Aspectos técnicos para establecer el límite de la detección mediante

Aspectos técnicos para establecer el límite
de la detección mediante amplificación por
PCR
Martha Graciela Rocha Munive
Centro Nacional de Investigación y
capacitación ambiental
Instituto Nacional de Ecología
Necesidad de un muestreo específicamente
diseñado para detectar OGMs
„
Protocolos existentes:
‰
USDA: “Sampling and testing recommendations for the
detection of Cry9c protein in hybrid seed corn”
‰
Normas internacionales como ISO542 o ISO6644
‰
Normas del ISTA (International Seed Testing Association)
‰
Los anteriores asumen homogeneidad de las muestras.
“Kernel lot distribution assessment (KeLDA)”
Fases en la detección
Toma de muestras
en el campo
Manejo de la
muestra
Homogeneización
Toma de
submuestra*
Extracción de ADN
Toma de
submuestra *
DETECCIÓN
Amplificación por PCR
LABORATORIO
*Estas deben ser representativas de todo el lote
“Polymerase Chain Reaction” o PCR
(Reacción en cadena de la polimerasa)
Es una técnica que permite obtener fragmentos de ADN in vitro, a
partir de un molde o patrón conocido (en este caso una secuencia
insertada en un OGM)
Monitoreo y detección de OGMs
„
Posibles errores en las
diferentes fases del
muestreo
‰
‰
‰
‰
Tamaños de muestra
pequeños
Falta de homogeneización de
la muestra
Extracción
Sub-muestra analítica
Homogeneización de la muestra
„
Si se analizan granos para poder analizar al
mismo tiempo el mayor número de individuos
posibles, estos deben molerse y
homogeneizarse.
Harina
Homogeneización de la muestra, toma de la
submuestra
Harina
1 g contiene 73,000
partículas
Realizar extracción de
ADN por duplicado
Usando la aproximación normal a
la distribución binomial, se pueden
asignar probabilidades de acuerdo
al número de partículas que se
tienen
Ejemplo:
Si el contenido de OGM del campo
es del 0.01%, la probabilidad de
que 2g contengan 0.01% ± 0.005,
es de p=0.943
Para 200mg,
p=0.4543
Para 100mg,
p=0.3308
Fase de sub-muestreo de ADN para la reacción
de PCR
Reacción
PCR
PCR
ADN molde
iniciador
Taq polimerasa
dNTP
MgCl2
Una reacción típica de PCR emplea 100ng de ADN,
que corresponden a 37,000 copias del genoma del
maíz
•Si la concentración es 0.1% (1/1000), hay 37
copias de genoma GM
•Si la concentración es 0.01% (1/10000), hay 3.7
copias de genoma GM
Importancia del
número de copias
del genoma!!!
Criterios para la evaluación de métodos
„
„
„
„
„
„
Precisión
Exactitud
Congruencia – repetibilidad :
‰ independiente del método
‰ intra - laboratorio
‰ inter - laboratorio
Sensibilidad
‰ Límite de detección (LOD)
‰ Límite de cuantificación (LOQ)
Especificidad
Aplicabilidad
‰ Matriz
‰ Concentraciones
Sensibilidad
„
El número de moléculas que se requieren
para que el método detecte al analito
„
Se espera que las pruebas de detección de
OGMs sean altamente sensibles
Límite de detección
„
La concentración mínima a la cual se puede
determinar el analito de manera confiable.
„
Generalmente se expresa como la
concentración del analito a la cual el método
lo puede detectar en un 95% de los casos.
Límite de cuantificación
„
Es la mínima cantidad o concentración de
analito que se puede cuantificar con
precisión y exactitud, de manera reproducible
de acuerdo a una validación intra o interlaboratorio.
Límites reconocidos
„
Límite de detección— 0.01%
„
Límite de cuantificación—0.1% usando PCR
en tiempo real
„
Recientemente se reportan valores de LOD
de hasta 0.0025%.
Determinación empírica del límite de detección
% OGM
Resultado
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Frecuencia
Detectada
0.02
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
10 de 10
0.01
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
10 de 10
0.005
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
9 de 10
0.0025
-
+
+
+
+
-
+
+
-
-
6 de 10
0.0012
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
0 de 10
Las muestras deben analizarse como muestras ciegas
Determinación empírica del límite de detección
0
0.01%
Controls
0.005%
1
2
Samples
1
2
3
4
5
0.02%
0.01%
0.005%
0.0025%
0.00125%
3
4
5
Las muestras deben analizarse junto con las
concentraciones al LOD
0%
0.1%
0.01%
0.01% #1
#2
#3
0%
0.1%
0.01%
0.01% #1
#2
#3
35S
NOS
Otras fases críticas en la eficiencia del método
„
Extracción ADN
‰
‰
‰
‰
Rendimiento de extracción
Pureza del ADN
Calidad para amplificación
Ausencia de inhibidores de PCR
Otras fases críticas en la eficiencia del método
„
Optimización de la reacción de amplificación
‰
‰
‰
‰
Selección de iniciadores óptimos
Condiciones de amplificación más eficientes
Uso de controles adecuados
Uso de enzimas de alta eficiencia de
amplificación
Conociendo el LOD se puede planear el
muestreo mas apropiado
„
„
„
„
„
„
„
Un LOD de la PCR permite emplear muestras grandes, de
hasta 10,000 granos
Se pueden hacer agrupamientos de las muestras
Suponer una frecuencia de 0.1% de OGM en la parcela
(1/1000)
Tamaño de muestra = 1000 granos
37% probabilidad de no encontrar el positivo (falsos
negativos)
Tamaño de muestra = 10,000 granos
99.99% probabilidad de detectar el OGM.
Como asegurar la certeza de los resultados:
„
„
„
„
Obtener muestras representativas del lugar donde se
requiere hacer la detección
Obtener muestras representativas y homogeneas del material
para realizar la extracción de ADN
Optimizar los métodos de extracción de ADN
Obtener el número suficiente de copias de ADN para poner a
la reacción de amplificación
„
Optimizar los protocolos de amplificación por PCR
„
Establecer y optimizar los límites de la detección
Fases en la detección
Toma de muestras
en el campo
Manejo de la
muestra
Homogeneización
Toma de
submuestra*
Extracción de ADN
Toma de
submuestra *
DETECCIÓN
Amplificación por PCR
LABORATORIO
*Estas deben ser representativas de todo el lote
Regresemos al muestreo en campo…
Una vez establecido el LOD, se requiere determinar el
“umbral de tolerancia” para la presencia en el
campo:
„
Si se puede detectar 1/10,000 podemos tener un
umbral de 0.01%
„
Un umbral más conservador 1/1000, permite
minimizar costos y esfuerzo de colecta, permite
cuantificar con precisión