Repaso de PCR y qPCR 1. Los siguientes oligonucleótidos se

Repaso de PCR y qPCR
1. Los siguientes oligonucleótidos se utilizaron para amplificar una región específica de DNA
o RNA, el diseño es variable de acuerdo a el propósito de los oligonucleótidos, a
continuación se da una lista de los posibles uso para los que fueron diseñados estos
oligonucleótidos con su respectiva representación.
a. Amplificación del marco de lectura
b. PCR anidada
c. PCR cuantitativa (tiempo real)
d. Retro transcripción ( paso de RNA a CDNA)
e. Síntesis de cDNA (representativo solo de la expresión de mRNA) a partir de RNA total
f.
Detección de mutaciones
2. Se ha realizado una estrategia de amplificación para verificar si el producto de interés (gen x) se
encuentra o no en los sujetos a estudiar, se sabe que el producto tiene un peso de 200 kb. Se
cuenta con un control positivo y negativo (carril 7 y 6 respectivamente), al realizar el análisis del
producto de amplificación (vía electroforesis en gel) se observó que las muestras 2, 3 y 4 son
positivas y si es perceptible alguna diferencia entre ellas siendo la más positiva la muestra 3 y 4, los
carriles 1 y 8 son lo marcadores de peso molecular.
+
++
+++
3. Las siguientes son dos representaciones de los métodos de detección para la PCR en tiempo real
Sondas TaqMan (fluorocromo unido a una molécula que mantiene retenida “roba” la
fluorescencia)
Alineamiento de la sonda y primers
Amplificación
Detección con materiales intercalantes en el producto de PCR (en el surco menor de la doble
hebra de DNA)
Alineamiento de la sonda y primers
Amplificación
4. En la siguiente grafica se muestran las curvas de amplificación de un ensayo de qPCR, las
muestras cuya curva comienza a hacerse visible a ciclos tempranos son las que cuentan con
mayores niveles de expresión. Si analizamos el grafico, la curva en color vino es la que posee
mayor cantidad de mRNA (se señala con una flecha) y la curva en verde es la que cuenta con
menor nivel de expresión (señalado con una estrella)
5. El siguiente resultado muestra la expresión genética de los genes CYP2C11 y CYP2E1 en
presencia del isoproterenol, la expresión de ambos genes en diferentes tejidos sin el efecto del
isoproterenol es decir la expresión normal es tomado como control y relativizado (normalizado) a
un valor de 1, el gen que se usó como expresión de referencia es el GAPDH; la expresión de ambos
genes es subexpresada en presencia de isoproterenol, de igual forma se observa para ambos
genes una ligera disminución en pulmón pero sin ser significativa, en hígado CYP2C11 disminuye
ligeramente, mientras que CYP2E1 aumenta ligeramente, ninguna de las dos modulaciones es
significativa, mientras que en riñon en presencia de isoproterenol ambos genes se sobreexpresan
siendo mas evidente y significativo CYP2E1
6. En la siguiente grafica se demuestra la expresión normalizada (control se relativizo con un valor
de 1) de varios genes, en la gráfica C representa la expresión control y E la expresión problema. Se
enlistan a continuación los sobre y sub expresados
Sobrexpresados: B-crystallin, MAFB, Prox-1
Subexpresados: Delta-1, a-crystalli, g-criystallin, Sox2, Sox1
Pax 6 tiene una expresión igual tanto en el control como en el problema
7. la siguiente grafica también es una representación de la expresión genética de cierto mRNA,
debido a que la expresión relativa se realizó mediante el análisis de ΔCP (CP del gen problema – CP
del gen de referencia), la muestra que tiene mayor expresión es la muestra N, debemos recordad
que el valor de ΔCP es inversamente proporcional al nivel de expresión, es decir a menor valor
numérico mayor expresión y a mayor numérico menor expresión.
Adicionalmente favor de repasar los conceptos de PCR, cuales son los requisitos para realizarla.
La PCR se basa en el mecanismo de la replicación in vivo del ADN: el ADN bicatenario se desenrolla
y pasa a ADN monocatenario, se duplica y se vuelve a enrollar.
Esta técnica consiste en ciclos repetitivos de:
1. Desnaturalización: la hebra molde se abre y se forman dos hebras monocatenarias, este
proceso se logra por medio del rompimiento de los puentes de hidrogeno formados entra
ambas hebras utilizando una temperatura de 93 -96 °C. Como resultado tendremos una gran
cantidad de bases nucleotidicas desapareadas (en un sistema in-vitro este paso se realiza
con ayuda de las helicasas)
2. La re hibridación de las hebras de ADN y los cebadores se logra a una temperatura de 55
a 65°C, en esta etapa se forman y rompen diverso puentes de hidrogeno pero perduran los
que se encuentren mas estables (que el apareamiento de las bases corresponda con
exactitud), en estos fragmentos de ADN bicatenario es donde se puede fijar la polimerasa.
(los primers tiene como equivalente en el proceso in-vivo a los pequeños primers de RNA
que se sintetizan por la RNA primasa para que en estos sitios se una la polimerasa)
3. Extensión: La polimerasa va elongando el extremo 3´del cebador añadiendo nucleótidos
complementarios a la hebra molde, este paso se realiza a una temperatura de 72°C y el
tiempo dependerá de la longitud del fragmento a elongar, tomando en cuenta que se
añaden 25 b por segundo, en este paso es cuando se unen los nucleótidos (dNTPs), esto lo
realiza la polimerasa que debemos recordar que existen muchos tipos de polimerasas de
alta o baja fidelidad dependiendo de su taza de error, polimerasas que tienen actividad a
temperatura de 37°C o que se activan a altas temperaturas ya que han sido modificadas al
agregarles un anticuerpo bloqueador del sitio de actividad enzimática, modificadas
químicamente o uniendo la enzima Taq a perlas de cera.
Los requerimientos son:
1. DNA molde
2. dNTPs (citosina, guanina, adenina, timina)
3. Oligonucleótidos: secuencias cortas de nucleótidos, diferentes entre si y complementarios
al sitio de reconocimiento del ADN que desea amplificarse
4. Magnesio /Buffer/agentes desestabilizantes
5. Enzima Taq Polimerasa: la polimerasa es una enzima aislada de la bacteria Thermus
aquaticus, esta enzima se active a altas temperaturas. Tambien existen las enzimas Pfu
polimerasa, aislada de la bacteria Pyrococcus furiosus.