avances en el diagnóstico de la enfemedad de carrion - BVS-INS

AVANCES EN EL DIAGNÓSTICO DE
LA ENFEMEDAD D E CARRION
Gladys Ventura
AVANCES EN EL
DIAGNOSTICO DE
LA ENFERMEDAD
DE CARRION
Bartonella bacilliformis
ORDEN:
FAMILIA:
GENERO:
ESPECIE :
Rickettsiales
Bartonellaceae
Bartonella
bacilliformis
• Bacteria pleomorfica, Gram. negativa
• Mide aproximadamente 3 micras de
largo y 0.25 a 0.3 micras de diámetro
• B. bacilliformis presenta flagelo, mientras
que B. quintana y B hensenlae presentan pilli
DIAGNOSTICO DE LA
ENFERMEDAD DE CARRION
DIAGNOSTICO DIRECTO
AISLAMIENTO DEL AGENTE ETIOLOGICO
DIAGNOSTICO
Bacteriológico
Frotis Sanguíneo
Cultivos
 Molecular
DIAGNOSTICO DIRECTO:
FROTIS SANGUINEO
Caracterización
Bacteriológica
 Aislamiento del agente
etiológico
Tiempo Desarrollo
Tº Crecimiento
Nutrientes
pH
colonias
• Bartonella
bacilliformis como
todas las células
contiene ácidos
nucleicos dentro de
su estructura.
TIPIFICACION
PCR - RFLP
Carril 1 : Marcador de Peso
300 pb
180 pb
Molecular, carril 2 :
Producto de amplificación
del gen citrato sintetasa,
carril 3 : Digestión del
producto de amplificación
con TaqI, carril 4 : Digestión
del producto de
amplificación con HinfI
80 pb
150 pb
50 pb
Bartonella henselae
Carril 1 : Marcador de
Peso Molecular, carril 2 :
Producto de amplificación
280
del gen citrato sintetasa,
carril 3 : Digestión del
producto de amplificación
170
140
con TaqI, carril 4 :
Digestión del producto de
amplificación con HinfI
70
100
SECUENCIAMIENTO
• Diversidad Genética de
B bacilliformis
SITUACION ACTUAL
El diagnóstico se basa principalmente en el examen
directo de frotis, sin embargo éste presenta baja
sensibilidad.
Las pruebas serológicas presentan el mismo
problema de sensibilidad y adicionalmente baja
especificidad.
Por otro lado, el desarrollo de este microorganismo
in Vitro es muy lento (5 a 45 días).
Es necesario tener una método de diagnóstico rápido
de alta sensibilidad y especificidad.
PCR para la detección de B bacilliformis en muestra
de sangre.
PCR
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es
una prueba moderna de diagnóstico consiste en la
amplificación específica de fragmentos de ADN de
los patógenos mediante el uso de ADN polimerasa
termoestables in vitro,.
Existe varios PCR propuestas para el diagnóstico de
la Bartonelosis:
• Amplificación del gen citrato sintetasa (gtlA)
• del gen de la proteína de división celular FtsZ
• del gen 16S rRNA
• del gen de la riboflavina ribC
•del gen que codifica a la proteína de estrés
térmico de 60 kDa
Sin embargo, estas no están diseñadas para el
diagnóstico específico de la Bartonellosis por B.
bacilliformis en muestras clínicas.
Diseño de Primers
Locus de invasión ialAB
Mapa del locus ialAB y ubicación de los primers diseñados.
Las flechas representan la parte codante de los factores de
invasión ial e indican la orientación de los genes.
MUESTRAS
• 200 uL de sangre con anticoagulante EDTA
o una gota de sangre impregnada en papel filtro
PURIFICACION DE LAS MUESTRAS
• usando kit basado en columnas de silica
Etapa de la purificación:
1. Lisis de la muestra (proteinasa K, detergentes)
2. Unión del ADN a las columnas de silica
3. Lavado contaminantes de las columnas
4. Obtención del ADN
Se añade 2 mL de esta purificación a cada reacción
de PCR
COMPONENTES DEL PCR
•Buffer de amplificación
•Nucleótidos
•Cloruro de Magnesio
•Primer o iniciadores
•DNA Polimerasa termoestable
•ADN a amplificarse
Procedimiento para realizar PCR
Área limpia
•Almacenamiento de reactivos de PCR
•Preparación de mezcla madre y tubos de reacción
Área semi-sucia
•Extracción de ADN de la muestra
•Incorporación de ADN a tubos de reacción
•Colocar tubos de reacción en termociclador
Área sucia
•Electroforesis de productos de amplificación en
geles de agarosa
•Tinción de geles de agarosa
•Visualización bajo luz ultravioleta
Condiciones de amplificación:
•La temperatura óptima de hibridación de los
oligonucleótidos fue 49 °C
•Los ciclos de temperatura para la amplificación
óptima fueron:
1.Denaturación inicial a 95°C por 10 minutos,
2. 35 Ciclos:
Denaturación a 95°C por 30 segundos
Hibridación a 49°C por 30 segundos
Extensión a 72°C por 45 segundos
3.Extensión final de 72°C por 5 minutos.
SENSIBILIDAD
ESPECIFICIDAD DEL PCR
PM
1
2
3
4
620 pb
 Especificidad de PCR con primers dirigidos al gen ialB. Carril 1:
B. bacilliformis, carril 2: B. hensenlae, carril 3: B. vinsonii, y carril
4: control negativo. PM marcador de peso molecular
/HindIII/EcoRI.
RESULTADOS
Se evaluaron: Muestras de pacientes con síntomas
compatibles a bartonellosis provenientes de áreas
endémicas y muestras de personas sanas
provenientes de áreas no endémica.
50 muestras de sangre positivas al cultivo o frotis
80 muestras de sangre negativas al cultivo o frotis
RESULTADOS
•Especificidad: no amplifican B. hensenlae, B. vinsonii,
Rickettsia, Vibrio, Salmonella, Shigella y E. coli.
Su sensibilidad diagnóstica evaluada de manera
preliminar alcanza a detectar el 100% de muestras
con frotis positivo o cultivo positivo (50 muestras
pacientes con síntomas compatibles con bartonelosis y
80 negativas)
•Sensibilidad diagnóstica: 3 genomas.
En el estudio de validación se detecta el triple de
casos que frotis y cultivo.
PCR :VENTAJAS
• Resultados en 48 h
• Útil en caso de brotes
• Costo aceptable
EL ROL DEL CNSP- INS
FORTALECIMIENTO
CONTROL DE CALIDAD
SUPERVISION
VIGILANCIA
INVESTIGACION
REGIONES ENDEMICAS DE LA ENFERMEDAD
DE CARRIÒN
1
9
Frotis
Cultivo
FUENTE:
FUENTE: CNSP / INS
CONTROL CALIDAD LAMINAS
CONCORDANCIA DEL DIAGNOSTICO
DIRECTO 2003
100
100
97
80
60
47.2
40
BAGUA (I, II,
III, IV)
ANCASH (IV)
LA LIBERTAD
(IV)
10
LA LIBERTAD
(III)
0
9.2
LA LIBERTAD
(II)
20
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
98
PIURA (III)
MA DRE DE DIO S
( III)
CHA CHA PO Y A S
(I, II)
87.2
LA MBA Y EQ UE
(I,II)
99.2 97.2 100 99.1 100 99.2 100
LA LIBERTA D ( II)
90
LA LIBERTA D ( I)
A NCA SH (III)
A NCA SH ( II)
A NCA SH ( I)
BAG UA (III)
BA G UA ( II)
BA G UA ( I)
JA EN ( II)
J AEN ( I)
CONTROL CALIDAD LAMINAS
CONCORDANCIA DEL DIAGNOSTICO
DIRECTO 2004
92
98
71.3
57.1
CAPACITACION DE LABORATORIOS DE
LA RED
REGION
1998
1999
LIMA-SUR
X
ANCASH
X
CUSCO
X
2000
2001
2002
X
X
PIURA
X
JUNIN
X
HUANUCO
X
AYACUCHO
X
2003
2004
X
X
X
CAJAMARCA
X
X
LA LIBERTAD
X
X
LAMBAYEQUE
X
X
SAN MARTIN
X
AMAZONAS
X
IQUITOS
X
MADRE DE DIOS
X