PCR - Facultad de Ciencias Marinas

PCR
Polymerase Chain Reaction
(Reacción en Cadena de la Polimerasa)
PCR
• Es una técnica de biología
molecular descrita en 1986
por Kary Mullis.
(Nobel de química en 1993)
• Necesidad de pruebas de
diagnóstico rápido.
• El objetivo es obtener un
gran número de copias a
partir de un segmento
determinado de DNA.
FUNDAMENTO
Componentes del PCR
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica que permite amplificar
mas de un millón de veces un DNA obtenido a partir de una región seleccionada del
genoma, utilizando para ello las propiedades de la Taq Polimerasa, siempre y
cuando se conozca una parte de la secuencia de nucleótidos.
• REACTIVOS Y ENZIMAS
- Taq polimerasa.
- Primers u oligonucleotidos.
- Buffer de amplificación (KCl, Tris y MgCl2).
- Deoxinucleotidos trifosfato dNTPs.
- Muestra de DNA ó cDNA.
• MATERIALES Y EQUIPOS
- Micropipetas de 2, 100 y 1000 µL.
- Puntas para micropipetas.
- Termociclador
- Tubos Eppendorf
Se debe disponer de un primer en sentido 5´ a 3´ , este será el F ó Forward.
Y un primer en sentido inverso, este será el R ó Reverso que en realidad es
un Inverso complementario a la hebra que va en sentido 3´ - 5´ y debe
sintetizarse en sentido 5´- 3´ !!!
ACTINALVANN_F: ACCCCATCGAGCACGGCATCG
ACTINALVANN_R: TGGTCTCGTGGATGCCGCAGG
Inv compl CCTGCGGCATCCACGAGACCA
Primer F
Así se
sintetiza
El diseño de cebadores no debe basarse en una sola secuencia conocida,
pues debemos tener la seguridad de que estos se incorporaran a
regiones que no sean variables entre individuos de la misma especie,
genero o familia.
GATGCACATATCTGACTAGTATCTATGCTAGCCACATGCTAGATTATATTCAGC
GATGCACATATCTGACTAGTATTTATGCTAGCCACATGCTAGATTATATTCAGC
GATGCACATATCTGACTAGTATCTATGCTACCCACATGCTAGATTATATTCAGC
GATGCACATATCTGACTAGTATCTATGCTAGCCACATGCTAGCTTATATTCAGC
GATGCACATATCTGACTACTATCTATGCTAGCCACATGCTAGATTATATTCAGC
GATGCACATATCTGACTAGTATCTTTGCTACCCACATGCTAGATTATATTCAGC
GATGCACATATCTGACTACTATCTATGCTAGCCACATGCTAGATTATAATCAGC
CATGCATATATCTGAC-AGTATCTATGCTAGCCACATGCTAGATTATATTCAGC
CATGCATATATCTGAC-AGTATCTATGCTAGCCACATGCTAGATTATATTCAGT
CATGCATATATCTGAC-AGTATCTTTGCTAGCCACATGCTAGATTATATTCAGC
CATGCATATATCTGAC-AGTATCTATGCTAGCCACATGCTAGAACATATTCAGC
CATGCATATATCTGAC-AGTATCTTTGCTAGCCACATGCTAGATCATATTCAGC
Primer R
1
Cebador especie 1: GATGCACATATCTGACT
Reglas Generales para el diseño de cebadores para PCR
GATGCACATATCTGACTAGTATCTATGCTAGCCACATGCTAGATTATATTCAGC
GATGCACATATCTGACTAGTATTTATGCTAGCCACATGCTAGATTATATTCAGC
GATGCACATATCTGACTAGTATCTATGCTACCCACATGCTAGATTATATTCAGC
GATGCACATATCTGACTAGTATCTATGCTAGCCACATGCTAGCTTATATTCAGC
GATGCACATATCTGACTACTATCTATGCTAGCCACATGCTAGATTATATTCAGC
GATGCACATATCTGACTAGTATCTTTGCTACCCACATGCTAGATTATATTCAGC
GATGCACATATCTGACTACTATCTATGCTAGCCACATGCTAGATTATAATCAGC
Parámetro
Cebador especie 2: CATGCATATATCTGAC
CATGCATATATCTGAC-AGTATCTATGCTAGCCACATGCTAGATTATATTCAGC
CATGCATATATCTGAC-AGTATCTATGCTAGCCACATGCTAGATTATATTCAGT
CATGCATATATCTGAC-AGTATCTTTGCTAGCCACATGCTAGATTATATTCAGC
CATGCATATATCTGAC-AGTATCTATGCTAGCCACATGCTAGAACATATTCAGC
CATGCATATATCTGAC-AGTATCTTTGCTAGCCACATGCTAGATCATATTCAGC
Óptimos
Secuencia única de nucleótidos
Sitio único de hibridación en el templete
Extremo 3’ con presencia de GC
1-2 G-C nucleótidos
Complementariedad interna
< 3 bases contiguas
Complementariedad con el otro cebador
< 3 bases contiguas
Composición y distribución de nucleótidos
%GC 45-60, TM 52–58°C, < 4 G´s ó C´s
Continuas
Longitud del cebador
18-25 nucleótidos
Temperatura de Incorporación
1-2°C de diferencia entre cebadores
Composición de la secuencia flanqueada
Parecida en proporción de bases al cebador
Longitud de la secuencia flanqueada
100-600 nucleótidos
Evitar formación de palindromes o dimeros.
Un perfil de PCR es la secuencia de pasos que se programan en el
termociclador para indicar las condiciones de la reacción:
100
Desnaturalización
Inicial
Fase Cíclica (X)
Enfriamiento
Desnaturalización
95°C
1 min
95°C
5 min
•
80
Extensión
Incorporación
60
72°C
2 min
72°C
5 min
Desnaturalización por calor
aplicando temperaturas de 90 a
95°C.
50°C
1.5 min
40
20
Extensión
Final
3 0
DESNATURALIZACION
4°C
Indefinido
0
5
6
7
8
9
10
140
150
2
HIBRIDACION
•
•
•
ENLONGACION
Annealing o de emparejamiento.
40 hasta 65°C.
Temperatura optima de
apareamiento entre los primers y
la cadena de ADN a amplificar.
• La taq polimerasa incorpora
nucleótidos en el extremo 3’
del primer.
• La temperatura a la que se
lleva a cabo este paso suele
ser 72 +/- 5°C.
Depende de la
enzima utilizada
Los modelos también evolucionan….
Cada enzima tiene diferentes requerimientos y varía en
especificidad, eficiencia y velocidad
•
Estos tres pasos constituyen un
ciclo. La repetición de este ciclo
permite obtener, amplificación,
millones de copias del fragmento
de interés.
•
Todo esto, se realiza de forma
automatizada, en un
termociclador.
TIPOS DE PCR
Para verificar que la PCR ha generado el fragmento de DNA se
emplean técnicas de electroforesis.
• Agarosa – polisacarido extraído
de algas marinas. Se usa a
concentraciones de 0.5-2%.
Facil de preparar y no tóxico.
Separa fragmentos de 20050,000 pb. Bajo poder de
resolución.
RT- PCR
•
Donde el molde inicial es RNA (mRNA) y se requiere de una transcriptasa inversa, para
realizar la conversión del RNA a un tipo de DNA llamado DNAc (DNA complementario).
• Polyacrilamida- son polimeros
de acrilamida. Se usa a
concentraciones de 3.5-20%.
Dificil de preparar y acrilamida
neurotóxica. Rango bastante
reducido de separación, pero
de gran poder de resolución.
Separa fragmentos de 500 pb.
Mas usual para proteínas.
3
PCR anidada
PCR IN SITU
•
Técnica muy sensible, el producto de la amplificación es utilizado como
molde para realizar una segunda amplificación con primers que se
encuentran en la primer secuencia amplificada.
•
•
•
•
PCR TIEMPO REAL
PCR Multiplex
•
Se amplifica mas de una
secuencia en una misma
reacción, se emplean dos
o mas pares de primers con
el
fin
de
amplificar
simultáneamente múltiples
segmentos de DNA
SYBR Green
Consiste en una reacción de PCR en
secciones histológicas o células,
donde los productos generados
pueden visualizarse en el sitio de
amplificación.
Es realizada sobre preparaciones fijas
en un portaobjetos.
Se realiza una primera amplificación
de DNA blanco y luego detección
mediante hibridación in situ
convencional con sondas de
DNA/RNA.
De esta manera pueden detectarse
cantidades pequeñísimas de genoma.
•
•
La principal característica es que
permite cuantificar la cantidad de DNA
o RNA presentes en la muestra
original.
Se utiliza comúnmente para
determinar la expresión del mRNA de
un gen.
Se utiliza una sustancia marcada con
un fluorocromo que, en un
termociclador con sensores para medir
fluorescencia tras excitar el
fluorocromo a la longitud de onda
apropiada, permite medir la tasa de
generación de uno o más productos
específicos.
Taqman
Aplicaciones
La técnica tiene una multitud de aplicaciones:
Medicina
• Permite el genotipar la especie o especies que provocan un determinado cuadro
infeccioso
• Se emplea fundamentalmente como herramienta de diagnosis (Coleman y Tsongalis,
2006).
Agronomía y diversidad
• Permiten discernir entre grupos infraespecíficos de cultivos de interés agronómico.
Paleontología, antropología biológica, y ciencias forenses.
• permite recuperar las escasas cantidades de ADN que aún no se han degradado.
4
RT-PCR como técnica poderosa para detectar portadores asintomaticos
Primers para WSSV
(Lo et al., 1996)
TSV en
America
1992
DNA
WSSV
en
America
1998
ssRNA
Materiales y Métodos:
-Pl a Juveniles de 3.5 g libres de WSSV y TSV por PCR.
Primers para TSV
(Nunan et al., 1998)
-90 camarones por acuario de 90L.
Objetivo: Realizar la detección simultanea de WSSV y TSV en un solo tubo
por 1-step multiplex RT-PCR
-Inoculos de P. monodon y L. vannamei infectados.
-Pleopodos colectados de organismos moribundos (20 ng).
Extracción de RNA
Fragmentos:
TSV
WSSV
ITS
231 pb
530 pb
892 pb
RT-PCR multiplex
Gel de agarosa al 2%
Resultado:
5