMOSFERA
HIPERBARICA DE CO2: EFECTOS SOBRE BACTERIAS
ACIDO LACTICAS Y LEVADURAS
KATHERIN SOCHA HIGUERA.
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para optar al titulo de Microbiólogo industrial
Microbióloga Industrial
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS
CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
Bogotá, D.C.
17 DE AGOSTO DE 2006
NOTA DE ADVERTENCIA
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus
alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada
contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan
ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo
de buscar la verdad y la justicia”.
Artículo 23 de la Resolución Nº 13 de Julio de 1946
MACERACIÓN DE ESTRUJADOS DE UVAS EN ATMOSFERA
HIPERBARICA DE CO2: EFECTOS SOBRE BACTERIAS
ACIDO LACTICAS Y LEVADURAS
KATHERIN SOCHA HIGUERA
APROBADO
________________________
Marco Quijano Rico
Dipl.Chem.,Ph.D
Director
________________________
Christian Suárez
Microbiólogo Industrial
Codirector
________________________
David Gomez M.Sc.
Jurado 1
________________________
Andrea Aguirre M.Sc.
Jurado 2
MACERACIÓN DE ESTRUJADOS DE UVAS EN ATMOSFERA
HIPERBARICA DE CO2: EFECTOS SOBRE BACTERIAS
ACIDO LACTICAS Y LEVADURAS
KATHERIN SOCHA HIGUERA
APROBADO
________________________
ANGELA UMAÑA M.Phil
Decano académico
________________________
David Gomez M.Sc.
Director de Carrera
Dedico este trabajo a DIOS por su enorme ayuda en todos los momentos de mi
vida, por hacer que de los tiempos difíciles
tomemos las enseñanzas para poder construir tiempos mejores, por poner
siempre en mi camino personas que hacen mejor mi existir,
por darme la oportunidad de aprender de cada segundo que vivo y de darme
las herramientas para poder culminar esta etapa tan importante en mi vida.
A mi mamá: Ana Edilma Higuera, por darme su inmenso amor, que ha sido el
principal instrumento para poder cumplir todas mis metas, por brindarme su
apoyo y seguridad, por enseñarme a ser todo lo que soy y por que siempre ha
estado en todos lo momentos de mi vida dándome lo mejor de ella.
A mi amigo: Ronald Rojas, por su apoyo incondicional y su gran ayuda para
que este sueño se hiciera realidad.
A todos los que han estado a mi lado,
Katherin Socha Higuera
Agradezco especialmente a mi director, Dr. Marco Antonio Quijano Rico,
por darme la oportunidad de aprender de sus grandes conocimientos, por su
hospitalidad y su apoyo incondicional, así como también al equipo de trabajo
del Viñedo & Cava Loma de Puntalarga, por su gran colaboración y acogida.
A mi codirector, Christian Suárez por su cooperación,
y tiempo dedicado a este proyecto.
A la Dr. Adriana Morantes Higuera por su atención, asesoria y contribución.
A el Dr. Rodolfo Gamboa Jefe del laboratorio de biología y Microbiología de la
Universidad de Boyacá, por su colaboración y ayuda desinteresada.
Y a todos los que me colaboraron para poder realizar este proyecto.
vii
ABSTRACT
Aim of this work was the evaluation of carbon dioxyde under hyperbaric
pressure for controlling microbiological off-odor producers: indigenous yeast
and lactic acid bacteria, in crushed local Pinot noir grapes, prior selected yeast
alcoholic fermentation. The procedure is equivalent to a carbonic maceration
under pressure. Crushed grapes were subjected to a CO2 atmosphere at
costant temperature and pressure of 15°C and 35 bar, during 360 minutes.
Population changes were monitored by plate counting. Population reductions
attained 97.8% in yeasts and 95.7% in lactid acid bacteria. Higher inhibition
rates could possibly be expected
in the absence of baroprotective effects,
probably due to the 28°Brix grape juice reducing sugars ( fructose and glucose).
Sensory characteristics of wines were scored by trained people, following OIV
wine tasting protocols. Obtained results show that carbonic maceration under
pressure, could ameliorate microbiological and sensory characteristics of wine.
RESUMEN
En esta investigación, se evaluó el potencial del dióxido de carbono bajo
presión hiperbárica, para el control de poblaciones de microorganismos
generadores de olores desagradables en el vino: levaduras y bacterias ácido
lácticas indígenas, en estrujados de uvas locales de Pinot noir, antes de la
fermentación alcohólica, con levaduras seleccionadas. La operación equivale a
una maceración carbónica bajo presión. Los estrujados de uvas fueron tratados
a presión y temperatura constantes: 35 bar y 15°C durante 360 minutos. Los
cambios en las poblaciones se siguieron por recuento en placa. Se alcanzaron
reducciones del 97.8% en las levaduras y del 95.7% en las bacterias ácido
lácticas. Parece que la inhibición podría ser mayor, si no se presentara un
efecto baroprotector atribuible al contenido relativamente elevado de los
estrujados en ázucares reductores (glucosa y fructosa), 28°Brix. Las
características sensoriales de los vinos obtenidos, se calificaron por personas
previamente entrenadas, siguiendo la metodología de L’Office Internationale de
la Vigne et du Vin (OIV). Los resultados obtenidos indican que el tratamiento
propuesto posiblemente puede contribuir a mejorar las características
microbiológicas y sensoriales del vino.
TABLA DE CONTENIDO
18
1 INTRODUCCIÓN
2 MARCO TEÓRICO Y
REVISION DE LITERATURA
20
2.1 Descripción de la uva
20
2.1.1 El raspón
20
2.1.2 Los hollejos
20
2.1.3 Las semillas
21
2.2 Maduración de la uva
21
2.2.1 Periodo herbáceo
21
2.2.2 Envero
21
2.2.3 Periodo de maduración
22
2.2.4 Sobremaduración
22
2.3 Composición de las uvas
22
2.3.1 Agua y sales minerales
22
2.3.2 Hidratos de carbono
22
2.3.3 Ácidos
23
2.3.4 Fenoles
23
2.3.4.1 Ácidos fenólicos
23
2.3.4.2 Flavonoides
24
2.3.5 Compuestos nitrogenados
24
2.3.6 Lípidos y compuestos relacionados
24
2.3.7 Terpenoides
25
2.3.8 Compuestos volátiles de aroma
25
2.3.9 Vitaminas
25
2.4 Estrujado
26
2.5 El mosto
26
2.5.1 Obtención y tratamiento del mosto de uva
26
2.5.2 Componentes de uvas y mosto
27
viii
2.6 Bacterias ácido lácticas
27
2.7 Levaduras
29
2.7.1 Brettanomyces sp
30
2.8 Defectos del vino
31
2.8.1 Bacterias ácido lácticas
32
2.8.2 Levaduras
34
2.8.2.1 Brettanomyces sp.
36
2.9 Etapas de contaminación durante la elaboración de
vino tinto
38
2.9.1 Contaminación en el vino por Brettanomyces
38
2.10 Métodos empleados para el control de Bacterias
ácido lácticas y Brettanomyces sp
41
2.11 Potencial de CO2 bajo presiones hiperbaricas para
el control de bacterias ácido lácticas y levaduras
( Brettanomyces sp )
42
2.12 Cinética de muerte microbiana
44
2.12.1 Cinética de desactivación microbiana por altas
presiones
45
3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y
JUSTIFICACIÓN
46
3.1. Formulación del problema
46
3.2. Justificación
46
4. OBJETIVOS
48
4.1. General
48
4.2. Específicos
48
5. MATERIALES Y MÉTODOS
49
5.1 Sitio de estudio
49
5.2 Muestreo
50
5.2.1 Preparación de muestras
50
5.3 Parámetros de operación del tratamiento
hiperbárico de CO2
50
5.4 Tratamiento de estrujados bajo presión
51
5.4.1 Biorreactor, partes y sus funciones
51
ix
5.4.2 Procedimiento
53
5.5 Recuento de bacterias acido lácticas
54
5.6. Recuento de levaduras
55
5.7 Fermentación alcohólica
55
5.8 Análisis microbiológico de los vinos
56
5.8.1 Aislamiento de bacterias ácido lácticas
56
5.8.2 Aislamiento de levaduras salvajes
56
5.8.3 Aislamiento de Brettanomyces sp
56
5.9 Parámetros físico-químicos
57
5.9.1
Determinación
del
contenido
alcohólico por el método de Roessner
58
5.9.2 Determinación refractométrica del extracto
del vino
58
5.9.3 Determinación potenciométrica del pH
58
5.9.4 Color comparativo
58
5.10 Evaluación sensorial
59
5.11 Análisis estadístico
59
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
60
6.1 Efectos del tratamiento hiperbárico de CO2
sobre células de levaduras y bacterias ácido
lácticas.
60
6.2 Parámetros Físico-Químicos de los vinos
69
6.3 Análisis microbiológico de los vinos
70
6.4 Análisis sensorial
71
7 CONCLUSIONES
77
8 RECOMENDACIONES
79
9 BIBLIOGRAFIA
10 ANEXOS
x
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1 Fermentaciones heterolácticas y homolácticas.
29
Figura 2 Formación de 4 etil fenol y 4 etil guaiacol en el vino.
38
Figura 3 Riesgo de contaminación por bacterias ácido lácticas y
levaduras (Brettanomyces) durante las etapas de la elaboración
de vino tinto, 2 y 3 riego extremo, 4 riesgo interno.
40
Figura 4 Vista aérea del Viñedo Loma de Puntalarga, Nobsa, Boyacá.
49
Figura 5 Esquema del biorreactor para presiones hiperbáricas de CO2
51
Figura 6 Procedimiento a seguir para el tratamiento en atmósfera
hiperbárica de CO2 de muestras de estrujados de uvas
53
Figura 7 Salida de muestra al ciclón de muestreo
54
Figura 8 Toma de muestra en el ciclón de muestreo
54
Figura 9 Equipo de filtración
57
Figura 10 Medio DBDM
57
Figura 11 Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en levaduras,
promedio de los tres montajes
61
Figura 12 Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en bacterias
ácido lácticas, promedio de los tres montajes
62
Figura 13 Efectos del tiempo de proceso (a 400Mpa y 25°C) en la
sobrevivencia de suspensión celular de R. rubra en medio de
Aw=0.94
67
Figura 14 Comparación del efecto del CO2 bajo presión.
Bacterias acido lácticas y levaduras.
68
Figura 15: Panel de catadores
72
Figura 16 Claridez de los vinos Pinot noir evaluados
73
Figura 17 Color de los vinos Pinot noir evaluados
73
Figura 18 Olor de los vinos Pinot noir evaluados
74
Figura 19 Sabor de los vinos Pinot noir evaluados
75
Figura 20: Impresión global de los vinos Pinot noir evaluados
76
xi
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1 Estimación aproximada de los porcentajes normales, en
peso, de los componentes de las uvas y del mosto, en el momento
de la vendimia.
27
Tabla 2 Defectos producidos en el vino por parte de las bacterias
ácido lácticas
32
Tabla 3 Características de las levaduras causantes de la flor del
vino.
35
Tabla 4 Defectos en el vino causados por Brettanomyces sp
36
Tabla 5 Métodos para el control de bacterias ácido lácticas y
Brettanomyces sp.
41
Tabla 6 Partes del biorreactor y su función.
52
Tabla 7 Promedio de los resultados del recuento de levaduras en
los tres montajes
60
Tabla 8 Promedio de los resultados del recuento de bacterias ácido
lácticas en los tres montajes
60
Tabla 9 Comparación del efecto del CO2 bajo presión. Bacterias
acido lácticas y levaduras.
67
Tabla 10 Resultado del análisis físico Químico de los vinos
69
xii
ÍNDICE DE ANEXOS
ANEXO 1 Equipos
ANEXO 2 Reactivos
ANEXO 3 Composición de medios de cultivo
3.1 Agar MRS
3.2 Agar YGC
3.3 Agar WL
3.4 Medio DBDM
3.5 Medio YNB
ANEXO 4 protocolo de procedimiento para tratamiento de
estrujados de uvas en atmósfera hiperbárica de CO2
ANEXO 5 Tablas de resultados
5.1 Resultados del recuento de levaduras en el Primer Montaje
5.2 Resultados del recuento de levaduras en el Segundo Montaje
5.3 Resultados del recuento de levaduras en el tercer montaje
5.4 Resultados del recuento de bacterias ácido lácticas en el Primer
Montaje
5.5 Resultados del recuento de bacterias ácido lácticas en el
Segundo Montaje
5.6 Resultados del recuento de bacterias ácido lácticas en el Tercer
Montaje
5.7 Efecto de las presiones hiperbáricas de CO2 en el tiempo de
reducción decimal (D) y la tasa de inactivación de levaduras
5.8 Efecto de las presiones hiperbáricas de CO2 en el tiempo de
reducción decimal (D) y la tasa de inactivación de bacterias ácido
lácticas
ANEXO 6 Graficas
6.1 Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en levaduras, Montaje 1
6.2 Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en levaduras, Montaje 2
xiii
6.3 Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en levaduras, Montaje 3
6.4 Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en bacterias acido
lácticas, Montaje 1
6.5 Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en bacterias acido
lácticas, Montaje 2
6.6 Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en bacterias ácido
lácticas, Montaje 3
6.7 Grafica comparativa del recuento de levaduras de los tres
montajes
6.8 Grafica comparativa del recuento de bacterias acido lácticas de
los tres montajes
ANEXO 7 Evaluación de características sensoriales
ANEXO 8
Tabla normalizada de la OIV para la evaluación de
características sensoriales
ANEXO 9 Guía de catación
ANEXO 10 Análisis Estadístico
10.1 Análisis estadístico de los resultados obtenidos de los
recuentos de levaduras en el Montaje Numero 1
10.2 Análisis estadístico de los resultados obtenidos de los
recuentos de levaduras en el Montaje Numero 2
10.3 Análisis estadístico de los resultados obtenidos de los
recuentos de levaduras en el Montaje Numero 3
10.4
Análisis estadístico de los resultados obtenidos de los
promedios de los recuentos de levaduras
10.5 Análisis estadístico de los resultados obtenidos de los
recuentos de bacterias ácido lácticas en el Montaje Numero 1
10.6 Análisis estadístico de los resultados obtenidos de los
recuentos de bacterias ácido lácticas en el Montaje Numero 2
10.7 Análisis estadístico de los resultados obtenidos de los
recuentos de bacterias ácido lácticas en el Montaje Numero 3
10.8 Análisis estadístico de los resultados obtenidos del promedio
de los recuentos de bacterias ácido lácticas
xiv
ANEXO 11 Interpretación del análisis estadístico
xv
INTRODUCCIÓN
En la elaboración de vinos tintos de la variedad Pinot noir en la Loma de
Puntalarga, ha sido cada vez más frecuente la aparición de defectos del
perfil sensorial como: arratonado, sudor de caballo, pesebrera, tono de
alquitrán,
medicina, cuero, los cuales se atribuyen generalmente a la
acción de levaduras del género Brettanomyces sp y/o a bacterias ácido
lácticas del género Lactobacillus. Este problema parece estar asociado a
los cambios en el proceso de vinificación que se han hecho para poder
desarrollar una fermentación maloláctica con cepas seleccionadas de
Oenococcus oeni, después de la fermentación alcohólica. Debido a la
gran sensibilidad de Oenococcus oeni al dióxido de azufre, SO2, es
necesario limitar la concentración de este en la masa estrujada alrededor
de 20ppm. Bajo estas condiciones el riesgo de desarrollo de
Brettanomyces sp y bacterias ácido lácticas indeseables es muy alto. En
efecto, para el control de Brettanomyces sp y bacterias ácido lácticas, en
general, se necesitan concentraciones de dióxido de azufre al menos de
40ppm.
Como la fermentación maloláctica con Oenococcus oeni le da a los vinos
de Pinot noir características sensoriales muy apreciadas, se requiere
evitar el daño causado por levaduras y bacterias lácticas indeseables. Es
decir, es necesario reducir considerablemente las poblaciones de esos
microorganismos y con ello los daños que pueden introducir en el perfil
sensorial.
Investigaciones precedentes realizadas en el Viñedo de Puntalarga
llevadas a cabo por Montaña, Ortegón (1997) y Álvarez, García (1998)
muestran que en las condiciones usuales de vinificación, el gas carbónico
a temperatura ambiente y bajo presiones hiperbáricas
(10 a 50 bar)
puede ser empleado con el fin mencionado. La utilización de gas
carbónico es particularmente atractiva debido a que no es tóxico,
abandona fácilmente el producto, no es demasiado costoso, hace parte
18
de la ecología de la vinificación y las presiones a las cuales se ha utilizado
en Puntalarga son tecnológicamente accesibles con facilidad.
La
presente investigación busca establecer el tiempo de residencia
necesario para controlar bacterias lácticas y levaduras contaminantes en
estrujados de uvas operando a una temperatura de 15°C bajo una presión
de 35 bar (25 Kg/cm2) y una concentración en SO2 de 20mg/l.
19
2. MARCO TEORICO Y REVISION DE LITERATURA
2.1 Descripción de la uva.
Es un fruto procedente de una planta fanerógama sarmentosa y
caducifoliar de ciclo anual en climas templados (Matiz y Prieto 1993).
El racimo de la uva comprende una parte leñosa o raspón y los granos
también llamados bayas que están constituidos por la piel, las semillas, y
la pulpa que proporciona el zumo o mosto. El grano de uva esta
compuesto por un epicarpio, la piel, película o pellejo, un mesocarpio
carnoso, la pulpa y un endocarpio, el cual tapiza los lóculos que contienen
las semillas (Galet 2000).
2.1.1. El raspón.
Los tallos, también llamados raspón o escobajo, constan del vástago
principal, que por lo común sale de la axila de una hoja, y de los tallitos
ramificados, en los que se asientan los granos. Constituyen a la vez las
vías de conducción de las sustancias nutricias, que se forman
preferentemente en las hojas y durante la etapa de crecimiento y
maduración se acumulan en la carne de las uvas como ácidos, azúcar,
etc. (Galet 2000).
Las uvas que se consideran bien maduras exhiben por lo general los
tallos de color castaño y completamente lignificados (Riberéau et al.
1989).
2.1.2. Los hollejos.
Las pieles u hollejos de las uvas están cubiertos por lo regular por una
fina capa cérea llamada pruina que protege las células de la piel de la
acción de la humedad atmosférica e impide la penetración de gérmenes
patógenos en el interior de los granos. El componente más importante del
20
hollejo es el pigmento contenido en las capas de células y cuya cantidad e
intensidad cromática desempeñan un papel relevante en la elaboración
del vino tinto (Vogt et al.1986, Reynier 1991).
2.1.3. Las semillas.
En todos los granos de la uva normalmente desarrollados existen semillas
cuyo número oscila entre 2 y 4, cuyo peso constituye el 3 o 4% del de los
granos, contienen 10-20% de aceite y
5-9% de taninos, pequeñas
cuantías de ácidos volátiles y una sustancia resinosa muy amarga que
presta al vino un desagradable sabor astringente cuando se disuelve a
partir de las semillas (Riberéau et al. 1989, Navarre 1991).
2.2 Maduración de la uva.
El estado de maduración de la uva condiciona la calidad e incluso el tipo
de vino, es por tanto, uno de los principales factores de la vinificación. En
la mayoría de las regiones vinícolas no se puede obtener vino de
excelente calidad, si la uva no esta bien madura. La evolución de la uva
se divide en cuatro periodos (Reyner 1991):
2.2.1. Periodo herbáceo. Durante este periodo se forma el grano, la uva
es verde, coloreada por la clorofila, y presenta una consistencia dura
(Riberéau et al. 1989, Galet 2000).
2.2.2. Envero. Corresponde a la época fisiológica de la coloración de la
uva, al mismo tiempo engorda y adquiere elasticidad. La uva blanca pasa
del verde al amarillo, la uva tinta pasa del verde al rojo claro y después al
rojo oscuro. Este fenómeno es muy brusco, durante este periodo el
azúcar de las uvas aumenta de modo repentino (Galet 2000).
21
2.2.3. Periodo de maduración. Es el periodo comprendido entre el
envero y la madurez de la uva en donde, la pulpa acumula rápidamente
azúcar y al mismo tiempo disminuye la acidez, se presenta engrosamiento
del grano de uva, formación de taninos, coloración del fruto y formación
de aromas. Este periodo es irregular y depende de las condiciones
meteorológicas (Ribéreau et al. 1989, Galet 2000).
2.2.4. Sobremaduración. Se presenta cuando la uva se deja en la vid
después de la madurez normal. Durante este periodo el fruto no recibe
nada más de la planta, vive de sus reservas y pierde agua (Vogt et al.
1986 y Galet 2000).
2.3 Composición de las uvas.
2.3.1. Agua y sales minerales.
Por medio del agua las raíces de la vid toman también sales minerales del
suelo necesarias para la constitución de la cepa, principalmente se trata
de fosfatos de potasio, calcio y magnesio, pero también de pequeñas
cuantías de sulfatos, cloruros y silicatos. De acuerdo con la variedad de
la uva y el grado de maduración de esta, el contenido de agua oscila entre
780 y 850 g/l (Vogt et al. 1986, Boulton et al. 2002).
2.3.2. Hidratos de carbono.
El azúcar se forma como resultado de la fotosíntesis en la que hay
asimilación del anhídrido carbónico (CO2) del aire por las hojas verdes de
la cepa bajo la acción de la luz, desde allí se transporta el azúcar hasta
los granos de uvas, donde se acumula en grandes cantidades en el curso
de la maduración. El azúcar presente en los racimos maduros se
compone, aproximadamente en partes iguales de
glucosa (azúcar de
uva) y fructosa. También se encuentra sacarosa pero en escasa
22
concentración, y otros azúcares, que se sabe están presentes debido a la
biosíntesis, entre ellos están: arabinosa, ribosa, xilosa, mucosa, maltosa,
manosa, melobiosa, rafinosa y estaquiosa (Blouin et al. 2000, Boulton et
al. 2002).
2.3.3. Ácidos
La cantidad de ácidos en las uvas o en los productos derivados de ellas
es pequeña. La acidez de las uvas sanas esta constituida, por 95%, de
los ácidos tartárico y málico, se encuentran igualmente pequeñas
cantidades de cítrico, isocítrico, aconitico, glutárico, fumárico, pirrolidincarboxilico, 2-cetoglutárico y sikímico, que también se encuentran en
mostos. En uvas y vinos dañados aparecen los ácidos propionico y
butírico (Blouin et al. 2000, Boulton et al. 2002).
2.3.4. Fenoles
Las sustancias fenólicas son muy importantes para las características de
la uva y del vino, así como para su calidad. En ellas se incluyen los
pigmentos colorantes, los compuestos que forman compuestos de color
marrón, los aromas, los gustos astringentes y las conocidas sustancias
amargas de las uvas y del vino (Boulton et al. 2002).
2.3.4.1. Ácidos fenólicos
Los ácidos fenólicos encontrados se incluyen en dos grupos. El primer
grupo son los hidroxibenzoatos considerados derivados del ácido phidroxibenzóico,
como
lo
son
el
ácido
p-hidroxibenzoico,
ácido
protocatetico, ácido gálico, ácido vainillínico, ácido siríngico, ácido
salicílico y el ácido gentísico. El segundo grupo los hidroxicinamatos se
consideran derivados del ácido p- cumárico, ácido cafeico y ácido ferúlico.
Entre los contenidos más elevados se encuentran al ácido siríngico y al
23
ácido P-cumárico (30mg/l), después el ácido vainillínico y el cafeico
(15mg/l) (Blouin et al. 2000, Boulton et al. 2002).
2.3.4.2. Flavonoides
Los antocianinos, son las sustancias que esencialmente caracterizan las
uvas. En la piel de las uvas, incluso de las blancas, hay una mezcla de
pigmentos verdes y amarillos. En las uvas rojas y azules se encuentra al
iniciarse la maduración un pigmento rojo azulado (enina, enocianina), este
corresponde a las sustancias colorantes vegetales rojas y azules
comprendidas bajo la denominación común de “antocianina“(Blouin et al.
2000).
La sustancia tánica (enotanino) esta contenida en el escobajo, pieles y
semillas y tiene un marcado sabor astringente (Ribéreau et al. 1989).
2.3.5. Compuestos nitrogenados
Los compuestos nitrogenados contenidos en la uva son principalmente las
sales amonicas, aminoácidos , péptidos, proteínas y derivados de ácidos
nucleicos, resultan de gran interés para la elaboración del vino por ser
sustancias nutricias imprescindibles para las levaduras (Blouin et al.
2000).
2.3.6. Lípidos y compuestos relacionados
El contenido de extracto graso en las semillas de la baya esta constituido
en un 90% por triglicéridos con alrededor del 75% de ácido linoleico y
10% de ácido oleico; en otras partes de la baya, como en la pruina del
hollejo,
también
hay
materiales
lipoides
extraíbles,
incluyendo
glucolipidos, fosfolipidos y ácidos grasos (Vogt et al. 1986, Boulton et al.
2002).
24
2.3.7. Terpenoides
Los grupos de mayor interés en la elaboración del vino, son los
monoterpenos y sus derivados. Los monoterpenos son compuestos de 10
átomos de carbono, mucho de los cuales son volátiles y poseedores de
aroma (Boulton et al. 2002).
2.3.8. Compuestos volátiles del aroma
En las uvas están presentes muchos compuestos volátiles de aroma y sus
precursores, cantidades importantes de estos compuestos, especialmente
etanol, alcoholes amílicos, acetato de etilo y derivados del acetaldehído,
se producen en todas las fermentaciones por levaduras (Boulton et al.
2002).
Las diversas clases de uvas se diferencian, únicamente en los valores
cuantitativos de las sustancias que la componen, así, las variedades de
“bouquet “se caracterizan por un elevado contenido en alcoholes y óxidos
terpénicos (Ribéreau et al. 1989).
2.3.9. Vitaminas
Las vitaminas solubles en grasas y sus precursores, con la excepción de
la vitamina E en el aceite de semilla de uva, son muy escasas o están
ausentes en las uvas y en el vino. Las vitaminas B, solubles en agua,
aparecen normalmente, pero no en niveles suficientes para hacer de ellas
una fuente especialmente atractiva para la nutrición de los seres
humanos. La vitamina C, ácido ascórbico, esta normalmente presente en
cifras de alrededor de 100 mg/kg de uvas frescas. Esta cantidad es mas o
menos la décima parte de la que hay en frutos cítricos, pero puede ser
importante (Boulton et al. 2002).
25
2.4 Estrujado
Consiste en romper el hollejo de la uva de modo que libere la pulpa y el
zumo, el estrujado puede ser más o menos intenso según el hollejo sea
simplemente aplastado o triturado. La estructura de la pulpa puede
permanecer casi intacta o por el contrario las gruesas vacuolas de las
células ceden todo su zumo (Ochoa et al. 1991, Bryce 2000).
2.5 El mosto
El zumo de uva que fluye al prensar los granos “machacados “es un
líquido turbio y dulce que exhibe color entre amarillento claro y rojizo, si se
deja en reposo, se clarifica dejando un pozo compuesto principalmente
por restos celulares de las uvas. El mosto de uva contiene numerosas
sustancias disueltas, entre las que prevalecen por su cantidad e
importancia, azúcares como glucosa y fructosa y ácidos como tartárico,
málico y cítrico. El “peso” del mosto, su contenido en azúcar, ácidos y
otros componentes, dependen de la clase de uva, del tipo de suelo del
que procede, de las condiciones atmosféricas que imperaron durante el
desarrollo y maduración de los racimos (Matiz et al. 1993, Ribéreau et al.
1989).
2.5.1. Obtención y tratamiento del mosto de uva
Los racimos cortados cuidadosamente de la cepa, con tijeras especiales
para vendimiar, se limpian de uvas resecas y podridas, se eliminan con la
mayor rapidez posible de los escobajos, luego se estrujan en molinos de
uva sin romper los granos (semillas), y a continuación se prensan en
prensas mecánicas, hidráulicas o neumáticas, en cuya operación se
separa el jugo (mosto) de la masa de uvas (bagazo). Una parte del mosto
fluye sin ejercer presión (mosto, flor) pero la mayor parte del mismo se
obtiene prensando (mosto de prensado) y todavía se obtiene una fracción
26
residual esponjando el bagazo y volviendo a prensar (mosto de
extracción, post extracto). En los vinos tintos la uva se fermenta sin
eliminar el hollejo y el color es extraído durante la fermentación (Lizarazo
y Martínez 1996).
2.5.2. Componentes de uvas y mosto
Tabla 1: Estimación aproximada de los porcentajes normales, en peso, de los
componentes de las uvas y del mosto, en el momento de la vendimia.
COMPUESTOS
BAYAS
MOSTO
Agua
74
76
Sales inorgánicas
0.5
0.4
Hidratos de carbono
24
23
Alcoholes
0
0
Ácidos
0.6
0.7
Fenoles
0.2
0.01
Compuestos nitrogenados
0.2
0.1
Lípidos
0.2
0.01
Terpenoides
0.02
0.01
Otros compuestos volátiles
0.01
0.01
Varios
0.1
0.01
Fuente: Boulton et al. 2002. Teoría y práctica de la elaboración del vino
2.6 Bacterias ácido lácticas
Las bacterias ácido lácticas forman un grupo heterogéneo, que presenta
características generales como ser, Gram positivas, catalasa negativas,
no esporuladas, microaerofilas, no presentan motilidad, no tienen
actividad citocromo oxidasa, ni reducen los nitratos, no producen
pigmentos y algunas presentan gránulos metacromáticos. Anaerobias
facultativas y fermentadoras de azúcares en condiciones diversas,
respondiendo a diversos tipos morfológicos, se distinguen los cocos de
forma redondeada u oval y los bacilos o bastones en forma de trazos mas
o menos largos. Los cocos tienen de 0.4 a 1.0ų de diámetro, los bacilos
27
pueden tener 0.5ų de espesor y de 2 a 5ų de longitud (Zambonelli 1988,
Álvarez et al. 1998).
Según el catabolismo de los azúcares, las bacterias ácido lácticas tienen
carácter homo y heterofermentativo. Las homofermentativas originan
ácido láctico (80-90%) utilizando la vía glicolitica de Embden-Meyerhof; y
las heterofermentativas metabolizan la glucosa siguiendo la ruta de
Warburg-Dickens ( figura 1 ), originando además de ácido láctico,
importantes
cantidades
de
anhídrido
carbónico,
ácido
acético,
acetaldehído, etanol, acetoina, diacetilo, etc. ( Hernández 1995 )
El manual de Bergeys las ha dividido en cuatro grupos considerando un
amplio número de elementos como son: la taxonomía molecular, la
determinación de peptidoglicano de la pared celular, la definición de los
grupos antigénicos y el isómero de ácido láctico obtenido. Se dividen en
los Géneros Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus y Pediococcus
(Krieg 1994, Zambonelli 1988).
28
Figura 1: Fermentaciones heterolacticas y homolacticas
Fuente: Boulton et al. 2002. Teoría y práctica de la elaboración del vino
2.7 Levaduras
Las levaduras se definen como hongos unicelulares, que se diferencian
de otros eucariotas, protozoos y algas, porque tienen paredes celulares
rígidas y no tienen pigmentos fotosintéticos y de las bacterias, porque
tienen núcleos con membrana. Las levaduras por su interés enológico se
clasifican en tres grupos : los agentes de fermentación alcohólica , los de
refermentación, las cuales causan la fermentación de los restos de azúcar
29
de los vinos dulces y pueden enturbiar o dar sedimentos en los vinos
secos; y las de contaminación, que se encuentran en gran cantidad en
bodegas de conservación destacándose los géneros Pichia, Hansenulla y
Candida , causantes de velos que se forman en la superficie de los vinos
o en paredes empapadas de vino y en contacto con el aire ( Dittrich 1987,
Loureiro et al. 2003).
2.7.1. Brettanomyces sp.
Brettanomyces es una levadura que pertenece a los ascomycetos y es la
responsable de olores y sabores desagradables principalmente en vinos
tintos de la variedad Pinot noir (Gerbaux et al. 2000).
Dekkera es la forma esporulada de la levadura Brettanomyces. El género
Brettanomyces, presenta 5 especies: B. nanus, B.
anomalus, B.
custersianus y B. naardenensis y B. bruxellensis, siendo ésta última la
que interesa desde el punto de vista enológico (Egli and Kling 2001).
Brettanomyces es un microorganismo fermentador relativamente lento,
por esta razón es raramente el organismo dominante durante la
fermentación primaria y puede encontrarse al final de la fermentación
alcohólica y maloláctica (FML), puede fermentar cantidades pequeñas de
azúcares residuales, es frecuentemente encontrada en vinos y puede
fermentar bajo condiciones aerobias y anaeróbicas. Es una levadura
fuertemente acidogénica, que produce grandes cantidades de ácido
acético de la oxidación del etanol (Parish et al. 2003, Chatonnet, 2002).
Brettanomyces puede usar varios sustratos y crecer rápidamente sobre
cualquier residuo de azúcar, como glucosa, fructosa, arabinosa y
trehalosa encontrada en el vino.
La celobiosa, un componente de la
celulosa es otro sustrato que puede ser utilizado por Brettanomyces
(Licker et al. 1998).
Un amplio espectro de sabores y aromas han sido asociados con el
carácter de Brettanomyces incluyendo los clavos de olor, corral, cuero,
30
medicinal, pelo del caballo, sudor del caballo, antiséptico, plástico, ratón, y
metálico (Chassagne 2005, Ibeas et al. 1996).
2.8 Defectos del vino
No siempre se consigue que un vino fermente y madure de manera que
satisfaga las expectativas de los conocedores. Desde el prensado hasta
el embotellado el vino esta expuesto al peligro de sufrir daños que pueden
llegar a motivar su completo deterioro, los microorganismos responsables
de esto son todos aquellos indeseables en un lugar y tiempo particular.
Obviamente, incluyen los microorganismos que producen aromas y
gustos extraños, olores, colores o precipitados, además de sustancias
indeseables que pueden incluso afectar a la aptitud del vino para el
consumo, es decir, que no solo afectan a los caracteres sensoriales
(ejemplo: producción de aminas biogenas), estos compuestos pueden
progresar- lo que resulta especialmente característico- y hacer al vino
incomestible (Suárez et al. 1990, Boulton et al. 2002).
La reproducción de los microorganismos se ve influenciada de manera
determinante por la composición del vino, pero, el crecimiento de estos
se puede frenar mediante la utilización de temperaturas suficientemente
bajas, altos contenidos en dióxido de azufre (H2SO3) libre sobre todo
eficaz frente a bacterias y levaduras, cuando se cuenta con elevados
grados de acidez. Sin embargo, grandes poblaciones de microorganismos
hacen que incluso cuando se utilizan las dosis mas altas de sustancias
antimicrobianas, la estabilidad no sea garantizable. El llenado de botellas
con las dosis mas altas de dióxido de azufre libre (50mg/l) tampoco
garantiza la estabilidad microbiológica del vino. La aparición de
enfermedades en el vino pueden prevenirse solo creando condiciones que
inhiban el crecimiento de microorganismos indeseables,
partiendo del
principio que es más fácil prevenir los defectos y enfermedades que
corregirlos o curarlos (Vogt et al. 1984, Ditrrich 1987).
31
2.8.1. Bacterias ácido lácticas
Tabla 2: Defectos producidos en el vino por parte de las bacterias ácido lácticas
DEFECTO
AGENTE
CARACTERISTICAS
SUSTANCIAS
RESPONSABLES
PICADO
Bacterias
Se reconoce por el
Ácido láctico, acético,
LACTICO
heterolácticas
penetrante sabor
glicerina, etanol y
pertenecientes al
ácido dulce y olor de
diacetilo. Formados
género
coles fermentadas
por la transformación
Lactobacillus
frescas (Guillaume
de azúcares
(Guillaume 2001).
2001).
residuales presentes
en el vino (Suárez et
al. 1990) (Pardo
2004).
Streptococcus
Se caracteriza por el
Polisacáridos exentos
ENFERMEDAD
mucilaginus var.
aspecto aceitoso o
de nitrógeno,
DE LA GRASA
vini, bacterias
filante (Suárez,
integrados por
heterofermentativas
1990).
glucanos,
del género
Cambio de la
glucomananos, y
Lactobacillus.
consistencia fluida,
polímeros
Especies del
normal en vinos
compuestos de
género
sanos, en otra mas
galactosa, manosa,
Leuconostoc
viscosa (Pardo
arabinosa y ácido
(Suárez et al.
2004).
galacturónico (Suárez
AHILADO O
1990).
VUELTA O
REBOTE
et al. 1990)
Bacterias del
Los vinos presentan
Ácido láctico o
género
enturbiamiento,
succínico, acético y
Lactobacillus
cambio de color,
CO2. Formados por la
(plantarum, brevis)
aspecto
degradación del
(Guillaume 2001).
achocolatado
ácido tartárico
negruzco en tintos y
(Guillaume 2001).
oscurecimiento en
los blanco, en la
32
superficie burbujas
de gas (Guillaume
2001).Se observan
irisaciones
coloreadas como
islotes flotantes de
grasa. El sabor y el
olor llegan a ser
repugnantes, siendo
este relacionado con
el olor a chucroutte
(Guillaume 2001).
Lactobacillus casei,
Color del vino rancio,
Acroleína en
DEL
Lactobacillus
presenta
combinación con los
AMARGOR
fructivorans,
enturbiamiento y se
polifenoles
Lactobacillus
genera un sedimento
(Guillaume 2001).
hilgardii,
castaño.
Leuconostoc
Sabor amargo
gracile,
elevado (Suárez et
Leuconostoc oenos
al. 1990).
ENFERMEDAD
(Suárez et al.
1990)
AMINAS
BIOGENICAS
Pediococcus,
Efectos sobre la
Formación de aminas
Oenococcus oeni,
salud humana,
biogénicas,
Bacterias
absorbidas en alta
histamina, tiramina,
heterolácticas
concentración
feniletilamina,
pertenecientes al
producen dolores de
cadaverina,
género
cabeza, alteraciones
putrescina y
Lactobacillus
respiratorias, hiper o
agmanita, por
(Moreno et al.
hipotensión y
descarboxilación de
2003).
fenómenos de
los aminoácidos
alergia. El carbamato
(Guillaume 2001).
de etilo es
Formación de
considerado como
carbamato de etilo,
un compuesto
por la degradación de
33
cancerigeno (Orduña
la arginina ( Orduña
2000).
2000)
Bacterias
El olor de estos vinos
Formación de
OLOR A
heterofermentativas
recuerda el olor de
piperidinas,
RATON
del género
los nidos de ratones
2-acetil-3, 4, 5,6-
Lactobacillus como
o la orina de raton
tetrahidropiridina
Lactobacillus brevis
(Boulton et al.
(Boulton et al. 2002).
y Lactobacillus
2002).
VINOS CON
hilgardii.
( Heresztyn 1986,
Boulton et al.
2002).
DETERIORO
Bacterias lácticas
Gusto a vinagre y a
Formación de
PRODUCIDO
heterofermentativas
ester. Producción de
manitol, butanol,
(Boulton et al.
viscosidad (Boulton
propanol y ácido
2002).
et al. 2002).
acético (Boulton et al.
POR MANITOL
2002).
2.8.2. Levaduras
Las levaduras salvajes podrían no tomarse como contaminantes en vinos,
es decir, los géneros que se encuentran en concentraciones mas bien
altas sobre las uvas, y que logran fermentaciones alcohólicas limitadas:
Kloeckera, Hansenulla y Hanseniaspora;
la influencia de estos
microorganismos sobre la fermentación alcohólica depende de las
condiciones de elaboración, el uso de dióxido de azufre y/o los cultivos
iniciadores de levaduras vínicas, pero en cualquier caso llegaran a ser
inactivas
cuando
la
concentración
de
etanol
alcanza
el
5%
aproximadamente(Boulton et al. 2002, Pina et al. 2004).
Otras levaduras silvestres como Pichia y Candida son contaminantes en
vinos jóvenes, especialmente si no se conservan adecuadamente con
SO2 y evitando el oxígeno; Metschnikowia, Torulospora, y Debaryomyces
34
pueden estar en concentraciones bajas en el vino joven, pero nunca crean
problemas durante la conservación (Dittrich 1987, Boulton et al. 2002)
Tabla 3: Características de las levaduras causantes de la flor del vino
MICROORGANISMO
CARACTERISTICAS PRINCIPALES
•
Pichia membranefaciens
Se desarrolla en mostos de uva
(Suárez et al. 1990).
•
A
veces
puede
iniciar
una
levísima fermentación sobre estos
(Montaña et al. 1997, Loureiro et
al. 2003).
•
En mostos de uva forma un velo
muy tenue, liso o con rugosidad,
muy fino (Flor del vino) (Suárez et
al. 1990).
•
Fermentan únicamente glucosa y
fructosa (Dittrich 1987).
•
Son
células
de
forma
oval,
alargadas o cilíndricas (Dittrich
1987).
•
Candida mycoderma
Fermenta débilmente la glucosa
(Suárez et al. 1990).
•
Asimila el etanol
como única
fuente de carbono (Montaña et al.
1997).
•
Produce la enfermedad de flor del
vino (Suárez et al. 1990).
•
Son
células
de
forma
oval,
alargadas, cilíndricas (Suárez et
al. 1990).
•
Hansenula anomala
Presenta células redondeadas y
alargadas (Dittrich 1987).
35
•
Esporas
con
forma
típica
de
sombrero de hongo (Suárez et al.
1990).
•
Fermenta
azucares:
débilmente
glucosa,
los
rafinosa,
sacarosa (Montaña et al. 1997).
•
Forma velo sobre el mosto antes
de fermentar (Suárez et al. 1990).
•
Zygosaccharomyces acidifaciens
Células ovales-alargadas de gran
tamaño (Dittrich 1987).
•
Presenta
poder
fermentativo
medio (Suárez et al. 1990).
•
Forma velo sobre vinos de baja
graduación alcohólica (Suárez et
al. 1990).
•
Se desarrolla en medios con alta
concentración de azúcar (Dittrich
1987).
2.8.2.1
Brettanomyces sp.
Tabla 4: Defectos en el vino causados por Brettanomyces sp.
CARACTERÍSTICAS
Perdida
de
los
sabores
COMPUESTOS RESPONSABLES
frutales,
ESTERASAS.
producidos por los esteres.
Secretadas
por
Se pierde parcialmente el carácter
enzimas promueven la perdida de esteres
varietal de un vino contaminado por
(Eder 2003).
Brettanomyces,
estas
Brettanomyces (Eder 2003).
Aroma desagradable, relacionado con
ACETATO DE ETILO Y ACIDO ACETICO. El
el aroma del
acetato es formado por oxidación del etanol.
chucroutte (Berger
2003) (Guillaume 2001).
(Berger 2003).
36
El aroma específico depende de la
TETRAHIDROPIRIDINAS. Para la síntesis de
concentración
de
estas se requiere de los sustratos lisina,
responsables.
En
los
compuestos
concentraciones
etanol o propanol
bajas huele como a pan o palomitas
(Heresztyn 1986).
de maíz. En grandes concentraciones
como ratón o pelo y sudor de caballo
(Heresztyn 1986).
Aroma
y
sabor
a
analgésico
y
4 etil fenol y 4-etil guaiacol, son fenoles
medicina gracias a la presencia del 4
volátiles, formados por la degradación del 4-
etil fenol, picante y humeante por el 4
vinil fenol y 4-vinil guaiacol , respectivamente
etil guaiacol (Eder 2003, Chassagne
( Chatonnet 1992, Gerbeaux et al. 2000,
2005).
Stender et al. 2001, Dias et al. 2003,
Loureiro et al, 2003).
Los compuestos fenólicos sólo se producen por Brettanomyces , su
presencia en el vino puede servir como una indicación absoluta de
contaminación por este microorganismo, en tanto los ácidos grasos
volátiles no
confirman
una directa
contaminación
por parte
de
Brettanomyces , ya que estos compuestos son producidos también por
muchas bacterias ácido lácticas y ácido acéticas, así como las
tetrahidropidridinas
producidas
también
por
lactobacilos
heterofermentativos (Heresztyn 1986 , Peyron 1998 , Berger, 2003).
Los vinos tintos tienen un nivel alto de taninos como el ácido ferúlico y
cumárico que son extraídos de los hollejos de las uvas durante la
fermentación. La levadura del vino Saccharomyces y algunas bacterias
ácido lácticas tienen enzimas las cuales degradan estos ácidos a
intermediarios débiles llamados 4 vinil fenol y 4 vinil guaiacol (paso 1,
figura 2). Estos compuestos son enzimáticamente degradados por
Brettanomyces a 4 etil fenol y 4 etil guaiacol respectivamente (paso 2,
figura 2) (Chatonnet et al. 1992).
37
Figura 2: Formación de 4 etil fenol y 4 etil guaiacol en el vino
Fuente: Gawel, 2004. Brettanomyces character in wine
2.9 Etapas de contaminación durante la elaboración de vino tinto.
2.9.1. Contaminación en el vino por Brettanomyces.
La relación de Brettanomyces con el vino comienza en la vid. Se ha
hallado en el hollejo de la uva de todo tipo de cepas de Vitis vinifera y en
casi todas aquellas regiones donde se ha estudiado con las técnicas
apropiadas, pero no causa ningún tipo de enfermedad ni al fruto ni a la
planta, simplemente se aprovecha de las soluciones azucaradas
secretadas. Cuando llega la época de la vendimia la levadura llega al
lugar adherida a la uva, por lo que es la propia materia prima la que
constituye la principal fuente de contaminación (Licker et al. 1998).
Las operaciones de previnificación que van desde la recolección de la
materia prima (uva) hasta el estrujado de la misma, es una fase de
moderado riesgo en cuanto a la contaminación se refiere; las operaciones
de vinificación que van desde la masa estrujada hasta el embotellado es
una fase en la que las condiciones pueden ser reguladas y controladas
dentro del proceso, la fermentación tampoco es una fase en la que suela
causar dificultades. Si los mostos se encuentran poco sulfitados puede
comenzar a desarrollarse al comienzo de la fermentación, pero muy
38
pronto
es eclipsada
por
la
levadura Saccharomyces cerevisiae.
Posteriormente, tras la fermentación, es muy posible que entre la flora
microbiana presente en el vino comience a sobresalir Brettanomyces,
sobre todo si las condiciones higiénicas durante la fermentación no han
sido adecuadas (Figura 3) (Caridi et al. 1993).
Las principales habilidades que tiene Brettanomyces para desarrollarse
en un vino son la gran capacidad para fermentar azúcares residuales y
una extraordinaria adaptación a condiciones ambientales adversas como
las que presenta el vino (alta concentración de alcohol, pH ácido, falta de
oxígeno, etcétera) Después de la fermentación del mosto
aún
permanecen trazas de azúcares que pueden ser utilizadas por este tipo
de levaduras para su desarrollo, su crecimiento es lento y su metabolismo
es complejo. En muchos casos la presencia de este contaminante no
implica que el vino vaya a enfermar ni siquiera en un período prolongado.
En otros, una barrica o una botella pueden pasar de tener un vino
excelente a otro con una alta acidez volátil y unos aromas desagradables
en cuestión de semanas. El ácido acético contribuye a aumentar la acidez
volátil, el olor a vinagre, también producido por muchas bacterias
indeseables, normalmente el aumento en ácido acético conlleva a la
aparición de acetato de etilo, que da olores a acetona (Chatonnet 2002,
Chatonnet et al. 1992).
Un vector de contaminación es la mosca de la fruta Drosophila
melanogaster, que es muy abundante en la época de la vendimia, y se
encarga de llevar Brettanomyces a todos los rincones de la cava. Si las
condiciones de desinfección no han sido apropiadas, en los instrumentos
e instalaciones de la cava pueden existir células que se pueden propagar
y contaminar los vinos (Berger 2003).
39
1.
Entorno
2. Cepa + uvas. Alto riesgo de contaminación por Bacterias lácticas y
Levaduras (Brettanomyces sp.)
3. Uvas,
operaciones
de
previnificación.
Moderado
riesgo
de
contaminación por Bacterias lácticas y Levaduras (Brettanomyces
sp.)
4. Uvas, operaciones de vinificación y acondicionamiento. Bajo riesgo
de
contaminación
por
Bacterias
lácticas
y
Levaduras
(Brettanomyces sp.)
Figura 3: Riesgo de contaminación por bacterias ácido lácticas y levaduras
(Brettanomyces) durante las etapas de la elaboración de vino tinto, 2 y 3 riego
externo, 4 riesgo interno
Fuente: Quijano-Rico 2005.
40
2.10 Métodos empleados para el control de bacterias ácido lácticas y
Brettanomyces sp.
Tabla 5: Métodos para el control de bacterias ácido lácticas y Brettanomyces sp.
METODO
Bacterias ácido lácticas
SO2
Son muy sensibles a este,
La adición de 20ppm no
comienzan
tiene ningún efecto en las
a
verse
afectadas
a
Brettanomyces sp
poblaciones de
concentraciones bajas de
Brettanomyces sp, la
20ppm
inhibición del crecimiento
(Suárez
y
Leal
1990).
de esta levadura se da
adicionando 40ppm
(Fevillat 1997).
REDUCCION DE LA
ACIDEZ
Un
pH
mas
básico
Se crea un ambiente mas
disminuye la eficacia del
favorable para el desarrollo,
anhídrido sulfuroso como
habría que utilizar el triple
antiséptico. Permitiendo así
de anhídrido sulfuroso para
un mejor desarrollo de las
conseguir
la
bacterias
protección
frente
lácticas
indeseables
NATAMICINA
(Gerbeaux
misma
a
los
microorganismos
et al. 2002)
( Gerbeaux et al. 2002)
No inhibe el crecimiento
Es
estos microorganismos
sobre
( Gerbeaux et al. 2002)
cuando se utiliza a una
un
fungicida,
actúa
Brettanomyces
concentración de 20mg/l,
su eficacia decrece con el
tiempo
( Gerbeaux et
al. 2000)
LISOZIMA
Inhibe el crecimiento de
Su crecimiento no se ve
bacterias lácticas a una
inhibido por esta (Gerbeaux
concentración
et al. 2000).
de
10g/l
(Gerbeaux et al. 2000).
41
Estas
FILTRACION
células
se
ven
filtros
de
membrana con tamaño de
membrana con un tamaño
poro de 0.45 micras. La
de poro de 0.65 micras.
filtración
atrapadas
ESTERIL
en
Se
utilizan
filtros
despoja
de
del
carácter frutal, reduciendo
la viscosidad, y creando un
tanino más fuerte en el vino
tinto
(Chatonnet
et
al.
se
ve
1999).
DIMETIL
DICARBONATO
( DMDC )
Inhibe el crecimiento de
Su
estas
inhibido, ya que, el DMDC
bacterias.
(Egli
y
Kling 2001).
crecimiento
es esterilizante (Egli y Kling
2001).
2.11 Potencial del CO2 bajo presiones hiperbáricas para el control de
bacterias ácido lácticas y levaduras.
Los efectos inhibitorios de gases bajo presión sobre células microbianas
han sido extensivamente estudiados. Sin embargo, el mecanismo general
de inhibición de microorganismos no es todavía bien entendido, aunque
existe la posibilidad de que se ejerza la absorción de gas por las células,
así,
cuando
las
células
microbianas
son
presurizadas,
el
gas
gradualmente penetra dentro de las ellas. Este fenómeno de gas puede
causar la inactivación de enzimas claves relacionadas con los procesos
metabólicos esenciales por cambios en el pH de las células y/o
solubilización de sustancias intracelulares tales como fosfolípidos de las
paredes de la célula y membrana citoplasmática (Haas et al. 1989).
Se ha observado que después del tratamiento con gas bajo presión, hay
presencia de hoyos y arrugas en las células de levadura. Algunas células
se encontraron totalmente estalladas, mientras las células no tratadas
aparecen como esferas, con superficie lisa. Las observaciones de los
cambios morfológicos sugieren que las células de levadura o al menos
algunas de ellas, son rotas mecánicamente o desgarradas por el
42
tratamiento con gas comprimido (Haas et al. 1989, Nakamura
et al.
1994).
El efecto del dióxido de carbono comprimido sobre diferentes tipos de
microorganismos ha sido estudiado por diversos investigadores. La
inactivación microbiana por CO2 es dependiente de muchos parámetros.
Algunas de las condiciones experimentales como temperatura, presión,
humedad, contribuye a un efectivo tratamiento por incremento de la
difusibilidad de CO2. Dentro de ciertos límites, una prolongada duración
de exposición al dióxido de carbono puede permitir la esterilización (Wei.,
et al. 1991) (Lin et al. 1993).
La resistencia microbiana al dióxido de carbono también depende de el
tipo de microorganismo, la fase de crecimiento, y el medio de suspensión,
este último puede inhibir el efecto bactericida de CO2 comprimido,
especialmente en sustratos ricos en proteínas .Varias hipótesis han sido
propuestas para explicar la actividad microbicida del dióxido de carbono
Lin et al (1993), ha observado que a alta presión, el dióxido de carbono
penetra las células haciendo que estás se rompan de repente. Los
autores pudieron
mejorar la
velocidad
de ruptura
disminuyendo
súbitamente la presión de CO2. Nakamura et al (1994) y Kumagai et al
(1997) observaron que el mejor resultado de destrucción microbiana fue
obtenido cuando la presión de CO2 fue reducida muy rápido. En alimentos
con alto contenido de agua, el CO2 disuelto produce ácido carbónico, de
acuerdo a la siguiente reacción de equilibrio:
H2O + CO2
↔
H+ + HCO3- ↔
H2CO3 ↔
2H+ + CO32-
Ecuación 1: Producción de acido carbónico
Fuente: Louka, 1999. Effect of compressed carbon dioxide on microbial cell viability
Así el CO2 disuelto actúa bajando el pH del medio, y el resultado de la
acidez permite interferir con algunos sistemas biológicos dentro de las
43
células. Esto sugiere que la inhibición microbiana puede resultar de
alteración en las propiedades de la célula (membrana, citoplasma,
enzimas, etc.). Por tanto una reducción en el pH del medio no es
suficiente para explicar la acción antimicrobiana con CO2, la cual muestra
un efecto inhibitorio específico, mayor que el de otros ácidos usados para
bajar la acidez del medio (ácido hidroclórico, ácido fosfórico), estos ácidos
no penetran en las células microbianas tan fácilmente como el dióxido de
carbono (Louka et al. 1999).
2.12 Cinética de muerte microbiana
La cinética de muerte celular es un factor importante que debe tenerse en
cuenta a la hora de diseñar procesos de esterilización. En un
medioambiente letal, las células de una población no mueren todas a la
vez sino que la desactivación del cultivo se produce durante un periodo
finito de tiempo que depende del número inicial de células viables y de la
severidad de las condiciones impuestas (Doran 1995).
La muerte de una población, al igual que su crecimiento, es generalmente
exponencial o logarítmica, es decir, la población se reduce en niveles
iguales a intervalos constantes. Si se representa el logaritmo del número
de microorganismos de la población que sobrevive, frente al tiempo de
exposición a un agente determinado, resulta en una línea recta. Cuando
la población se ha reducido notablemente, la velocidad de destrucción
puede disminuir debido a la supervivencia de las cepas microbianas mas
resistentes (Mañas et al. 2005).
44
2.12.1 Cinética de desactivación microbiana por altas presiones
La aplicación de cualquier nueva tecnología en la preservación de
alimentos requiere un modelo fiable que describa con presición la tasa de
inactivación. El modelo debe poder establecer las condiciones de
tratamiento apropiadas para lograr los niveles de inactivación microbiana,
permitiendo la producción de estabilidad y seguridad en los alimentos
(Mañas et al. 2005).
Los parámetros del proceso térmico generalmente han sido calculados a
través del modelo cinético de primer orden. Como resultado una curva de
supervivencia recta (gráfico de Log de células sobrevivientes vs tiempo
de tratamiento) es obtenida, un tiempo de reducción decimal (valor D) y
valor Z son usados para calcular los parámetros del proceso (Smelt et al.
2002).
Los primeros experimentos para dilucidar la cinética de destrucción de los
microorganismos por las altas presiones se hicieron imitando los modelos
muy bien conocidos de los tratamientos térmicos, es decir, representando,
a presión constante, el logaritmo de supervivientes frente al tiempo de
tratamiento (Mañas et al. 2005).
Sin embargo, en los últimos 10 años la conveniencia de la cinética de
primer orden para modelos de inactivación por calor, así como para las
nuevas tecnologías esta revisándose. Esto es debido a la ocurrente
frecuencia de desviaciones (Chen et al. 2003).
Algunos autores admiten que la naturaleza de la cinética de desactivación
por las altas presiones difiere de la de la muerte térmica y otros tipos de
tratamientos pudiendo variar incluso entre cepas de la misma especie y
de la presión que se aplique (Simpson y Gilmour 1997).
45
3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION.
3.1.
Formulación del problema.
Para la realización de la fermentación maloláctica bajo condiciones
controladas es necesario reducir considerablemente las dosis usuales de
SO2. En estas condiciones diversos microorganismos perjudiciales para
las características sensoriales del vino tales como: bacterias ácido lácticas
y levaduras por ejemplo del género Brettanomyces, pueden multiplicarse
sin grandes limitaciones y causar daños importantes e irremediables en el
perfil sensorial de los vinos. La utilización del CO2 hiperbárico para el
tratamiento de los estrujados de uvas debe permitir una reducción
suficiente de las poblaciones de estos microorganismos para evitar las
mencionadas alteraciones del perfil sensorial del vino, o por lo menos
reducirlas a niveles aceptables.
3.2.
Justificación.
La elaboración de vinos tintos de calidad superior consta de cuatro etapas
en el proceso de vinificación: 1. maceración de la masa estrujada de la
vendimia, 2. fermentación alcohólica en la cual se transforman los
principales azúcares de la uva, glucosa y fructosa, en etanol y dióxido de
carbono, 3. fermentación maloláctica que tiene por objeto transformar el
ácido málico relativamente áspero en ácido láctico mucho más suave, y 4.
en el caso de los vinos Pinot noir una etapa ulterior a la fermentación
maloláctica, que se ha observado incide sobre la estabilidad del color, que
es el reposo del vino sobre el deposito de células no viables de levadura.
En estas cuatro etapas el riesgo de daño del perfil sensorial del vino por la
acción de bacterias ácido lácticas y/o levaduras como las pertenecientes
al género Brettanomyces sp es muy alto. Probablemente la eliminación de
una parte importante de las poblaciones de los microorganismos
mencionados,
puede
permitir
la
46
reducción
del
riesgo.
Por
las
características químicas, toxicológicas, tecnológicas, el dióxido de
carbono bajo presión parece ser promisorio para alcanzar este objetivo, ya
que el uso del dióxido de azufre como antiséptico es limitado en el
presente caso por la sensibilidad a este de Oenococcus oeni (agente de
la fermentación maloláctica controlada). El tratamiento con dióxido de
carbono bajo presión no produce alteraciones en el perfil sensorial. En
cambio la pasteurización y la termovinificación que vienen a ser una
alternativa, introducen cambios notables en el perfil sensorial de los vinos.
No sobra anotar que actualmente cerca de setenta viticultores están
asociados al proyecto vitivinícola de Puntalarga y por lo tanto su ingreso
depende en gran medida del éxito de los vinos regionales en el mercado.
47
4. OBJETIVOS
4.1. GENERAL
Evaluar el potencial del CO2 bajo presión hiperbárica, para el control de
poblaciones de levaduras y bacterias ácido lácticas, en uvas estrujadas
de la variedad Pinot noir del Viñedo & Cava Loma de Puntalarga.
4.2. ESPECIFICOS
•
Establecer el tiempo necesario para reducir en mas de 95% las
poblaciones de bacterias ácido lácticas y levaduras bajo las siguientes
condiciones: Presión: 35 bar, pH: 3.2-3.3, temperatura
15°C y
concentración de azúcares 28°Brix.
•
Evaluar la respuesta al tratamiento hiperbárico de CO2 de poblaciones
de bacterias ácido lácticas y levaduras por medio de la técnica de
“recuento en placa”.
•
Evaluar la presencia de Brettanomyces sp. en medio DBDM después
de la fermentación alcohólica.
• Comparar los perfiles sensoriales de vinos obtenidos a partir de
estrujados tratados y no tratados con CO2 bajo presión hiperbárica.
48
5. MATERIALES Y METODOS
5.1 Sitio de estudio
El trabajo se llevó a cabo en el viñedo “Loma de Puntalarga” Nobsa,
Boyacá (Figura 4), situado a 5°46'47.1” latitud norte y 72°58'36.5” longitud
oeste, altitud de 2618 m.s.n.m. la loma esta localizada al borde
del
denominado Valle del Sol, Valle de Sogamoso en la proximidad del curso
del rió Chicamocha en la vertiente occidental de la cordillera oriental de
los Andes. En el año se tienen promedios de temperatura y precipitación
de 16.5°C y 830mm respectivamente (Chaparro 2001).
Figura 4: Vista aérea del Viñedo Loma de Puntalarga, Nobsa, Boyacá
Fuente: Quijano-Rico 2005
49
5.2 Muestreo
Se escogió aleatoriamente una parcela dentro del viñedo, cultivada con
cepas de Pinot noir. Posteriormente se tomaron 100 uvas de diferentes
plantas, con el fin de determinar el grado de maduración de la uva, por
medio del contenido en azúcar grados Brix (gramos de azúcar en 100 ml
de solución: 1° Brix equivale a 10g de azúcar/ L), el cual aumenta con el
grado de maduración (Matiz et al. 1993, Bryce 2000).
Una vez conocido el grado de maduración de las uvas se llevo a cabo la
vendimia o cosecha, de plantas seleccionadas aleatoriatoriamente. Se
procedió con precaución al momento de cortar el racimo de la mata. Los
racimos fueron recolectados y depositados en baldes (Matiz et al. 1993,
Paipilla et al. 1997,).
5.2.1 Preparación de muestras
Se realizó un despalillado manual de los racimos seleccionando las uvas
por color y sanidad. Se pesaron 8Kg de uvas. Y se procedió a realizar un
estrujado manual de los granos de uva, se adicionó 0.35g de metabisulfito
de sodio, y se procedió a almacenarlo en bolsas de polietileno con 250g
de estrujado c/u. Se sellaron y se almacenaron a -18°C. (Gutiérrez et al.
1993, Steild et al. 2001, Archer 2004, Zdenek 2003).
5.3 Parámetros de operación del tratamiento hiperbárico de CO2
En este estudio se empleo el CO2 para probar su poder de inactivación
sobre el crecimiento de células microbianas. En los estrujados de uvas.
Se experimentó con un método de control de CO2 a una presión de
operación de 35 bar, temperatura 15°C, 28°Brix y pH: 3.3.
Para cada montaje se tomaron muestras a los 0, 30, 60, 90, 120, 150,
180, 210, 240, 300 y 360 minutos de tratamiento, a cada muestra se le
50
realizó recuento en placa de bacterias ácido lácticas y levaduras (Anexo
5) (Montaña et al. 1997, Álvarez et al. 1998, Quijano 2005).
Con el fin de obtener una mayor exactitud en los resultados, el
procedimiento se realizó por triplicado (montaje 1,2 y 3)
5.4
Tratamiento de estrujados bajo presión
5.4.1 Biorreactor, partes y sus funciones
Figura 5: Esquema del biorreactor para presiones hiperbáricas de CO2
Fuente: Montaña 1997, Quijano-Rico 2005.
51
Tabla 6: Partes del biorreactor y su función
PARTES DEL
FUNCIÓN
BIOREACTOR
A. Válvula
Abre el cilindro que contiene el CO2.
B. Válvula
Regula el paso de CO2.
C. Válvula
Permite el paso de CO2 del cilindro al autoclave.
D. Válvula
Se utiliza para la extracción de la muestra desde la cámara de
presión.
Un medidor de presión (manómetro de 0-100 bar).
E. Manómetro
F.
Válvula
de Permite regular la presión del biorreactor.
alivio
G.
Tapones
y Para sellar y conectar tramos de tubería de ¼ de pulgada
uniones “T”
respectivamente.
H. Conectores
Al cilindro de CO2.
Conducto Paso del CO2, del cilindro al recipiente de la muestra.
J.
central
Para salida de muestra, en tela de acero inoxidable.
K. Filtro
Recipiente Fabricado en acero inoxidable 316.
L.
contenedor
del
liquido
M.
Ciclón
de Para toma de muestras.
muestreo
N. Cilindro de CO2 Contiene CO2.
O. Doble pared
Para la regulación de temperatura, mediante la circulación de un
líquido caloportador.
P. Abrazadera
Ajusta herméticamente el biorreactor.
El biorreactor, esta conectado a un sistema de refrigeración para
mantener constante la temperatura del biorreactor a un valor de 15°C,
compuesto por: un recipiente de doble camisa, uno en acero inoxidable
316, y otro en icopor, una bomba de recirculación de agua, compresor,
radiador y ventilador (Sanabria y Zarate 2005).
52
5.4.2 Procedimiento
Descongelación de
muestras 15°C por 15 h
Carga del biorreactor
con 750g de estrujado
Cierre hermético del
equipo
Expulsión de aire por
corriente de CO2
durante 5 minutos
Presurización con CO2
35 bar, 15°C
Toma de muestras (minutos)
(Figuras 7 y 8)
0
30
60
90
120
150
180
Recuento
Levaduras
Bacterias
ácido lácticas
210
240
300
Lavado y desinfección
del ciclón de muestreo
Después de cada
toma de muestra
Figura 6: Procedimiento a seguir para el tratamiento en atmósfera hiperbárica de CO2 de
muestras de estrujados de uvas
53
360
Figura 7: Salida de muestra al ciclón de muestreo
Figura 8: Toma de muestra en el ciclón de muestreo
5.5 Recuento de bacterias ácido lácticas
Para realizar el conteo de bacterias ácido lácticas, se realizaron diluciones
seriadas decimales desde 10-1 hasta 10-6 en agua peptonada al 0.1%p/v
Se sembraron en superficie 0.1ml de estas diluciones en agar MRS
(Anexo 3.1) y se incubaron a 30ºC por 72 horas, en microaerofília. La
aparición de colonias blancas, Gram positivas y catalasa negativas se
considero indicativo de bacterias ácido lácticas (Álvarez et al. 1998 y
Carrascal et al. 2002).
Para la lectura se escogieron placas con 30 a 300 colonias y el número
final de bacterias se calculó de acuerdo a la dilución escogida (UFC/ ml).
54
5.6 Recuento de levaduras
Para realizar el conteo de levaduras, se realizaron diluciones seriadas
decimales desde 10-1 hasta 10-6 en agua peptonada al 0.1%p/v.
Se sembraron en superficie 0.1ml de las diluciones en agar YGC (Anexo
3.2) y se llevaron a incubar a 25°C por 3 días, adicionalmente se realizo
coloración de Gram (Lizarazo et al. 1996, Zagorc et al. 2001, Carrascal et
al. 2002).
Para la lectura se escogieron placas con 15 a 150 colonias y el número
final de levaduras se calculó de acuerdo a la dilución escogida (UFC/ ml)
5.7 Fermentación alcohólica
Una vez establecido el tiempo de tratamiento en el cual se redujeron las
poblaciones de levaduras y bacterias ácido lácticas a más de un 95 por
ciento, se realizó la fermentación alcohólica. Para realizar la fermentación
se procedió a descongelar 1500g de estrujado de uvas (15°C por 15
horas), de los cuales 750g fueron sometidos a tratamiento hiperbárico con
CO2 a 35bar, 15°C y 360 minutos, esta muestra llevó el nombre de
muestra con tratamiento hiperbárico de CO2.
Los 750g restantes, no tuvieron ningún tratamiento con dióxido de
carbono, esta muestra llevó el nombre de “muestra control”.
La muestra con tratamiento hiperbárico de CO2, y la muestra control
fueron sometidas a fermentación alcohólica bajo condiciones controladas,
utilizando la levadura Saccharomyces cerevisiae, cepa ATCC procedente
de Lallemand, Canadá, selección comercial en forma de levadura
liofilizada (Rojas 1991 y Quijano 2005).
55
5.8 Análisis microbiológico de los vinos
5.8.1 Aislamiento de bacterias ácido lácticas
Para determinar la presencia o ausencia de bacterias ácido lácticas, se
realizaron siembras en superficie del producto final (vino con tratamiento
hiperbárico de CO2 y vino control) en medio MRS (Anexo 3.1), selectivo
para bacterias ácido lácticas, se incubaron a 30°C por 72h en
microaerofília. La aparición de colonias blancas, Gram positivas y
catalasa negativas se considero indicativo de presencia de bacterias
acido lácticas (Álvarez et al.1998; Carrascal et al. 2002, Sanabria et al.
2005).
5.8.2 Aislamiento de levaduras salvajes
Para verificar la presencia o ausencia de levaduras salvajes, se realizo
una siembra en superficie de las muestras de vino en agar WL (Anexo
3.3), luego se llevaron a incubar a 25°C por tres días, adicionalmente se
realizo coloración de Gram (Carrascal et al. 2002, Sanabria et al. 2005).
5.8.3 Aislamiento de Brettanomyces sp
Para determinar la presencia de Brettanomyces sp se realizaron siembras
en superficie de los vinos obtenidos, en agar DBDM (anexo 3.4).
El medio sembrado se llevó a incubar a 25°C por 14 días (Mitrakul et al.
1999, Gerbeaux et al.2000, Rodríguez et al. 2001, Días et al. 2003, Silva
et al. 2004).
Este medio de cultivo es parcialmente selectivo y completamente
diferencial para Brettanomyces sp. en vinos, la aparición de colonias
amarillo crema como puntos de alfiler, el cambio de color del medio de
azul a amarillo y la detección de olores fenólicos (olor a ratón, sudor de
caballo, establo, analgésico y/o ahumado) es indicativo de la presencia
56
de Brettanomyces sp. (Gerbeaux et al. 2000, Rodríguez et al. 2001, Días
et al. 2003).
Figura 9: Equipo de filtración
Figura 10: Medio DBDM
5.9 Parámetros físico-químicos
Para el análisis físico-químico se utilizaron muestras del vino con
tratamiento hiperbárico de CO2 y vino control.
57
5.9.1 Determinación del contenido alcohólico por el método de
Roessner
Para la determinación del grado alcohólico de los vinos se utilizó un
areómetro, con escala entre 980 y 1020 g/l, y un refractómetro calibrado,
con escala en °Brix (Quijano 2005).
Seguido a esto se aplicó la formula de Roessner:
CETL = [(CRFT°Brix.4,17) + (1000-d)] X 0,365
5.9.2 Determinación refractométrica del extracto del vino
Se utilizó una muestra de 25 ml de vino, y se redujo el volumen en un
dispositivo evaporador en corriente de aire caliente a 90°C, hasta
aproximadamente 15 ml. Se completó con agua destilada a 25 ml, se
mezcló bien, seguido a esto se leyó en el refractómetro el valor en °Brix
de la solución. Se expresó el resultado en g/100g (Quijano 2005).
5.9.3 Determinación potenciométrica del pH
Para realizar esta medida se utilizó pH-metro metrohm , pH 0,0-14,0 ±0,1
(Quijano 2005).
5.9.4 Color comparativo
Se utilizaron copas blancas especiales para evaluar el color del vino, esta
evaluación también se llevó a cabo en el vino con tratamiento hiperbárico
de CO2 y el vino control (Quijano 2005).
58
5.10 Evaluación sensorial
El análisis sensorial se llevó a cabo por 4 jueces entrenados de acuerdo
con la metodología establecida en el viñedo & Cava Loma de Puntalarga
por un tiempo aproximado de 1-20 años, incluyendo a la autora del
presente trabajo. Se evaluaron las características sensoriales de tres
muestras correspondientes a vino Pinot noir del Viñedo de Puntalarga,
vino con tratamiento hiperbárico con CO2 y vino control. Las pruebas de
análisis sensorial se realizaron en un salón ventilado e iluminado, se sirvió
aproximadamente 30ml de las muestras a temperatura ambiente en copas
de degustación transparentes e incoloras, codificadas con un digito (1,
2,3) (Anexo 8 y 9) (Porras et al 2003, Quijano 2005, Sanabria et al. 2005).
5.11 Análisis estadístico
Los resultados de los recuentos realizados a las muestras con tratamiento
hiperbárico de CO2 se analizaron usando el programa statistiXL versión
1.4; con el cual se trabajo a un nivel de significancía de α=0.05. Para el
análisis de los datos se aplicó el modelo estadístico de Regresión Lineal
Simple, el cual explica la variación en los recuentos en UFC/mL que es la
variable dependiente numérica (y) en términos de una variable numérica
independiente (x), en este caso el tiempo (Anexo 10 y 11) (Walpole et al.
1992, Morantes 2006)
59
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1 Efectos del tratamiento hiperbárico de CO2 sobre células de
levaduras y bacterias ácido lácticas.
En este trabajo de investigación se evaluó el efecto de la presión de CO2
sobre bacterias ácido lácticas y levaduras como metodología alternativa
de tratamiento para mejorar la calidad de vinos de la variedad Pinot noir.
Los resultados obtenidos se muestran en las tablas 7 y 8.
Tabla 7: Promedio de los resultados del recuento de levaduras en los tres montajes.
TIEMPO EN
UFC/ml
MINUTOS
0
30
60
90
120
150
180
210
240
300
360
Log 10
LN
Porcentaje(%)
UFC/ml
UFC/ml
de inhibición
4
5,619789
12,940042
0
4
5,392110
12,4157932
40.48
3
4.942834
11,381297
79.05
3
4,873126
11,220789
82.14
3
4,790050
11,0294988
85.24
3
4,721536
10,871738
87.38
3
4,587337
10,5627332
90.71
3
4,552262
10,4819718
91.19
3
4,472268
10,2977794
92.86
3
4,308208
9,92001685
95.24
3,3970037
9,1413475
97.86
42x10
25x10
88x10
75x10
62x10
53x10
39x10
37x10
30x10
20x10
3
9x10
Tabla 8: Promedio de los resultados del recuento de bacterias ácido lácticas en los tres
montajes.
TIEMPO EN
UFC/ml
MINUTOS
0
30
60
90
120
Log 10
LN
Porcentaje de
UFC/ml
UFC/ml
inhibición
4
5,44715803
12,5425449
0
4
5,18563658
11,9403695
46.43
3
4,95744765
11,4149451
67.5
3
4,92771246
11,3464773
69.64
3
4,88460658
11,2472223
72.5
28x10
15x10
91x10
85x10
77x10
60
150
69x103
4,83674597
11,1370192
75.36
3
4,71321044
10,8525681
81.43
3
4,56427143
10,5096234
86.79
3
4,4366926
10,2158622
91.79
3
4,23044892
9,74096862
93.93
3
4,09108047
9,4200609
95.71
52x10
180
37x10
210
23x10
240
17x10
300
12x10
360
Estos resultados mostraron que con un tiempo de residencia de 360
minutos bajo presión de 35 bar, 15°C, 28°Brix y pH 3.3, en estrujados de
uvas, se obtuvó una reducción de la población de levaduras del 97.9 por
ciento correspondiente a una población final de 9X103 UFC/mL y de 95.7
por ciento de bacterias ácido lácticas con una biomasa final de 12X103
UFC/mL, datos obtenidos del promedio de los tres montajes realizados.
Las figuras 11 y 12 muestran que la disminución de la viabilidad celular
depende no solo de la presión sino también del tiempo de exposición, se
ha reportado
que el tiempo requerido para la inactivación completa,
depende de factores tales como: tipo de microorganismo (bacteria,
hongo), estado en que se encuentra (vegetativa, espora), fase de
crecimiento, composición del medio y condiciones del tratamiento (Louka
et al. 1999, Karama et al. 2001 y Spilimbergo et al. 2003).
6
Log UFC/mL
5,5
5
4,5
Log UFC/mL
4
3,5
3
0
100
200
300
400
Tiempo ( min )
Figura 11: Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en levaduras, promedio de los tres
montajes
61
6
Log UFC/mL
5,5
5
4,5
Log UFC/mL
4
3,5
3
0
100
200
300
400
Tiempo ( min )
Figura 12: Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en bacterias ácido lácticas, promedio
de los tres montajes
Con el fin de comprobar la acción del dióxido de carbono bajo presión
sobre las poblaciones de microorganismos evaluadas, se calcularon los
valores D y K. El valor K definido como la velocidad de muerte constante
o tasa de inactivación, fue calculado del reciproco de la pendiente de la
curva de sobrevivencia siguiendo un análisis cinético tradicional, los
resultados de este presentaron un valor de 0.0133 min –1 para levaduras y
para bacterias ácido lácticas de 0.0097 min
–1
. Los valores K obtenidos en
el tratamiento bajo presiones hiperbáricas de CO2 indican que este
tratamiento afecta significativamente la respuesta microbiana, como fue
reportado previamente por Shimoda et al. 2001 (Erkmen et al. 2000 y
Karaman et al. 2001 ).
El tiempo de reducción decimal, valor D para levaduras y bacterias ácido
lácticas hallados a partir del promedio de los montajes, señaló que se
necesitan 173 y 238 minutos respectivamente, para reducir una población
a su décima parte a una presión de CO2 de 35 bar, 15°C, 28°Brix y pH
3.3, en estrujado de uvas de la variedad Pinot noir, es decir disminuir una
unidad logarítmica, lo cual comprueba que las levaduras son menos
62
resistentes a la presión de CO2 que las bacterias ácido lácticas quienes
necesitan mayor tiempo de exposición (Anexo 5.7 y 5.8).
Los resultados señalaron que la cinética de inactivación por presión para
los dos tipos de microorganismos evaluados sigue un modelo cinético de
primer orden debido a la baja dispersión de los datos (Ver anexo 10)
demostrado en sus altos coeficientes de correlación (r2>0.9); resultados
similares fueron obtenidos por Shimoda et al. 2001, Erkmene et al. (2000)
y Karaman et al. (2001).
A pesar que los efectos inactivantes del CO2 sobre los microorganismos
son utilizados en la industria alimenticia, el mecanismo de inactivación no
ha sido claramente definido. A continuación se presentan algunos
posibles mecanismos basados en la información obtenida en la literatura
consultada.
Karaman et al. (2001) atribuyeron el poder inactivante de este proceso a
la alteración de las proteínas responsables para la replicación, integridad
y metabolismo. La alta presión al parecer no rompe enlaces covalentes,
pero si altera uniones tipo
puentes de hidrógeno y uniones iónicas
responsables para mantener a las proteínas en su forma biológicamente
activas.
Erkemen 2000 , piensa que se origina en la difusión del dióxido de
carbono dentro de la membrana celular, acumulandose dentro de las
células. A presión suficiente es posible que un gran número de moléculas
de CO2 pasen continuamente la membrana celular y reduzcan el pH
interno copando la capacidad buffer del citoplasma. Cuando el pH
intracelular cae por debajo de 3, procesos vitales biológicos como la
glicólisis son inhibidos . Según Louka et al. 1999, Erkmen 2000 y
Karaman et al. 2001, el dióxido de carbono se disuelve en solución
acuosa formando ácido carbónico, lo cual baja el pH del medio, aunque
63
es difícil esperar que este sea el único mecanismo responsable del efecto
letal en las células.
Hass et al. 1989 y Nakamura et al. 1994, observaron que después del
tratamiento con gas bajo presión, hay presencia de hoyos y arrugas en
las células, esto sugiere que las células o al menos algunas de ellas, son
rotas mecánicamente o desgarradas por el tratamiento con gas
comprimido.
En estudios realizados anteriormente en el Viñedo & Cava Loma de
Puntalarga se utilizó el tratamiento con CO2 para inactivar células de
levadura (Montaña y Ortegón 1997), y bacterias ácido lácticas en vinos
por Álvarez y García 1998. En mostos de uvas a 30 bar se observó una
reducción del 96 por ciento de la población de levaduras a los 120 min en
mostos de uvas con 14°Brix, mientras en vino de 11.5 volúmenes% en
alcohol y menos de 1g/L de azúcar residual se logro inactivación de
bacterias ácido lácticas a 30 bar por 30 minutos. Comparando estos
resultados con la presente investigación, deduce la importancia que tiene
el medio en el cual se encuentran suspendidas las células microbianas,
ya que la eliminación de las poblaciones evaluadas en este proyecto fue
menos rápida, debido talvez en parte a la naturaleza del medio (estrujado
de uvas), esta diferencia podría atribuirse también al contenido en
sustancias disueltas en las muestras evaluadas. Se trabajó con una
concentración de azúcares de 28°Brix, mayor a la utilizada en mostos de
uva (14ºBrix). Según Mohio (1993) cuanto más alta sea la presión de CO2
y más bajo el contenido de azúcar, será mas rápida la inactivación,
demostrando así que la inhibición de los microorganismos por alta presión
de CO2 esta sujeta a gran variedad de parámetros, que hacen que las
condiciones de operación se limiten a un caso específico (Karama et al.
2001).
64
Montaña y Ortegón (1997), utilizando la misma técnica que la aquí
descrita, pero nitrógeno en cambio de dióxido de carbono, no observaron
reducciones significativas en poblaciones naturales de levaduras de
mostos de uvas. Los autores aplicaron presiones de 40 y 100 bar hasta
por 120 minutos, a una temperatura promedio de 17°C. Estos resultados
pueden atribuirse a la inercia química del nitrógeno, frente a la actividad
química del dióxido de carbono, en las condiciones experimentales. Dillow
et al. (1999) ya anotaron que la toxicidad del CO2 para microorganismos,
en un medio acuoso, esta relacionada esencialmente con la formación de
acido carbónico en solución acuosa, que resume la reacción:
H2O + CO2
↔
H+ + HCO3- ↔
H2CO3 ↔
2H+ + CO32-
El equilibrio de esta reacción, es desplazado por incremento de la presión,
en la dirección de la formación de ácido carbónico, de acuerdo con el
principio de Le Chatelier.
La concentración de H2CO3 en un sistema acuoso es directamente
proporcional a la solubilidad del CO2 en el sistema. A su turno, esta
dimensión es directamente proporcional a la presión ejercida por el gas
sobre el sistema. Además aumenta con el contenido del sistema en
etanol, pero disminuye con la temperatura y con la concentración de otras
sustancias en solución (glucosa, fructosa, glicerol, taninos) Cavazzani
(1985).
Aunque los mecanismos de inhibición de microorganismos por medio de
altas
presiones
hidrostáticas
(1000
a
10000
bar),
difieren
considerablemente de los que operan en presencia de un gas con
actividad química, bajo presiones relativamente bajas (10 a 50 bar), como
el aquí estudiado ( Quijano 2006 ), es interesante tener presentes los
fenómenos de baroprotección y baropromoción de la inhibición de
microorganismos por presión, debidos a sustancias disueltas en sistemas
acuosos hidrostáticos, descritos por Knoor (1995). En la figura 13 tomada
65
de dicho autor, se observan los efectos baroprotector de la fructosa y
glucosa y baropromotor de NaCl, en la inhibición de poblaciones de
Rhodotorula rubra, bajo una presión de 4000 bar. La sacarosa, en las
condiciones experimentales, es un baroprotector más eficaz que la
fructosa, mientras que NaCl al 10% es un baropromotor muy eficaz.
Guardando
todas
las
proporciones
del
caso,
el
análisis
del
comportamiento de poblaciones de bacterias acido lácticas y levaduras en
estrujados de uvas y vinos tratados con dióxido de carbono bajo presión,
puede dar algunas luces sobre manifestaciones similares a las que se
acaban de describir, Figura 14. El efecto baroprotector, en principio es
atribuible al contenido en glucosa y fructosa (28°Brix) de los estrujados de
uvas, es notorio, mas en el caso de las bacterias ácido lácticas, que en el
de las levaduras. En cambio, la curva referente a un vino (contenido en
etanol 11,5 vol%, en azúcar residual <1g/l) muestran un efecto
baropromotor que recuerda al del NaCl. En primera aproximación estos
fenómenos pueden ser atribuidos al contenido relativamente elevado, en
sólidos solubles ( glucosa, fructosa 28°Brix) de los estrujados de uvas y al
del etanol (11.5 vol%), en el caso del vino. Parece que el método, de
inhibición de microorganismos por CO2 bajo presión, se encuentra, como
los sistemas de inhibición hidrostáticos, con barreras y ventajas asociadas
respectivamente con los fenómenos de baroprotección y baropromoción,
pese a las diferencias del orden de un factor de 100 en los valores de las
presiones aplicadas.
66
Figura 13: Efectos del tiempo de proceso (a 400Mpa y 25°C) en la sobrevivencia de
suspensión celular de R. rubra en medio de Aw=0.94.
Fuente: Knoor, R.1995. Food process design and evaluation
Tabla 9: Comparación del efecto del CO2 bajo presión. Bacterias ácido lácticas y
levaduras.
Tiempo
0
30
60
90
120
150
180
210
240
300
360
% de células vivas
de bacterias acido
lácticas en
estrujados de uvas
a 35bar(este
trabajo)
100
53.57
32.5
30.3
27.5
24.64
18.57
13.21
8.21
6.07
4.29
% de células
vivas de
levaduras en
estrujados de
uvas a 35bar(este
trabajo
100
59.5
20.9
17.8
14.8
12.61
9.29
8.81
7.14
4.76
2.14
67
%de células vivas
de bacterias ácido
lácticas en vino a
30bar(Álvarez et
al.,1998)
100
0
0
0
0
0
-
Porcentaje de celulas vivas
100
90
80
70
60
Bacterias acido lacticas en
estrujados de uvas a 35bar
50
Levaduras en estrujados de
uvas a 35bar
40
30
Bacterias acido lacticas en
vino 30bar
20
10
0
0
100
200
300
400
Tiempo ( min )
Figura 14: Comparación del efecto del CO2 bajo presión. Bacterias acido lácticas y
levaduras.
Finalmente, el análisis estadístico de la reducción de poblaciones
microbianas por presiones hiperbáricas de CO2 realizado por la técnica de
recuento en placa, a través del modelo de regresión lineal simple,
demostró que existe una fuerte correlación lineal negativa entre los datos,
ya que a
medida que aumenta el tiempo, el número de Unidades
Formadoras de Colonia disminuye en forma lineal, tal como se verifica por
el Coeficiente de Correlación de Pearson obtenido(> -0.95), el hecho de
que el valor de significancía del coeficiente obtenido, sea muy pequeño
(0.000001), indica la fuerte relación existente entre las variables. El
análisis de varianza ANOVA ( One way AOV) dentro de los resultados de
la regresión evaluó la hipótesis de si existía relación entre la variable
dependiente para este caso las UFC/mL y la independiente el tiempo de
tratamiento, los valores obtenidos del estadístico F: 257.0777 para
bacterias ácido lácticas y 103.2667 para levaduras ( F(0.05,1,9) = 5.12) ,
reveló que existía una innegable relación entre las variables, y sugirió que
la variable independiente es un indicador significativo de la variable
dependiente. El modelo de regresión lineal se ajusto al tipo de datos
manejado, mostrando obviamente una disminución en la población tanto
68
de levaduras como de bacterias ácido lácticas, siendo dicha disminución
debida al efecto del tratamiento sobre las poblaciones, en relación con el
tiempo de tratamiento (ver anexo 10 y 11).
6.5 Parámetros Físico-Químicos de los vinos
Al vino obtenido de los estrujados de uvas sometidos a 35 bar de presión
de CO2 y al vino control (sin tratamiento), se les determinó porcentaje de
alcohol, extracto seco (g/L) y pH; para saber si el tratamiento con
presiones hiperbáricas de CO2 afectaba algunos parámetros. En la
composición química del vino influyen factores como el manejo de las
vides, del mosto y del vino, así como el clima y las condiciones
atmosféricas (Porras y Santos 2003).
Tabla 10: Resultado del análisis físico Químico de los vinos
VINO
% Alcohol
15.27%
Extracto
seco g/L
32.0
Control
Tratamiento de
CO2
pH
3.56
15.27%
32.0
3.58
El pH es una medida del equilibrio de la concentración del ion hidrógeno y
se ve afectado por la medida en que se neutralizan los ácidos de la
solución. Se mide fácilmente usando un pH-metro, pero los factores que
determinan su valor son más complicados y menos evidentes. Este
parámetro es importante ya que el grado de ionización de diversos
compuestos químicos, la velocidad de numerosas reacciones químicas,
las propiedades físicas y la estabilidad microbiológica de mostos y vinos,
son función del pH (Boulton et al. 2002).
Como se observa en la tabla 10 en relación con el valor de pH en el vino
obtenido con estrujados de uvas tratadas con presión respecto al vino
control, este parámetro no presenta una variación significativa, lo que
muestra que el pH del vino no es alterado por el tratamiento del estrujado.
69
El porcentaje de alcohol se encuentra relacionado con la concentración
de azúcares que están disponibles para ser convertidos en etanol por la
acción de las levaduras. El resultado de este análisis en los dos vinos no
presentó variación alguna (Tabla 10), en consecuencia el tratamiento
hiperbárico de CO2 no afecta los azúcares presentes en los estrujados de
uvas, además de esto las muestras con las cuales se realizó la
vinificación tenían el mismo contenido de azúcar (28°Brix), lo que explica
la no diferencia en los resultados de este análisis (Boulton et al. 2002).
El extracto seco de un vino se refiere a los sólidos solubles libres de
alcohol, corresponde a los componentes naturales del vino, es importante
en la expresión sensorial de los vinos, ya que un bajo contenido en estas
materias los hace flojos y ligeros al paladar (Porras y Santos 2003).
El resultado de este análisis fue igual tanto para el vino de estrujado
tratado como para el vino control, mostrando que el proceso al que fueron
sometidos, no modificó el contenido en extracto seco, como era de
esperar.
La comparación de color deja ver que la intensidad del rojo en el vino con
tratamiento de CO2 y el vino control era la misma. En cuanto a la
tonalidad, el vino con tratamiento de CO2 presentaba un mayor
desplazamiento hacia el naranja que el control. Estos resultados indican
que el tratamiento con CO2 bajo presión podrían tener efecto perceptible
sobre el color del vino.
6.6 Análisis microbiológico de los vinos
En esta investigación se pretendía lograr una disminución de las
poblaciones
de bacterias ácido lácticas y levaduras presentes en
estrujados de uvas de la variedad Pinot noir, para reducir la población de
microorganismos indeseables en el vino y con esto, defectos en el perfil
sensorial de los mismos. A pesar de haber usado tiempos de exposición
relativamente prolongados al tratamiento hiperbárico de CO2, no logró
eliminar el total de las poblaciones evaluadas, pero si una alta proporción.
70
El resultado obtenido en el recuento de bacterias ácido lácticas en el vino
control fue de 1,2x103 UFC/mL y en el vino con tratamiento hiperbárico de
CO2 fue de 3,0x102 UFC/mL, lo que indica que las disminución de la
población de bacterias ácido lácticas por el método de alta presión con
CO2 sirvió para disminuir el contenido de células presentes en el vino.
Además este vino se encontró por debajo del valor máximo permitido que
es 1x103 UFC/mL, contrario a lo que sucedió con el vino control (Boulton
2002).
Por otro lado el valor obtenido el recuento de levaduras salvajes en el vino
control fue de 2x101 UFC/ml, por debajo del valor límite permitido que es
1x103UFC/ml. En el vino con tratamiento hiperbárico de CO2 no hubo
crecimiento de levaduras salvajes (Zarzoso et al. 2002).
En el medio DBDM no hubo crecimiento, lo que indica, que dentro de las
levaduras salvajes presentes en el vino control no se encontraban
levaduras del genero Brettanomyces sp. , causantes de los denominados
olor a sudor de caballo, pesebrera, medicina y cuero (Chatonnet et al.
1992, Gerbeaux et al. 2000, Stender et al. 2001, Días et al. 2003).
El bajo recuento de los vinos obtenidos de estrujados de uvas tratados
con dióxido de carbono bajo presiones hiperbáricas muestra la utilidad del
proceso para la aplicación industrial. En cuanto a la diferencia conseguida
en el recuento
de levaduras salvajes, se podría sugerir que estas
levaduras que podrían estar como contaminantes en el vino fueron
eliminadas por el tratamiento hiperbárico de CO2 (Chassagne 2005; Pina
et al. 2004; Días et al. 2003, Romano et al, 2003, Graham et al, 2003).
6.7 Análisis sensorial
Para este análisis, se utilizo el vino producido con estrujado de uvas
sometidas a tratamiento hiperbárico de CO2, vino control realizado con
muestras sin tratamiento hiperbárico de CO2 y un vino Pinot noir
tradicional del Viñedo & Cava Loma de Puntalarga (figura 15).
71
Color, olor, claridez y sabor son los parámetros que dan las
características típicas a cada clase de vino. Los vinos obtenidos fueron
sometidos a una evaluación sensorial a cargo de cuatro catadores, Se
calificaron los caracteres organolépticos utilizando la tabla normalizada de
la OIV (anexo 8 y 9) (Paipilla et al. 1997 y Quijano 2005).
Figura 15: Panel de catadores
La figura 16 muestra la claridez de los vinos evaluados. Se observa que el
vino producido con estrujado de uvas sometidas a tratamiento hiperbárico
de CO2 y el vino control fueron claros a diferencia del vino Pinot noir del
Viñedo & Cava Loma de Puntalarga, el cual presento alguna turbidez.
Esto indica que el tratamiento hiperbárico de CO2 no altera la claridez del
vino, como era de esperar (Anexo 7).
72
Pinot noir
Tratamiento
hiperbarico de CO2
Control
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
Puntaje
Figura 16: Claridez de los vinos Pinot noir evaluados
Por otra parte, en la figura 17 se observa que el vino producido con
estrujado de uvas sometidas a tratamiento hiperbárico de CO2 y el vino
control se caracterizan por presentar un color típico correspondiente a los
vinos de la variedad Pinot noir, mientras que el vino Pinot noir del Viñedo
& Cava Loma de Puntalarga presenta un color atípico. Estos resultados
demuestran también que el tratamiento con CO2 no afecta el pígmento
(taninos) que se encuentra en las capas de las células del hollejo de la
uva cuya cantidad
e intensidad cromática desempeñan un
papel
especialmente importante en la elaboración del vino tinto (Anexo 7) (Vogt,
et al., 1986).
Pinot noir
Tratamiento
hiperbarico de
CO2
Control
0
1
2
Puntaje
Figura 17: Color de los vinos Pinot noir evaluados
73
3
4
En cuanto a el olor, se observa en la figura 18 que el vino producido con
estrujado de uvas sometidas a tratamiento hiperbárico de CO2 y el vino
control no presentan notas extrañas. El vino Pinot noir del Viñedo & Cava
Loma de Puntalarga presentó notas finas (Anexo 7). Así el tratamiento
hiperbárico de CO2 no presenta ningún efecto en el olor del vino, su
similaridad con el vino control tal vez se deba al corto período de
maduración que presentaban. El vino Pinot noir del Viñedo & Cava Loma
de Puntalarga presentó leves notas extrañas relacionadas con fenoles
volátiles, esto podría ser atribuido a la producción de ácido p-cumárico y
ácido-ferúlico por parte de Brettanomyces sp. Los resultados obtenidos
anteriormente muestran que la ausencia de Brettanomyces sp en el vino
control pudo se debida al buen manejo de las prácticas higiénicas en el
proceso de elaboración ya que como sugiere Cocolin en el 2004, esta
especie de levadura puede sobrevivir, multiplicarse y contaminar vinos
trasladados a sitios que no han tenido un óptimo proceso de limpieza y
desinfección después del uso.
Pinot noir
Tratamiento
hiperbarico de
CO2
Control
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
Puntaje
Figura 18: Olor de los vinos Pinot noir evaluados
El sabor del vino (figura 19) producido con estrujado de uvas sometidas a
tratamiento hiperbárico de CO2 se caracterizo por ser armónico con una
calificación de 6.75 y el vino control con un puntaje inferior de 5.75 lo cual
lo clasifica como liviano con carácter. El vino Pinot noir del Viñedo &
74
Cava Loma de Puntalarga obtuvo un puntaje de 7.5 el cual también esta
dentro del rango para vinos armónicos. La mayor calificación fue obtenida
por este vino debido posiblemente al mayor tiempo de maduración en el
momento de la catación (Anexo 7).
Pinot noir
Tratamiento
hiperbarico de CO2
Control
0
2
4
6
8
Puntaje
Figura 19: Sabor de los vinos Pinot noir evaluados
En la figura 20 se observa la impresión global de los vinos, la cual permite
considerar que el vino control y el vino Pinot noir del Viñedo & Cava Loma
de Puntalarga usados para la catación fueron los adecuados. El vino
producido con estrujado de uvas sometidas a tratamiento hiperbárico de
CO2, obtuvo un puntaje de 13.75 que lo clasifica como un vino de calidad
media, mientras que los otros dos vinos alcanzaron un menor nivel. Los
resultados
señalaron que el vino con mayor puntaje fue el vino con
tratamiento de dióxido de carbono, esto debido posiblemente a la
disminución de poblaciones de levaduras y bacterias ácido lácticas en los
estrujados de uvas tratados con CO2 a altas presiones, pues los
microorganismos tienen un papel prominente en la determinación de la
composición química del vino, ya que durante la fermentación
metabolizan los azúcares de la uva y otros componentes en etanol,
dióxido de carbono y cientos de productos finales y secundarios que,
colectivamente contribuyen a la sutileza e individualidad del carácter del
75
vino. Esto hace que el uso de altas presiones de dióxido de carbono
originen un vino de mejor calidad, pues en la industria vinícola cuando las
fermentaciones ocurren en presencia de muchas especies de levaduras y
bacterias es difícil señalar las actividades fermentativas benéficas y
dañinas que se llevan a cabo, por lo tanto cuando se trabaja bajo
condiciones
controladas
se
evita
la
producción
de
compuestos
indeseables por parte de los microorganismos que llevan a la perdida de
atributos en el producto final (Graham 2003, Loureiro et al. 2003).
Pinot noir
Tratamiento
hiperbarico de
CO2
Control
12
12,5
13
13,5
Puntaje
Figura 20: Impresión global de los vinos Pinot noir evaluados
76
14
7. CONCLUSIONES
•
Se determinó que a los 360 minutos evaluados a una presión de CO2
de 35 bar se obtiene una reducción de la población de levaduras de
97.9% y de 95.7% para bacterias ácido lácticas, sobre estrujados de
uvas de la variedad Pinot noir.
•
El tiempo de reducción decimal (valor D) fue de 173 minutos para
levaduras y 238 minutos para bacterias ácido lácticas, lo cual indica el
tiempo necesario para reducir las poblaciones a su décima parte a una
presión de CO2 de 35 bar, 15°C, 28°Brix y pH 3.3, en estrujado de
uvas de la variedad Pinot noir.
•
Los resultados obtenidos en los recuentos muestran que las bacterias
ácido lácticas son mas resistentes a la presión hiperbárica de CO2 que
las levaduras, según lo señalado por el valor D y los porcentajes de
inhibición.
•
La velocidad de muerte constante (valor K) para levaduras fue de
0.0133 min
–1
y para bacterias ácido lácticas de 0.0097 min
–1
siguiendo un análisis tradicional cinético de primer orden.
•
Los análisis físico-químicos medidos en el vino (control y tratamiento)
señalaron que la presión de dióxido de carbono no tiene efecto alguno
sobre: pH, extracto seco y % de alcohol.
•
Los resultados microbiológicos de los vinos evaluados, señalan que el
uso de altas presiones mejora la calidad microbiológica de los vinos.
•
La no detección de Brettanomyces sp. en los vinos puede ser debida
al buen manejo de prácticas higiénicas en el proceso de vinificación.
77
•
El análisis sensorial mostró que la utilización de presiones hiperbáricas
de CO2 como tratamiento esterilizante no afecta las cualidades
organolépticos del vino Pinot noir, proponiendo este tratamiento como
una nueva alternativa para ser implementada en la producción de
vinos.
78
RECOMENDACIONES
•
Se recomienda realizar investigaciones encaminadas al uso de
técnicas moleculares para la identificación de Brettanomyces sp.
•
Con el fin de evaluar cuales son los microorganismos mas
resistentes al tratamiento, se debería realizar identificación de las
especies presentes en estrujados de uvas, seguido de un análisis
individual para cada una de las especies encontradas.
•
Implementar el sistema de tratamiento por presión a escala
industrial para estrujados de uva utilizados en la elaboración de
vinos de la variedad Pinot noir para disminuir así, el riesgo de
contaminaciones microbiológicas.
•
Encaminar estudios hacia la evaluación de mayores presiones con
menores tiempos de exposición en búsqueda de la optimización del
proceso.
79
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ANEXO 1
EQUIPOS
• Biorreactor bajo presión
Viñedo & Cava Loma de Puntalarga
• Medidor de pH ( pH-metro)
Metrohm, Suiza
• Incubadora a 37°C
Arthur Tomas Co Philadelphia USA
• Incubadora a 25°C
Memmert, Alemania
• Equipo de filtración
Millipore, California
• Termostato y termómetro digital
Jhonson’s controls MR12
• Manómetro
Linde, Mainz-Alemania
• Refractómetro
Zeiss, Oberkochem-Alemania
• Microscopio
Olympus, España
• Balanza analítica
BOECO
ANEXO 2
REACTIVOS
Reactivos
N° de catalogo
Casa comercial
1.01614
Merck
128708-56
Aldrich
1.04699
Merck
C9008-16
Sigma
Agar MRS
01-135
Scharlau
Agar YGC
1.16000
Merck
Agar WL
1.10866
Merck
Alcohol etílico
1.00983
Merck
Campygen®
1.13682
Merck
Ciclohexamida
1.09228CASE
Merck
Cristal violeta
1.09228
Merck
C020
Millipore
Fucsina de Gram
1.09217
Merck
Hidróxido de sodio
1.06462
Merck
Medio YNB
239210
DifcoTM
Peptona
A1070431000
Merck
Verde de bromocresol
VE00700001
Scharlau
Agar-Agar
Acido ferúlico
Aceite de inmersión
Acido p-cumárico
Filtro 0.2µm
ANEXO 3
COMPOSICIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
3.1 Agar MRS
•
Peptona proteasa
10g/L
•
Extracto de carne
8g/L
•
Extracto de levadura
4g/L
•
Glucosa
•
Acetato de sodio
5g/L
•
Citrato triamonico
2g/L
•
Sulfato de magnesio
•
Sulfato de manganeso
•
Fosfato dipotásico
2g/L
•
Polisorbato 80
1g/L
•
Agar-Agar
14g/L
•
Ciclohexamida
4mg/L
•
pH 6.2 ( +/-0.2 )
20g/L
0.2g/L
0.05g/L
3.2 Agar YGC
•
Glucosa
•
Extracto de levadura
•
Cloranfenicol
•
Agar-Agar
•
pH 6.6 ( +/- 0.2 )
20g/L
5g/L
0.1g/L
15g/L
3.3 Agar WL
•
Extracto de levadura
4g/L
•
Hidrolizado de caseína
5g/L
•
D (+) glucosa
•
Fosfato diácido de potasio
0.005g/L
•
Cloruro de potasio
0.425g/L
•
Cloruro de calcio
0.125g/L
•
Sulfato de magnesio
•
Verde de bromocresol
•
Agar-Agar
•
Cloruro de hierro (III)
•
Ciclohexamida
•
Sulfato de manganeso
•
pH 5 ( +/-0.2 )
50g/L
0.0025g/L
0.022g/L
15g/L
0.125g/L
0.01g/L
0.125g/L
3.4 Medio DBDM
•
Medio YNB
6.7 g/L
•
Etanol
6%v/v
•
Acido p-cumárico
100mg/L
•
Acido ferúlico
100mg/L
•
Verde de bromocresol
•
Agar-agar
•
Ciclohexamida
22mg/L
2g/L
10mg/L
El agar-agar fue adicionado después de su esterilización en autoclave a
una temperatura de 50°C, los demás componentes del medio de cultivo
fueron esterilizados por filtración, utilizando filtros de membrana de 0.2µm
de diámetro, a excepción de la ciclohexamida que se adicionó al final. El
pH del medio fue ajustado a 5.4 con hidróxido de sodio 0.1N.
3.5 Medio YNB
•
Sulfato de amonio
5.0g
•
Fosfato monopotásico
1.0g
•
Sulfato de magnesio
0.5g
•
Cloruro de sodio
0.1g
•
Cloruro de calcio
0.1g
•
L-histidina monohidroclorada
•
LD metionina
20mg
•
LD triptofano
20mg
•
Inositol
•
Acido bórico
500µg
•
Niacina
400µg
•
Sulfato de manganeso
400µg
•
HCL piridoxina
400µg
•
Sulfato de zinc
400µg
•
HCL tiamina
400µg
•
Pantetonato de calcio
400µg
•
Cloruro ferrico
200µg
•
Molibdato de sodio
200µg
•
Riboflavina
200µg
•
Acido p-aminobenzoico
200µg
•
Yoduro de potasio
100µg
•
Acido fólico
2µg
•
Biotina
2µg
10.0mg
2000µg
ANEXO 4
PROTOCOLO DE PROCEDIMIENTO PARA TRATAMIENTO DE
ESTRUJADOS DE UVAS EN ATMOSFERA HIPERBARICA DE CO2
1. Descongelación de las muestras a 15°C por 15 horas.
2. Lavado del autoclave
3. Desinfección del biorreactor con 200ppm de Hipoclorito de sodio
4. Lavado con agua destilada estéril
5. Carga del recipiente contenedor con 750g de estrujado de uva (3
muestras), el cual se dispuso en el interior del biorreactor.
3. Cierre hermético del equipo con el cierre de la abrazadera.
4. Purga del biorreactor, abriendo la válvula A, B, C, F y manteniendo
cerrada la válvula D. Durante 5 minutos.
5. Lograda la saturación del estrujado con el gas se cierra la válvula F.
6. Alcanzada la presión deseada (35 bar) en el manómetro se cerrara la
válvula C para mantener la presión constante en el interior del autoclave.
7. Toma de muestras a los 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 300 y
360 minutos, abriendo la válvula D, esta válvula se cerró después de la
salida de la muestra.
8. La muestra se deposito en el ciclón de muestreo, de donde se tomaron
alícuotas de 4ml en jeringas estériles.
9. Se realizo recuento de levaduras y bacterias acido lácticas, a cada una
de las muestras tomadas.
10. Después de haber tomado la muestra correspondiente a cada tiempo
de tratamiento, el ciclón de muestreo se enjuago con agua destilada
estéril, se desinfecto con 200ppm de hipoclorito de sodio durante 15
minutos, y finalmente se volvió a enjuagar con agua destilada estéril.
12. Finalizado el último tiempo de tratamiento (360min), se despresurizo
el biorreactor, abriendo lentamente la válvula F.
13. Se retiro la abrazadera y se saco el recipiente contendor.
14. Lavado y desinfección del equipo.
11. Los pasos descritos anteriormente (1-14) se repitieron dos veces mas
(Ossa 1992, Montaña et al. 1997, Álvarez et al. 1998,Quijano 2005, Arias
2004).
ANEXO 5
TABLAS DE RESULTADOS
5.2 Resultados del recuento de levaduras en el Primer Montaje
TIEMPO EN
UFC/ml
MINUTOS
Log 10
LN
Porcentaje(%)
UFC/ml
UFC/ml
de
inhibición
0
30
60
90
120
150
180
210
240
300
360
4
5,579783
5,579784
0
4
5,342422
5,342423
42.11
3
4,924279
4,924279
77.9
3
4,857332
4,857333
81.05
3
4,792392
4,792391
83.69
3
4,716003
4,716003
86.32
3
4,568201
4,568202
90.26
3
4,544068
4,544068
90.79
3
4,477121
4,477121
92.11
3
18x10
4,255273
4,255273
95.26
3
3,903089
3,903089
97.9
38x10
22x10
84x10
72x10
62x10
52x10
37x10
35x10
30x10
8x10
5.2 Resultados del recuento de levaduras en el Segundo Montaje
TIEMPO EN
UFC/ml
MINUTOS
Log 10
LN
Porcentaje(%)
UFC/ml
UFC/ml
de
0
45x104
5,653212
13,01700
inhibición
0
30
28x104
5,447158
13,01700
37.78
3
4,963788
11,42954
79.56
3
4,886491
11,25156
82.89
3
4,812913
11,08214
85.56
3
4,740363
10,91509
87.78
3
4,602059
10,59663
91.11
3
4,579783
10,54534
91.56
3
4,477121
10,30895
93.33
60
90
120
150
180
210
240
92x10
77x10
65x10
55x10
40x10
38x10
30x10
300
360
23x103
4,361728
10,04325
94.89
3
4,041393
9,30565
97.56
11x10
5.3 Resultados del recuento de levaduras en el tercer montaje
TIEMPO EN
UFC/ml
MINUTOS
Log 10
LN
Porcentaje(%)
UFC/ml
UFC/ml
de
0
42x104
5,623249
12,94801
inhibición
0
30
24x104
5,380211
12,38832
42.86
3
4,939519
11,37366
79.29
3
4,875061
11,22524
82.14
3
4,763428
10,96819
86.19
3
4,707570
10,83958
87.86
3
4,591065
10,57132
90.71
3
4,531479
10,43412
91.90
3
4,462398
10,27505
93.09
3
4,30103
9,90349
95.24
3,954242
9,10498
97.86
60
90
120
150
180
210
240
300
360
87x10
75x10
58x10
51x10
39x10
34x10
29x10
20x10
3
9x10
5.4 Resultados del recuento de bacterias ácido lácticas en el Primer
Montaje
TIEMPO EN
UFC/ml
MINUTOS
0
30
60
90
120
150
180
210
240
300
360
Log 10
LN
Porcentaje de
UFC/ml
UFC/ml
inhibición
4
5,414973
12,468436
0
4
5,113943
11,775289
50
3
4,949390
11,396391
65.77
3
4,913813
11,314474
68.46
3
4,875061
11,225243
71.15
3
4,819543
11,09741
74.62
3
4,707570
10,839580
80.38
3
4,531478
10,434115
86.92
3
4,380211
10,085809
90.77
3
4,204119
9,680344
93.85
3
4,079181
9,3926619
95.38
26x10
13x10
89x10
82x10
75x10
66x10
51x10
34x10
24x10
16x10
12x10
5.5 Resultados del recuento de bacterias ácido lácticas en el
Segundo Montaje
TIEMPO EN
UFC/ml
MINUTOS
0
30
60
90
120
150
180
210
240
300
360
Log 10
LN
Porcentaje de
UFC/ml
UFC/ml
inhibición
4
5,477121
12,611538
0
4
5,255272
12,100712
40
3
4,968482
11,440355
69
3
4,944482
11,385092
70.67
3
4,908485
11,302204
73
3
4,851258
11,170435
76.33
3
4,748188
10,933107
81.33
3
4,591065
10,571317
87
3
4,477121
10,308953
90
3
4,30103
9,9034876
93.33
3
4,146128
9,5468126
95.33
30x10
18x10
93x10
88x10
81x10
71x10
56x10
39x10
30x10
20x10
14x10
5.6 Resultados del recuento de bacterias ácido lácticas en el Tercer
Montaje
TIEMPO EN
UFC/ml
MINUTOS
Log 10
LN
Porcentaje de
UFC/ml
UFC/ml
inhibición
4
5,447158
12,542545
0
4
5,176091
11,918391
46.43
3
4,954243
11,407565
67.86
3
4,924279
11,338572
70
3
4,869232
11,211820
73.57
150
3
69x10
4,838849
11,141862
75.36
180
48x103
4,681241
10,778956
82.86
3
4,568202
10,518673
86.79
3
4,447158
10,239959
90
3
4,176091
9,6158055
94.64
3
4,041393
9,3056506
96.07
0
30
60
90
120
210
240
300
360
28x10
15x10
90x10
84x10
74x10
37x10
28x10
15x10
11x10
5.7 Efecto de las presiones hiperbáricas de CO2 en el tiempo de
reducción decimal (D) y la tasa de inactivación de levaduras
Montaje
1
2
3
Promedio
5.8
VALOR D(min.)
178
169
172
173
VALOR k
0.0129
0.0136
0.0134
0.0133
Efecto de las presiones hiperbáricas de CO2 en el tiempo de
reducción decimal (D) y la tasa de inactivación de bacterias ácido
lácticas
MONTAJE
1
2
3
promedio
VALOR D (min.)
233
240
240
238
VALOR k
0.0099
0.0096
0.0096
0.0097
ANEXO 6
GRAFICAS
6.1 Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en levaduras, Montaje 1
6
Log UFC/mL
5,5
5
Log UFC/ml
4,5
4
3,5
3
0
100
200
300
400
Tiem po ( m in )
6.2 Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en levaduras, Montaje 2
6
Log UFC/mL
5,5
5
4,5
Log UFC/ml
4
3,5
3
0
100
200
Tiem po ( m in )
300
400
6.3 Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en levaduras, Montaje 3
6
Log UFC/mL
5,5
5
4,5
Log UFC/ml
4
3,5
3
0
100
200
300
400
Tiem po ( m in )
6.4 Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en bacterias acido
lácticas, Montaje 1
6
Log UFC/mL
5,5
5
Log UFC/ml
4,5
4
3,5
3
0
100
200
Tiem po ( m in )
300
400
6.5 Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en bacterias acido
lácticas, Montaje 2
6
Log UFC/mL
5,5
5
Log UFC/ml
4,5
4
3,5
3
0
100
200
300
400
Tiem po ( m in )
6.6 Efecto de la presión hiperbárica de CO2 en bacterias ácido
lácticas, Montaje 3
6
Log UFC/mL
5,5
5
4,5
Log UFC/ml
4
3,5
3
0
100
200
Tiem po ( m in )
300
400
6.7 Gráfica comparativa del recuento de levaduras de los tres
montajes
6
Log UFC/mL
5,5
5
Montaje 1
4,5
Montaje 2
Montaje 3
4
3,5
3
0
100
200
300
400
Tiempo ( min )
6.8 Gráfica comparativa del recuento de bacterias acido lácticas de
los tres montajes
6
Log UFC/mL
5,5
5
Montaje 1
4,5
Montaje 2
Montaje 3
4
3,5
3
0
100
200
Tiempo ( min )
300
400
ANEXO 7
EVALUACION DE CARACTERISTICAS SENSORIALES
Vino control
Vino Pinot noir
Claridez
Vino con tratamiento
hiperbárico de co2
1
1
0.75
Color
4
4
1.75
Olor
2
2
2.75
Sabor
6.75
5.75
7.5
IMPRESIÓN
13.75
12.75
12.75
Características
GLOBAL
ANEXO 8
TABLA NORMALIZADA DE LA OIV ( ORGANIZACIÓN
INTERNACIONAL DEL VINO) PARA LA EVALUACIÓN DE
CARACTERISTICAS SENSORIALES
Nombre: ___________________
Fecha: ___________________
CARACTERISTICAS
CLARIDEZ:
Turbio
Claro
Claro brillante
COLOR:
Atípico
Típico
OLOR:
Defectuoso
Neutro
Sin notas extrañas
Fino
Floral
SABOR:
Defectuoso
Neutro ( 1-3 )
Liviano con carácter ( 1-3 )
Armónico (1-3 )
Maduro y noble (10-12 )
CALIDAD DEL VINO:
Superior
Medio
Menos que medio
Inaceptable
Muestra:____________________
CALIFICACION
0
1
2
0
4
0
1
2
3
4
0
1-3
4-6
7-9
10-12
17-20
13-16
9-12
0-8
ANEXO 9
GUIA DE CATACIÓN
Nombre: ___________________
Fecha: ___________________
Muestra:____________________
CARACTERISTICAS
VINO 1
CLARIDEZ:
Turbio
Claro
Claro brillante
COLOR:
Atípico
Típico
OLOR:
Defectuoso
Neutro
Sin notas extrañas
Fino
Floral
SABOR:
Defectuoso
Neutro ( 1-3 )
Liviano con carácter ( 1-3 )
Armónico (1-3 )
Maduro y noble (10-12 )
CALIFICACION
VINO 2
VINO 3
ANEXO 10
ANALISIS ESTADISTICO
10.1 Análisis estadístico de los resultados obtenidos de los
recuentos de levaduras en el Montaje Numero 1.
Linear Regression Results for:
Y = Hoja1!$C$3:$C$14
X = Hoja1!$A$3:$A$14
Descriptive Statistics
Variable
ln UFC/ml
Tiempo
(Min)
Mean
Std Dev.
N
10,877
1,077
11
158,182
113,121
11
Pearson Correlations
ln UFC/ml Tiempo (min)
ln UFC/ml
Tiempo
(Min)
1,000
-0,966
-0,966
1,000
Significance for Pearson Correlations
ln UFC/ml Tiempo (min)
ln UFC/ml
0,000
Tiempo
(Min)
0,000
-
Summary
R2
0,932
ANOVA
Source
Regression
R
0,966
Sum Sq.
10,819
Adj. R2
0,925
D.F.
1
S.E. of
Estimate
0,295
Mean Sq.
10,819
F
124,129
Prob.
0,000
Residual
Total
0,784
11,604
9
10
Regression
Coefficients
Source
Coefficient
Intercept
12,331
Tiempo
(Min)
-0,009
Std Error
0,158
0,087
-95% C.I.
11,974
+95% C.I.
12,689
t
78,039
Prob.
0,000
-0,011
-0,007
-11,141
0,000
Std Pred
Pred Norm
Std
Pred Y
Y
Residual
Res
Residual
12,331
1,398
0,517
0,474
2,072
12,055
1,133
0,246
0,307
0,944
11,779
0,868
-0,441
-0,474
-1,635
11,504
0,603
-0,319
-0,307
-1,157
11,228
0,338
-0,193
-0,209
-0,689
10,952
0,072
-0,093
-0,064
-0,330
10,676
-0,193
-0,157
-0,132
-0,560
10,400
-0,458
0,063
0,064
0,226
10,124
-0,723
0,185
0,132
0,676
9,573
-1,254
0,226
0,209
0,881
9,021
-1,784
-0,034
0,000
-0,148
1 Case Critical Value for Studentised Residual (alpha = 0.05)
All Cases Critical Value for Studentised Residual (alpha = 0.05)
Stu.
Residual
2,702
0,937
-1,839
-1,182
-0,668
-0,313
-0,537
0,214
0,654
0,869
-0,140
2,306
3,900
0,001
Std Beta
-0,966
Residuals
Normal Prob. Plot
0,6
Residuals
0,4
0,2
0,0
-0,2
-0,4
-0,6
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
Normal Distribution
Residuals vs Pred ln UFC/ml
0,6
Residuals
0,4
0,2
0,0
-0,2
-0,4
-0,6
0
5
10
15
Predicted ln UFC/ml
Scatter Plot
14
ln UFC/ml
12
10
8
6
4
2
0
0
100
200
300
Tiempo (Min)
400
10.2 Análisis estadístico de los resultados obtenidos de los
recuentos de levaduras en el Montaje Numero 2.
Linear Regression Results for:
Y = Hoja2!$C$2:$C$13
X = Hoja2!$A$2:$A$13
Descriptive Statistics
Variable
Ln UFC/ml
Minutos
Mean
Std Dev.
N
11,003
1,065
11
158,182
113,121
11
Pearson Correlations
Ln
UFC/ml
Ln UFC/ml
1,000
Tiempo
(min)
-0,950
Tiempo
(min)
-0,950
1,000
Significance for Pearson Correlations
Ln
UFC/ml Tiempo(min)
Ln UFC/ml
0,000
Tiempo
(min)
0,000
-
Summary
R2
0,903
ANOVA
Source
Regression
Residual
Total
R
0,950
Sum Sq.
10,247
1,096
11,343
Regression
Coefficients
Source
Coefficient
Intercept
12,419
Minutos
-0,009
Adj. R2
0,893
D.F.
1
9
10
Std Error
0,187
0,001
S.E. of
Estimate
0,349
Mean Sq.
10,247
0,122
Std Beta
-0,950
F
84,161
Prob.
0,000
-95% C.I.
11,996
-0,011
+95% C.I.
12,841
-0,007
t
66,501
-9,174
Prob.
0,000
0,000
Residuals
Std Pred
Pred Norm
Std
Y
Res
Residual
Pred Y
Residual
12,419
1,398
0,598
0,560
2,029
12,150
1,133
0,392
0,363
1,272
11,882
0,868
-0,452
-0,560
-1,420
11,614
0,603
-0,362
-0,363
-1,110
11,345
0,338
-0,263
-0,248
-0,795
11,077
0,072
-0,162
-0,076
-0,486
10,808
-0,193
-0,212
-0,157
-0,637
10,540
-0,458
0,006
0,000
0,017
10,271
-0,723
0,038
0,076
0,117
9,734
-1,254
0,309
0,248
1,021
9,197
-1,784
0,108
0,157
0,403
1 Case Critical Value for Studentised Residual (alpha = 0.05)
All Cases Critical Value for Studentised Residual (alpha = 0.05)
Residuals vs Pred Ln UFC/ml
0,8
0,6
0,6
0,4
0,4
Residuals
0,8
0,2
0,0
-0,2
0,2
0,0
-0,2
-0,4
-0,6
-1,0
-0,4
-0,6
-0,5
0,0
0,5
1,0
0
Normal Distribution
5
14
12
10
8
6
4
2
0
0
10
Predicted Ln UFC/ml
Scatter Plot
Ln UFC/ml
Residuals
Normal Prob. Plot
Stu.
Residual
2,597
1,324
-1,520
-1,127
-0,778
-0,464
-0,615
0,016
0,110
1,024
0,384
2,306
3,900
100
200
300
Tiempo(min)
400
15
10.3 Análisis estadístico de los resultados obtenidos de los
recuentos de levaduras en el Montaje Numero 3.
Linear Regression Results for:
Y = Hoja3!$C$2:$C$13
X = Hoja3!$A$2:$A$13
Descriptive Statistics
Variable
Ln UFC/ml
Minutos
Mean
Std Dev.
N
10,912
1,081
11
158,182
113,121
11
Pearson Correlations
Ln
UFC/ml Tiempo(min)
Ln UFC/ml
1,000
-0,958
Tiempo(min)
-0,958
1,000
Significance for Pearson Correlations
Ln
UFC/ml Tiempo(min)
Ln UFC/ml
0,000
Tiempo(min)
0,000
-
Summary
2
R
0,919
ANOVA
Source
Regression
Residual
Total
R
0,958
Sum Sq.
10,726
0,951
11,677
2
Adj. R
0,910
D.F.
1
9
10
Regression
Coefficients
Source
Coefficient
Intercept
12,360
Minutos
-0,009
Std Error
0,174
0,001
Residuals
Pred Y
Residual
Std Pred
S.E. of
Estimate
0,325
Mean Sq.
10,726
0,106
Std Beta
-0,958
Pred Norm
F
101,510
Prob.
0,000
-95% C.I.
11,967
-0,011
+95% C.I.
12,754
-0,007
Std
Stu.
t
71,045
-10,075
Prob.
0,000
0,000
Y
Res
Residual
12,360
1,398
0,588
0,521
2,141
12,086
1,133
0,303
0,338
1,054
11,811
0,868
-0,437
-0,521
-1,473
11,536
0,603
-0,311
-0,338
-1,024
11,262
0,338
-0,293
-0,231
-0,953
10,987
0,072
-0,147
-0,146
-0,475
10,712
-0,193
-0,141
-0,071
-0,456
10,438
-0,458
-0,003
0,000
-0,011
10,163
-0,723
0,112
0,146
0,373
9,614
-1,254
0,290
0,231
1,028
9,064
-1,784
0,041
0,071
0,163
1 Case Critical Value for Studentised Residual (alpha = 0.05)
All Cases Critical Value for Studentised Residual (alpha = 0.05)
Residuals vs Pred Ln UFC/ml
0,8
0,6
0,6
0,4
0,4
Residuals
0,8
0,2
0,0
-0,2
-0,4
-0,6
-1,0
0,2
0,0
-0,2
-0,4
-0,6
-0,5
0,0
0,5
1,0
0
Normal Distribution
5
14
12
10
8
6
4
2
0
0
10
Predicted Ln UFC/ml
Scatter Plot
Ln UFC/ml
Residuals
Normal Prob. Plot
Residual
2,880
1,062
-1,594
-1,027
-0,947
-0,454
-0,435
-0,011
0,354
1,032
0,154
2,306
3,900
100
200
300
Tiempo(min)
400
15
10.4 Análisis estadístico de los resultados obtenidos de los
promedios de los recuentos de levaduras.
Linear Regression Results for:
Y = Hoja1!$G$3:$G$14
X = Hoja1!$F$3:$F$14
Descriptive Statistics
Variable
Ln UFC/ml
Tiempo(min)
Mean
Tiempo(min)
N
10,933
1,073
11
158,182
113,121
11
Pearson Correlations
Ln
UFC/ml
Ln UFC/ml
Std Dev.
Tiempo(min)
1,000
-0,959
-0,959
1,000
Significance for Pearson Correlations
Ln
UFC/ml Tiempo(min)
Ln UFC/ml
0,000
Tiempo(min)
0,000
-
Summary
2
R
0,919
ANOVA
Source
Regression
Residual
Total
R
0,959
Sum Sq.
10,571
0,933
11,504
2
Adj. R
0,910
D.F.
1
9
10
Regression
Coefficients
Source
Coefficient
Intercept
12,371
Tiempo(min)
-0,009
Std Error
0,172
0,001
Residuals
Pred Y
Residual
Std Pred
S.E. of
Estimate
0,322
Mean Sq.
10,571
0,104
Std Beta
-0,959
Pred Norm
F
101,928
Prob.
0,000
-95% C.I.
11,981
-0,011
+95% C.I.
12,761
-0,007
Std
Stu.
t
71,775
-10,096
Prob.
0,000
0,000
Y
Res
Residual
12,371
1,398
0,569
0,516
2,093
12,098
1,133
0,318
0,335
1,117
11,825
0,868
-0,444
-0,516
-1,510
11,553
0,603
-0,332
-0,335
-1,103
11,280
0,338
-0,251
-0,228
-0,821
11,007
0,072
-0,136
-0,070
-0,442
10,735
-0,193
-0,172
-0,144
-0,561
10,462
-0,458
0,020
0,000
0,066
10,189
-0,723
0,108
0,144
0,364
9,644
-1,254
0,276
0,228
0,988
9,099
-1,784
0,043
0,070
0,172
1 Case Critical Value for Studentised Residual (alpha = 0.05)
All Cases Critical Value for Studentised Residual (alpha = 0.05)
Residuals vs Pred Ln UFC/ml
0,8
0,6
0,6
0,4
0,4
Residuals
0,8
0,2
0,0
-0,2
0,2
0,0
-0,2
-0,4
-0,4
-0,6
-0,5
0,0
0,5
0
1,0
5
Scatter Plot
14
12
10
8
6
4
2
0
0
10
Predicted Ln UFC/ml
Normal Distribution
Ln UFC/ml
Residuals
Normal Prob. Plot
-0,6
-1,0
Residual
2,754
1,134
-1,648
-1,118
-0,805
-0,421
-0,539
0,062
0,345
0,987
0,163
2,306
3,900
100
200
300
Tiempo(min)
400
15
10.5 Análisis estadístico de los resultados obtenidos de los
recuentos de bacterias ácido lácticas en el Montaje Numero 1.
Linear Regression Results for:
Y = Hoja4!$C$2:$C$13
X = Hoja4!$A$2:$A$13
Descriptive Statistics
Variable
Mean
Std Dev.
N
ln UFC/ml
10,883
0,918
11
MINUTOS
158,182
113,121
11
Pearson Correlations
ln UFC/ml
Tiempo(min)
ln UFC/ml Tiempo(min)
1,000
-0,983
-0,983
1,000
Significance for Pearson Correlations
ln UFC/ml Tiempo(min)
ln UFC/ml
0,000
Tiempo(min)
0,000
-
Summary
R2
0,966
ANOVA
Source
Regression
Residual
Total
R
0,983
Sum Sq.
8,140
0,289
8,429
Adj. R2
0,962
D.F.
1
9
10
Regression
Coefficients
Source
Coefficient
Intercept
12,144
MINUTOS
-0,008
Std Error
0,096
0,001
Residuals
Pred Y
Residual
Std Pred
S.E. of
Estimate
0,179
Mean Sq.
8,140
0,032
Std Beta
-0,983
Pred Norm
F
253,149
Prob.
0,000
-95% C.I.
11,927
-0,009
+95% C.I.
12,361
-0,007
Std
Stu.
t
126,543
-15,911
Prob.
0,000
0,000
Y
Res
Residual
12,144
1,398
0,324
0,288
2,140
11,905
1,133
-0,130
-0,127
-0,819
11,666
0,868
-0,269
-0,288
-1,645
11,426
0,603
-0,112
-0,080
-0,669
11,187
0,338
0,038
0,039
0,224
10,948
0,072
0,149
0,187
0,874
10,709
-0,193
0,131
0,127
0,767
10,469
-0,458
-0,035
0,000
-0,209
10,230
-0,723
-0,144
-0,187
-0,870
9,752
-1,254
-0,071
-0,039
-0,458
9,273
-1,784
0,120
0,080
0,867
1 Case Critical Value for Studentised Residual (alpha = 0.05)
All Cases Critical Value for Studentised Residual (alpha = 0.05)
Residuals vs Pred ln UFC/ml
0,4
0,3
0,3
0,2
0,2
Residuals
0,4
0,1
0,0
-0,1
-0,2
0,1
0,0
-0,1
-0,2
-0,3
-0,2
0,0
0,2
0
0,4
5
Scatter Plot
14
12
10
8
6
4
2
0
0
10
Predicted ln UFC/ml
Normal Distribution
ln UFC/ml
Residuals
Normal Prob. Plot
-0,3
-0,4
Residual
2,879
-0,802
-1,855
-0,647
0,212
0,862
0,748
-0,197
-0,857
-0,437
0,854
2,306
3,900
100
200
300
Tiempo(min)
400
15
10.6 Análisis estadístico de los resultados obtenidos de los
recuentos de bacterias ácido lácticas en el Montaje Numero 2.
Linear Regression Results for:
Y = Hoja5!$C$2:$C$13
X = Hoja5!$A$2:$A$13
Descriptive Statistics
Variable
ln UFC/ml
Tiempo
(min)
Mean
Std Dev.
N
11,025
0,908
11
158,182
113,121
11
Pearson Correlations
ln UFC/ml
Tiempo
(min)
ln UFC/ml Tiempo(min)
1,000
-0,981
-0,981
1,000
Significance for Pearson Correlations
ln UFC/ml Tiempo(min)
ln UFC/ml
0,000
Tiempo
(min)
0,000
-
Summary
R2
0,962
ANOVA
Source
Regression
Residual
Total
R
0,981
Sum Sq.
7,931
0,313
8,244
Regression
Coefficients
Source
Coefficient
Intercept
12,270
Tiempo
(min)
-0,008
Adj. R2
0,958
D.F.
1
9
10
Std Error
0,100
0,001
S.E. of
Estimate
0,186
Mean Sq.
7,931
0,035
Std Beta
-0,981
F
228,066
Prob.
0,000
-95% C.I.
12,044
+95% C.I.
12,496
t
122,939
Prob.
0,000
-0,009
-0,007
-15,102
0,000
Residuals
Std Pred
Pred Norm
Std
Y
Res
Residual
Pred Y
Residual
12,270
1,398
0,341
0,299
2,167
12,034
1,133
0,067
0,041
0,405
11,798
0,868
-0,358
-0,299
-2,100
11,562
0,603
-0,177
-0,194
-1,014
11,326
0,338
-0,023
-0,041
-0,132
11,089
0,072
0,081
0,132
0,456
10,853
-0,193
0,080
0,084
0,451
10,617
-0,458
-0,046
-0,084
-0,260
10,381
-0,723
-0,072
-0,132
-0,416
9,908
-1,254
-0,005
0,000
-0,030
9,436
-1,784
0,111
0,194
0,773
1 Case Critical Value for Studentised Residual (alpha = 0.05)
All Cases Critical Value for Studentised Residual (alpha = 0.05)
Residuals vs Pred ln UFC/ml
0,4
0,3
0,3
0,2
0,2
Residuals
0,4
0,1
0,0
-0,1
0,1
0,0
-0,1
-0,2
-0,2
-0,3
-0,3
-0,4
-0,2
0,0
0,2
0
0,4
5
Scatter Plot
14
12
10
8
6
4
2
0
0
10
Predicted ln UFC/ml
Normal Distribution
ln UFC/ml
Residuals
Normal Prob. Plot
-0,4
-0,4
Stu.
Residual
2,953
0,385
-2,771
-1,015
-0,124
0,435
0,430
-0,246
-0,396
-0,029
0,754
2,306
3,900
100
200
300
Tiempo(Min)
400
15
10.7 Análisis estadístico de los resultados obtenidos de los
recuentos de bacterias ácido lácticas en el Montaje Numero 3.
Linear Regression Results for:
Y = Hoja6!$C$2:$C$13
X = Hoja6!$A$2:$A$13
Descriptive Statistics
Variable
Mean
Std Dev.
N
ln UFC/ml
10,911
0,955
11
MINUTOS
158,182
113,121
11
Pearson Correlations
ln UFC/ml
Tiempo(min)
ln UFC/ml Tiempo(min)
1,000
-0,985
-0,985
1,000
Significance for Pearson Correlations
ln UFC/ml Tiempo(min)
ln UFC/ml
0,000
Tiempo(min)
0,000
-
Summary
R2
0,970
ANOVA
Source
Regression
Residual
Total
R
0,985
Sum Sq.
8,852
0,275
9,126
Regression
Coefficients
Source
Coefficient
Intercept
12,226
MINUTOS
-0,008
Residuals
Adj. R2
0,967
D.F.
1
9
10
Std Error
0,094
0,000
S.E. of
Estimate
0,175
Mean Sq.
8,852
0,031
Std Beta
-0,985
F
290,018
Prob.
0,000
-95% C.I.
12,015
-0,009
+95% C.I.
12,438
-0,007
t
130,762
-17,030
Prob.
0,000
0,000
Std Pred
Pred Norm
Std
Y
Res
Residual
Pred Y
Residual
12,226
1,398
0,316
0,280
2,142
11,977
1,133
-0,059
-0,078
-0,380
11,727
0,868
-0,320
-0,280
-2,005
11,478
0,603
-0,139
-0,182
-0,854
11,228
0,338
-0,017
-0,038
-0,100
10,979
0,072
0,163
0,182
0,978
10,729
-0,193
0,050
0,078
0,298
10,480
-0,458
0,039
0,038
0,235
10,230
-0,723
0,010
0,000
0,059
9,731
-1,254
-0,116
-0,124
-0,763
9,232
-1,784
0,073
0,124
0,546
1 Case Critical Value for Studentised Residual (alpha = 0.05)
All Cases Critical Value for Studentised Residual (alpha = 0.05)
Residuals vs Pred ln UFC/ml
0,4
0,3
0,3
0,2
0,2
Residuals
0,4
0,1
0,0
-0,1
0,1
0,0
-0,1
-0,2
-0,2
-0,3
-0,3
-0,4
-0,2
0,0
0,2
0
0,4
5
Scatter Plot
14
12
10
8
6
4
2
0
0
10
Predicted ln UFC/ml
Normal Distribution
ln UFC/ml
Residuals
Normal Prob. Plot
-0,4
-0,4
Stu.
Residual
2,883
-0,361
-2,542
-0,840
-0,095
0,976
0,282
0,223
0,056
-0,744
0,523
2,306
3,900
100
200
300
Tiempo(min)
400
15
10.8 Análisis estadístico de los resultados obtenidos del promedio
de los recuentos de bacterias ácido lácticas.
Linear Regression Results for:
Y = Hoja2!$G$4:$G$15
X = Hoja2!$F$4:$F$15
Descriptive Statistics
Variable
Ln UFC/ml
Tiempo(min)
Mean
Tiempo(min)
N
10,943
0,925
11
158,182
113,121
11
Pearson Correlations
Ln
UFC/ml
Ln UFC/ml
Std Dev.
Tiempo(min)
1,000
-0,984
-0,984
1,000
Significance for Pearson Correlations
Ln
UFC/ml Tiempo(min)
Ln UFC/ml
0,000
Tiempo(min)
0,000
-
Summary
R2
0,968
ANOVA
Source
Regression
Residual
Total
R
0,984
Sum Sq.
8,285
0,273
8,558
Regression
Coefficients
Source
Coefficient
Intercept
12,215
Tiempo(min)
-0,008
Adj. R2
0,965
D.F.
1
9
10
Std Error
0,093
0,000
S.E. of
Estimate
0,174
Mean Sq.
8,285
0,030
Std Beta
-0,984
F
273,392
Prob.
0,000
-95% C.I.
12,005
-0,009
+95% C.I.
12,426
-0,007
Std
Residual
Stu.
Residual
Residuals
Pred Y
Std Pred
Y
Residual
Pred Norm
Res
t
131,107
-16,535
Prob.
0,000
0,000
12,215
1,398
0,327
0,279
2,225
11,974
1,133
-0,034
-0,038
-0,218
11,733
0,868
-0,318
-0,279
-1,998
11,491
0,603
-0,145
-0,181
-0,890
11,250
0,338
-0,003
0,038
-0,015
11,008
0,072
0,129
0,181
0,775
10,767
-0,193
0,086
0,078
0,517
10,526
-0,458
-0,016
0,000
-0,097
10,284
-0,723
-0,068
-0,124
-0,424
9,801
-1,254
-0,060
-0,078
-0,400
9,319
-1,784
0,101
0,124
0,758
1 Case Critical Value for Studentised Residual (alpha = 0.05)
All Cases Critical Value for Studentised Residual (alpha = 0.05)
Residuals vs Pred Ln UFC/ml
0,4
0,3
0,3
0,2
0,2
Residuals
0,4
0,1
0,0
-0,1
-0,2
-0,3
-0,4
-0,4
0,1
0,0
-0,1
-0,2
-0,3
-0,4
-0,2
0,0
0,2
0,4
0
Normal Distribution
5
14
12
10
8
6
4
2
0
0
10
Predicted Ln UFC/ml
Scatter Plot
Ln UFC/ml
Residuals
Normal Prob. Plot
3,128
-0,206
-2,525
-0,878
-0,014
0,757
0,495
-0,092
-0,404
-0,381
0,739
2,306
3,900
100
200
300
Tiempo(min)
400
15
ANEXO 11
INTERPRETACION DEL ANALISIS ESTADISTICO
•
La primera tabla muestra las estadísticas descriptivas (Media y
desviación estándar) tanto para la variable dependiente (UFC/ml)
como para la independiente (tiempo) y el número de datos que forman
parte del análisis estadístico.
•
La siguiente tabla muestra el Coeficiente de Correlación Pearson para
cada par posible de valores de las variables dependiente e
independiente. Estos valores pueden variar desde –1 a 1. Un valor de
–1 indica una CORRELACION LINEAL NEGATIVA PERFECTA
(Mientras la variable independiente aumenta, la variable dependiente
disminuye en una forma lineal consistente); por consiguiente un valor
de 1 indica una CORRELACION LINEAL POSITIVA PERFECTA
(Mientras la variable independiente aumenta, la variable dependiente
aumenta en una forma lineal consistente). La tabla siguiente indica la
Significancia del Coeficiente de Correlación de Pearson precedente;
los valores menores a 0.05 en esta tabla sugieren una fuerte relación
entre las variables que difícilmente puede verse afectada.
•
En la tabla Resumen se presenta el valor R2 para el modelo de
regresión lineal. R2 o Coeficiente de Determinación; es la fracción de
la variación en la variable dependiente (y) que es explicada por la
variación en la variable independiente (x) y su rango va desde 0 (No
se explica la variación) hasta 1 (Variación totalmente explicada).
•
ANÁLISIS DE VARIANZA (ANOVA): Con frecuencia el problema de
analizar la calidad de la línea de regresión se maneja a través de un
enfoque de análisis de varianza. El análisis de varianza dentro de los
resultados de la regresión evalúa la hipótesis de si existe relación
entre la variable dependiente y la independiente.
•
La columna Cuadrados Medios informa la medida de la variación
asociada a la variable dependiente que es explicada por la variable
independiente (Cuadrado Medio de la Regresión) y el nivel de
variación que no es explicado por la variable independiente (Cuadrado
Medio de Residuales). Al realizar la división de estos dos valores se
obtiene en Valor F, que es el estadístico de prueba usado para evaluar
la significancía del modelo de regresión. Un valor grande de F significa
que la variación explicada es mucho mayor que la variación no
explicada, sugiriendo que la variable independiente es un predictor
significativo de la variable dependiente. En la última columna del
ANOVA, se presenta el valor de Probabilidad P; este se evalúa
teniendo en cuenta que un valor P menor que 0.05 se toma
usualmente como fuerte indicador.
•
Por último y cumpliendo con el objetivo de la Regresión Lineal se
presentan los Coeficientes de Regresión con los cuales se construye
la línea de regresión del sistema de datos. En el caso del primer
montaje de las levaduras, la línea de regresión estimada es:
ln y = -0.009x + ln 12,331
•
El gráfico de residuales es útil para determinar si los residuales reúnen
uno de los requisitos del modelo de regresión lineal: Que estos estén
distribuidos normalmente. Los residuales normalmente distribuidos
deben caer a lo largo de la línea continua.
•
Grafico de Residuales versus Valor esperado por el cálculo
de
regresión.
•
Grafica de dispersión: correspondiente a la dispersión de los datos y la
línea de regresión correspondiente.