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Departamento de Microbiología y Virología
Facultad de Biología
Universidad de La Habana
Trabajo de Diploma
En opción al título de Licenciado en Microbiología y Virología
Diagnóstico molecular, subtipaje y detección de
resistencia a macrólidos de Treponema pallidum
en Cuba
Nelvis Matos Salazar
Instituto de Medicina Tropical
“Pedro Kourí”
La Habana, 2015
Departamento de Microbiología y Virología
Facultad de Biología
Universidad de La Habana
Trabajo de Diploma
Diagnóstico molecular, subtipaje y detección de
resistencia a macrólidos de Treponema pallidum
en Cuba
Autor: Nelvis Matos Salazar
Tutores: Lic. Islay Rodríguez González, Dr C
Lic. Angel A. Noda Ramos, Ms C
La Habana, 2015
Al único que es digno de recibir toda la gloria y la honra:
JHA Jiréh……..
Resumen
Treponema pallidum subespecie pallidum (T. pallidum) es el agente causal de
la sífilis, una infección reemergente de transmisión sexual de gran importancia
para la salud pública y considerada por tanto de declaración obligatoria. Desde
el año 2010 ha existido un notable aumento en el número de casos de la
infección con sífilis notificados en La Habana, Cuba, en la mayoría de los casos
en pacientes coinfectados con VIH y ocurriendo en hombres que tienen sexo
con hombres. Para la detección molecular de T. pallidum se utilizó una PCR
convencional que amplifica el gen polA de T. pallidum según Liu et al.(Liu et al.,
2001) a partir de lesiones en piel sugerentes a sífilis, procesándose un total de
144 muestras clínicas de diferentes sitios anatómicos correspondiéndose a 107
pacientes entre junio del 2012 y abril del 2015. De estas muestras el 26,4%
resultó ser positivo para la detección de este gen correspondientes a 31
pacientes, los resultados fueron comparados con las pruebas serológicas
treponémicas y no treponémicas. A los 31 pacientes diagnosticados con sífilis
mediante la PCR se les realizaron estudios de subtipificación molecular y de
detección de mutaciones puntuales que le confieren resistencia a los
macrólidos el tratamiento alternativo en pacientes alérgicos a la penicilina. Las
cepas de T. pallidum fueron genotipificadas a partir de métodos de tipificación
molecular analizando el número de repeticiones de 60-pb en el gen de
repeticiones proteicas acídicas (arp) y los polimorfismos en el gen de las
repeticiones de T. pallidum (tpr). La detección de los puntos de mutación
A2058G y A2059G en el ARNr 23S de T. pallidum fue realizado con el uso de
enzimas de restricción MboII y BsaI respectivamente. De los 31 pacientes
diagnosticados con sífilis mediante PCR el 54,8% presentó la mutación
A2058G y no hubo ningún caso con presencia de la mutación A2059G. De
estos pacientes con la mutación A2058G el 64,5% correspondió a pacientes
co-infectados con VIH. De las 31 muestras tipiadas se identificaron 8 subtipos
de T. pallidum. El subtipo 14f (21,4%) fue el más común en los aislamientos
seguido de los subtipos 14d (17,8%), 12f (14,3%) y 10f (14,3%). No se
encontró ninguna relación entre la identificación de un subtipo y la presencia de
ambos puntos de mutación que le confiere resistencia a los macrólidos, aunque
se observó que los subtipos 14f y 14d se encontraron en pacientes coinfectados con VIH. Por primera vez se informa en Cuba la existencia de la
mutación A2058G asociada a fallas en el tratamiento con los macrólidos y la
circulación de estos subtipos, informándose por vez primera para América
Latina y el Caribe, los subtipos 7f (10,7%) y 17d (3,6%).
Relación de tablas:
Tabla
Encabezado de la tabla
Página
Tabla 1
Secuencias de los cebadores utilizados para la PCR que amplifica un
27
fragmento del gen de la β-globina humana
Tabla 2
Secuencias de los cebadores utilizados para la PCR que amplifica un
28
fragmento del gen polA de T. pallidum
Tabla 3
Secuencias de los cebadores utilizados para la subtipificación molecular de
29
T. pallidum
Tabla 4
Determinación del subtipo de T. pallidum de acuerdo al número de
31
repeticiones en el gen arp estimado según la talla de los amplicones
Tabla 5
Subtipos de T. pallidum atendiendo a las tallas de los fragmentos obtenidos
33
por PCR-RFLP del gen tpr (TruI esquisómero de MseI)
Tabla 6
Secuencia de los cebadores para la PCR de resistencia que amplifica un
fragmento de 629 pb
:
34
Relación de figuras:
Figura
Pie de figura
Página
Figura 1
Lesión cutánea de sífilis primaria: A) chancro genital
6
en el hombre, B) chancro genital en la mujer C)
chancro
extragenital.
Lesión
cutánea
de
sífilis
secundaria: D) exantema diseminado o erupción
granulomatosa.
Figura 2
Comportamiento de la sífilis venérea en Cuba (2000-
24
2015)
Figura 3
Representación
esquemática
de
patrones
de
32
restricción obtenidos por RFLP con la enzima MseI del
gen tpr de T. pallidum
Figura 4
Electroforesis submarina en gel de agarosa al 2% de
39
los productos amplificados por PCR convencional del
gen polA de T. pallidum. Líneas 1 y 11: patrones de
peso molecular escalera 100 pb; línea 2: control
positivo (ADN de cepa de referencia Nichols), línea
10: control negativo (agua ultrapura estéril); líneas 3 al
9: resultados de la amplificación a partir de los
extractos de ADN de las muestras en estudio
Figura 5
Electroforesis submarina en gel de agarosa al 1,5%
47
de amplicones obtenidos por amplificación del gen arp.
Línea 1: patrón de peso molecular (1kb); línea 2:
muestra clínica correspondiente al subtipo 7; línea 3:
muestra clínica correspondiente al subtipo 12; línea 5:
muestra clínica correspondiente al subtipo 17; línea 5:
muestra clínica correspondiente al subtipo 14; línea 7:
control positivo (ADN de la cepa de referencia Nichols
(subtipo 14).
Figura 6
Electroforesis submarina en gel de agarosa al 2% de
49
los patrones obtenidos de PCR-RFLP con la enzima
MseI del gen tpr. Línea 1: Patrón de peso molecular
(escalera
de
1kb);
línea
2:
muestra
clínica
correspondiente al subtipo a; línea 3: muestra clínica
correspondiente al subtipo d; líneas 4 y 5: muestras
clínicas correspondientes al subtipo f, línea 6: control
positivo
(ADN
de
cepa
de
referencia
Nichols)
correspondiente al subtipo a
Figura 7
Prevalencia
de
los
subtipos
de
T.
pallidum
51
encontrados en el estudio entre junio/2012 y abril/2015
Figura 8
Distribución de los subtipos encontrados en el estudio
52
en comparación a lo informado en la literatura
internecional (2000-2015)
Figura 9
Electroforesis submarina en gel de agarosa al 1% de
57
la digestión enzimática con MboII de los productos
amplificados por PCR para la detección de la mutación
A2058G. Línea 1: patrón de peso molecular (100 pb);
línea 2: ADN de cepa de referencia Nichols (sensible a
los macrólidos); líneas 3 y 4: muestras clínicas sin la
mutación A2058G; líneas 5, 6,7 y 8: muestras clínicas
con la mutación A2058G
Figura 10
Frecuencia de subtipos de T. pallidum resistentes a
macrolidos en las muestras en estudio
63
Glosario:
Análisis de restricción: La obtención del ADN, la digestión con enzimas de
restricción, su posterior análisis por medio de la electroforesis sobre gel de
agarosa, suministra información genética valiosa para la identificación de los
microorganismos. Esta información conocida como "fingerprinting" (huella
dactilar) es un patrón que identifica al microorganismo.
Enfermedad re-emergente: Enfermedades que resurgen después de haber
logrado un control que proporciono una considerable declinación de sus
incidencias en la mayoría de los países y que en estos momentos aumentan
significativamente.
Enzimas de restricción: Enzimas que reconocen secuencias (específicas
para las del tipo II) en el ADN bicatenario (generalmente palíndromes), las
cuales cortan y separan el ADN de acuerdo a la cantidad de cortes
que producen en el mismo. Por tanto un ADN puede definirse con respecto a
una enzima particular de acuerdo al número y la talla de los fragmentos que
esta produce.
Epidemiología molecular: La epidemiología molecular está basada en la
epidemiología clásica general y utiliza a la Biología Molecular para definir la
distribución de la enfermedad y de sus determinantes etiológicos dentro de las
familias y a través de las poblaciones. La epidemiología molecular en el
diagnóstico
de
enfermedades infecciosas
permite
establecer
patrones
epidemiológicos más precisos que complementen o substituyan los métodos
tradicionales.
Infección: Proceso mediante el cual un microorganismo es capaz de atravesar
las barreras de defensa de un individuo
y multiplicarse en sus tejidos,
pudiendo o no provocarle daño. Presencia, sobrevivencia y multiplicación de
microorganismos en tejidos vivos humanos, animales o vegetales. Un tipo
particular es la colonización.
Linfocito: Uno de los tipos de glóbulos blancos de los vertebrados. Son de
pequeño tamaño y de forma esférica, con citoplasma relativamente escaso. Es
no fagocítico y su síntesis ocurre en el tejido linfoide, constituyendo del 20 al
25% de los glóbulos blancos en el hombre.
PCR: Método in vitro para sintetizar de manera enzimática secuencias
específicas de ADN. La reacción utiliza dos oligonucleótidos (entre 15 y 40 pb)
como cebadores que hibridizan en extremos opuestos de la secuencia que se
quiere amplificar. La elongación de estos cebadores es catalizado por una ADN
Polimerasa termoestable (Ej. Taq polimerasa). Una serie repetida de ciclos que
involucra, la desnaturalización del molde, la hibridización de los cebadores y la
elongación de los cebadores por la polimerasa, resulta en la acumulación
exponencial del fragmento de ADN a amplificar. La especificidad de la reacción
está dada por la secuencia de los oligonucleótidos cebadores y en esto radica
el éxito y la gran utilidad de esta técnica.
Plásmidos: Son los vectores más utilizados para la clonación de sondas, ya
que son fácilmente manipulables y su multiplicación en Escherichia coli es
altamente productiva. Permite la clonación de fragmentos entre 0.1 y 5 Kb. En
ocasiones su eficiencia es baja.
Prevalencia: Número de casos de una enfermedad dada, registrado en un
tiempo concreto y expresado como una proporción de la población en estudio.
Pruebas serológicas: Constituyen pruebas de diagnóstico basadas en la
reacción antígeno-anticuerpo.
RFLP (Polimorfismos de Longitud de Fragmentos de Restricción):
Secuencias específicas de nucleótidos en el ADN que son reconocidas y
cortadas por las enzimas de restricción (también llamadas endonucleasas de
restricción) y que varían entre individuos. En un cromosoma humano, una
enzima de restricción puede producir un gran número de cortes en los lugares
donde reconozca la secuencia específica para hacerlo. Las secuencias de
restricción presentan usualmente patrones de distancia, longitud y disposición
diferentes en el ADN de diferentes individuos de una población, por lo que se
dice que la población es polimórfica para estos fragmentos de restricción. Los
RFLP son marcadores genéticos del ADN y se pueden encontrar en regiones
que codifican proteínas o exones, en los intrones o en el ADN que separa un
gen de otro. Lo único que se necesita para que puedan ser marcadores
genéticos es que sean polimórficos teniendo más de un alelo.
Serodiagnóstico: Procedimiento de diagnóstico en el cual se usa suero
sanguíneo como medio de reacción.
Temperatura de hibridación (anneling): Temperatura a partir de la cual los
oligonucleótidos se unen a sus secuencias específicas por complementación
de bases, la polimerasa se une al ADN y usando el oligonucleótido como
cebador comienza a polimerizar, oscila fundamentalmente entre 45ºC y 60 ºC.
Microlesiones: Mutaciones puntuales que involucran un pequeño número de
bases en una secuencia de nucleótidos.
Mutación: Cualquier cambio o alteración en la información genética del
material hereditario que se trasmita a la descendencia. Constituye un cambio
estable en la información genética que se va a perpetuar a través de la
descendencia. Cualquier variación que no llegue a estabilizarse en la molécula
del DNA no constituye una mutación. Estas alteraciones son eventos raros, de
baja frecuencia y que generalmente se producen al “azar”.
Mutación puntual: Cambio de un solo nucleótido en el ADN, especialmente en
una región del ADN que codifica proteína.
Índice
Contenido
Páginas
I.
Introducción
1
II.
Revisión Bibliográfica
5
II.1 Características generales de la sífilis
5
II.1.1 Patogénesis de la enfermedad
7
II.2 Agente causal y características generales
9
II.2.1 Taxonomía
10
II.2.1.2 Características genómicas
11
II.3 Diagnóstico
11
II.3.1 Diagnóstico indirecto
12
II.3.1.1 Pruebas no treponémicas
12
II.3.1.2 Pruebas treponémicas
13
II.3.2 Diagnóstico directo
14
II.4 Tratamiento y resistencia a macrólidos
18
II.4.1 Mecanismos de acción de los macrólidos
19
II.4.1.1 Resistencia microbiana a los macrólidos
III.
20
II.4.2 Identificación de subtipos de T. pallidum
21
II.5 Situación actual de la sífilis
22
Materiales y Métodos
25
III.1 Diseño del estudio
25
III.1.1 Recolección de la información
25
III.2 Toma y procesamiento de las muestras
25
III.3 Detección molecular de T. pallidum subespecie pallidum
26
III.3.1 Extracción de ADN
26
III.3.2 Evaluación de la ausencia de inhibidores
27
III.3.3 PCR para T. pallidum subespecie pallidum
III.4Subtipaje molecular de T. pallidum subespecie pallidum
III.4.1 Determinación del número de repeticiones del gen arp
III.4.2 Análisis por PCR-RFLP de los genes tpr
28
29
30
31
III.4.2.1 Análisis de los patrones de restricción
obtenidos para el gen tpr
32
III.5Determinación de la resistencia de T. pallidum subespecie
pallidum a macrólidos
33
III.6 Diagnóstico serológico de sífilis
35
III.7 Análisis estadístico
35
III.8 Consideraciones éticas de la investigación
35
IV.
Resultados y Discusión
37
V.
Conclusiones
66
VI.
Recomendaciones
67
I.
Introducción
La sífilis es una Infección de Transmisión Sexual (ITS), causada por Treponema
pallidum subespecie pallidum (T. pallidum) (García et al., 2011). Es considerada una
enfermedad reemergente debido al incremento en los índices de incidencia de la
misma a nivel mundial, afectando tanto a países desarrollados como subdesarrollados
(Gayet-Ageron et al., 2015).
La sífilis se caracteriza por cuatro etapas clínicas bien definidas, conocidas como sífilis
primaria, secundaria, latente y terciaria; cada una con manifestaciones clínicas
variadas (Cabie et al., 2010) y con ubicaciones anatómicas específicas (Azzato et al.,
2012).
La Organización Mundial de la Salud ha informado que la cuarta parte de todos los
casos que anualmente se informan de la infección con sífilis, ocurren en América
Latina y el Caribe, con una mayor incidencia en pacientes coinfectados con el Virus de
Inmunodeficiencia Humana (VIH) y en hombres que tienen sexo con hombres (HSH)
(Cruz et al., 2010).
En Cuba la sífilis es una Enfermedad de Declaración Obligatoria y de acuerdo a
estudios diversos, se informa mayor incidencia de esta infección en la población joven
sexualmente activa, que oscila entre los 15-45 años de edad, existiendo un aumento
de 1,9% de los casos diagnosticados para el año 2010, con un aumento significativo al
cierre del 2014 con una tasa de incidencia de 36,2/100 000 habitantes (MINSAP, 2013;
IPK 2014).
El diagnóstico de la sífilis se realiza teniendo en cuenta los criterios clínicos,
epidemiológicos y de laboratorio. Entre las muestras a utilizar se encuentran la linfa de
las lesiones primarias y secundarias, el líquido cefalorraquídeo (LCR), el suero, las
biopsias de las lesiones y el líquido amniótico. También se utiliza la sangre periférica,
los granulocitos purificados y la eyaculación de los pacientes con sífilis (Damasceno et
al., 2011). Las pruebas que se realizan en el diagnóstico de laboratorio, se clasifican
en pruebas directas e indirectas. Dentro del diagnóstico indirecto o el serodiagnóstico
se utilizan dos tipos principales de pruebas serológicas: las no treponémicas o
inespecíficas (VDRL/RPR) para la detección de anticuerpos no específicos o
“reagínicos”, que reaccionan con antígenos no treponémicos y las treponémicas o
específicas (TPHA) que utilizan un antígeno treponémico para la detección de
anticuerpos treponémicos; diferenciándose en los antígenos utilizados y en el tipo de
anticuerpo a determinar (Gayet-Ageron et al., 2013). El diagnóstico directo se realiza
por examen directo en campo oscuro constituyendo el único método inmediato y
específico para el diagnóstico de la sífilis a partir de la identificación positiva de T.
pallidum, mediante el uso de lesiones procedentes de un individuo infectado (Vulcano
et al., 2011).
Uno de los problemas que enfrenta el diagnóstico de laboratorio es la falta de
sensibilidad y especificidad en el periodo pre-serológico de la sífilis primaria, ya que al
no existir una respuesta inmunológica del hospedero, no existe una detección
temprana de anticuerpos por las pruebas serológicas no treponémicas y treponémicas
en un periodo de dos a cuatros semanas, siendo en este periodo el diagnóstico
inespecífico y poco concluyente; sin embargo el examen directo de campo oscuro es
no recomendable, ya que de acuerdo al sitio anatómico no es posible diferenciar entre
treponemas patógenos y no patógenos.
Debido a estos problemas que enfrenta el diagnóstico de laboratorio de la sífilis se ha
propuesto recientemente en algunos países la utilización de técnicas de biología
molecular como diagnóstico confirmatorio de la sífilis durante la sífilis primaria y
secundaria; y como diagnóstico exclusivo en etapas temprana de la sífilis primaria
donde existe un fallo en las pruebas serológicas con compromiso de la especificidad
reflejando en ocasiones resultados falsos positivos en pacientes coinfectados con
otros patógenos o agentes virales (Smajs et al., 2012).
En países desarrollados, se ha puesto en práctica el uso de la técnica de Reacción en
Cadena de la Polimerasa (PCR, de sus siglas en inglés ¨Polymerase Chain Reaction¨),
como diagnóstico confirmatorio para la sífilis, obteniéndose resultados promisorios
según el tipo de muestra seleccionada en relación con el estadio de la enfermedad
(Peng et al., 2011). Las muestras utilizadas para el diagnóstico molecular de la sífilis
varían de acuerdo a la etapa de la enfermedad, siendo las más recomendadas para la
sífilis primaria: exudados provenientes de úlceras genitales y extragenitales (anal, oral)
sugerentes a chancro; y para la sífilis secundaria: biopsias extraídas de lesiones en
piel, y sangre total (Grange et al., 2012).
Dentro de los genes dianas que se han sugerido para la amplificación de ADN de T.
pallidum, se encuentra el gen que codifica para la proteína de membrana externa de
47kDa y el gen que codifica para la ADN polimerasa I, siendo esta última región la más
recomendada para la detección molecular de T. pallidum en lesiones ulceradas debido
a su función esencial ampliamente descrita y a su conservación en el genoma
bacteriano (Damasceno et al., 2011).
Los estudios recientes sobre la sífilis han estado encaminados al uso de técnicas de
epidemiología molecular que garanticen una caracterización profunda y exhaustiva del
agente causal así como a un control epidemiológico de la enfermedad en todas sus
etapas, para dejar al descubierto la información referida a la cadena de transmisión de
la sífilis y particularmente a entender el desarrollo y diseminación de cepas resistentes
a antibióticos, requiriendo para ello métodos de diferenciación de cepas de T .pallidum
(Ho & Lukehart, 2011). Se ha desarrollado un método de tipificación de T. pallidum
basado primeramente en la determinación del número de repeticiones de 60 pb en el
gen arp (de sus siglas en inglés ``acidic repeat protein``) y luego en la diferencias de
secuencias en el gen tpr (de sus siglas en el inglés `` Treponema pallidum repeat ``)
de la subfamilia génica II constituidas por los genes ((tprE [tp0313], tprG [tp0317], y
tprJ [tp0621])), determinados mediante análisis por RFLP (de sus siglas en inglès
``Restriction Fragment Length Polymorphism``) (Wu et al., 2012).
En Cuba, hasta la fecha, no se ha utilizado la PCR como prueba de diagnóstico de la
infección por T. pallidum como agente etiológico de lesiones en piel, sugerentes de
sífilis. Igualmente no se tiene información sobre los subtipos circulantes y su
frecuencia, así como de la presencia de resistencia a macrólidos, aspectos que
motivaron a la realización de la presente investigación y para la cual se tuvieron en
cuenta los siguientes objetivos:
Objetivos:
1.
Evaluar la utilidad de la PCR en muestras de pacientes con lesiones sugerentes
de sífilis.
2.
Determinar la frecuencia de los subtipos de T. pallidum circulantes en los
pacientes estudiados.
3.
Explorar el comportamiento de la resistencia a macrólidos de los subtipos de T.
pallidum identificados.
II. Revisión Bibliográfica
II.1 Características generales de la sífilis
La sífilis es una Infección de Transmisión Sexual (ITS), considerada una
enfermedad reemergente (Cabié et al., 2010). Es una infección caracterizada
por cuatro etapas bien definidas: sífilis primaria, secundaria, latente y terciaria
(Mattei et al., 2012).
La etapa primaria de la sífilis se caracteriza por el ingreso del patógeno (la
bacteria T. pallidum subespecie pallidum) a la epidermis, a través de heridas,
fisuras o diminutas abrasiones ocurridas durante las relaciones sexuales
(Heyman, 2010); el microorganismo se reproduce en forma local, antes de
diseminarse profusamente, a través de la vía linfático-hematógena, ubicándose
en los tejidos subepiteliales y provocando lesiones erosivas indoloras en los
genitales llamados chancro duro (Farhi, 2009). Se pueden presentar también
chancros extragenitales que suelen aparecer en los dedos, el borde de la
lengua, la parte interna de las mejillas, el paladar y, desde luego, en la región
ano-rectal. Estos síntomas se evidencian aproximadamente después de tres
semanas de haber ocurrido la infección, aunque esta manifestación clínica
puede ir de tres a 90 días (Ho & Lukehart, 2011).
La sífilis primaria progresa a sífilis secundaria entre dos semanas y dos meses
después de la aparición del chancro. La sífilis secundaria constituye el patrón
de enfermedad sistémica (Radolf et al., 2006), caracterizada por la aparición de
rash cutáneo en palmas de las manos y los pies, exantema sifilítico en el tórax
y el abdomen, alopecia, sifílides en la boca, lengua, área genital, anal y
perianal y condilomas planos en el área genital; y al igual que el chancro
primario todas estas lesiones son particularmente contagiosas (Baughn &
Musher, 2005). Ejemplos de estas manifestaciones clínicas típicas de la
enfermedad se muestran en la figura 1.
Luego de este periodo la enfermedad entra en un período asintomático
conocido como sífilis latente en el cual T. pallidum puede seguir diseminándose
de forma intermitente a través de la corriente sanguínea. Alrededor del 70% de
los pacientes con sífilis latente no tratada no presenta signos clínicos de sífilis
tardía, pero no es seguro que se curen de forma espontánea (La Fond, 2006).
Durante la etapa secundaria o terciaria se pueden presentar afectaciones del
Sistema Nervioso Central (SNC) con manifestaciones variadas, que pueden
comprometer en algunos casos al sistema cardiovascular provocando como
principales afectaciones cardiacas: aortitis sifilítica y aneurisma sacciforme
(Miklossy, 2012). Las manifestaciones cardiovasculares de la sífilis se atribuyen
a la endarteritis obliterante de los vasa vasorum que riegan y nutren a los
grandes vasos. Los síntomas aparecen de 10 a 40 años después de la
infección (Jackman et al., 1989).
A)
B)
C)
D)
Figura 2.1 Lesión cutánea de sífilis primaria: A) chancro genital en el hombre,
B) chancro genital en la mujer C) chancro extragenital. Lesión cutánea de sífilis
secundaria: D) exantema diseminado o erupción granulomatosa.
II.1.1 Patogénesis de la enfermedad
La sífilis es considerada una enfermedad infectocontagiosa, que afecta a
diversas regiones anatómicas (Salazar et al., 2002).
T. pallidum es capaz de atravesar rápidamente las mucosas íntegras o las
erosiones microscópicas de la piel y en pocas horas penetra en los vasos
linfáticos y en la sangre produciendo una infección generalizada con focos
metastásicos alejados antes de que aparezca la lesión primaria. La sangre de
un paciente con sífilis precoz o en fase de incubación es sumamente
contagiosa. Se calcula que el tiempo de reproducción in vivo de T. pallidum
durante la fase activa de la sífilis precoz es de 30 a 33 h, y el período de
incubación de la sífilis es inversamente proporcional al número de
microorganismos inoculados. La concentración de los treponemas asciende por
lo general a 107, como mínimo, por gramo de tejido antes de que aparezca
clínicamente una lesión (Hazlett et al., 2001).
El período de incubación (desde la inoculación hasta que aparece la lesión
primaria) rara vez supera las seis semanas. Un tratamiento insuficiente durante
el período de incubación puede retrasar la aparición de la lesión primaria, pero
no es seguro que disminuya las probabilidades de que aparezca a la larga la
enfermedad con sus síntomas (Peeling & Hook, 2006).
La lesión primaria surge en el sitio de la inoculación, persiste por lo común
cuatro a seis semanas, y luego se cura espontáneamente. El examen
histológico de esta lesión muestra una infiltración perivascular formada
principalmente por linfocitos (incluidas las células CD8+ y CD4+), células
plasmáticas y macrófagos, junto con una proliferación del endotelio capilar, que
va seguida de oclusión de los vasos sanguíneos pequeños. La infiltración
celular ofrece un perfil de citocinas del tipo Th1, congruente con la activación
de los macrófagos (Morgan et al., 2002). En este momento se puede demostrar
en el chancro la presencia de T. pallidum en los espacios intercelulares de los
elementos epiteliales, en las invaginaciones o fagosomas de las células
epiteliales, los fibroblastos, las células plasmáticas y las células endoteliales de
los capilares pequeños, en el interior de los conductos linfáticos y en los
ganglios linfáticos regionales. Al final, los microorganismos son fagocitados y
destruidos por los macrófagos activados, lo que produce la desaparición
espontánea del chancro (Leader et al., 2007).
Las manifestaciones generales parenquimatosas y mucocutáneas de la sífilis
secundaria suelen aparecer unas seis a ocho semanas después de
desaparecer el chancro, aunque 15% de los pacientes de sífilis secundaria
sigue teniendo un chancro que persiste. En otros pacientes, las lesiones
secundarias aparecen varios meses después de curar el chancro, y algunos
pacientes pueden pasar a la fase latente sin haber tenido nunca lesiones
secundarias identificables. Los signos histopatológicos de las lesiones
cutáneas maculopapulosas del período secundario son: hiperqueratosis de la
epidermis, proliferación capilar con tumefacción endotelial en el corion
superficial y afluencia de leucocitos polimorfonucleares en las papilas dérmicas,
mientras que en el corion profundo, los treponemas se encuentran en muchos
tejidos, incluidos el humor acuoso y el líquido cefalorraquídeo (LCR) (Baughn &
Musher, 2007). La invasión del SNC por T. pallidum se produce en las primeras
semanas o meses de la infección, y hasta 40% de los pacientes muestra
alteraciones de la composición del LCR durante el período secundario. Las
manifestaciones clínicas de hepatitis y de glomerulonefritis membranosa
inducida por inmunocomplejos son bastante raras pero bien conocidas durante
la sífilis secundaria; las pruebas funcionales hepáticas pueden ser anormales
hasta en 25% de los pacientes con sífilis precoz. Se notan adenopatías
generalizadas no dolorosas en 85% de los pacientes con sífilis secundaria (De
Almeida et al., 2010).
Antiguamente, la forma más frecuente de sífilis terciaria era el goma sifilítico,
que es una lesión granulomatosa por lo común benigna. Hoy en día, los gomas
son muy raros. La sífilis cardiovascular, también rara en la actualidad, se debe
a una endarteritis obstructiva de los vasos pequeños que suele afectar a los
vasa vasorum de la aorta ascendente e inducen la formación de un aneurisma.
La afección asintomática del SNC se puede demostrar hasta en 25% de los
pacientes con sífilis latente tardía. Se desconocen los factores que favorecen el
desarrollo y el empeoramiento progresivo de la sífilis terciaria, aunque se
conoce que en el 30% de los casos, después de 7 a 20 años, el paciente puede
evolucionar a la fase terciaria caracterizada por manifestaciones cutáneas o
viscerales, sobre todo cardiovasculares y nerviosas, dado por una alteración
del equilibrio entre el microorganismo y los mecanismos de defensa
establecidos, o por la alteración de la inmunidad celular asociada con la edad
(Marra, 2009).
II.2 Agente causal y características generales
T. pallidum subespecie pallidum, es una espiroqueta que responde como
negativa a la tinción de Gram, tiene una apariencia espirilar delgada, y es
observable solo por microscopía de campo oscuro, debido a sus dimensiones
de 0,5 µm de ancho y de 10 a 15 µm de longitud (Madigan et al., 2012). No se
tiñe con colorantes de anilina pero sí con Giemsa y métodos de impregnación
argéntica, como el de Fontana-Tribondeau que utiliza nitrato de plata, el cual se
transforma en plata metálica en la superficie de la espiroqueta y se deposita en
forma de placas; esto lo hace más grueso y permite su visualización por el
microscopio de luz de campo brillante, aunque provoca la deformación del
mismo (Llop et al., 2001).
Presenta entre 4 a 14 vueltas de espira de igual tamaño, espaciadas por una
distancia de 1 µm, que aumentan en periodicidad y disminuyen en amplitud
hacia los extremos, dando a la célula una forma afilada (como un sacacorchos
invertido). Por lo regular, el eje largo de la espiral es recto, pero a veces puede
estar inclinado, dándole en algunos momentos la forma de un círculo completo
y después retorna a su posición recta normal (Larsen et al., 1999).
Es considerado un microorganismo microaerófilo, capaz de sobrevivir a una
atmósfera de oxígeno de 3 a 5%, por largos periodos. T. pallidum, hasta el
momento no es cultivable in vitro (La Fond & Lukehart, 2006), aunque se
comprobó que se podía mantener de 4 a 7 días a una temperatura de 25 oC, en
un medio anaerobio compuesto por albúmina, bicarbonato de sodio, piruvato,
cisteína y un ultrafiltrado de suero bovino (Schiller & Cox, 1977).
Esta bacteria es móvil y su viabilidad varía de acuerdo a las condiciones del
ambiente a las que está expuesto; en sangre total o plasma almacenada a
4oC, mantiene su viabilidad al menos por 24 horas, en presencia de sustancias
reductoras y en una suspensión líquida apropiada manifiesta movilidad en un
periodo de 3 a 6 días a 25oC. Si se mantiene fuera del cuerpo en un lugar
oscuro y húmedo, no sobrevive más de dos horas. Debido a sus características
de bacteria fastidiosa se ha caracterizado por presentar un parasitismo
obligado, es un patógeno altamente invasivo, persistente, con pequeña
actividad toxigénica (Abbas et al., 2006). Se ha comprobado que muere
rápidamente por desecación, y es destruida por acción de arsenicales
trivalentes, mercurio y bismuto (sustancias contenidas en los fármacos de
interés para el tratamiento de la sífilis). Es sensible a la penicilina y puede ser
reactivado por compuestos que tengan grupos surfhidrilos (SH), por ejemplo,
cisteína o BAL (dimercaprol) (Joklik et al., 1998).
La capacidad metabólica y adaptabilidad de T. pallidum son mínimas, debido a
la ausencia de vías metabólicas, que incluyen no solo el ciclo de los ácidos
tricarboxílicos, sino también la fosforilación oxidativa, entre otras vías
biosintéticas (Giacani et al., 2009).
II.2.1 Taxonomía
De acuerdo con el Manual de Bergey T. pallidum se ubica taxonómicamente
en:
Phylum B XVII. Spirochaetes phy. Nov.
Clase I. Spirochaetes
Orden I. Spirochaetales
Familia I. Spirochaetaceae
Género IX. Treponema (Garrity et al., 2001).
Este género incluye, además, otras especies patógenas humanas tales como:
T. pallidum subespecie endemicum, agente etiológico de la sífilis endémica o
bejel; T. pallidum subespecie pertenue, agente etiológico del pian o frambesia y
T. carateum, agente etiológico de la pinta o mal de pinto. Las mismas son
indistinguibles desde el punto de vista morfológico y antigénico. En el hombre
se describen varias especies en la cavidad oral como T. vincentii, que puede
transformarse en patógeno y producir la angina de Vincent cuando aumenta su
número y se asocia con los bacilos fusiformes de la boca (Lemont et al., 2010).
T. refringens y T. phagedenis, cuya variedad de fácil cultivo (treponema de
Reiter) es de utilidad para el estudio serológico de la sífilis. La especie
patógena tipo de este género es T. pallidum, cepa Nichols (La Fond &
Lukehart, 2006).
II.2.1.1 Características genómicas
En el año 1991 mediante técnicas de electroforesis de campo pulsado se llevó
a cabo la caracterización del genoma de T. pallidum, por Walker et al.,
observándose la presencia de un genoma pequeño similar al de especies del
género Mycoplasma y Borrelia. La secuenciación del genoma de T. pallidum
subespecie pallidum (Nichols) se determinó en el año 1998, utilizando técnicas
de secuenciación shot-gun permitiendo la fragmentación al azar del ADN de
todo el genoma, una vez obtenidas las secuencias se alinean y se ensamblan
basándose en secuencias que se solapan (Norris et al., 2001).
El genoma consiste de un cromosoma de simple cadena circular de 1 138 006
pares de bases, el contenido de Guanina + Citocina es de 52,8%, muy superior
al de Borrelia burgdorferi que es de 39%. El genoma está formado por un total
de 1 041 de marcos abiertos de lectura (ORF, de las siglas en inglés “Open
Reading Frames”´); representando el 92,9% del total del ADN genómico
(McKevitt et al., 2003).
II.3 Diagnóstico
Para la realización del diagnóstico es importante tener en cuenta no solo el tipo
de muestra a tomar según las diferentes manifestaciones clínicas de la sífilis,
sino también, los criterios epidemiológicos, clínicos y de laboratorio. Dentro de
las muestras a tomar se selecciona las muestras de suero, linfa de lesiones
primarias y secundarias, LCR, líquido amniótico, así como las biopsias de las
lesiones. Se pueden tomar otras muestras como sangre periférica, los
granulocitos purificados y la eyaculación de los pacientes con sífilis
(Damasceno et al., 2011).
El criterio del laboratorio es el principal a tener en cuenta para el diagnóstico de
la enfermedad, dividiéndose en dos categorías: pruebas de diagnóstico directas
y pruebas de diagnóstico indirectas (Vulcano et al., 2011).
II.3.1 Diagnóstico indirecto
Debido a que T. pallidum no es cultivable in vitro, el diagnóstico serológico
reviste gran importancia en la actualidad, sobre todo en aquellos países como
Cuba que realizan esta alternativa como las únicas variantes para el
diagnóstico. El diagnóstico indirecto agrupa pruebas serológicas que se
clasifican en treponémicas y no treponémicas, diferenciadas así a partir del tipo
de antígeno que utilizan y los anticuerpos a determinar (Zeltser & Kurban,
2004).
II.3.1.1 Pruebas no treponémicas
Estas pruebas determinan anticuerpos reagínicos (IgM e IgG). A pesar de que
las pruebas no treponémicas son relativamente específicas, no son exclusivas
para la sífilis y por tanto, pueden producirse reacciones falsas positivas
(Rodríguez et al., 2006).
En estas pruebas se utiliza como antígeno la cardiolipina purificada, extraída
del corazón de buey. La cardiolipina es un fosfatidilglicerol que requiere la
adición de lecitina y colesterol o de otros sensibilizadores para reaccionar con
la reagina. La reagina está constituida por una mezcla de anticuerpos IgM e
IgG capaces de reaccionar contra antígenos distribuidos en los tejidos
normales, y se encuentra en el suero del paciente a partir de la segunda o la
tercera semana del inicio de la enfermedad no tratada y en el LCR entre la
cuarta y la octava semana (Manavi et al., 2006).
Entre las pruebas no treponémicas que se usan en la actualidad se encuentran:
la Venereal Disease Research Laboratory (VDRL, por sus siglas en inglés) y la
prueba para la detección rápida de reaginas (RPR, de sus siglas en inglés
“Rapid Plasma Reagin”). Se trata de pruebas bien controladas, fáciles de
realizar y que se pueden semicuantificar con exactitud (Mattei et al., 2012).
VDRL y RPR
Las pruebas RPR y VDRL tienen una sensibilidad similar y pueden utilizarse
para la detección inicial o la cuantificación de los anticuerpos séricos; se
caracterizan por una alta sensibilidad pero una baja especificidad, por lo que
siempre es necesaria la confirmación por otro método treponémico que
presente una mayor especificidad. El título sérico refleja el grado de actividad
de la enfermedad. En la evolución de la sífilis inicial puede observarse un
incremento al cuádruple o mayor del título. En la sífilis activa la prueba VDRL
alcanza niveles de 32 o más durante la sífilis secundaria. Una disminución de
dos diluciones o al cuádruple, o más, tras el tratamiento de la sífilis inicial
representa un indicio de respuesta adecuada al tratamiento. Los títulos en las
pruebas VDRL no se corresponden con los observados en la prueba RPR, y las
pruebas cuantitativas secuenciales, como las aplicadas para conocer la
respuesta terapéutica, deben estar basadas en el uso de un solo método de
medición (Emerson, 2009).
Dentro de los grandes inconvenientes de estas pruebas se encuentran la
elevada ocurrencia de reacciones falsas positivas, debido a que en estas el
antígeno utilizado también se encuentra en los tejidos, y pueden resultar
positivas en personas que no presentan infección treponémica, además puede
depender de otros factores como la carga bacteriana presente en el organismo
así como de las condiciones inmunológicas del organismo (Mattei et al., 2012).
II.3.1.2 Pruebas treponémicas
Estas pruebas a diferencia de las anteriores, que muestran una declinación en
los títulos o se convierten en no reactivas con el tratamiento efectivo, se
mantienen reactivas durante años o de por vida. Se basan en la utilización de
T. pallidum como antígeno para detectar anticuerpos contra componentes
celulares, y pueden ser agrupadas en diferentes categorías:

Inmunofluorescencia indirecta: prueba de absorción de anticuerpos
fluorescentes contra T. pallidum (FTA-Abs).

Hemaglutinación y microhemaglutinación para anticuerpos contra T.
pallidum (TPHA, MHA-TP).

Pruebas inmunoenzimáticas para la detección de anticuerpos contra T.
pallidum.
A pesar de que estas pruebas presentan una
mayor especificidad
desafortunadamente son costosas y técnicamente complejas, por lo que sólo
se utilizan para confirmar los resultados obtenidos en las pruebas no
treponémicas (Sokolovsky et al., 2009).
Pruebas rápidas
En la actualidad, existen más de 20 pruebas rápidas en el mercado. La mayoría
se hacen en formato de tira reactiva o de flujo lateral. Son exámenes
treponémicos sencillos, se realizan en el lugar de la consulta médica y pueden
llevarse a cabo fuera de entorno del laboratorio, con una mínima capacitación
del personal, sin un equipo especializado y con la recolección, mediante el
pinchazo en el dedo, de una cantidad pequeña de sangre completa. No
requieren condiciones especiales de almacenamiento o transporte y el
resultado es fácil de interpretar, en condiciones ideales, se establece entre 15 a
20 minutos. En cambio, tienen la desventaja de no poder distinguir entre una
infección activa y una anterior por lo que requieren de la confirmación mediante
las pruebas estándares (Schimelis y Tadesse, 2015).
II.3.2 Diagnóstico directo
Examen microscópico en campo oscuro
El examen microscópico en campo oscuro es esencial para evaluar las lesiones
cutáneas húmedas como el chancro que aparece durante la sífilis primaria o los
condilomas planos de la sífilis secundaria. Para la toma de la muestra se
exprime la lesión para que expulse un trasudado seroso (linfa) y se coloca una
gota del mismo en la superficie de un portaobjetos (Bravo, 2002). Si fuera
necesario, puede mezclarse una gota de solución salina, sin aditivos de tipo
bacteriostático, con el trasudado y se examina de manera inmediata para
observar la presencia de T. pallidum con técnica de campo oscuro o de
contraste de fase. No se recomienda el diagnóstico de lesiones bucales y las
úlceras anales con este método porque es difícil diferenciar T. pallidum de otras
espiroquetas que puedan estar presentes; además, en la cavidad oral se
encuentran otros treponemas que son anfibiontes de esta cavidad y puede
confundir el diagnóstico por esta vía (Singh & Romanowski, 1999; Lemont,
2010).
Una prueba negativa no excluye la posibilidad de sífilis. Para lograr la
visualización es necesario que en el exudado haya al menos 10 4 treponemas;
el uso previo de antisépticos tópicos o del lavado realizado por el paciente
puede alterar los resultados. Idealmente, el examen en campo oscuro debe
repetirse a los tres días antes de considerarlo negativo (Sanguinetti & Tafur,
2004).
Inmunoflourescencia directa
La prueba de anticuerpos fluorescentes directos a T. pallidum (DFA-TP, siglas
en ingles de “Direct Fluorescent Assay for T. pallidum”), puede llevarse a cabo
utilizando un anticuerpo policlonal antitreponémico conjugado con fluoresceína
para la detección de T. pallidum en frotis desecados, obtenidos de lesiones
orales, rectales o intestinales. Esta técnica detecta y diferencia a los
treponemas patógenos de los no patógenos, mediante una reacción antígenoanticuerpo, no requiriendo de la presencia del microorganismo móvil para su
realización, siendo una técnica sumamente sensible. Un avance de esta
técnica es el uso de un anticuerpo monoclonal específico para treponemas
patógenos (Mattei et al., 2012).
Inoculación animal
Esta es una prueba realizada para medir la sensibilidad de la técnica de PCR
(Krause, 1996; Lukehart et al., 2007). Consiste en la inoculación de T. pallidum
en los testículos de un conejo. La vía de inoculación más utilizada es la
intratesticular, además de la intradérmica, ocular, intravenosa y escrotal. Esta
prueba es la de referencia, que determina la sensibilidad y especificidad de las
otras pruebas para el diagnóstico de sífilis. Además es el método más antiguo
para detectar una infección por T. pallidum. No se utiliza de rutina porque es
costoso y representa una dificultad técnica mayor (Morgan et al., 2003;
Workowski & Berman, 2010).
Inmunoperoxidasa
La tinción con inmunoperoxidasa permite demostrar la presencia de
espiroquetas en los tejidos fijados con formaldehído de pacientes con sífilis
secundaria, esta técnica es más sensible que algunos métodos convencionales
y puede usarse como prueba confirmatoria en los casos de sífilis secundaria
(Kimberly et al., 2002).
Técnicas de biología molecular
Debido a las limitaciones de los métodos de diagnóstico disponibles en la
actualidad, el diagnóstico de la sífilis es poco específico. En este contexto, se
ha planteado el uso de las técnicas de amplificación de los ácidos nucleicos,
basados en la PCR para la detección de T. pallidum subespecie pallidum.
Estas pruebas se basan principalmente en la detección de dos genes: el gen
tpN47 que codifica para la proteína de membrana de 47 kDa y el gen polA que
codifica para la ADN polimerasa I (Palmer, 2003; Peng et al., 2011).
La PCR dirigida al gen de la proteína de 47 kDa se ha utilizado ampliamente
para detectar T. pallidum en distintos tejidos, mostrando sensibilidades
similares a la prueba de inoculación en conejos en muestras de úlceras
genitales y en sangre total. Sin embargo, su uso en LCR ha demostrado tener
sensibilidades menores a éstas, alrededor de 65% y 67%. Por otra parte, el uso
de la PCR para el gen polA ha sido reportado con sensibilidad de 95,8% para
úlceras genitales y de 41% para sangre total (Rodes, 2001), en cambio no ha
sido descrito para muestras de LCR como método diagnóstico de neurosífilis
(Damaseno et al., 2011).
Se han descrito distintas variantes de la técnica de PCR, tales como PCR
anidada, para muestras de lesiones genitales y sangre (Grange et al., 2012);
así como PCR múltiple que permita detectar y diferenciar Haemophilus
ducreyii, T. pallidum, virus del Herpes Simple tipo 1 y 2
de otras úlceras
genitales (Mehta et al., 2012).
La técnica de PCR amplifica o replica varias veces secuencias específicas de
ADN de una muestra. Se utiliza dos porciones cortas de ADN denominados
cebadores o "primers", estos son oligonucleótidos sintéticos de ADN o ARN
cuya secuencia es conocida, que luego de fusionarse (hibridizarse) a un ADN
complementario, actúan como una plantilla para sintetizar ADN nuevo, esto es
un proceso enzimático repetido en varios ciclos térmicos (Wenhai et al., 2004).
El proceso se inicia con la separación del ADN de doble cadena mediante calor
(desnaturalización), al bajar la temperatura se produce recombinación o
emparejamiento de los primers con el ADN original de una sola cadena, se
prolongan las secuencias de ADN cebado y por medio de una incubación con
la enzima ADN polimerasa se sintetiza una nueva cadena complementaria de
ADN. Cada ciclo va duplicando la cantidad de ADN de manera exponencial y
por lo general se llevan a cabo unos 30 o 40 ciclos. Esta técnica tiene
diferentes variantes, dependiendo del ADN a amplificar, que consiste en
modificaciones de alguno de los pasos del proceso básico (Grange et al.,
2012).
La prueba de la PCR que detecta ADN de T. pallidum es de gran utilidad en el
diagnóstico de la sífilis cuando el diagnóstico representa dificultad como en el
caso de sífilis congénita. La ventaja de la PCR es que al amplificar ADN
específico de T. pallidum, se elimina la posibilidad de detectar falsos positivos,
además que puede realizarse en gestación temprana, mediante el estudio del
líquido amniótico (Wisconsiva et al., 2006).
En muchos estudios, el gen de T. pallidum que codifica para la proteína de 47
kDa ha sido usado como región diana; sin embargo, se ha visto que cuando se
usa el gen que codifica para la ADN polimerasa I de T. pallidum como región
diana hay un aumento en la sensibilidad de la técnica. La PCR que amplifica el
gen que codifica para la proteína de 47 kDa detecta ADN en muestras de
tejidos con muy baja sensibilidad, en base a esto se han realizado estudios que
describen la utilización de una PCR semi-anidada que amplifique la región que
codifica a la ADN polimerasa I, embebiendo los tejidos en parafina (Bherhof et
al., 2008).
Para un correcto diagnóstico se ha sugerido el uso tanto de técnica de PCR
como de la inmunohistoquímica esencialmente para diagnóstico de sífilis
secundaria (Buffet et al., 2007). Otros estudios sugieren el uso de una PCR en
tiempo real donde se han obtenido sensibilidad de 94% y especificidad de
100%, aun en muestras de LCR (Koek et al., 2006).
La sensibilidad de la PCR varía de acuerdo a la temperatura de hibridación, el
número de ciclos y la concentración de los cebadores; por lo que estos son
parámetros a tener en cuenta al optimizar una PCR (Mikalova et al., 2010).
Las técnicas de biología molecular pueden aportar ventajas en el diagnóstico
directo de la infección por T. pallidum. Por el momento, no hay técnicas
comercializadas, y las descritas en la bibliografía se han desarrollado en
centros de referencia. Se han reportado diferentes técnicas que amplifican
genes de T. pallidum. Mediante una PCR en tiempo real, que amplifica una
región de 366 pb del gen ARNr 16S, se obtiene una extraordinaria sensibilidad.
La PCR que amplifica el gen de la ADN polimerasa I presenta una mayor
sensibilidad, ya que está basada en las dos características distintivas de este
gen: presenta una región que codifica para un alto contenido de cisteínas, que
hace que esta región presente una baja homología con regiones similares del
gen que codifica para la ADN polimerasa I de otros microorganismos
conocidos; el segundo y único rasgo es la presencia de cuatro inserciones en el
gen, permitiendo de esta manera que la PCR que amplifica esta región del
genoma de T. pallidum, permita diferenciar entre subespecies patogénicas de
T. pallidum (Liu et al., 2001).
Una de las técnicas más referenciadas es la que amplifica el gen de la proteína
de 47 kDa. Su éxito estriba en que se ha presentado en formato múltiple frente
a otras dos causas de úlceras genitales: Haemophilus ducreyii y virus del
herpes simple (VHS) tipos 1 y 2. Su sensibilidad varía entre 91 y 95%. Esta
técnica no se ha comercializado. Otros campos de interés de la biología
molecular de T. pallidum son la tipificación mediante el análisis del polimorfismo
de los fragmentos de restricción (RFLP, de sus siglas en inglés “Restriction
Fragment Length Polymorphism”) de los genes tpr y arp, así como la detección
de resistencia a antimicrobianos mediante PCR en tiempo real (Peng et al.,
2011).
II.4 Tratamiento y resistencia a macrólidos
Desde el año 1940 con el advenimiento de la penicilina, esta se ha usado para
el tratamiento de la sífilis, persistiendo como el medicamento de elección en
todos sus estadios, recomendado por el CDC (de sus siglas en inglés ``Centres
for Diseases Control and Prevention``) (Stamm et al., 2000). Las preparaciones
usadas: benzatínica, procaínica o cristalina, así como la dosis y duración del
tratamiento, dependerán del estadio y las manifestaciones clínicas de la
enfermedad. La sífilis ha sido tratada de manera eficiente desde hace 50 años
con la penicilina G benzatínica, sin informarse casos de resistencia a este
antibiótico (Douglas, 2009); sin embargo, la necesidad de usar un tratamiento
alternativo para pacientes alérgicos a la penicilina e intolerantes a inyecciones
intramusculares ha traído consigo el desarrollo de una segunda línea de
antibióticos con efectos similares para el tratamiento de la enfermedad, como
son la doxiciclina, tetraciclina y azitromicina (Wong, 2008).
Con el descubrimiento en el año 1952 de la eritromicina se incorpora al arsenal
de los antimicrobianos una nueva familia: la de los macrólidos. Este compuesto
fue aislado por Mc Guire y colaboradores en los productos metabólicos de una
cepa de Streptomyces eruthraeus obtenida en una muestra de suelo recogida
en el archipiélago filipino. Más de 3 décadas después, y a pesar de no tener un
efecto tan amplio como los β-lactámicos, las quinolonas o los aminoglucósidos,
la incorporación de nuevos compuestos a la familia, hace que se consideren de
elección contra nueve microorganismos y como primera opción frente a otros
14 (De Jesús et al., 2013).
Los macrólidos son un grupo de antibióticos bacteriostáticos que inhiben la
síntesis proteica (Vester, & S. Douthwaite, 2001) y que se encuentran muy
relacionados entre sí caracterizándose por tener un anillo macrocíclico de
lactosa formados por 14 a 16 miembros, al que se une uno o más
desoxiazúcares; la diferencia entre los compuestos de esta familia radica en la
cantidad de átomos que componen esta molécula (Lewis & Lukhart, 2011),
cuyo prototipo y macrólido más utilizado, es la eritromicina. La claritromicina y
la azitromicina son derivados sintéticos de la eritromicina, usualmente usados
para el control de infecciones donde los pacientes presentan alergia al
tratamiento con penicilina (Stamm, 2010). Entre otras propiedades químicas
presentan: poca solubilidad en agua, tienen aspecto cristalino blanco, son
bases débiles que se inactivan en medio ácido, de ahí que se presenten en
forma de sales o ésteres que son más resistentes a los ácidos, así como que
en sus presentaciones orales tengan una cubierta entérica para protegerlos de
la acción de los ácidos a nivel del estómago (Goodman & Gilman, 1990). Se ha
informado que existen diferentes subtipos de T. pallidum que son resistentes a
macrólidos (Muller et al., 2012).
II.4.1 Mecanismo de acción de los macrólidos
Los macrólidos ejercen su actividad antimicrobiana al obstaculizar la síntesis de
proteínas en la bacteria a nivel ribosómico, se fijan a la unidad 50S del mismo,
e impiden la translocación del aminoacil ARNt y la transpeptidación en la cual la
cadena de péptido en crecimiento se desplaza del sitio aceptor al donador, por
esta particularidad se proscribe su combinación con otras drogas que compiten
con un sitio similar de fijación en el ribosoma (Tenson et al., 2003). Su efecto
bactericida o bacteriostático depende de su concentración en el sitio de
infección, del microorganismo, del inóculo, su sensibilidad, y de la fase de
proliferación en que se encuentren las bacterias. Ellos penetran más fácilmente
en las bacterias gram-positivas; la claritromicina es el único que posee
actividad sobre bacterias gram-negativas, pero es muy escasa (Calvo &
Martínez, 2009).
II.4.1.1 Resistencia microbiana a los macrólidos
El aumento y ocurrencia de resistencia antimicrobiana está asociado con la
prolongación en el uso de un agente antimicrobiano, trayendo consigo el
fenómeno de resistencia innata y resistencia adquirida. La resistencia adquirida
puede ser resultado de la ocurrencia de mutaciones de novo o de la adquisición
de
material
genético
de
una
bacteria
susceptible
por
conjugación,
transformación y transducción (Davies et al., 2010).
La resistencia de los microorganismos frente a los macrólidos se produce por
diferentes mecanismos. Algunos bacilos gramnegativos son resistentes por
incapacidad del medicamento para penetrar en los sitios receptores. En
microorganismos sensibles como algunos gram-positivos, la resistencia se
produce por mutación o determinantes cromosómicos y otras veces es
mediada por plásmidos (sistema de expulsión por bombeo) por vía de
desmetilación
de
adenina
en los ribosomas 23S del
ARN de
los
microorganismos (presencia de ARNr metilasa) (Morshed y Jones, 2006).
Pueden generarse también enzimas como las esterasas, glicosilasas y
fosfotransferasas que inactivan a los macrólidos de 14 carbonos, mecanismo
conocido como modificación enzimática (Tenover, 2006). La resistencia a
macrólidos está frecuentemente asociada con una alteración del sitio diana
(región peptidiltransferasa en el dominio V del ARNr 23S) mediante una
dimetilación y adenización de esta proporción del ARN, llevadas a cabo por las
proteínas Erm, codificadas por el gen erm (presentes en Staphilococcus,
Streptococcus, Enterobacterias, Lactobacillus) (Leclercq, 2002), esta alteración
de la conformación trae como resultado la imposibilidad de unión del antibiótico
al ribosoma; existen dos tipos de modificaciones: la constitutiva (resistencia de
amplio espectro excepto a la Estreptogramicina) y la inducible (resistencia a los
macrólidos de 14 y 15 carbonos). También pueden alterar la permeabilidad, por
alteraciones de las porinas en la membrana plasmática, disminuyendo la
susceptibilidad de entrada de los macrólidos (Stokes & Gilings, 2011).
La resistencia a macrólidos en T. pallidum se identifica mediante amplificación
por PCR de un fragmento del gen que codifica el ARNr 23S con un
subsecuente análisis de digestión con las enzimas de restricción MboII para las
mutaciones A2058G y BsaI para las A2059G. El genotipo de resistencia a
macrólidos se confirma por secuenciación de los productos de PCR una vez
purificados (Lukehart et al., 2004; Mueller et al., 2012).
II.4.2 Identificación de subtipos de T. pallidum
En los últimos 10 años ha existido un aumento en la población mundial de los
casos de sífilis primaria y secundaria, trayendo complicaciones como
neurosífilis y sífilis cardiovascular (Wu et al., 2012), por lo que se hace
necesario para
el control de la enfermedad un diagnóstico eficiente y un
tratamiento efectivo (Workowski & Berman, 2010).
En la actualidad se ha observado la resistencia a macrólidos (Azzato et al.,
2012), mediante el estudio de mutantes y subtipajes moleculares de inóculos
de T. pallidum al estudiar la resistencia a azitromicina en pacientes con sífilis
(Zhou et al., 2010). La existencia de los métodos de subtipaje ha sido el
vehículo para el estudio de la resistencia a macrólidos y de esta forma poder
tener el control de la enfermedad (Wu et al, 2012). La subtipificación es una
herramienta eficiente para poder determinar la diversidad de los patógenos y la
epidemiología de la infección por T. pallidum. En 1998 investigadores del CDC
publicaron un método molecular para diferenciar entre subtipos de T. pallidum
subespecie pallidum (Pillay et al., 1998). El método está basado en la
determinación del número de repeticiones de 60pb en el gen arp (de sus siglas
en inglés ``acidic repeat protein``) y en la diferencias en las secuencias en los
genes de la Subfamilia II de T. pallidum (tprE [tp0313], tprG [tp0317], tprJ
[tp0621]), determinado por RFLP. La designación de los subtipos está dada por
el número de repeticiones y por los patrones del RFLP, pudiendo realizarse a
partir de diferentes muestras clínicas (Palmer et al., 2009; Marra et al., 2010).
Para la determinación del número de fragmentos de 60-pb repetidos en tándem
del gen arp se debe aplicar una PCR para la amplificación de un fragmento
interno del gen que contiene las repeticiones seguido por secuenciación de
ADN (Harper et al., 2008).
La familia génica tpr fue descubierta por cuatro mecanismos independientes:
por mutagénesis TnPhoA, análisis de secuenciación del genoma, hibridación
subtractiva y pesquisa de diferenciación inmunológica. Esta familia está
compuesta por 12 genes paralogos o pseudogenes (de tprA a tprL). Estas
proteínas pueden ser subdivididas en tres familias variando su talla desde 55,5
kDa hasta 81,5 kDa (Norris et al., 2001).
Los estudios realizados sugieren utilizar
extractos en los que se detecte
material genético de T. pallidum y someterlos a subtipificación molecular
mediante la caracterización de los genes repetidos arp y tpr (Martin et al.,
2010). Se ha reportado que algunos de los subtipos circulantes están
asociados con la resistencia a macrólidos (Flasarová et al., 2012).
La subtipificación de T. pallidum basada en la variabilidad de los genes arp y
tpr constituye una eficiente técnica epidemiológica (Pope et al., 2005).
II.5 Situación actual de la sífilis
En los Estados Unidos, las autoridades de salud registraron más de 36,000
casos de sífilis en el 2005, en etapas de sífilis primaria y secundaria. Así
mismo, la mitad de todos los casos de sífilis primaria y secundaria en el 2006
se reportaron en 20 condados y dos ciudades, y en su mayoría correspondían
a personas de 20 a 39 años de edad. La incidencia más alta de sífilis primaria y
secundaria se registró en mujeres de 20 a 24 años de edad y en hombres de
35 a 39 años. Entre el 2004 y el 2005, el número de casos reportados de sífilis
primaria y secundaria aumentó en un 11,8%. Entre el 2000 y el 2005 las tasas
de sífilis primaria y secundaria en hombres se incrementaron anualmente de
2,6 a 5,7, mientras que en las mujeres esto mismo ocurrió entre el 2004 y el
2005. En el 2006, el 64% de los casos reportados de sífilis primaria y
secundaria correspondieron a hombres que tienen relaciones sexuales con
hombres (HSH) (Schmid et al., 2009).
Durante los últimos 5 años se ha visto un aumento en la tasa de casos de sífilis
en Cuba, previa a una disminución que existió entre los años 2000-2009, según
se observa en la figura 2. La sífilis es una ITS de declaración obligatoria,
constituyendo un importante problema de salud en varias regiones del mundo.
Su epidemiología varía en los últimos años, pues se observa una reemergencia
de la sífilis primaria y secundaria entre los hombres y las mujeres
heterosexuales, situación que lleva también a un dramático incremento de la
sífilis congénita. De acuerdo al sexo se ha visto que existe un mayor porcentaje
en el sexo masculino que en el femenino, de un 66% y 34% respectivamente.
De acuerdo al grupo de edades en provincia Habana se ha observado que
entre los años 2009-2011, ha existido una prevalencia mayor en individuos
entre 20 y 24 años de edad (MINSAP, 2013; IPK, 2014).
En los últimos cuatro años las cifras superan los 3 300 casos en todo el país,
con una tasa de 29,6/100 000/habitantes, existiendo un ligero aumento de 1,9%
con respecto al año anterior donde la provincia de La Habana notifica 430
casos nuevos para el año 2011, con una tasa de 20,3/100 000/habitantes,
situándose como la provincia de mayor tasa en Cuba, según se observa en el
gráfico 1 (MINSAP, 2014; IPK, 2015).
El fenómeno asociado con este incremento a nivel mundial y en Cuba se debe
a una liberación en las relaciones sexuales, con cambios frecuentes de pareja
sin protección, al comienzo temprano de las relaciones sexuales y la
coinfección con otras ITS, lo que eleva el riesgo en la población, sobre todo
entre los más jóvenes (OMS, 2012).
Figura 2.2 Comportamiento de la sífilis venérea en Cuba (2000-2015)
III. Materiales y Métodos
III.1 Diseño del estudio
En el Laboratorio Nacional de Referencia de Espiroquetas del IPK (LNRE-IPK) se
realizó un estudio de corte transversal, en el periodo comprendido de junio del 2012 a
abril del 2015, para la detección molecular, subtipaje y detección de resistencia a
macrólidos de T. pallidum en muestras de exudados o biopsias de lesiones de piel y
mucosas en pacientes con sospechas clínicas de sífilis, que asistieron a la consulta de
ITS del servicio de Dermatología en el Instituto de ”Medicina Tropical Pedro Kourí
“(IPK).
III.1.1 Recolección de la información
A cada uno de los pacientes involucrados en el estudio se les explicó de forma verbal
en qué consistía el estudio y se les solicitó su aprobación para la toma de muestras.
Además se les aplicó una encuesta epidemiológica (Anexo 1).
III.2 Toma y procesamiento de las muestras
Para la toma de las muestras de exudados de las lesiones ulceradas se limpió el área
de la lesión y presionándola fuertemente desde su base se tomó el exudado con un
hisopo estéril, el que se colocó y transportó al laboratorio de espiroquetas en un tubo
con 1 mL de Medio Esencial Mínimo Alfa (MEM Alpha) (GIBCO, EUA). Después de
homogenizar manualmente el hisopo en el medio se tomaron 500 μL para un nuevo
tubo que se conservó a -20ºC hasta su posterior extracción de ADN y el resto se
congeló a -70ºC.
Para la toma de las muestras de biopsias en piel se anestesió localmente la lesión
seleccionada, según criterio dermatológico, y se realizó un ponche de dos milímetros
(mm) con ayuda de un punzón de biopsia y se procedió de igual manera que con los
exudados.
A cada individuo se le realizó extracción de sangre por punción venosa para la
obtención del suero por los especialistas del Laboratorio Clínico del Hospital del IPK.
Las muestras de sueros fueron trasladadas al LNRE-IPK cumpliendo con las medidas
de bioseguridad.
III.3 Detección molecular de T. pallidum
III.3.1 Extracción de ADN
Para la realización de la extracción de ácidos nucleicos se emplearon las muestras
conservadas a -20ºC, usando el estuche comercial QIAmp DNA mini kit (QIAGEN,
Alemania) siguiendo las orientaciones del fabricante.
Una vez descongeladas las muestras se sometieron a centrifugación por 30 minutos a
14 000 revoluciones por minuto (rpm) en la microcentrífuga (Labogene, Korea). Se
desechó el sobrenadante y se añadieron 20 μL de solución de proteasa y 600 μL de
tampón AL (tampón de lisis), se mezcló inmediatamente mediante vórtex por 15
segundos. Luego se incubó a 56 ºC por 10 minutos en el bloque térmico AccuBlockTM
(Labnet International, Inc, Woodbridge, EUA), y se centrifugó a 14 000 rpm, un minuto.
Se añadió 600 μL de etanol absoluto (96-100%) frío y se mezcló mediante vórtex. Se
aplicaron 700 μL de esta mezcla en una columna QIAampMini contenida en un tubo
colector de 2mL, se cerró y se centrifugó a 14 000 rpm, un minuto, y se desechó el
filtrado contenido en el tubo colector. Se repitió el paso anterior aplicando 700 μL de la
mezcla en la columna, se cerró y se centrifugó a 14 000 rpm, un minuto, y se desechó
el filtrado contenido en el tubo colector.
Posteriormente se añadió 500 μL del tampón AW1, se centrifugó 14 000 rpm un
minuto, desechándose el filtrado contenido en el tubo colector. Se añadió 500 μL del
tampón AW2, se centrifugó a 14 000 rpm por 3 minutos, se desechó el filtrado
contenido en el tubo colector y se volvió a centrifugar un minuto a 14 000 rpm. Luego
se colocaron las columnas en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, y se añadieron
150 μL del tampón de elución AE, se dejó incubar un minuto a temperatura ambiente y
se centrifugó después a 14 000 rpm un minuto.
Se tomaron los 150 μL contenidos en los tubos (extractos de ADN) y se conservaron a
-70 ºC hasta su uso.
III.3.2 Evaluación de la ausencia de inhibidores
Para comprobar la ausencia de inhibidores se realizó una PCR para la amplificación
de un fragmento de ADN de 268 pb del gen que codifica para la β-globina humana
(Talmaci et al., 2004). Esta PCR se realizó a partir de una mezcla de reacción para
volúmenes finales de 25 μL, conteniendo 2,5 μL de tampón PCR 10X, 0,5 μL de una
mezcla de deoxinucleótidos (dNTP) (10mM), 1,25 μL de cada cebador (10 μM), 0,125
μL de Taq polimerasa (5 U/μL) (QIAGEN, Alemania), 5 μL de la muestra de ADN y
suficiente cantidad de agua ultrapura estéril. Se utilizó para cada ensayo un control
positivo que consistió en un extracto de ADN a partir de células HeLa, donadas por el
Laboratorio de Cultivo de Células del IPK, y un control negativo donde la mezcla de
reacción contenía agua ultrapura estéril en lugar del extracto de ácidos nucleicos.
Los cebadores empleados fueron sintetizados en el Centro de Ingeniería Genética y
Biotecnología, Cuba y sus secuencias se describen en la tabla 1.
Tabla 3.1 Secuencias de los cebadores utilizados para la PCR que permite la
amplificación de un fragmento del gen de la β-globina humana
Nombre
del
cebador
PfL32
PC04
Secuencia 5’- 3’
TAGAATCAAGATCCCAAATCCTCC (24 bases)
CAACTTCATCCACGTTCACC (20 bases)
Gen
diana
βglobina
humana
Talla del
amplicón
(pb)
Referencia
Talmaci
628
al., 2004
La amplificación del ADN se realizó en un termociclador "Mastercycler personal"
(Eppendorf, Alemania), utilizando una desnaturalización inicial a 94ºC por cinco
minutos, seguido de 40 ciclos de desnaturalización a 94ºC por 40 segundos,
hibridación a 59ºC por 30 segundos, extensión a 72ºC por un minuto; con una
extensión final a 72ºC durante cinco minutos.
Los productos de PCR se visualizaron mediante electroforesis submarina en gel de
agarosa al 2% utilizando como tampón de corrida Tris-Borato-EDTA (TBE) 0,5X
(Anexo 2). La cámara electroforética GNA 100 (Pharmacia Biotech, Suecia) acoplada
a la fuente de electroforesis EPS 301 (Amersham Biosciences, Suecia), se ajustó a
una diferencia de potencial de 110 V con una intensidad de corriente de 90 mA
durante 45 minutos. Se empleó como patrón de peso molecular la escalera de 50 pb
(PROMEGA, MADISON, WI, EUA), como colorante de corrida electroforética 5X Green
GoTaq Flexi Buffer (Promega, Madison, Wi, EUA) y Bromuro de Etidio (1 μg/mL) como
agente intercalante del ADN (Anexo 2).
III.3.3 PCR para T. pallidum subespecie pallidum
La PCR se realizó a partir de una mezcla de reacción para volúmenes finales de 25
μL, conteniendo 2,5 μL de tampón PCR 10X; 0,5 μL de una mezcla de dNTP (10mM);
2,5 μL de colorante de corrida 10X; 2,5 μL de cada cebador (10 μM); 0,125 μL de Taq
et
polimerasa (5U/μL) (QIAGEN, Alemania); 5 μL de la muestra de ADN y suficiente
cantidad de agua ultrapura estéril. Como control positivo se utilizó ADN de T. pallidum
cepa Nichols, donado por el Prof. Jorgen Jensen del Instituto Estatal del Suero de
Dinamarca, y como control negativo agua ultrapura estéril.
Los cebadores utilizados para la amplificación se describen en la tabla 2.
Tabla 3.2 Secuencias de los cebadores utilizados para la PCR que amplifica un
fragmento del gen polA de T. pallidum
Nombre
del
cebador
Secuencia 5’- 3’
Gen diana
Talla del
amplicón
(pb)
F1
TGCGCGTGTGCGAATGGTGTGGTC (24 bases)
DNA
polimerasa I
(polA)
377
R1
CACAGTGCTCAAAAACGCCTGCACG (25 bases)
Referencia
Liu et al.,
2001
Los cebadores fueron sintetizados por el Centro de Ingeniería Genética y
Biotecnología (CIGB) de La Habana, Cuba.
La amplificación del ADN se realizó en un termociclador "Mastercycler personal"
(Eppendorf, Alemania), utilizando una desnaturalización inicial a 94ºC por cinco
minutos, seguido de 40 ciclos de desnaturalización a 94ºC por 30 segundos,
hibridación a 60ºC por 30 segundos, extensión a 72ºC por un minuto; con una
extensión final a 72ºC durante cinco minutos, según el informe original de Liu et al.,
2001.
Para la visualización de los productos de PCR se realizó el mismo procedimiento
descrito anteriormente en el acápite III.2.2. Como patrón de peso molecular se utilizó
la escalera de 100 pb (Promega, Madison, Wi, EUA).
III.4 Subtipaje molecular de T. pallidum
La subtipificación se basó en la amplificación de un fragmento del gen arp para
identificar el número del subtipo a partir del número de repeticiones de dicho
fragmento en el gen, y en la amplificación por una PCR anidada de un fragmento del
gen tpr con posterior digestión enzimática para la determinación de la letra del subtipo
según el patrón electroforético obtenido. Para ello se siguió el informe original de Pillay
et al., 1998. Los extractos de las muestras que resultaron positivos por la PCR para el
gen polA, se sometieron paralelamente a PCR para la amplificación de fragmentos de
los genes mencionados anteriormente. Las secuencias de los cebadores utilizados,
sintetizados en el CIGB, se muestran en la tabla 3.
Tabla 3.3 Secuencias de los cebadores utilizados para la subtipificación
molecular de T. pallidum
Nombre del
cebador
Secuencia 5’- 3’
ARP-1
CAAGTCAGGACGGACTGTCC (20 bases)
ARP-2
GGTATCACCTGGGGATGC (18 bases)
B1
ACTGGCTCTGCCACACTTGA (20 bases)
Gen diana
Talla del
amplicón
(pb)
arp
60
2 186
A2
CTACCAGGAGAGGGTGAAGC (20 bases)
IP6
CAGGTTTTGCCGTTAAGC (19 bases)
tpr
1 836
IP7
AATCAAGGGAGAATACCGTC (20 bases)
III.4.1 Determinación del número de repeticiones del gen arp
Para ello se realizó una PCR cuya mezcla de reacción se preparó en un volumen final
de 25 µL, conteniendo 2,5 μL de tampón PCR 10X; 0,5 μL de la mezcla de dNTP
(10mM); 2,5 µL de colorante de corrida 10X; 2,5 μL de cada cebador (10 μM); 0,125
μL de Taq polimerasa (5U/μL) (QIAGEN, Alemania); 5 μL de la muestra de ADN y
suficiente cantidad de agua ultrapura estéril para completar volumen. La amplificación
se realizó según se informa por Pillay et al., 1998: desnaturalización inicial a 94ºC por
4 minutos, seguido de 45 ciclos de desnaturalización a 94ºC por un minuto, hibridación
a 62ºC por un minuto, extensión 72ºC por un minuto y la extensión final consistió en un
ciclo de 72 ºC por siete minutos.
Para la visualización de los productos de amplificación se realizó una electroforesis
submarina en gel de agarosa según se describió previamente en acápite III.2.2. Se
empleó como patrón de peso molecular la escalera de 1kb y 100 pb (Promega,
Madison, Wi, EUA).
En dependencia del número de repeticiones del fragmento de 60-pb presentes en el
gen arp varió la talla del producto amplificado, la que se determinó a partir del
amplicón obtenido por la cepa de referencia (Nichols) de 1 155 pb y que equivale a 14
repeticiones, según Pillay et al., 1998. En la tabla 4 se muestran las tallas aproximadas
conocidas e informadas y el número de repeticiones estimadas para ellas. El número
que identifica el subtipo se corresponde con el número de repeticiones estimadas.
Tabla 3.4 Determinación del subtipo de acuerdo al número de repeticiones en el
gen arp según la talla de los amplicones
Talla del
Número de
amplicón
repeticiones del
(pb)
fragmento en el
gen arp
735
7
915
10
1099
13
1155
14
1220
15
1274
16
1495
20
1553
21
III.4.2 Análisis por PCR-RFLP de los genes tpr
A cada extracto de ADN se le realizó una primera PCR para amplificar un fragmento
de 2 186 pb del gen tpr.
La mezcla de reacción se preparó para un volumen final de 25 µL, conteniendo 2,5 µL
del tampón de la enzima (10X), 0,5 µL de la mezcla de dNTP (10mM), 1,25 µL de los
cebadores F3 y R3 (10 μM), 0,125 µL de la enzima Top Taq polimerasa (5U/µL), 5 µL
de ADN y suficiente cantidad de agua ultrapura para completar el volumen.
El programa de amplificación se realizó según Pillay et al., 1998, con las
modificaciones propuestas por Flasarová et al., 2012: desnaturalización inicial a 94ºC
por cinco minutos, seguido de 35 ciclos de desnaturalización a 94ºC por 1 minuto,
hibridación 64ºC por 1 minuto, extensión a 72ºC por 1 minuto; y luego una etapa de
extensión final a 72ºC por cinco minutos.
Al producto de amplificación de esta PCR se le realizó una segunda PCR para la
amplificación de un fragmento interno de 1 836-pb, cuya mezcla de reacción difirió de
la anterior en los cebadores utilizados, en este caso se empleó IP6 y IP7 y como
muestra de ADN se añadieron 5 µL del producto amplificado anteriormente.
Para la amplificación se realizó una desnaturalización inicial a 94ºC por cinco minutos,
seguido de 45 ciclos de desnaturalización a 94ºC por 1 minuto, hibridación a 64ºC por
1 minuto, extensión a 72ºC por 1 minuto; y luego una etapa de extensión final a 72ºC
por cinco minutos (Flasarová et al., 2012).
Los amplicones obtenidos de esta segunda etapa de PCR se digirieron
individualmente con la endonucleasa de restricción MseI, en una mezcla que tenía
como volumen final 31 µL. Se utilizaron 2 µL del tampón R (10X), 1 µL de la enzima
MseI (ThermoScientific, EUA), 10 µL de los productos de PCR y suficiente cantidad de
agua ultrapura para completar volumen.
Los fragmentos de restricción fueron separados por electroforesis en gel de agarosa al
2% a 100 V, con una intensidad de corriente de 90 mA por una hora. Se empleó como
patrón de peso molecular la escalera de 100 pares de bases (Promega, Madison, Wi,
EUA), como colorante de corrida electroforética 5X Green Go Taq Flexi Buffer
(Promega, Madison, Wi, EUA) y bromuro de etidio (1 μg/mL) como agente intercalante
del ADN.
III.4.2.1 Análisis de los patrones de restricción obtenidos para el gen tpr
Para la identificación del subtipo de las muestras en estudio según los patrones de
restricción obtenidos se compararon los mismos con los descritos en la figura 3.1 y
tabla 3.5.
Figura 3.1 Representación esquemática de patrones de restricción obtenidos por
RFLP con la enzima MseI del gen tpr de T. pallidum (donada gentilmente por el Dr.
Etienne Mueller del Centro para VIH e ITS, del Instituto Nacional de Enfermedades
Comunicables en Johannesburgo, Sudáfrica).
Tabla 3.5 Subtipos de T. pallidum atendiendo a las tallas de los fragmentos
obtenidos por PCR-RFLP del gen tpr (TruI esquisómero de MseI) (donado
gentilmente por el Dr. Etienne Mueller del Centro para VIH e ITS, del Instituto
Nacional de Enfermedades Comunicables en Johannesburgo, Sudáfrica)
III.5 Determinación de la resistencia de T. pallidum a macrólidos
Para la detección de las mutaciones en las posiciones A2058G y A2059G en el gen
ARNr 23S, responsables de la resistencia a macrólidos en T. pallidum dado un cambio
en la secuencia génica de adenina por guanina, según informes de Mueller et al.,
2012, se realizó una PCR seguida de ensayos con enzimas de restricción.
Los cebadores utilizados para la PCR, según informó Lukehart et al., 2004, se
describen en la tabla 6.
Tabla 3.6 Secuencia de los cebadores para la PCR de resistencia que amplifica
un fragmento de 629 pb
Nombre del
cebador
Secuencia 5’- 3’
F5
GTACCGCAAACCGACACAG (19 bases)
R5
AGTCAAACCGCCCACCTAC (19 bases)
Gen diana
Talla del
amplicón
(pb)
ARNr 23S
629
La mezcla de reacción se realizó para 25 μL como volumen final, conteniendo, 5 μL de
tampón PCR 10X; 0,5 μL de la mezcla de dNTP (10mM); 1,5 μL de cada cebador (10
μM); 0,125 μL de Taq polimerasa (5U/μL) (QIAGEN, Alemania); 5 μL de la muestra de
ADN y suficiente cantidad de agua ultrapura estéril para completar el volumen.
La amplificación del ADN se realizó en un termociclador "Mastercycler personal"
(Eppendorf, Alemania), utilizando una desnaturalización inicial a 93ºC por tres minutos,
seguido de 40 ciclos de desnaturalización a 93ºC por 1 minuto, hibridación a 62ºC por
1 minuto, extensión a 72ºC por un minuto; con una extensión final a 72ºC durante 10
minutos, según Mueller et al., 2012.
Los productos de PCR se visualizaron mediante electroforesis submarina en gel de
agarosa al 1% empleando las mismas condiciones descritas anteriormente. Se empleó
como patrón de peso molecular la escalera de 100- pb (Promega, Madison, Wi, EUA).
La digestión enzimática de los amplicones obtenidos del ARNr 23S se realizó usando
las enzimas Mbo II (para la mutación A2058G) y Bsa I (para la mutación A2059G).
Las mezclas para la digestión enzimática con la enzima MboII se realizaron para un
volumen final de 10 µL; compuesta por 1 µL de tampón de la enzima (10X); 0,1 µL de
BSA (10X); 1 µL de la enzima MboII; 6 µL de los productos de PCR y suficiente
cantidad de agua ultrapura para completar el volumen. Las mezclas se incubaron a
37ºC durante tres horas en un bloque térmico AccuBlockTM (Labnet International, Inc,
Woodbridge, EUA). Para la enzima BsaI, las mezclas de reacción tenían igual
composición, solo que se añadió la enzima BsaI; y la digestión se realizó a 56ºC
durante cuatro horas utilizando el bloque térmico, para evitar la evaporación de la
mezcla preparada para la digestión enzimática con la enzima BsaI.
Los productos de las digestiones enzimáticas se visualizaron mediante electroforesis
submarina en gel de agarosa al 2% como ya se describió anteriormente. Se empleó
como patrón de peso molecular la escalera de 100 pb (Promega, Madison, Wi, EUA).
Las muestras sin las mutaciones A2058G y A2059G mostraron una sola banda de 629
pb. Las muestras con la mutación A2058G mostraron dos fragmentos de restricción de
449 pb y 180 pb, y las muestras con la mutación A2059G resultan en fragmentos de
432 pb y 197 pb.
III.6 Diagnóstico serológico de sífilis
Las muestras de sueros de los pacientes involucrados en la investigación formaron
parte del diagnóstico de rutina que se realiza en el laboratorio y se sometieron a la
prueba VDRL (Centis, Cuba) o RPR (Centis, Cuba) como pruebas de pesquisa de
sífilis y a la HATP (Centis, Cuba) como prueba confirmatoria. Las mismas se realizaron
según las orientaciones del fabricante.
III.7 Análisis estadístico
Los resultados se introdujeron en una base de datos diseñada al efecto mediante el
empleo del programa Excel (Microsoft Office).
A partir de la encuesta epidemiológica se describieron diferentes variables plasmadas
en la misma relacionándolas con los resultados de laboratorio obtenidos. Se
emplearon medidas de estadística descriptiva como frecuencias absolutas y
porcentajes.
III.8 Consideraciones éticas de la investigación
Se cumplieron las medidas de bioseguridad establecidas para el trabajo, la
manipulación del microorganismo y las muestras clínicas, según los niveles de riesgo
establecidos por la Comisión Nacional de Seguridad Biológica en la Resolución
38/2006 (CITMA, 2006).
La información de la investigación se conservó con carácter confidencial. No se reveló
la identidad de los individuos que proporcionaron las muestras clínicas para el estudio.
Los resultados de las pruebas de laboratorio se enviaron al médico de asistencia que
solicitó los análisis, y se utilizó por el equipo de investigación con fines científicos.
Los individuos involucrados en la investigación, conocieron los resultados de las
pruebas de diagnóstico microbiológico evaluadas a través de su médico de asistencia.
Ninguna de las labores planificadas en el presente trabajo atentó contra la integridad
de los individuos involucrados, ellas facilitaron la confirmación de su infección por T.
pallidum, lo que contribuyó a la aplicación oportuna y rápida de tratamiento específico,
así como al control y prevención de nuevos casos en la comunidad.
Se obtuvo el consentimiento informado de los individuos para participar de manera
voluntaria y gratuita en el estudio correspondiente a la evaluación de la PCR
convencional para confirmar el diagnóstico de sífilis, previa a la explicación en un
lenguaje sencillo y claro de cómo se realizaría el mismo, su importancia y los
beneficios que proporcionaría dicha evaluación. Los datos de los participantes se
mantuvieron bajo estricta confidencialidad, solo accesibles a los investigadores
partícipes en el estudio.
En general, toda la información relacionada con esta investigación se encuentra en
formato electrónico, conservada y protegida en el LNRE-IPK, donde se realizaron
además copias (salvas) de la información.
IV. Resultados y Discusión
IV.1 Características demográficas de los pacientes incluidos en el estudio
y muestras analizadas.
En la presente investigación se analizaron 144 muestras clínicas de 107
pacientes, tomadas de distintos sitios anatómicos en dependencia de la
ubicación de las lesiones.
El 59,8% (64/107) de los pacientes eran seropositivos al VIH y el 40,2%
(43/107) seronegativos hasta el momento en el que se le realizó la toma de
muestra. De estos individuos el 98,1% (105/107) correspondían al sexo
masculino y de ellos el 74,3% (78/105) manifestaron ser hombres que tienen
sexo con hombres (HSH). El 1,9% (2/107) restante se correspondía con el sexo
femenino. El rango de edad osciló entre 15 y 64 años, con una media de 31
año, que se corresponde con la edad sexualmente activa.
Como se puede constatar la mayoría de los pacientes son seropositivos al VIH.
Es conocido que en pacientes donde se ha informado la coinfección sífilis-VIH
el diagnóstico serológico no treponémico de la sífilis puede traer dificultad,
particularmente en individuos con bajo conteo de linfocitos CD4, ya que estos
pueden presentar síntomas atípicos tales como la ulceración herpetiforme, que
puede dificultar la impresión diagnóstica (Pope et al., 2005), por ello la
necesidad de pruebas de diagnóstico directo. El problema de la sífilis es más
grave en la era del VIH, debido a que las úlceras genitales aumentan la
probabilidad de contagio del virus (Palmer et al., 2003).
El 79,2% (114/144) de las muestras clínicas estudiadas procedían de lesiones
genitales, el 11,1% (16/144) de lesiones orales, el 6,2% (9/144) de lesiones
anales, el 2,8% (4/144) de lesiones en piel y el 0,7% (1/144) de lesión en el
cuero cabelludo.
IV.2 Detección molecular de T. pallidum en las muestras clínicas
La amplificación exitosa de una región de interés es dependiente de la calidad
y cantidad del ADN templado. Este último tiene que estar libre de inhibidores
potenciales de las ADN polimerasas. Frecuentemente los inhibidores lo
constituyen restos de reactivos comúnmente usados en la purificación de
ácidos nucleicos o restos del material de partida. Estos incluyen sales,
proteasas, guanidina, solventes orgánicos y duodecil sulfato de sodio (SDS, de
sus siglas en inglés: Sodium Duodecil Sulphate) (Martin et al., 2010).
El método de extracción utilizado permitió extraer ADN de calidad y en
cantidades suficientes para ser detectado por la PCR. Se comprobó la
ausencia de inhibidores en los extractos pues en las PCR de β-globina no se
detectaron fallas de amplificación, lo que corroboró la presencia de ADN de
células del hospedero y la selección adecuada de las muestras para el estudio
molecular.
La región polA de T. pallidum presenta características únicas que la diferencian
de otros microorganismos al mostrar baja homología con regiones similares en
estos, así como la presencia de cuatro inserciones en el gen (Agerón et al.,
2015). Precisamente por las características de esta región es que se prefiere
para la amplificación y detección por PCR. La ADN polimerasa I es una enzima
importante que se encuentra involucrada en la replicación y reparación del
ADN, su secuencia ha sido descrita y conservada entre microorganismos,
especialmente
en
los
dominios
funcionales.
Contiene
24
cisteínas
representando el 2,4% del total de aminoácidos (Liu et al., 2001).
Otros genes de T. pallidum, como el de la proteína de 47 kDa, tienen funciones
desconocidas o pobremente caracterizadas y como T. pallidum tiene un
genoma relativamente conservado, estos genes pueden tener inserciones o
deleciones según se ha informado en artículos recientes de heterogeneidad
entre especies de T. pallidum (Ej. genes arp, tpr); afectando la especificidad de
los resultados por la PCR (Smajs et al., 2012).
La PCR dirigida al gen de la proteína de 47kDa se ha descrito ampliamente
para detectar T. pallidum, mostrando sensibilidades similares a la prueba de
infectividad en conejos en muestras de úlceras genitales y sangre total (Marfin
et al., 2001); sin embargo, recientemente se informa que la PCR que amplifica
el gen polA presenta mayor sensibilidad (95,8%) en muestras de lesiones
genitales (García et al., 2011).
La amplificación del fragmento deseado (gen polA), de aproximadamente 377
pb, a partir del ADN control de la cepa Nichols de referencia permitió
comprobar que los cebadores seleccionados, así como la composición de la
mezcla de reacción y programa de amplificación permiten amplificar la región
de interés según se ha descrito con anterioridad por otros autores (Behrhof et
al., 2012; Chi et al., 2015), según se muestra en la figura 4.1.
Figura 4.1 Electroforesis submarina en gel de agarosa al 2% de los productos
amplificados por PCR convencional del gen polA de T. pallidum. Líneas 1 y 11:
patrones de peso molecular escalera 100 pb; línea 2: control positivo (ADN de
cepa de referencia Nichols), línea 10: control negativo (agua ultrapura estéril);
líneas 3 al 9: resultados de la amplificación a partir de los extractos de ADN de
las muestras en estudio.
De las muestras evaluadas en el estudio el 27,1% (39/144) resultaron positivas
por la PCR; de estas, el 94,9% (37/39) procedían de pacientes con sospechas
de sífilis primaria y el 5,1% (2/39) de sífilis secundaria. En cuanto a la
positividad según pacientes, el 28,9% (31/107) de los individuos tuvo PCR
positiva.
Los porcentajes de positividad, tanto según muestras como pacientes, son
inferiores a los informados en la literatura, lo cual podría estar dado por
concentraciones bacterianas bajas en la lesión y el límite de detección de la
PCR empleada. Los estudios que han mostrado resultados superiores utilizaron
como herramienta diagnóstica otras variantes de PCR más sensibles como:
PCR en tiempo real o PCR anidada (Liu et al., 2001; Flasarová et al., 2012;
Chen et al., 2013).
De acuerdo a la ubicación anatómica de las muestras clínicas estudiadas el
21,9% (25/114) de las genitales resultaron positivas por la PCR, el 50% (8/16)
de las lesiones orales, 44,4% (4/9) de las anales y 50% (2/4) de las de piel. En
la lesión del cuero cabelludo no se detectó la presencia de ADN de T. pallidum.
Los resultados correspondientes a pacientes con lesiones en piel sugerentes
de sífilis secundaria son similares a los encontrados en una investigación
realizada en Colombia, en la cual se analizaron 12 muestras procedentes de
lesiones en piel, obteniéndose 66% (9/12) de positividad con respecto al total
de muestras que resultaron positivas para la PCR (Cruz et al., 2010). Sin
embargo, se diferencian de los resultados informados en un estudio realizado
en Paris, Francia en el que se obtuvo 35% (103/294) de positividad a pesar de
emplear una técnica de biología molecular más sensible, comparando los
resultados con pruebas inmunohistoquímicas, y es notable que el tamaño de
muestras incluidas en el estudio fue superior al del actual estudio (Grange et
al., 2012).
En otro estudio, realizado en Francia, se obtuvieron resultados superiores al
obtener 75% de positividad. Es de destacar que el número de muestras
analizadas fue también limitado; de un total de 12 biopsias realizadas para
obtener los ponches de las lesiones en piel, nueve fueron identificados por la
PCR y comparados con ensayos serológicos e inmunohistoquímicos,
confirmando los resultados obtenidos por PCR (Buffet et al., 2007).
Es válido mencionar que en los estudios más recientes y dirigidos a la
detección del gen polA en T. pallidum para la confirmación de sífilis secundaria,
las técnicas moleculares utilizadas son más sensibles y cuentan con un mayor
límite de detección; además ventajosamente se escoge como muestra la
sangre en vez de utilizar biopsias de piel, ya que en este estadio la infección
adquiere carácter sistémico y existe mayor probabilidad de encontrar alta carga
bacteriana en sangre, debido a que ocurre una diseminación y proliferación de
T. pallidum por todo el cuerpo, trasladándose de esta manera al sistema
nervioso central mediante diseminación por vía hematógena o a través del
sistema linfático (Miklossy, 2012).
Uno de los estudios realizados en Sur América, específicamente en la ciudad
de Cali en Colombia, sugiere la utilización de muestras de sangre en los casos
de sífilis secundaria no tratada para PCR cuantitativa, con una sensibilidad de
15 y 150 espiroquetas/mL; de las 26 muestras de sangre analizadas, en el 46%
(11/26) se detectó ADN de T. pallidum (Cruz et al., 2010).
La prueba utilizada en la presente investigación es una PCR convencional o a
punto final para la que se reconoce menor sensibilidad en relación a las PCR
anidadas y PCR en tiempo real; no obstante, permitió la detección de la
infección en el 50% de los casos.
El diagnóstico de la sífilis está basado en la presentación clínica de los casos o
antecedentes epidemiológicos y en ensayos no específicos de laboratorio, con
confirmación en la serología treponémica (Gracia et al., 2011). Uno de los
problemas que enfrenta el diagnóstico serológico es la ocurrencia de falsos
positivos en pruebas no treponémicas (VDRL/RPR) en estadios tempranos de
la enfermedad como la sífilis primaria (Rodríguez et al., 2013). Estas pruebas
tienen como inconveniente una elevada ocurrencia de reacciones falsas
positivas; que en ocasiones son el primer indicio de una enfermedad sistémica
de tipo inmunológica (Rodríguez et al., 2006).
La sensibilidad de estas pruebas varía para los casos de sífilis primaria:
VDRL/RPR (70-80%) y TPHA (70-80%). Una respuesta serológica por la
presencia de T. pallidum usualmente tarda 1-4 semanas para desarrollarse, y
es normalmente presentada en el tiempo en el que se muestra el chancro
sifilítico o lesión primaria. La detección serológica temprana monitorea el
comienzo de una respuesta de IgM; sin embargo, este monitoreo serológico
falla en un 30% de los casos de sífilis primaria. Otro de los problemas que
enfrenta el diagnóstico serológico de la sífilis es cuando se presenta una
coinfección con el VIH, ya que en estos pacientes la carga baja de linfocitos
CD4 influye en los resultados serológicos, así como la liberación de reaginas a
sangre producto de la invasión del virus a otras células, reaginas que son
detectadas por las pruebas serológicas no treponémicas.
De los 31 pacientes que se diagnosticaron por PCR con sífilis primaria o
secundaria, el 22,6% (7/31) resultó negativo tanto para la serología no
treponémica (VDRL/RPR) como treponémica (TPHA). Estos pacientes
manifestaron no tener ningún antecedente de ITS, incluyendo sífilis, aunque en
uno de los casos la pareja un año atrás fue diagnosticado con sífilis. La
aparición de las lesiones en estos, tanto orales como genitales referentes a
manifestaciones clínicas de la sífilis primaria, ocurrieron en un periodo de 2
días a 3 semanas. Para estos casos es de esperar la no detección de
anticuerpos ya que estos comienzan a ser detectables en un periodo superior a
los 20 días aproximadamente, luego de la aparición del chancro sifilítico
(Gayet-Ageron et al., 2013).
Es necesario destacar que el tiempo aproximado que transcurre desde la
aparición del chancro hasta el estadio de sífilis secundaria es de 4 a 10
semanas (Ho & Lukehart, 2011), y debido a que las pruebas serológicas son
tan inespecíficas para el diagnóstico temprano de la sífilis primaria, es
necesario contar con pruebas más sensibles y específicas que garanticen un
diagnóstico precoz y directo de la enfermedad en este estadio; sobre todo,
porque la sífilis en su etapa primaria se puede confundir clínicamente con otras
enfermedades de origen sexual, que provocan la aparición de lesiones en
genitales y áreas extragenitales.
De los siete pacientes con resultados serológicos negativos y PCR positiva, el
71,4% (5/7) eran pacientes coinfectados con VIH. En estos casos es
fundamental disponer de un diagnóstico efectivo en etapas tempranas de la
sífilis, ya que estos pacientes pueden presentar modificaciones en la evolución
clínica de la enfermedad, resultando confusa la impresión diagnóstica de la
sífilis; además pueden resultar falsos biológicos positivos y negativos por
serología, debido al compromiso del sistema inmune por parte de la infección
con el VIH.
En los pacientes seropositivos al VIH es más rápida la progresión a neurosífilis
que en los seronegativos, lo que puede conllevar a problemas con el
tratamiento propuesto en etapas avanzadas de la sífilis, por lo que el correcto
diagnóstico en etapas tempranas depende de la disponibilidad de pruebas más
sensibles, como la utilizada en el presente estudio.
Del 71% (76/107) de los casos clínicos que resultaron negativos a la detección
de ADN de T. pallidum por PCR, al 19,7% (15/76) no se les pudo realizar las
pruebas serológicas debido a que las muestras de suero no fueron entregadas
al Laboratorio Nacional de Referencia de Espiroquetas del IPK.
Se conoce que a estos pacientes se le diagnosticó por técnicas de Biología
Molecular la presencia del Virus del Herpes Simple tipo 2 (VHS-2) a partir de
las mismas muestras (dato no mostrado); además estaban coinfectados con
VIH, por lo que se puede hipotetizar que en estos casos pudo no haber existido
una falla de la PCR para la detección de T. pallidum sino que las lesiones de
estos pacientes se correspondía con las del VHS-2, a pesar de que las úlceras
fueran sugerentes de sífilis.
Recientemente se ha descrito que en pacientes con VIH las lesiones genitales
provocadas por microorganismos y agentes virales causantes de alguna ITS,
pueden tener un aspecto diferente a las manifestaciones clínicas de la ITS que
se trate, por lo que en esos casos la impresión diagnóstica por el personal
médico suele ser difícil y poco concluyente (Mehta et al., 2012).
De los casos con resultados negativos por la PCR convencional para la
detección de la región polA, a dos de ellos se les realizaron biopsias en
diferentes áreas de la piel según las localizaciones de las lesiones sugerentes
de sífilis, así como las pruebas serológicas no treponémicas y treponémicas.
En ambos casos se obtuvo títulos elevados por serología no treponémica
(VDRL/RPR) de 64 y 512 diluciones, con confirmación en la serología
treponémica (TPHA), lo que apoya el diagnóstico de sífilis. El resultado
negativo por PCR pudo estar dado por la sensibilidad de la prueba y la carga
bacteriana en las muestras tomadas.
Es importante mencionar que para uno de los pacientes se tomó también
muestra de una lesión ulcerada oral para la que se obtuvo amplificación del
fragmento de ADN deseado, por lo que podría tratarse de un paciente con sífilis
primaria en el que comenzaban a concomitar lesiones del estadio secundario
(con baja carga bacteriana), evolución clínica frecuente en pacientes
seropositivos
al
VIH.
Lamentablemente
no
se
cuenta
con
pruebas
inmunohistoquímicas como alternativa para comprobar la presencia de
treponemas en la muestra de piel, ya que para este tipo de muestra se sugiere
la combinación de técnicas moleculares sensibles para la detección de T.
pallidum con los ensayos histoquímicos de biopsias. A partir de esta
combinación se ha informado la presencia de T. pallidum en el 92% de los
casos diagnosticados con sífilis secundaria realizadas en otros estudios (Buffet
et al., 2007; Cruz et al., 2010).
El otro caso, con resultado negativo por PCR y resultados serológicos positivos
(VDRL 512 diluciones), se correspondía a un paciente seropositivo al VIH en
fase SIDA, cuya lesión se tomó del cuero cabelludo, localización anatómica no
común en casos de sífilis, por lo que quizá la causa etiológica era otra. En la
literatura científica revisada no se informan lesiones de sífilis (primarias o
secundarias) en cuero cabelludo.
Un estudio realizado en Alemania sugiere para los casos de sífilis secundaria,
la realización de técnicas moleculares a muestras obtenidas de lesiones en piel
pero embebidas en parafina, garantizando de esta manera que no ocurra
degradación del ADN en las muestras, y que se puedan obtener resultados
más efectivos; aunque también sugieren la combinación del uso de técnicas
moleculares con pruebas histoquímicas para un diagnóstico certero. De los 36
casos analizados en ese estudio, el 39% (14/36) resultó corresponder a casos
de sífilis secundaria con confirmación serológica (Behrhof et al., 2007).
De los 107 pacientes incluidos en el estudio y de los cuales se analizaron 144
muestras clínicas; 19 de estos pacientes presentaron resultados negativos por
la PCR que detecta el gen polA de T. pallidum pero sin embargo en todos los
casos hubo serología reactiva por las pruebas no treponémicas (VDRL/RPR) y
treponémicas (TPHA).
El 94,7% (18/19) de estos casos correspondió a pacientes con úlceras
genitales y anales sugerentes al chancro primario, según la impresión
diagnóstica. De estos pacientes el 16,7% (3/18) refirió estar administrando
azitromicina, rosefín y tetraciclina 15 días antes de acudir a la consulta, por lo
que esto es un factor a tener en cuenta que pudo intervenir en la detección
molecular de ADN de T. pallidum ya que disminuyó la carga bacteriana en la
lesión, a pesar de ello por las pruebas serológicas no treponémicas se detectó
carga bacteriana debido a que esta prueba detecta una respuesta inmunológica
a partir de la tercera semana de la post-infección y al igual que la prueba
treponémica es una respuesta que se mantiene constante en el tiempo.
En otros dos casos, se obtuvieron resultados de serología reactiva por la
prueba treponémica y no reactivo por la prueba no treponémica, lo cual se
refiere a una infección pasada no a un caso propio de sífilis ya que las pruebas
treponémicas detectan anticuerpos a partir de la semana cinco de la postinfección y se mantiene constante en el tiempo
aún luego de haber sido
tratada la enfermedad, estos casos resultaron estar co-infectados con VHS-2 y
VIH, por lo se trataba de lesiones herpéticas ocasionadas por el VHS-2 y no
por T. pallidum (dato no mostrado).
El resto de los casos refirió que el tiempo de aparición de la lesión osciló entre
los 6 días a las 12 semanas, lo cual refiere que a partir de la cuarta semana de
aparición de la lesión la carga bacteriana disminuye, siendo detectable solo por
serología o por técnicas de biología molecular más sensibles que la utilizada en
la actual investigación.
A pesar de los resultados negativos por la PCR convencional, es necesario
aclarar que estos no descartan la infección; sin embargo, la positividad
encontrada fundamentalmente en los casos de sífilis temprana es de extrema
importancia para la confirmación de los mismos, pues durante este estadio de
la enfermedad el diagnóstico por la técnicas serológicas de rutina no es
concluyente; ello favorecería el tratamiento inmediato de estos casos.
La utilidad de esta técnica consiste en dilucidar casos que sean complejos y
dudosos, especialmente en los que se sospecha sífilis primaria, donde las
características clínicas de la enfermedad pueden confundirse con las de otros
patógenos causantes de úlceras, fundamentalmente genitales, y en casos de
coinfección con VIH donde las manifestaciones clínicas de la sífilis primaria
puede variar; por lo que la aplicación de esta técnica de biología molecular es
complementar el diagnóstico de laboratorio de la infección y no sustituir el
diagnóstico serológico actual.
4.3 Caracterización molecular de T. pallidum mediante la detección por
PCR de las familias génicas arp y tpr
El diagnóstico efectivo de la sífilis no solo depende de su detección temprana a
partir de herramientas moleculares sensibles que permitan la selección de un
adecuado tratamiento para la eliminación de la enfermedad, sino también de un
monitoreo epidemiológico molecular, que permita distinguir entre los subtipos
de T. pallidum más frecuentes según la región en estudio, su asociación con
determinados cuadros clínicos y resistencia a macrólidos; logrando de esta
manera una caracterización molecular del agente causal de la sífilis.
Estudios recientes en diferentes países han propuesto la caracterización
molecular de T. pallidum a partir de la determinación de los patrones obtenidos
por la detección del gen arp, repetido en pequeñas secuencias en tándem en el
genoma bacteriano con una talla de 60 pb, y que hasta el momento no tiene
una función bien dilucidada. En combinación con estos patrones obtenidos por
disposición de la familia génica arp en el genoma bacteriano, se ha estudiado
la familia génica del gen tpr, que también permite la caracterización molecular
de T. pallidum. Actualmente se sugiere que algunos genes pertenecientes a
esta familia génica, pueden estar involucrados en los mecanismos de evasión
del reconocimiento del sistema inmune en la sífilis latente y la ocurrencia de la
persistencia bacteriana, mediante mecanismos de variabilidad genética de esta
familia (La Fond & Luckhart, 2006). Por tanto, la caracterización molecular de
T. pallidum, constituye sin dudas, una herramienta efectiva para el control
epidemiológico de la sífilis.
4.3.1 Reacción en cadena de la polimerasa del gen arp
De los 31 pacientes a los que se le detectó ADN de T. pallidum en las muestras
tomadas, a partir de la detección del gen polA por PCR, solamente se encontró
suficiente cantidad de ADN para la subtipificación del gen arp en 28 muestras,
representando el 90,3% (28/31) de los casos en estudio.
El gen arp contiene una región variable que presenta secuencias de 60 pb
repetidas. La PCR se realizó evaluando los cebadores ARP-1 y ARP-2, a partir
del ADN de la cepa de referencia Nichols de T. pallidum, resultando en un
amplicón de una talla de 1 155 pb, el cual se corresponde con 14 repeticiones
de las secuencias repetidas en tándem en el gen arp. Las tallas de los
amplicones resultantes a partir de la amplificación del ADN de las 28 muestras
clínicas evaluadas en el presente estudio, variaron desde 735 pb a 1 274 pb,
correspondiéndose de 7 a 17 repeticiones, respectivamente. Los productos de
PCR de las muestras más representativas se muestran en la figura 4.2.
Figura 4.2 Electroforesis submarina en gel de agarosa al 1,5% de amplicones
obtenidos por amplificación del gen arp. Línea 1: patrón de peso molecular
(1kb); línea 2: muestra clínica correspondiente al subtipo 7; línea 3: muestra
clínica correspondiente al subtipo 12; línea 5: muestra clínica correspondiente
al subtipo 17; línea 5: muestra clínica correspondiente al subtipo 14; línea 7:
control positivo (ADN de la cepa de referencia Nichols (subtipo 14).
Basado en el número obtenido de repeticiones, fueron agrupadas las 28
muestras en 5 subtipos, los cuales fueron designados de acuerdo al número de
repeticiones, según se ha informado en la literatura, estos subtipos obtenidos
fueron: 7, 10, 12, 14 y 17 respectivamente. El subtipo que más se encontró fue
el correspondiente a 14 repeticiones, el cual representó el 46,4% (13/28) de
las muestras analizadas; el 25% (7/28) correspondió a 12 repeticiones; el
14,3% (4/28) a 10 repeticiones; el 10,7% (3/28) a 7 repeticiones y solamente el
3,6% (1/28) se relacionó con el subtipo correspondiente a 17 repeticiones. El
hallazgo de encontrar los subtipos correspondientes a 14 y 12 repeticiones
como los de mayor prevalencia está en correspondencia con los informes
existentes a nivel internacional.
4.3.1.1 Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) del
gen tpr
A partir de las muestras que resultaron positivas a la presencia de ADN de T.
pallidum, solamente fueron tipificables para la subtipificación del gen tpr 29
muestras realizándose un RFLP a las mismas, representando el 93,5 % (29/31)
de los pacientes incluidos en el estudio con resultados positivos para la PCR
que detecta el gen polA del agente causal de la sífilis, solamente 2 muestras
no presentaron cantidades suficientes de ADN de la bacteria para examinar la
heterogeneidad de la familia génica tpr y ser detectados de esta manera por la
PCR y los ensayos de digestión enzimática con la enzima MseI.
Al realizar el RFLP con la endonucleasa de restricción MseI a los productos
obtenidos de la PCR que amplifica el fragmento de la familia génica tpr, se
obtuvieron 3 patrones designados con las letras: a, d, f, según se muestra en la
figura 4.3. Las diferencias entre los subtipos obtenidos por RFLP se basaron en
la presencia o ausencia de fragmentos de ADN con una talla entre 300 pb y
830 pb. El patrón f se encontró en el 55,2% (16/29) de las muestras, seguido
de los patrones a y d con un 20,7% (6/29) y un 24,1% (7/29) respectivamente.
Los patrones por RFLP de los subtipos obtenidos se representan en la figura
4.3.
Figura 4.3 Electroforesis submarina en gel de agarosa al 2% de los patrones
obtenidos de PCR-RFLP con la enzima MseI del gen tpr. Línea 1: Patrón de
peso molecular (escalera de 1kb); línea 2: muestra clínica correspondiente al
subtipo a; línea 3: muestra clínica correspondiente al subtipo d; líneas 4 y 5:
muestras clínicas correspondientes al subtipo f, línea 6: control positivo (ADN
de cepa de referencia Nichols) correspondiente al subtipo a.
4.3.2 Distribución y prevalencia de los subtipos existentes en Cuba
La Organización Mundial de la Salud ha informado que la cuarta parte de todos
los casos que anualmente se informan de la infección con sífilis, ocurren en
América Latina y el Caribe (Schmid et al., 2009). Estudios publicados
recientemente brindan evidencias de que la sífilis venérea no es solo altamente
endémica de algunas regiones sino que constituye una importante infección de
transmisión sexual en regiones tropicales de América Latina (Clark et al.,
2008). El actual estudio ha sido encaminado fundamentalmente a entender el
comportamiento de la epidemiología molecular de la sífilis en Cuba. En el
mismo se ha demostrado la existencia de una gran heterogeneidad genética en
dos regiones diferentes del genoma del agente causal de la sífilis que permiten
la diferenciación entre cepas de T. pallidum. A partir de la amplificación por
PCR y el análisis por RFLP de estos dos marcadores genéticos diferentes se
ha desarrollado un sistema que permite separar aislamientos de T. pallidum
dentro de un largo número de subtipos diferentes, sentando de esta manera las
bases para un estudio más exhaustivo y profundo de la epidemiologia
molecular de la sífilis.
Las tallas obtenidas en las regiones repetidas en el gen arp proveen el primer
nivel para la diferenciación entre cepas y la subsecuente caracterización
molecular según se mostró en la figura 4.2.
En un segundo nivel de
caracterización fue realizado el análisis por RFLP de los productos de PCR de
la familia génica tpr, porque múltiples copias de estos genes están contenidos
en el cromosoma de T. pallidum, existiendo disímiles variaciones en copias
simples de estos genes.
Los resultados reflejados en el presente estudio muestran una alta diversidad
de aislamientos de T. pallidum, correspondiéndose con los subtipos que están
presentes fundamentalmente en América del Norte y Asia, donde se ha
informado que la sífilis suele ser una enfermedad altamente endémica; además
los subtipos encontrados coinciden con los que más prevalecen en regiones
con cercanía geográfica, tales como: EUA (Marra et al., 2010), Canadá (Martin
et al., 2010), y Colombia (Cruz et al., 2010).
Al combinar los resultados de la subtipificación por los ensayos de arp y tpr los
subtipos que se identificaron fueron: 14f; 14d; 12f; 10f; 12a; 7f; 14a; 17d con
índices de prevalencia de 21,4%; 17,8%; 14,3%; 14,3%; 10,7%; 10,7%; 7,1% y
3,6% respectivamente, sugiriendo la alta diversidad genética que existe entre
las cepas de T. pallidum (figura 4.4), comparadas con Europa y Sudáfrica.
Subtipos circulantes en La Habana, Cuba
25
21,4
17,8
20
15
Frecuencia de
subtipos (%) 10
5
14,3
14,3
10,7
10,7
7,1
4
3
4
3
2
12a
14a
5
6
3,6
1
0
7f
10f
12f
14d
14f
17d
Subtipaje de T. pallidum por la caracteriziación de los genes arp-tpr
Figura 4.4 Prevalencia de los subtipos de T. pallidum encontrados en el
estudio entre junio/2012 y abril/2015.
Según los resultados mostrados anteriormente el subtipo encontrado con
mayor frecuencia es el 14f (21,4%), el cual es de los que ha estado
ampliamente distribuido en la región norte y sur de América. En un estudio
realizado en los EUA en el estado de Arizona, el subtipo 14f tuvo una
prevalencia de un 53,3% al analizar 45 muestras, valor superior al de la
presente investigación (Sutton et al., 2001).
Otra investigación llevada a cabo también en los EUA, pero en el Norte y Sur
de Carolina, al analizar 28 muestras con suficiente ADN de T. pallidum por
ambos métodos de subtipificación sugirió también que el subtipo que más
predominaba era el 14f con una prevalencia de 52,2% (Pope et al., 2005).
Este subtipo también ha sido informado con alta prevalencia en otras regiones
del mundo distantes geográficamente; por ejemplo: en el norte, sur y este de
China se ha encontrado con una frecuencia de 39%, 34% y 43%
respectivamente, según se muestra en la figura 4.5 (Ho & Lukehart, 2011).
Figura 4.5 Distribución de los subtipos encontrados en el estudio en
comparación a lo informado en la literatura internecional (2000-2015).
La relativa alta frecuencia del subtipo 14f sugiere, según se ha documentado
en los diferentes estudios, que es el más transmisible respecto al resto de los
subtipos encontrados (Peng et al., 2012).
En la región de Latinoamérica, hasta la fecha según la literatura revisada, solo
se ha realizado un estudio, específicamente en Colombia, en el cual se informó
que los subtipos de mayor distribución son el 14d y 16d, ambos con 33,3% de
prevalencia (Cruz et al., 2010). Estos resultados difieren con los encontrados
en este trabajo, aunque el subtipo 14d fue el segundo en orden de prevalencia
encontrado en el actual estudio (17,8%).
Precisamente el subtipo 14d es otro de los subtipos de T. pallidum
ampliamente distribuidos a nivel mundial, y por primera vez se da a conocer su
circulación en Cuba. En una investigación llevada a cabo en los EUA se
informó de la prevalencia de este subtipo en pacientes diagnosticados con
sífilis en estadios primario y secundario, al emplear también muestras de
lesiones en piel, área genital, oral y anal. Los resultados obtenidos en ese
estudio reflejaron que la prevalencia del subtipo 14d era de 75,4%, valor
superior al obtenido en esta investigación, pero hay que señalar que el número
de muestras trabajados fue 69, superior a las analizadas en este trabajo (Katz
et al., 2010). Es necesario tener en cuenta que la prevalencia de un subtipo u
otro constituye un factor intrínseco de cada región, aunque evidentemente
entre regiones cercanas debe existir similitud en cuanto a los subtipos que más
circulan.
El subtipo 14d también se ha visto distribuido a nivel mundial en países como
Canadá (Martin et al., 2010), Sudáfrica (Pillay et al., 2002) y Reino Unido (Cole
et al., 2009), los cuales refieren una prevalencia de 87,3%, 27,3% y 75,8%
respectivamente. En cada uno de estos estudios el número de muestras
estudiadas fue superior, por lo que podría existir mayor probabilidad de
encontrar dicho subtipo.
Un aspecto importante a tener en cuenta en la variabilidad de subtipos son las
recientes migraciones a otros países, así como la entrada de personal
extranjero al país. No se puede ignorar tampoco que las personas que
practican el sexo transaccional constituyen un importante factor de riesgo en
todos los países donde la sífilis es considerada una enfermedad de alta
prevalencia; estos pudieran ser un canal de entrada para la alta variabilidad
genética, encontrada en los diferentes subtipos distribuidos e informados en la
presente investigación.
Resulta interesante mencionar que en este estudio los subtipos 14d y 14f, los
de mayor prevalencia, fueron encontrados fundamentalmente en pacientes
infectados por el VIH, representando el 81,8% (9/11) de los casos notificados
con estos subtipos; siendo el 72,7% (8/11) HSH, por lo que se puede estimar
que los subtipos 14d y 14f prevalecen en pacientes coinfectados con VIH y en
la población de HSH. Si se tiene en cuenta que el 72,2% de los casos
diagnosticados con VIH en la población cubana corresponde a HSH (MINSAP,
2014), es de esperar relación entre pacientes HSH con VIH y este subtipo.
Esta posible asociación existente entre los subtipos 14d/f y la condición VIH de
los pacientes, ha sido señalada en solo un estudio realizado en EUA
(Washington), en el cual este fue el principal subtipo y el de mayor prevalencia
en pacientes coinfectados con VIH y que además eran HSH. En dicho estudio
se señaló de que a pesar de que el subtipo 14d/f es el más distribuido en
etapas variadas de la sífilis suele ser común, al menos en esta zona
geográfica, en pacientes que presentan neurosífilis (Marra et al., 2010).
El subtipo 14a no es de los más informados en la región; sin embargo, algunos
autores lo refieren con una baja prevalencia; por ejemplo, en Phoenix, EUA
tuvo una prevalencia de 4% (Ho & Luckehart et al., 2011). Las regiones en las
que se informa con mayor prevalencia son Pretoria en Sudáfrica (Pillay, 2002;
Molepo et al., 2007), Madagascar (Van Damme et al., 2009) y Portugal (Castro,
2009) con cifras de 54%, 15% y 65%, respectivamente. Estos resultados
difieren de los obtenidos en el presente estudio. Se trata de regiones distantes
geográficamente de Cuba y con las que existe aparentemente poco
intercambio de personas o práctica del turismo, por lo que la probabilidad de
su introducción en el país es menor. Ello no significa que no pueda existir una
emergencia del mismo en América Latina y el Caribe, sino que hasta el
momento no ha sido informado en la región con una alta prevalencia.
En las investigaciones realizadas a nivel internacional se ha informado la
circulación del subtipo 12f, específicamente en Phoenix y Baltimore, condados
de los EUA. La frecuencia de este subtipo es menor en comparación a la de los
subtipos 14d y 14f, siendo de 11% y 13%, respectivamente en los condados
anteriormente
mencionados (Ho
&
Lukehart,
2011),
valores que
se
corresponden con los obtenidos en esta investigación. Hasta la fecha, según la
literatura revisada y los resultados que se muestran en este trabajo, parece que
T. pallidum subtipo 12f es exclusivo de América del Norte y el Caribe, aunque
con baja prevalencia.
Otro resultado interesante de la presente investigación es el hallazgo del
subtipo 12a, el que se informa por primera vez en América Latina y el Caribe.
Este subtipo solamente ha sido encontrado en China y en el estudio realizado
en Phoenix, con una prevalencia baja de un 13% en este último (Van et al.,
2009), resultado similar al obtenido en la presente investigación.
En la figura 4.5 se representó el resto de los subtipos que fueron encontrados
en el estudio actual como parte de la caracterización molecular de T. pallidum,
donde se muestra el comportamiento de los subtipos 7f, 10f, 10d y 17d en
Cuba con respecto a su circulación en otros países, demostrando la gran
variabilidad genética de los aislamientos de T. pallidum identificados en las
muestras clínicas analizadas en esta investigación. Aunque la frecuencia de
circulación de estos subtipos es relativamente baja en comparación con otros
subtipos encontrados en América Latina y el Caribe, en otras regiones se ha
encontrado algunos de estos subtipos con prevalencias relativamente iguales a
la informada en este trabajo.
La prevalencia del subtipo 7f en este estudio es superior a la que se informa en
una investigación realizada en regiones del este y sur de China, donde se
informó un valor de 1% (Peng et al., 2011). Aparentemente la circulación de
este subtipo en el continente americano es baja también, ya que hasta el
momento ningún estudio ha informado la existencia del mismo.
En el estudio realizado en Colombia, encaminado a caracterizar los
aislamientos de T. pallidum en pacientes con lesiones características de sífilis
secundaria, se encontró una gran variabilidad de subtipos que se informaron
por primera vez en la región (es el primer estudio que se realiza); además de
los subtipos 14d y 16d, se informaron el 13d y 22a. Es interesante como en la
caracterización de aislamientos provenientes de un mismo estadio de la sífilis
se encuentra una gran variedad de subtipos, sosteniendo ello el grave
problema que representa la sífilis en el mundo actual.
Los subtipos 10f y 17d han sido descritos fundamentalmente en el norte y sur
de China con una prevalencia de 1% y 3%, respectivamente (Martin et al.,
2009). En cambio, en Sudáfrica se ha dado a conocer que el subtipo 17d ha
tenido una prevalencia mayor (13%) (Mueller et al., 2012). El subtipo 10f en la
muestra de pacientes cubanos estudiados tuvo una prevalencia mayor a la
informada en China; sin embargo, es similar con la dada a conocer en un
estudio realizado en EUA (9%) (Pope et al., 2005).
4.4 Detección de las mutaciones A2058G y A2059G responsables de la
resistencia a los macrólidos en el gen ARNr 23S
Para el tratamiento de la sífilis es usado comúnmente a nivel internacional la
penicilina G (Grange et al., 2012); sin embargo, durante los últimos 10 años se
informa un incremento en el número de pacientes alérgicos a la penicilina. Ello
unido a la poca conformidad de los pacientes para administrarse la dosis
intramuscular de penicilina G benzatínica hacen que se requiera de
tratamientos alternativos (Mateˇ jkova et al., 2009). La relativa baja toxicidad y
el fuerte efecto bacteriostático de los macrólidos constituyen razones para el
uso de la eritromicina y la azitromicina, así como de las tetraciclinas, para el
tratamiento de la sífilis en sus diferentes etapas (Hook et al., 2010).
A diferencia de la penicilina los macrólidos representan un riesgo de falla
terapéutica en el tratamiento de la sífilis, debido a que se ha informado alta
resistencia en T. pallidum codificada en el cromosoma bacteriano, trayendo
consigo el subtipo resistente a los macrólidos, causado por un fenómeno de
transición en el gen ARNr 23S que ocasiona un cambio de base [Adenina (A)
por Guanina (G)] en dos posiciones diferentes del gen (posiciones 58 y 59) y
por tanto, la presencia en el genoma de dos puntos de mutación, que le
confieren resistencia a los macrólidos (Hook et al., 2002).
Para Mycoplasma genitalium se han informado genotipos resistentes a
eritromicina y espiramicina (macrólidos), con la presencia de las mutaciones
A2058G y A2059G descritas en T. pallidum, del tipo microlesiones, con un
cambio de A por G en una secuencia de nucleótidos del gen ARNr 23S del
genoma bacteriano (Lucier et al., 1995). Debido a la presencia de estas dos
mutaciones tanto en M. genitalium como en T. pallidum, en el presente estudio
se realizó un primer ensayo con cepas de referencia de M. genitalium
resistentes
a los macrólidos con presencia de las mutaciones A2058G y
A2059G, una cepa sensible de M. genitalium y la cepa de referencia Nichols de
T. pallidum sensible también a los macrólidos, obteniéndose en las cepas
resistentes de M. genitalium, luego de la digestión enzimática con las enzimas
MboII y BsaI, amplicones de aproximadamente 100 pb y 200 pb, y en la cepa
sensible de micoplasma un solo amplicón de 400 pb; en el caso de la cepa de
referencia de T. pallidum se obtuvo un amplicón de 629 pb, correspondiéndose
con las tallas informadas en la literatura (Martínez et al., 2006).
Las condiciones para la realización de la PCR que amplifica el fragmento de
629 pb fueron optimizadas, obteniendo mejores resultados al emplear 0,2 µL de
cada cebador (10 µM) en la mezcla de reacción. Utilizando estas condiciones
se evaluaron las muestras positivas para la PCR que amplifica el gen polA de
T. pallidum correspondientes a 31 pacientes, estudiando solo una de las
muestras por paciente, en los casos donde se tomaron duplicadas. Solo una de
las muestras no presentó suficiente ADN para ser detectado por la PCR que
amplifica el fragmento interno de 629 pb. En la figura 4.6 se muestran los
patrones obtenidos por amplificación del gen ARNr 23S, en las muestras donde
no hay mutación se observa un único amplicón de 629 pb, y donde hay
presencia de la mutación A2058G se observan dos fragmentos de restricción
de 449 y 180 pb.
Figura 4.6 Electroforesis submarina en gel de agarosa al 1% de la digestión
enzimática con MboII de los productos amplificados por PCR para la detección
de la mutación A2058G. Línea 1: patrón de peso molecular (100 pb); línea 2:
ADN de cepa de referencia Nichols (sensible a los macrólidos); líneas 3 y 4:
muestras clínicas sin la mutación A2058G; líneas 5, 6,7 y 8: muestras clínicas
con la mutación A2058G.
El 56,7% (17/30) de las muestras analizadas resultaron resistentes a los
macrólidos, detectándose la mutación A2058G por los ensayos de digestión
enzimática con la enzima MboII. Para estas muestras se obtuvieron dos
amplicones con tallas de 449 pb y 180 pb, lo que indica la presencia de este
punto de mutación. Sin embargo, no se detectó la mutación A2059G al realizar
la digestión enzimática con BsaI, pues en todos los casos se obtuvo un solo
amplicón correspondiente a 629 pb, lo cual indica la ausencia de este punto de
mutación en el genoma de T. pallidum. Estos resultados revelan una alta
prevalencia de la resistencia a macrólidos producto de la existencia del punto
de mutación A2058G.
El porcentaje de resistencia encontrado es superior en relación a otros estudios
realizados a nivel internacional durante los últimos cinco años, en los cuales a
pesar de utilizarse técnicas moleculares más sensibles los resultados obtenidos
para la detección de la mutación A2058G fue de 52,1% (66/129) (Chen et al.,
2013).
En otros estudios, en los que la metodología realizada ha sido igual a la
realizada en la presente investigación, se informó 18,2% (4/22) de casos
resistentes a azitromicina en la República Checa (Mateˇ jkova et al., 2009) y
19,4% (7/36) en Canadá (Martin et al., 2010). Solo en un estudio realizado en
los EUA, se obtuvo un resultado superior de 67,7 % (42/62) (Katz et al., 2007).
Investigaciones realizadas en los últimos años sugieren que los pacientes
coinfectados con VIH tienen la tendencia a incrementar el porcentaje de casos
con fallos serológicos para el tratamiento de la sífilis (Horberg et al., 2010).
Aunque la repercusión de la coinfección con VIH para el tratamiento terapéutico
antibacteriano en pacientes con sífilis aún no está bien dilucidado, se piensa
que existe una relación entre pacientes coinfectados con VIH y la presencia de
cepas de T. pallidum resistentes a azitromicina (Marra et al., 2010).
De las 17 muestras que resultaron resistentes a macrólidos, el 52,9% (9/17)
resultó ser de pacientes coinfectados con VIH. Este resultado hace pensar en
una posible relación entre subtipos resistentes de T. pallidum y la coinfección
con VIH, y esto podría verse apoyado por las observaciones de algunos
autores cuando han constatado que una respuesta satisfactoria a la terapia
antirretroviral provoca una reducción en la velocidad de fallas serológicas para
la sífilis en el 65% de los casos, disminuyendo la probabilidad de desarrollar
neurosífilis,
sugiriendo
que
la
terapia
antirretroviral
puede
mejoramiento en la respuesta inmune local contra T. pallidum
traer
un
y un mejor
control de la infección (Poliseli et al., 2008).
De los pacientes en los que se detectó la mutación A2058G, uno manifestó
haber recibido tratamiento con doxiciclina por otra causa una semana antes de
acudir a la consulta y llevaba con la lesión genital solo dos días; se trataba
además de un paciente seronegativo al VIH y coinfectado con el VHS-2 (dato
no mostrado en el estudio). La doxiciclina, perteneciente al grupo de las
tetraciclinas, es otro de los tratamientos alternativos que se utiliza para
pacientes alérgicos a la penicilina, y hasta el momento no se han informado
fallas terapéuticas con el mismo (Ho & Lukehart, 2011), aunque se informan
mecanismos de resistencia comunes para los macrólidos y tetraciclinas en
otros microorganismos como Neisseria gonorrhoeae, agente causal de la
gonorrea (Lewis & Lukehart, 2011).
Conociendo que el periodo de incubación de T. pallidum puede oscilar de 10 a
90 días a partir del contacto del hospedero con el microorganismo, resulta
interesante que este antimicrobiano no hubiese tenido efecto sobre el proceso
de infección treponémica y la aparición de la lesión. Este es uno de los
antibióticos más usados a nivel internacional para el tratamiento alternativo de
la sífilis, debido a que se administra por vía oral y porque se mantiene más
tiempo circulando en sangre en comparación con los macrólidos. Este hallazgo
de posible resistencia se podría apoyar en la existencia, en otros
microorganismos, de un punto de mutación en el gen ARNr 16S de la unidad
ribosomal 30S que trae consigo la resistencia a la doxiciclina (Stamm et al.,
2010).
La no detección de la mutación A2059G en las muestras estudiadas se
corresponde con un estudio realizado en Sudáfrica en el cual no se obtuvo
patrones de resistencia para esta mutación en los pacientes analizados
diagnosticados con sífilis, aunque en el 3% de los casos se detectó la mutación
A2058G, indicando niveles bajos de resistencia en esta región (Mueller et al.,
2012).
Algunos estudios han sugerido que la mutación A2059G en el gen ARNr 23S
de T. pallidum está relacionada con aislamientos de pacientes con historial
clínico de fallas en el tratamiento con espiramicina (Vester & Douthwaite,
2001), el cual constituye un macrólido de 16 átomos de carbono que actúa
como inhibidor de la síntesis proteica (Calvo & Martinez-Martinez et al., 2009).
Otros autores no concuerdan con este planteamiento y plantean que ambos
puntos de mutación están relacionados igualmente con la resistencia a los
macrólidos: azitromicina, eritromicina y espiramicina (Zhou et al., 2010). Sin
embargo, los datos informados de la determinación de aislamientos resistentes
a macrólidos producto de la mutación A2059G en diferentes regiones
geográficas en la actualidad son escasos (Katz & Klausner, 2008; Wu et al.,
2012), lo cual no indica la ausencia de casos de resistencia a los macrólidos,
sino la no detección hasta el momento de este punto de mutación, responsable
también de la resistencia a macrólidos.
Este constituye el primer estudio que se realiza un Cuba y el segundo en
América del Sur, en el cual se estudia la resistencia de aislamientos de T.
pallidum a macrólidos; obteniéndose resultados elevados de resistencia,
fenómeno que puede estar determinado debido a que la azitromicina es un
medicamento frecuentemente utilizado para el tratamiento y prevención de un
número elevado de infecciones no sifilíticas, de origen respiratorio y de
infecciones de transmisión sexual causadas por Mycoplasma y Chlamydia
trachomatis; lo cual podría incidir en el desarrollo de mecanismos de
resistencia por T. pallidum (Marra et al., 2006).
Uno de los principales problemas a enfrentar por la comunidad científica en el
campo del tratamiento de la sífilis, debido a que T. pallidum no es cultivable in
vitro, es la evaluación de nuevos grupos o líneas de antibióticos como
alternativas terapéuticas; para ello sería necesario realizar ensayos en modelos
animales a través de la inoculación de treponemas en testículos de conejos,
procedimiento que es sumamente laborioso y que requiere de personal
adiestrado. Igualmente será interesante la determinación de nuevos puntos de
mutaciones que confieran resistencia a otros tratamientos alternativos como las
tetraciclinas.
Desde los comienzos de la epidemia del VIH/SIDA, ha existido un aumento
significativo del VIH-1 en pacientes con sífilis. Desde el 2002, el CDC informó
que el 25% de los casos de sífilis primaria y secundaria ocurre en personas
infectadas con VIH, y la incidencia de sífilis en personas infectadas con VIH es
mayor que en la población en general. El incremento en la incidencia de la
sífilis en pacientes infectados con VIH se debe esencialmente a factores
inmunológicos del hospedero y factores bacteriológicos (Workowski & Berman,
2010).
La aparición del chancro sifilítico facilita la adquisición y transmisión del VIH por
trastornos a las barreras epiteliales y mucosas (Greenblatt, 1988). Además, el
influjo de células del sistema inmune aumenta en las lesiones sifilíticas el
número de dianas celulares disponibles para la infección por VIH. Las
lipoproteínas de T. pallidum incrementan la expresión de CCR5, un miembro de
la familia de receptores de las quimiocinas, y la expresión del receptor en
macrófagos y células dendríticas que actúan como correceptor para la entrada
del VIH al interior de las células CD4+ (Sheffield et al., 2007). Debido a estos
aspectos, se ha sugerido que la coinfección con T. pallidum tiene un efecto
nocivo en el estado inmunológico y virológico en personas infectadas con VIH,
influyendo el tratamiento para la sífilis, aunque estos datos aún no están bien
dilucidados (Palacios et al., 2007).
Se ha demostrado que el tratamiento con azitromicina como medicamento
alternativo presenta fallos terapéuticos asociados a la resistencia de T.
pallidum, según informes en diferentes partes del mundo (Katz et al., 2007). A
esta situación se le añade que el grupo más vulnerable a contraer la infección
por T. pallidum, según lo informado en el presente estudio y otras
investigaciones a escala internacional, son los HSH y que a su vez presentan la
infección por VIH debido al compromiso del sistema inmune. Esta última
condición representa un grave problema de salud, ya que los pacientes con la
coinfección sífilis/VIH y que a su vez son resistentes al tratamiento alternativo
con azitromicina y alérgicos a la penicilina G, constituye un llamado de alerta a
la comunidad científica de salud.
La OMS recientemente ha estimado que 10,6 millones de casos nuevos de
sífilis son informados cada año, e igualmente ha informado de la emergencia
de cepas de T. pallidum resistentes a los macrólidos, resaltando la importancia
de las investigaciones en el campo de la epidemiologia molecular (Stamm,
2010). A nivel mundial la tipificación molecular de muestras clínicas de T.
pallidum ha ayudado a la caracterización temprana de la sífilis, evaluación de
los subtipos asociados con neurosífilis, monitorear la resistencia a macrólidos
(Martin et al., 2010), diferenciar entre episodios de recaídas y reinfección y a
entender mejor las distribuciones geográficas y temporales de las poblaciones
de T. pallidum (Cole et al., 2009).
Algunos autores han sugerido una posible relación entre algunos subtipos de T.
pallidum y la posible existencia de un punto de mutación u otro o de ambos en
los aislamientos clínicos (Marra et al., 2010; Wu et al., 2012). Según los
resultados obtenidos en esta investigación se detectó resistencia en todos los
subtipos encontrados (figura 4.7), con valores superiores al 50% en cinco de
los ocho subtipos (12a, 12f, 14a, 14d, 17d).
Figura 4.7 Frecuencia de subtipos de T. pallidum resistentes a macrolidos en
las muestras en estudio.
En un estudio realizado en Canadá se informó que el subtipo más común fue el
14d y que este se vio mayormente asociado a la presencia de la mutación
A2058G, detectado en el 16,6% (5/30) de los aislamientos (Martin et al., 2010).
En otro estudio llevado a cabo en China se informó que el subtipo más
asociado a la resistencia a los macrólidos fue el 14f detectado en un 50%
(9/18) de los aislamientos caracterizados (Wu et al., 2013). En Washington,
EUA recientemente se sugirió también que los subtipos 14d/f y 14d/g están
mayormente asociados a la resistencia a los macrólidos con los puntos de
mutación A2058G y A2059G indistintamente que confieren resistencia a los
macrólidos, con una prevalencia de un 88,9% (32/36) (Grimes et al., 2013).
En cambio, en un estudio realizado en Sudáfrica se sugirió que el subtipo 14b
era el asociado a la mutación A2059G (Mueller et al., 2012), siendo el único
que ha informado la relación existente entre este subtipo y el fenómeno de
resistencia a macrólidos.
Aunque los subtipos informados con mayor prevalencia en cuanto a la
resistencia a los macrólidos difieren en la caracterización asignada por tpr,
queda claro que el subtipo 14 identificado por la caracterización del gen arp,
presenta relación directa con la existencia de las mutaciones A2058G y
A2059G.
La resistencia a los macrólidos está a menudo asociada con una alteración del
sitio diana en el dominio V en la región peptidiltransferasa del ARNr 23S,
mediante la ocurrencia de una mutación o una metilación. Estos dos puntos de
mutaciones descritos hasta el momento en T. pallidum, son mutaciones
puntuales que ocurren en una secuencia de nucleótidos del genoma
bacteriano. Estas microlesiones ocurren al azar de forma endógena y
espontánea, por lo que es poco probable que se pueda establecer una relación
entre la presencia de un punto de mutación de acuerdo a un subtipo
determinado ya que la diferenciación entre un subtipo u otro se encuentra en la
disposición de los genes arp y tpr en el genoma, y estas disposiciones no están
dadas por la selección o no de las cepas de T. pallidum al estar en contacto
con el antibiótico.
Los análisis de secuencia del genoma de T. pallidum han revelado que este
tiene carencia de elementos genéticos como: plásmidos, bacteriófagos, y
transposones, comúnmente asociados con los mecanismos de trasferencia
horizontal de genes como: transformación, conjugación y transducción, que
constituyen una vía para la adquisición de resistencia (Stamm et al., 2010), por
lo que la existencia de estas mutaciones son consecuencias de una resistencia
intrínseca, que ocurre de manera espontánea y al azar.
En la presente investigación se informa por primera vez que el subtipo más
común de T. pallidum en los pacientes cubanos objeto de estudio es el 14f y
que está relacionado a la resistencia a los macrólidos, y que además es más
frecuente en pacientes HSH coinfectados con VIH.
Conclusiones
1. Se ratifica la utilidad de la PCR como herramienta complementaria para el
diagnóstico temprano de la sífilis, fundamentalmente en pacientes con lesiones
primarias y resultados negativos por serología; lo que avala su empleo en el
diagnóstico de esta entidad infecciosa.
2. La elevada versatilidad de los subtipos de T. pallidum circulantes en los
pacientes estudiados sugiere un patrón de transmisión heterogéneo en Cuba
que apunta a futuros estudios de epidemiología molecular.
3. Las altas cifras de resistencia a macrólidos detectadas en los subtipos
encontrados constituye un problema para la salud pública cubana, pues este
hallazgo conlleva a fallas terapéuticas al emplear los tratamientos alternativos.
V. Recomendaciones
1. Informar a las autoridades de Salud Pública de Cuba sobre los resultados
encontrados en esta investigación.
2. Implementar herramientas moleculares más sensibles para el diagnóstico de
la sífilis temprana en Cuba.
3. Extender la subtipificación molecular y la detección de resistencia a
macrólidos a muestras de pacientes de las diferentes regiones del país.
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Anexos
1. Encuesta epidemiológica
Encuesta clínico-epidemiológica
para estudio de lesiones genitales
Nombre del paciente:_____________________________________________
Fecha: __________Identificación de la muestra:_________
Edad: _______
1.
Sexo:_______
No. Historia Clínica____________________
Mantiene relaciones sexuales con:
___ personas del mismo sexo___ personas del sexo contrario___ personas de ambos sexos
___ siempre con la misma persona
___ con varias personas conocidas, siempre las mismas
___ esporádicamente con personas desconocidas o poco conocidas
___ frecuentemente con personas desconocidas o poco conocidas
2.
Usa condón: No____
3.
Es paciente seropositivo al VIH: Sí ____
4.
Ha tenido anteriormente otra infección de transmisión sexual:
No____ Sí ____
Sí ____
Siempre____ A veces____
No____
Cuál______________ Cuándo____________
5.
Qué tiempo lleva con la lesión: _________
6.
# lesiones genitales:_______
7.
Localización de la lesión:
Hombres:Glande o prepucio_____Cuerpo del pene____
Base del pene____ Otra (cuál)_______
Mujeres:Labios mayores____
Vagina____
Labios menores____
Endocervix____ Otra (cuál)_______
8.
La lesión es dolorosa: Sí ____No ____
9.
Presencia de secreción en la lesión: Sí ____No ____
10. Ha recibido algún tratamiento con antibióticos o antiviral durante los últimos 15 días:
No____
Sí ____
Cuál______________
11. Mencione otros signos o síntomas clínicos que presente:
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
_________
2. Preparación de geles y soluciones
Alcohol 70%

Diluir 70 mL de etanol absoluto en 30 mL de agua bidestilada estéril

Identificar y conservar a temperatura ambiente.
Tampón Tris-Borato-EDTA (TBE) pH 8 (0,5X)
1. Solución Madre de TBE a 5X, para 1 L se utilizarán:
Componentes
Cantidad
Tris Base
54 g
Acido bórico
27,5 g
EDTA 0,5M
20 mL
H2O bidestilada
800 mL

Homogenizar

Ajustar pH a 8

Completar con agua bidestilada estéril hasta 1 L.

Identificar y conservar a 4oC.
2. Solución de trabajo TBE a 0,5X, para 1 L se utilizarán:

100 mL de TBE 5X

900 mL de H2O bidestilada estéril

Identificar y conservar a 4oC.
Gel de Agarosa al 2%

Pesar 2 g de agarosa para ácidos nucleicos

Añadir 100 mL de tampón TBE 0,5X

Calentar en baño de María hasta que la solución se torne translúcida
totalmente

Dejar refrescar hasta una temperatura aceptable por la piel de la mejilla

Adicionar cuidadosamente 3 µL de Bromuro de Etidio (10 mg/mL)

Homogenizar

Verter sobre el molde y colocar el peine (todo sobre una superficie a nivel)

Esperar a que solidifique y retirar con cuidado el peine.
Gel de Agarosa al 1,5%

Pesar 0,9 g de agarosa para ácidos nucleicos

Añadir 60mL de tampón TBE 0,5X

Calentar en baño de María hasta que la solución se torne translúcida
totalmente

Dejar refrescar hasta una temperatura aceptable por la piel de la mejilla

Adicionar cuidadosamente 3 µL de Bromuro de Etidio (10 mg/mL)

Homogenizar

Verter sobre el molde y colocar el peine (todo sobre una superficie a nivel)

Esperar a que solidifique y retirar con cuidado el peine.
Gel de Agarosa al 1%

Pesar 0,7 g de agarosa para ácidos nucleicos

Añadir 60mL de tampón TBE 0,5X

Calentar en baño de María hasta que la solución se torne translúcida
totalmente

Dejar refrescar hasta una temperatura aceptable por la piel de la mejilla

Adicionar cuidadosamente 3 µL de Bromuro de Etidio (10 mg/mL)

Homogenizar

Verter sobre el molde y colocar el peine (todo sobre una superficie a nivel)

Esperar a que solidifique y retirar con cuidado el peine.
Bromuro de etidio (10 mg/mL)
Usar guantes:

Disolver 0,1 g de Bromuro de Etidio en 10 mL de agua destilada

Homogenizar con agitador por varias horas hasta que esté todo disuelto y
siempre protegido de la luz

Alicuotar en volúmenes de 1 mL y cubrir con papel de aluminio.

Identificar y conservar a 4oC.
Precauciones Importantes:

El bromuro de etidio es cancerígeno por lo que debe ser manipulado con
extremo cuidado, uso de guantes y naso buco.

Los frascos que se utilicen para este reactivo no se emplearán para otro
objetivo