Laboratorio PCR y diseno primers
Anuncio
PCR PCR • Técnica inventada por Kary Mullis :1987 • Premio Nobel 1993 • Amplifica una ÚNICA secuencia a partir de una mezcla compleja de ADN Aprovecha los requerimientos de la replicación • • • • Templete ADN Nucleótidos Primers (Imprimadores) Polimerasa Primers Se debe tener información de la secuencia que rodea el fragmento de interés Primers dan especificidad a la reacción, delimitan región a amplificar 6-40 nucléotidos Usualmente 18-22 A no más de 4 kb uno de otro Primers •2 primers: complementarios a bandas opuestas •Deben estar en exceso Para realizar la técnica se necesitan: • dNTPs • Dos cebadores (o primers) • Iones divalentes. Se suele usar magnesio (Mg2+), agregado comúnmente como cloruro de magnesio (MgCl2), Actúan como cofactores de la polimerasa. • Una solución tampón o buffer que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN polimerasa. • ADN polimerasa (la más común es la Taq polimerasa). • ADN molde • Termociclador Ciclos 20 a 35 ciclos de: 1. Desnaturalización: 94-96° 5‘ 3‘ 3‘ 5‘ 5‘ 3‘ 3‘ 5‘ 2. Annealing 50-65° 5‘ 3‘ 3‘ 5‘ 3. Elongación 72°C 5‘ 3‘ 3‘ 5‘ Ciclo completo de PCR Tamaño definido Clave para facilidad proceso: polimerasa • Debe ser termoestable • Thermus aquaticus, una bacteria Desventajas de la Taq • No corrige errores • 1 error en 2 x 104 bases • Nuevas polimerasas cometen menos errores Termociclador Templete para PCR • • • • • Se pueden usar bajas cantidades En teoría: una sola molécula No se debe aislar la secuencia de interés No debe ser muy puro ADN es una molécula muy estable en ausencia de nucleasas A partir de: • • • • • • Sangre Semen Pelo Mucosa bucal Uñas Cepillo dientes Cuidado con PCR • Es tan sensible que se debe evitar la contaminación Resolución de problemas de PCR http://bitesizebio.com/articles/the-essential-pcrtroubleshooting-checklist/ Primers Características importantes de un primer • Longitud • Tm Tm Temperatura de “melting”, separación, fusión – la temperatura a la que la mitad de las hebras de ADN son simple banda y la mitad son doble banda. Entre más GC más alta Tm. Cálculos: Menos de 13: Tm= (wA+xT) * 2 + (yG+zC) * 4 Más largo de 13: Tm= 64.9 +41*(yG+zC-16.4)/(wA+xT+yG+zC) Programas usan fórmulas modificadas más exactas. Consideran concentración de sales, de iones, etc Características de un buen primer • Tm en el rango de 52°C a 65°C. Idealmente ambos primers con Tm parecida. • Que no sean capaces de dimerizar • Ausencia de formación de horquillas • Falta de sitios secundarios de unión Unión única Secuencia debe ser única en el ADN templete No debe existir annealing en posibles fuentes contaminantes (humano, rata, ratón). Se logra haciendo BLAST o BLAT con el genoma correspondiente 5’...TCAACTTAGCATGATCGGGTA...GTAGCAGTTGACTGTACAACTCAGCAA...3 ’ CAGTCAACTGCTAC TGCTAAGTT G Primer candidato 2 5’-CAGTCAACTGCTAC-3’ No único! Único! A TGCT AGTTG Primer candidato 1 5’-TGCTAAGTTG-3’ Longitud del primer • En términos generales: ▫ ▫ ▫ ▫ Entre más largo más específico Entre más largo más alta Tm y temp annealing Por lo menos 15pb de longitud Por lo general 17-28pb ▫ Caso especial: mutagénesis dirigida. Longitud: 2545pb Temperatura de Annealing Temperatura de Annealing, Tanneal – temperatura a la que los primers se unen al molde de ADN. Se puede calcular a partir de Tm . Ta Opt = 0.3 x (Tm de primer) + 0.7 x (Tm del producto) - 25 Tm del primer: es la Tm del primer que tenga la más baja Estructura Interna Unión de primer con él mismo, o con el otro primer antes que con el molde: disminuye eficiencia Podría no ser tan importante si la temperatura de annealing no los deja formarse. Algunos dímeros y horquillas se forman a 30°C. Pareja de primers debe “calzar” • Primers funcionan en parejas • Se usan en la misma reacción de PCR: las condiciones deben ser adecuadas para ambos • Máxima diferencia entre temperaturas de annealing debería ser 3°C Especificidad del producto Tanneal es el factor principal en determinar especificidad del annealing y que se obtenga el producto deseado • Tanneal : muy baja menos específico unión de primers en otro lado bandas inespecíficas muy alta primers pueden no unirse Estabilidad 3’ y 5’ Elongación de primer empieza en extremo 3’. Mientras el extremo 3’ se una al molde, la elongación empieza. 5’ menos importante Problema: Si 3’ tiene 3 o más C/G, se puede unir establemente a casi cualquier secuencia con tres C/G Situación Ideal: Extremo 5’ estable + extremo 3’menos estable, elimina unión incorrecta debida a unión de sólo extremo 3’. Preferiblemente: extremo 5’ con 1 o 2 bases G/C. Extremo 3’ no tiene más de una base G/C. Resumen criterios para diseño 1. Unión única 2. Longitud: 17-28 bases. Podría variar 3. Composición: contenido promedio de (G+C) alrededor 5060%; evitar secuencia larga de (A+T) y región rica en (G+C) 4. Optimizar apareamiento: estabilidad en extremo 5’ debe ser alta y relativamente baja en 3’, para evitar unión equivocada de los primers 5. Tm preferiblemente entre 55-65 °C 6. Primers en un “juego” con diferencia de t. de annealing entre 2-3°C 7. Minimizar estructura secundaria interna: horquillas y dímeros se deben evitar Diseño de primers con computadora Mucho mejores resultados que a mano Algunos programas: - Primer3: MIT http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi -Oligo -GCG -BioTools - Otros: GeneFisher, Primer!, Web Primer Software para calcular Tm: - BioMath: http://www.promega.com/biomath/calc11.htm PCR Multiplex • Varias parejas de primers en mismo tubo al hacer PCR • Bueno para amplificar sitios múltiples • Ej: microsatélites • Dificultad de diseño ▫ Tm deberían ser parecidas ▫ Evitar dímeros Primers universales Basados en alineamiento de secuencias Ejemplo: todos los genes de una familia el mismo gen en diferentes organismos Estrategia 1. Alinear secuencias a amplificar. 2. Buscar regiones más conservadas en extremos 5’ y 3’. 3. Diseño de primer F en la región conservada 5’. 4. Diseño de primer R en la región conservada 3’. 5. Buscar la mejor pareja en cuanto a Tm etc 6. Asegurarse de amplificación única en todas secuencias 7. Asegurar que no amplifique posibles contaminantes
