Tesis Jimena Bustamante Giraldo

Comparación de los proteomas de la semilla de dos genotipos de Coffea
arabica L. con diferencias en el nivel de oviposición de la broca del café
Hypothenemus hampei (Ferrari) (Coleoptera: Curculionidae: Scolytinae).
LILIANA JIMENA BUSTAMANTE GIRALDO
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS
MAESTRÍA EN CIENCIAS AGRARIAS – FITOMEJORAMIENTO
PALMIRA, 2013.
Comparación de los proteomas de la semilla de dos genotipos de Coffea
arabica L. con diferencias en el nivel de oviposición de la broca del café
Hypothenemus hampei (Ferrari) (Coleoptera: Curculionidae: Scolytinae).
LILIANA JIMENA BUSTAMANTE GIRALDO
Tesis o trabajo de investigación presentada(o) como requisito parcial para optar al título
de: Magister en Ciencias Agrarias con énfasis en Fitomejoramiento
DIRECTOR
JOSÉ RICARDO ACUÑA ZORNOSA
Biólogo. Ph.D. Investigador Científico III.
Disciplina de Mejoramiento Genético y Biotecnología.
Centro Nacional de Investigaciones de café, Cenicafé.
CODIRECTOR
KARINA LÓPEZ LÓPEZ
Ingeniera Bioquímica. PhD
Profesor asosiado. Facultad de Ciencias Agropecuarias
Universidad Nacional de Colombia Sede Palmira
ASESORES
JENNY DIMELZA GOMEZ
Microbióloga Msc.
CLAUDIA PATRICIA BOLIVAR
Química Industrial.
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
FACULTAD DE CIENCIAS
MAESTRÍA EN CIENCIAS AGROPECUARIAS – FITOMEJORAMIENTO
PALMIRA, 2013
DEDICATORIA.
A Dios, por haber iluminado el camino durante la realización de este trabajo.
A mis padres Francisco Javier y Nancy por ser el motor de mi vida, por guiar todos
mis pasos y por haberme dado las herramientas mas valiosas de mi vida.
A Alejandro por su amor, todas su palabras de motivación y animo cada vez que
fue necesario.
AGRADECIMIENTOS
Al centro Nacional de Investigaciones de Café “Pedro Uribe Mejia”
Al Ministerio de agricultura y Desarrollo Rural por el apoyo financiero
A la Universidad Nacional de Colombia Sede Palmira y sus profesores
A la Disciplina de Mejoramiento Genético y Biotecnología de Cenicafé.
Al Doctor Hernando Cortina por brindarme la oportunidad de realizar mi maestría.
Al Doctor Ricardo Acuña por sus aportes a esta investigación.
A la Doctora Pilar Moncada por su gran ayuda y colaboración en este trabajo
A la Doctora Karina López, por su asesoría.
A Claudia Bolívar y Jenny Gómez por sus conocimientos aportados, por su ánimo
para lograr este objetivo y por su valiosa amistad.
A Fernando Castillo y Gladys Romero por su gran apoyo y amistad.
A Jonathan Núñez por sus aportes en el análisis de las secuencias
A mis compañeros de trabajo y a todas las personas que con su orientación,
apoyo y cariño ayudaron en el desarrollo de este trabajo.
TABLA DE CONTENIDO
INDICE DE FIGURAS ............................................................................................. 9
LISTA DE ANEXOS .............................................................................................. 11
RESUMEN ............................................................................................................ 15
ABSTRACT........................................................................................................... 16
1. INTRODUCCION ............................................................................................ 17
2. OBJETIVOS ................................................................................................... 19
2.1 General .......................................................................................................... 19
2.2 Específicos ................................................................................................... 19
3. MARCO TEÓRICO ......................................................................................... 20
3.1
Generalidades sobre Coffea ..................................................................... 20
3.2
Generalidades de la broca ........................................................................ 21
3.2.1
Daño ........................................................................................................ 22
3.2.2 Manejo integrado de la broca del café. ................................................ 23
3.2.2.1 Control cultural ...................................................................................... 23
3.2.2.2 Control químico ..................................................................................... 24
3.2.2.3 Control biológico ................................................................................... 24
3.2.2.4 Control genético .................................................................................... 25
3.3 Proteomica ................................................................................................. 28
3.3.1 Separación de las proteínas. .................................................................... 31
3.3.2 Identificación de proteína por espectrometría de masas .......................... 34
3.3.3 Interpretación de los datos ....................................................................... 36
3.4 Antecedentes de proteómica en Coffea arabica y Hypothenemus
hampei .................................................................................................................. 36
4. MATERIALES Y METODOS .......................................................................... 39
4.1
Localización ............................................................................................... 39
4.2
Material Biológico ...................................................................................... 39
4.3 Extracción de proteínas de la semilla de Coffea arabica ....................... 39
4.3.1 Protocolo 1 ............................................................................................... 40
4.3.2 Protocolo 2 ............................................................................................... 41
4.3.3 Protocolo 3 ............................................................................................... 42
4.4 Separación de las proteínas por Eletroforesis Bidimensional (2-D) ..... 43
4.4.1 Primera dimensión: Isoelectroenfoque (IEF) ............................................ 43
4.4.2 Segunda dimensión SDS-PAGE .............................................................. 44
4.4.3 Tinción...................................................................................................... 44
4.5
Digitalización y análisis de las imágenes de los geles bidimensionales
45
4.6 Electroforesis de diferencial en gel (DIGE) ............................................. 45
4.6.1 Marcaje de proteínas primera y segunda dimensión ................................ 45
4.6.2 Adquisición de la imagen y análisis de datos ........................................... 47
4.7
Identificación de las proteínas. ................................................................ 48
4.8
Clasificación de las proteínas por función.............................................. 51
5. RESULTADOS ............................................................................................... 53
5.1
Extracción, limpieza y concentración de las proteínas ......................... 53
5.2
Separación de las proteínas por Electroforesis Bidimensional (2-D) ... 55
5.3 Proteómica Diferencial entre semillas de Caturra y CCC 534 ............... 57
5.3.1 Análisis de las imágenes .......................................................................... 58
5.3.2 Identificación de las proteínas .................................................................. 59
6. DISCUSIÓN .................................................................................................... 66
6.1
Proteínas con actividad oxidoreductasa ................................................. 68
6.2
Proteasas y proteínas de defensa............................................................ 72
6.3
Proteínas involucradas en transferasa .................................................... 79
6.4
Proteínas involucradas en la unión de ATP ............................................ 81
6.5
Proteínas de choque térmico ................................................................... 82
6.6
Proteínas involucradas en la unión ARN................................................. 84
6.7
Proteína de Unión de ARNr....................................................................... 84
6.8
Proteínas con actividad lipoxigenasa ...................................................... 85
6.9
Proteínas de transporte de electrones .................................................... 85
6.10 Proteínas de almacenamiento .................................................................. 86
6.11 Proteína involucrada con la Unión de iones de Magnesio..................... 87
6.12 Proteínas involucradas en la Unión de GTP ........................................... 87
7. CONCLUSIONES ........................................................................................... 89
8. PERSPECTIVAS ............................................................................................ 90
9. BIBLIOGRAFÍA .............................................................................................. 91
ANEXOS ............................................................................................................. 115
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Esquema de la obtención de un proteoma.……………………………….32
Figura 2. Dibujo esquemático del concepto de electroforesis en gel diferencial
usando el marcaje de proteínas con fluorocromos…………………………47
Figura 3. Plataforma del programa PDQuest para el análisis comparativo de los
mapas proteómicos bidimensionales realizados a semillas de Caturra
(barra inferior color rojo) y CCC 534 (barra inferior verde). El Gel Máster
(barra
inferior
de
color
blanco)…………………………………………………………………………..49
Figura 4. Gel Máster construido a partir de comparaciones entre los geles
bidimensionales de semillas de Caturra y CCC 534.………………………49
Figura 5. Electroforesis unidimensional de proteínas de semillas de Caturra y CCC
534……………………………………………………………………………….53
Figura 6. Electroforesis unidimensional de semillas de café de las introducciones
CCC 534 y Caturra …………………………………………………………….54
Figura 7. Mapa proteómico de las semillas de café variedad Caturra y CCC 534.
Geles de 7cm, realizado en la cámara de electroforesis Mini-Protean..…56
Figura 8. Mapa proteómico de las semillas de café variedad Caturra Geles 17cm,
realizado en la cámara Protean-Cell…………………………………………56
Figura 9. Mapa proteómico de semillas de café variedad Caturra y CCC 534.
Geles de 24cm, realizado en la cámara Dodeca-Cell.……………………..57
Figura 10. Patrones electroforéticos de proteínas de los extractos de semillas de
Caturra y CCC 534 con la técnica 2D-DIGE.………………………………..59
Figura 11. . Gel preparativo de semillas de la introducción CCC 534, indicando las
manchas proteicas aisladas para identificación por espectrometría de
masas. .
Cada gel con 1.0mg de proteína, teñidos con Sypro
Rubi……………………………………………………………………………...60
Figura 12. Ilustración de sobreabundancia y proteínas diferenciales identificadas
en semillas de CCC534 y caturra. Cada barra representa el valor medio de
de
las
dos
replicas…………………………………………………………………………..61
Figura 13. Clasificación de las proteínas identificadas en CCC534, de acuerdo a la
función
en
la
cual
intervienen………………………………………………………………………62
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Diseño del experimento de electroforesis diferencial con DIGE.………...46
Tabla 2. Códigos de las manchas proteicas de la introducción CCC 534 enviadas
a secuenciación por espectrometría de masas en la Universidad de
Stanford. ………………………………………………………………………….50
Tabla 3. Proteínas de CCC534 identificadas con la base de datos de plantas y de
café………………………………………………………………………………...64
Tabla 4. Proteínas de CCC534 identificadas con la base de datos de plantas y de
café.………………………………………………………………………………..65
LISTA DE ANEXOS
ANEXO 1: Protocolo para la preparación de las muestras de interés y extracción
de las proteínas……………………………………………………………...115
ANEXO 2: Protocolo para la limpieza y purificación de las proteínas de semillas de
café con el ReadyPrep 2-D Clean-up Kit de Bio-RadTM………………...117
ANEXO
3:Curva de calibración para cuantificación de proteínas en
Espectrofotómetro…………………………………………………………..120
ANEXO 4: Rehidratación de las tiras de isoelectroenfoque con las proteínas
solubilizadas………………………………………………………………….122
ANEXO 5: Enfoque Isoeléctrico (IEF) de las proteínas (Primera dimensión)…...124
ANEXO 6: Equilibración de los geles IPG enfocados……………………………...127
ANEXO 7: Electroforesis SDS-PAGE (Polyacrylamide Gel Electrophoresis).
Segunda dimensión…………………………………………………………129
ANEXO 8: Fijación y tinción de los geles bi-dimensionales……………………….134
ANEXO 9: Electroforesis Diferencial en Geles Bidimensionales de proteínas de
semillas de variedades de Coffea arabica (DIGE)……………………….136
RECURSOS INFORMÁTICOS
BRENDA
http://www.brenda.uni-koeln.de
EXPASY
http://us.expasy.org/tools/dna.html
NCBI
http://www.ncbi.nlm.nih.gov
MASCOT
www.matrixscience.com
SWISS-PROT
http://us.expasy.org/expasyhunt/
TIGR
http://www.tigr.org
UNIPROTKB
http://www.uniprot.org/uniprot/
PRODOM
http://prodom.prabi.fr/prodom/current/html/home.php
PFAM
http://pfam.sanger.ac.uk
ABREVIATURAS UTILIZADAS
(k)Da kilodalton
µg microgramos
µl microlitros
2-DE electroforesis bidimensional (two Dimensional Electrophoresis)
ADN ácido desoxirribonucleico
APS persulfato de amonio (Ammonium Peroxodi-Sulfate)
BSA albúmina de suero bovino (Bovine Serum Albumin)
DTT ditiotreitol
ESTs secuencias expresadas (Expressed Sequence Tags)
IAA iodoacetamida (iodoacetamide)
IEF isoelectroenfoque (Isoelectrofocusing)
IPG gradiente inmovilizado de pH (immobilized pH gradient)
LC/MS-MS cromatografía líquida y espectrometría de masas en tándem
M molaridad
m/z relación masa/carga
MALDI ionización de muestras por láser (Matrix Assisted laser Desorption
Ionization)
ml mililitro
mm milímetro
mM milimolar
Mowse (Molecular Weight Search)
MS-MS espectrómetro de masa-masa
MW peso molecular
nm nanomoles
PAGE electroforesis en gel de poliacrilamida (PolyAcrylamide Gel electrophoresis)
pl punto isoeléctrico (isoelectric point)
PM peso molecular
PMF espectros de masas de péptidos
rpm revoluciones por minuto
SDS dodecil sulfato sódico (sodium dodecyl sulfate)
SDS-PAGE electroforesis en geles de poliacrilamida con el denaturante dodecilsulfato sódico
SA sobre-acumuladas
TCA acido tricloroacético
TEMED N,N,N’, N’-tetrametil-etilendiamina
Tris trisina
UV ultra violeta
V voltios
V/gel voltios por gel
v/v volumen/volumen
w/v peso/volumen
RESUMEN
Hypothenemus hampei es en la actualidad la plaga más importante del cultivo de
café, pues reduce la producción y afecta la calidad del grano. En C. arabica,
específicamente en algunas introducciones etíopes se ha encontrado una menor
oviposición de la broca hasta un 35% menos que Caturra. En el presente trabajo
se evaluó la expresión diferencial de proteínas en semillas de Caturra variedad
susceptible al ataque de la broca y en semillas de la introducción etíope CCC534,
utilizando electroforesis bidimensional (2-D), secuenciación por espectrometría de
masas y análisis bioinformatico para interpretar secuencias peptidicas
estableciendo la función putativa de cada proteína secuenciada. Inicialmente se
optimizó la metodología de extracción y limpieza de proteínas de semillas de café
para la elaboración de los mapas proteómicos. Para la separación de las proteínas
por punto isoléctrico se utilizaron dos tamaños de geles de isoelectroenfoque
(IPG) de 7 y 24 cm; una vez enfocadas las proteínas se realizó la segunda
dimensión en diferentes cámaras de electroforesis de acuerdo al tamaño IPG. Se
realizó electroforesis diferencial en gel bidimensional, los geles se digitalizaron,
procediendo a detectar, comparar y cortar un total de 35 manchas proteicas que
estuvieron diferencialmente o sobre-acumuladas en semillas de CCC534, para ser
secuenciadas por espectrometría de masas. De las 30 proteínas diferenciales y
sobre-acumuladas identificadas, siete presentaron homología con proteínas de
oxidoreductasa, cuatro con proteasa, tres con proteínas de defensa, seis fueron
transferasas, tres participan en la Unión de ATP, dos fueron de unión de ARN, una
proteína de almacenamiento, una actividad lipoxigenasa, una de transporte de
electrones, dos de unión de GTP y una implicada en la unión de iones de
Magnesio. La información obtenida en este trabajo es el inicio de una serie de
investigaciones diseñadas para descifrar el factor de resistencia de las
introducciones con menor oviposición de la broca, que ayudarían en un futuro a
descubrir mecanismos de control con esta plaga.
Palabras clave: proteoma, electroforesis diferencial en gel, espectrometría de
masas, broca del café, Caturra, CCC534.
ABSTRACT
Hypothenemus hampei is currently coffee cultivation’s most important pest; it
reduces production, and affects the quality of the grain. In the following work we
evaluated the differential expression of proteins in seeds from species susceptible
to attack on the coffee bean and seeds with the introduction of Ethiopian CCC534
which has 35% less oviposition compared to Caturra. Utilizing two-dimensional
electrophoresis (2-D), sequencing via mass spectrometry and an bioinformatics
analysis to interpret peptide sequences to establish the putative function of each
protein sequenced. Initially the methodology of extraction was optimized and seed
proteins where cleaned for the protein maps. To separate proteins via isoelectric
point to gel sizes IPG 7 and y 24 cm where utilized, focusing on the proteins a
second dimension is realized within different cameras of electrophoresis depending
on the size IPG. Differential electrophoresis was realized in bi-dimensional gel, the
gels where digitized, then proceeded to detect, compare, and cut a total of 35
protein stains that where expressed differentially and over-expressed in seeds
CCC534, to be sequenced via mass spectrometry. Of the 30 differentiated overexpressed proteins identified, seven showed homology with proteins of
oxidoreductase, four in protest, three in defense, six in transfer, three that
participate n union of ATP, two of ARN union, one storage protein, one
lipoxygenase, one of electron transport, two of GTP union, and one implicated in
the union of ions of Magnesium. The information obtained is this work in the start of
a series of studies designed to decipher the factors of resistance in the
introductions of less oviposition within the Hypothenemus hampei, which will help
uncover mechanisms of control for this pest.
Keywords: Proteome, differential electrophoresis in gel, mass spectrometry, broca
(Hypothenemus hampei) Caturra, CCC534.
1. INTRODUCCION
El café es uno de los principales productos de exportación agrícola en Colombia y
representa una de las principales industrias en el país con aproximadamente
921.000 hectáreas sembradas. Genera alrededor de 560.000 empleos directos
37% del empleo rural y 1.000.000 entre directos e indirectos. De su producción,
comercialización y procesamiento derivan el sustento de aproximadamente
563.000 familias cafeteras en 16 departamentos (Federación Nacional de
Cafeteros 2011).
El café contribuyó con el 12.4% del producto interno bruto agropecuario del país
(Federación Nacional de Cafeteros 2011). Con respecto al PIB total Nacional el
aporte es del 1.7% (Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural 2006). Estas cifras
representan uno de los productos principales de la economía agrícola Colombiana
con una producción para el 2012 de 7.8 millones de sacos de 60 Kilogramos.
Todo el café que se produce en Colombia es de la especie Coffea arabica L. de
calidad reconocida en el mundo. En Colombia se han cultivado extensas áreas
con pocas variedades, con una baja variabilidad genética, como consecuencia de
estos se presenta una caficultura vulnerable a plagas como la broca
Hypothenemus hampei (Ferrari), estos factores son limitantes en la producción.
La broca es la principal plaga que afecta la caficultura colombiana estimándose
daños en más de 700.000 hectáreas. Por la reducción de la producción, la
alteración de la calidad, el aumento de los costos de producción, se estima en un
7% el costo del control de la broca (Federación Nacional de Cafeteros 2000;
Duque 2004), y la disminución del precio de compra. Su control debe ser
económico y causar los menores efectos tóxicos sobre los habitantes y el
agroecosistema cafetero. Uno de los componentes de un programa de manejo
integrado de plagas son las variedades resistentes; una herramienta de control
ecológica, barata y de fácil adopción. En el café puede usarse para el control de la
17
broca, siempre que se identifiquen fuentes de resistencia y sean utilizadas para la
producción de variedades mejoradas con alguna resistencia a esta plaga. A pesar
que dentro del género Coffea no se conocen genotipos resistentes a la broca,
trabajos previos, han mostrado diferencias entre algunos, que aunque pequeñas,
pueden ser de interés en un programa de control integrado de la plaga.
En Cenicafé, dentro de un proyecto de búsqueda de fuentes de resistencia a la
broca del café, se han evaluado en campo gran parte de las entradas de la
Colección Colombiana de café para resistencia a broca, encontrándose varias
introducciones con menos infestación que Caturra que es una variedad comercial
la cual ha sido utilizada como testigo. Posteriormente se han evaluado algunas
introducciones en condiciones controladas con el fin de confirmar los resultados en
campo, encontrándose que la tasa reproductiva de la broca criada en tres
accesiones etíopes entre ellas la introducción CCC 534 es menor hasta en un 35%
que cuando era criada en Caturra (Romero y Cortina 2004, Bustamante 2006). No
se han encontrado enzimas involucradas con esta menor oviposición.
Hasta ahora no se conocen las causas de la menor oviposición de la broca, es
necesario identificar cuáles serian los posible factores de resistencia de estos
genotipos, esto permitiría en un futuro diseñar estrategias de control más eficaces
y seleccionar genotipos resistentes
Para contribuir con esta información, en este trabajo se identificaron las principales
proteínas acumuladas diferencialmente en dos introducciones de café, utilizando
técnicas que permiten separar las diferentes proteínas en Caturra y en la
introducción Etíope CCC 534, contribuyendo a determinar un posible factor de
resistencia.
18
2. OBJETIVOS
2.1 General
Encontrar diferencias en la acumulación de proteínas de la semilla en dos
genotipos de café que tienen diferencias en el crecimiento poblacional de la broca.
2.2 Específicos
Obtener mapas proteómicos bi-dimensionales de semillas de Coffea arabica.
Determinar diferencias en el perfil proteíco de la introducción Etiope CCC 534, y
Caturra, en las cuales la broca tiene diferencias en la tasa intrínseca de
crecimiento (r).
19
3. MARCO TEÓRICO
3.1
Generalidades sobre Coffea
El café pertenece a la familia Rubiaceae, subfamila Cinchonoideae, tribu Coffeae,
subtribu Coffeinae, caracterizada por una invaginación ventral del albumen o
endospermo del grano, que forma una hendidura que le atraviesa. Los cafetos son
árboles o arbustos perennes de amplia adaptación, reconocibles por sus hojas
simples, opuestas y con estípulas frecuentemente bien desarrolladas, flores
tubulosas y blancas, hermafroditas, que se agrupan en glomérulos axilares
(rosetas), en número variable, y sus frutos son drupas. El tallo es leñoso, y posee
ramas dimórficas: ortotrópicas que crecen verticalmente; y las plagiotrópicas de
crecimiento lateral, que son las productivas. El sistema radical es pivotante, con
raíces finas superficiales (Charrier y Berthaud 1985, Fazuoli 1986).
De acuerdo con su estructura floral, se divide en los géneros Psilanthus (estilo
corto con las anteras y estigma interiores) y Coffea (estilos largos con las anteras
y estigmas exteriores) (Wrigley 1988, Bridson 1994). Los estudios de las
variaciones del ADN cloroplástico de 25 taxa (Cros 1996), y la variación de las
secuencias genómicas de la región ITS2 (Internal Transcribed Secuences), de 37
accesiones de Coffea y 3 especies de Psilanthus (Lashermes et al. 1997),
permitieron agrupar cuatro grupos filogenéticos en las zonas biogeográficas
ilustradas en la figura 1.1.
Las dos especies de interés económico pertenecen al género Coffea, que está
compuesto por 103 especies, originarias de las zonas tropical y subtropical de
África y Asia.
Coffea arabica y C. canephora son las especies utilizadas comercialmente, las
demás especies del género son silvestres y de poco valor comercial, aunque con
características de interés para ser transmitidas a sus parientes cultivados. Se
incluyen especies de diferentes hábitats africanos, por ejemplo: C. congensis
20
colectada en zonas inundables por ríos, C. stenophylla en la parte alta de colinas,
C. liberica en la margen de bosques o C. humilis principalmente en áreas secas
(Berthaud y Charrier 1988). Estas características junto con genes de resistencia a
diferentes factores bióticos y abióticos son de interés para los programas de
mejoramiento de C. arabica y C. canephora
La mayoría de las especies del género Coffea son diploides (2n= 22), el mismo
genoma ancestral y una estructura cromosómica similar. Su organización
ecogeográfica está bien establecida: oeste y centro, este de África y la región de
Madagascar. Las diferencias observadas en cantidad de ADN en las especies,
cruzabilidad, fertilidad de los híbridos y el porcentaje de células madres de polen
con meiosis normal, son mayores entre grupos que dentro de ellos (Charrier y
Eskes 2001).
Coffea arabica L., por otro lado, es una especie alotetraploide 2n = 44
cromosomas, no obstante, se han realizado cruzamientos interespecíficos entre
ella y sus parientes diploides, con resultados que sugieren que estas especies
pueden reunirse en el mismo pool genético y que pese a las diferencias en ploidía,
los cruces con C. arabica son posibles, produciendo híbridos triploides o
tetraploides (Berthaud y Charrier 1988)
3.2
Generalidades de la broca
En 1988 se detectó en Colombia la presencia de la broca del café Hypothenemus
hampei (Ferrari) (Coleóptera: Curculionidae: Scolytinae), en el sur de Nariño. Este
insecto es la plaga más importante que afecta el café en los países cafeteros
donde ha llegado. En la actualidad se estima que afecta 800.000 hectáreas que
corresponden al 90% del área cafetera colombiana y afecta el patrimonio de más
de medio millón de familias cafeteras colombianas (Duque et al. 2002, Bustillo
2008).
21
La broca es una plaga exótica originaria de la zona ecuatorial de África
probablemente de etiopía, e inducida accidentalmente al continente americano en
Brasil, a principios del siglo pasado (Bergamin 1943). Por eso, cuando llega a un
lugar con condiciones favorables, desarrolla todo su potencial biótico sin ninguna
restricción y alcanza altos niveles de población, debido a la carencia de agentes
de control, que han coevolucionado con ella en su sitio de origen (Bustillo 1991).
Es originaria del África ecuatorial, probablemente de Uganda de donde se
diseminó a otras partes del mundo donde se cultiva café y se encuentra atacando
especies de café silvestres que crecen en los bosques naturales de esas áreas
(Bergamin 1943). Fue introducida al continente americano, (Brasil) en 1913.
3.2.1 Daño
Esta plaga vive únicamente en las cerezas de café excavando galerías dentro de
las semillas; todo su desarrollo se presenta en la misma semilla. Causando la
pérdida directa del producto, ya sea por destrucción total o por la perforación de
los granos (Bergamin 1943).
La broca empieza su penetración en la corona del fruto, la hembra perfora hasta el
endospermo y allí realiza una galería piriforme con una longitud de 2-3 mm que es
ensanchada para construir una cámara de oviposición. Si el fruto no tiene la
consistencia adecuada, la hembra permanece en el canal de perforación sin
penetrar el endospermo (Decazy 1990).
En C. arabica se ha encontrado que el ataque sobre frutos en formación no
permite la reproducción del insecto ya que este no se desarrolla en un medio
acuoso o pastoso, en estos frutos se genera una clorosis que va acompañada de
la pudrición del fruto y luego su caída (Alonzo 1984; Bergamin 1943; Ticheler
1963).
22
La broca es un insecto espermatófogo, holometábolo (Alonzo 1984) de hábitos
crípticos. La hembra perfora el fruto con sus mandíbulas a la altura de la corona o
cicatriz del cáliz floral para lo cual gasta de cuatro a seis horas (Le pelley 1963;
Penagos y Flores 1974; Cardenas 1990). Posteriormente la broca elabora una
galería piriforme (Baker 1985) donde realiza la oviposición, siempre y cuando el
grano tenga más de 130 días, es decir más del 20% de su peso seco (Baker et al.
1992; Gaviria et al. 1995). En esta cámara pone entre 20 y 25 huevos en los
primeros 15 dias y en total de 30 a 40 huevos en cuatro semanas (Cárdenas
1993).
3.2.2 Manejo integrado de la broca del café.
La Federación Nacional de Cafeteros de Colombia, a través del Centro Nacional
de Investigaciones del Café-CENICAFÉ, recomienda para su control un manejo
integrado, basado en la renovación oportuna de los cafetales, la recolección
permanente de los frutos, el control biológico y, cuando hay alta infestación el
control químico con insecticidas de categoría III, buscando alterar lo menos
posible el equilibrio en los agroecosistemas (Cadena 1993).
En relación con la estructura de costos de producción, el manejo integrado de la
broca del café equivale al 7% de los costos año, donde el control cultural emplea
el 54%; el control químico 26%, el biológico el 10%, las evaluaciones el 7% y los
equipos de aspersión el 3% (Duque 2004).
3.2.2.1
Control cultural
Son prácticas encaminadas a minimizar la disponibilidad de alimento y refugio de
la plaga y a modificar las condiciones favorables para la reproducción de la broca.
Estas labores incluyen podas frecuentes, zoqueos, cosechas oportunas,
condiciones de higiene y cubrimiento del café durante el beneficio y secado para
evitar el escape de la broca y métodos de muestreo en campo, entre otras (Bustillo
et al. 1998).
23
3.2.2.2
Control químico
El uso de insecticidas para el control de la broca solo se deben emplear como
último recurso cuando la infestación es muy alta; se recomienda por lo tanto,
aplicarlos de manera localizada en el tiempo apropiado, utilizando insecticidas de
categoría toxicológica III y con una actividad biológica no mayor a 15 días (Bustillo
et al. 1998).
En casos de ataques generalizados de broca es muy difícil reducir las poblaciones
con sólo insecticidas, ya que se necesita aspersiones con mucha frecuencia,
causando riesgos a los agricultores, a la fauna benéfica, contaminando el
ambiente, surgimiento de otras plagas del café y resistencia a estos productos
(Bustillo 1990).
3.2.2.3
Control biológico
El control biológico se considera la alternativa más recomendable para disminuir
las poblaciones de la broca sin generar un desequilibrio en el ecosistema cafetero
(Klein et al. 1988). Conocer los organismos que controlan a la broca del café
favorece de forma directa en la economía del caficultor, quien tendrá que disponer
de menos recursos y tiempo en el control de esta plaga (Bustillo et al. 2002).
Los hongos entomopatógenos para el control de la broca son un componente
fundamental en el programa de manejo integrado que tenga por finalidad la
preservación del medio ambiente y la racionalidad del uso de insecticidas
químicos. También han sido utilizados parasitoides como Cephalonomia
stephanoderis y Prorops nasuta introducidos desde África, los cuales han logrado
establecerse en las condiciones de campo de Colombia (Bustillo et al. 1998).
24
3.2.2.4
Control genético
El control de insectos en cultivos comerciales se ha basado habitualmente en el
uso de insecticidas; sin embargo, en años recientes el uso de estos ha sido
regulado y limitado, generando una búsqueda por alternativas para el control de
los insectos, tratando que los métodos de control sean específicos al insecto
plaga. Existen dos alternativas para el contol genético de una plaga, la primera ha
sido el desarrollo de variedades resistentes, que se encuentran en la misma
especie o en especies relacionadas genéticamente (mejoramiento genético por
cruzamientos; sin embargo, es limitada, debido a la falta de fuentes de resistencia
en las plantas. Otra alternativa es la tecnología de la ingeniería genética que ha
permitido la introducción de genes de cualquier especie en cualquier planta, a
estas plantas se les conoce como plantas transgénicas o modificadas
genéticamente, y de esta manera ha sido posible obtener resistencia a insectos en
las principales especies cultivadas en el mundo (Thomas et al. 1994).
Sin embargo, la creación de plantas transgénicas resistentes a insectos, tienen
desafíos técnicos considerables: el primer paso consiste en la identificación y la
caracterización de los factores de la resistencia y de los genes que los codifican.
El factor de resistencia debe satisfacer tres características: a) la planta
transformada
debe
producir
los
factores
transgénicos,
en
niveles
lo
suficientemente altos para afectar el insecto plaga; b) el factor no debe interferir
con el funcionamiento agronómico normal de la planta; y c) el factor de resistencia
debe afectar en los posible al insecto plaga sin causar daño a otro organismos. El
segundo paso en la producción de las plantas transgénicas, es el desarrollo de
sistemas de regeneración y transformación, específicamente en genotipos en los
que se produzca la inserción del DNA y una estable heredabilidad de éste. Los
procedimientos para desarrollar eventos de transformación en variedades o
cultivares élites aceptados y usados por los agricultores, dependen del método de
propagación y las bases genéticas de la especie cultivada (Gongora 1999,
Gongota et al. 2008)
25
Solamente un número limitado de productos naturales se ha caracterizado e
identificado como agentes defensivos eficaces contra insectos herbívoros. Estos
factores de resistencia naturales incluyen:
Las polifenol oxidasas, modifica las proteínas en la dieta de los insectos (Felton et
al. 1992); la invertasa y la hexosil tranferasa, modifica los azúcares (Purcell et al.
1994). Estas proteínas alteran componentes básicos en la dieta de los insectos,
privándolos de alimentos, o generando compuestos tóxicos, sin embargo no
actuán sobre el intestino del insecto como sitio de acción primario.
Las lectinas (Duck y Evola 1997), los inhibidores de proteinasas (Gatehouse y
Gatehouse 1998) y los inhibidores de alfa amilasas (Schroeder et al. 1995) privan
a los insectos de nutrientes necesarios para su crecimiento y desarrollo. Las
lectinas se unen directamente a los nutrientes y los secuestran, mientras que los
inhibidores de proteinasas y los inhibidores de alfa amilasas interfieren con las
enzimas digestivas de los insectos, y por lo tanto hacen la digestión menos
eficientes (Gatehouse y Gatehouse 1998; Richardson 1991).
Las endotoxinas de Bacillus thuringiensis y las enzimas colesterol oxidasas
(Purcell et al. 1993; Shen et al. 1997), lípido acil hidrolasas (Strickland et al. 1995)
y quitinasas (Krammer 1997; Broadway 1998, Gongogara et al. 2001),
corresponden a proteínas que atacan la integridad del epitelio del intestino de los
insectos, interfiriendo en la absorción de nutrientes del insecto.
Para buscar fuentes de resistencia a la broca, la disciplina de Mejoramiento
genético de CENICAFÉ, evaluó en campo en 26 experimentos, alrededor de 750
entradas, la mayoría originaria de Etiopía, de la Colección Colombiana de café –
Proyecto Meg 0800- (Cortina 2000), no encontrando inmunidad en ninguna, pero
en varios experimentos algunas introducciones tuvieron significativamente menos
infestación que la variedad Caturra. Posteriormente Romero 2003, evaluó en
laboratorio 18 de estas accesiones, para precisar el efecto que tenían sobre los
parámetros poblacionales de la broca, comparados con la variedad comercial
Caturra: Encontró que en algunas la fecundidad de la broca se redujo hasta en un
26
35%, y como consecuencia las tasas de crecimiento eran menores (Romero y
Cortina 2004).
En años recientes a través de tecnologías, en Cenicafé se han venido
desarrollando herramientas de apoyo al mejoramiento genético convencional
como es la transformación genética, la cual permite la búsqueda e incorporación
de genes que confieren una resistencia perdurable al café contra la broca.
Actualmente se están introduciendo genes de quitinasas aislados de hongos, que
han demostrado en dietas inhibición del crecimiento y mortalidad de la broca y de
otros insectos (Góngora 2001, Martinez et al. 2012)
Se ha demostrado que los inhibidores de las α-amilasas provenientes de dos
especies de leguminosas Phaseolus vulgaris y P. coccineus, son proteínas que
bloquean la actividad de las amilasas digestivas de H.hampei (Valencia et
al.2000), siendo los genes de estas proteínas candidatos promisorios para conferir
resistencia a esta plaga.
Bioensayos realizados en el laboratorio con dietas artificiales que contienen
alrededor de 5% del inhibidor de amilasa del frijol, produjeron una mortalidad de
60% en larvas de la broca (Cenicafé 2003). El gen del inhibidor de α-amilasa se
aisló a partir del genoma del frijol y fue transferido por transgénesis a plantas de
Nicotiana benthamiana, donde se expresó bajo el control de dos promotores de
expresión genética. El gen se introdujo en un vector de transformación, bajo el
control de expresión de un promotor específico del endospermo del café, y esta
disponible para su uso en experimentos de transformación genética del café
(Cenicafé 2004).
Trabajos destinados a buscar especies vegetales promisorias como fuente de
resistencia a la broca se han realizado con extractos proteicos de las semillas
Vicia faba, Brachiaria decumbens, Canavalia insiformes, Trifolium hydridum,
Acacia melanoxylum, Adenanthera pavonica y Erythrina rubrinervia, las cuales han
presentado de una forma no concluyente diferentes porcentajes de actividad
inhibitoria contra las amilasas de la broca (González 1999; Ossa et al.1999).
27
Posteriormente, se realizaron pruebas de actividad inhibitoria con extractos
proteicos de semillas de varias especies promisorias contra las amilasas de H.
hampei, encontrando que maíz, Brachiaria y trigo, alcanzaron más del 50% de
inhibición de las amilasas de broca (Padilla et al. 2006).
Debido a esto, la resistencia introducida mediante ingeniería genética debe
disponer de genes de resistencia de diferente naturaleza, lo cual permitirá que las
plantas de café presenten una mayor durabilidad de la resistencia hacia la broca
por medio de la piramidización de genes.
3.3
Proteomica
El proteoma es el conjunto de proteínas expresadas por un organismo en un
momento dado (Jacobs et al. 2001). Los proteomas son dinámicos y cambian con
el tiempo, con el estadio del desarrollo y con las condiciones intra y extracelulares.
La proteómica es el estudio de los proteomas que separa, identifica y caracteriza
proteínas a gran escala, define niveles de proteínas celularmente, investiga
complejos de proteínas, elucida funciones, caminos metabólicos e interrelaciones.
La proteómica tiene que analizar un número muy grande de proteínas (Kenyon et
al. 2002) (en organismos eucarióticos es usualmente un número mayor que el
número de genes presentes en el genoma); también se encarga de la
caracterización funcional de tales proteínas y de sus relaciones estructurales. Se
puede decir que la genómica produce las estructuras primarias de las proteínas,
mientras que la proteómica se encargará de producir las estructuras secundaria,
terciaria y cuaternaria.
Existen varias razones por las que el estudio proteómico aplicado a tejidos y
organismos vegetales se está convirtiendo en un área complementaria a los
estudios a nivel genómico.
Las investigaciones encaminadas a la secuenciación de genomas de especies
vegetales no revelan información a cerca de la cantidad y número de proteínas
28
activas que se encuentra en los tejidos vivos. A pesar de que existe información
completa y detallada del genoma de diferentes especies vegetales, el estudio de
los genes ofrece poca información a cerca de la función que desempeñan las
proteínas que codifican o de las variaciones de la expresión y síntesis de las
diferentes proteínas como respuesta a diferentes estímulos (Pandey y Mann
2000).
La secuencia de los genomas de los principales cultivos agrícolas ya están
disponibles y la lista sigue aumentando debido a las nuevas técnicas de
secuenciación de ADN. Sin embargo, la secuenciación del genoma vegetal y su
anotación es un reto debido a su gran tamaño y poliploidía (Agrawal et al., 2012)
En los análisis funcionales de los estudios genómicos, las secuencias de ADN no
son muy informativas per se debido a que la anotación estructural de un genoma
consiste en identificar las coordenadas de los genes que codifican las proteínas
mediante herramientas computacionales bioinformáticas. Estos algoritmos buscan
marcos de lectura (ORF) de los genes y sus características estructurales, tales
como el inicio y el final de la región de codificación o de las uniones de empalme
entre los exones y los intrones. Sin embargo, estas predicciones no son muy
confiables por lo que los modelos genéticos pueden ser inexactos, en particular, si
el análisis se realiza utilizando algoritmos entrenados en plantillas de especies
diferentes (Agrawal et al., 2012). La modelación de genes se está mejorando
mediante el uso de máquinas de aprendizaje basadas en programas de predicción
alimentadas con un conjunto de secuencias de trascripción del RNA mensajero
(ESTs) de la especie que se está anotando, por lo que entre más grande el
conjunto de secuencias el modelo es más exacto (Castellana et al. 2010).
Una validación definitiva de los genes se puede lograr mediante el análisis de
diferencial de las proteínas. Si el genoma de la especie en estudio está
secuenciado, la proteómica se puede emplear para la detección y caracterización
de las proteínas expresadas al nivel de un determinado proteoma. Este enfoque
se denomina comúnmente “proteo-genómica”. Como puede haber una diferencia
29
significativa entre el nivel de transcritos y las proteínas expresadas, en parte
debido a la existencia de mRNAs no codificantes, el análisis proteogenómico es la
prueba final para la validacion de los genes. Análogo a la información
proporcionada por la secuenciación de transcriptos que demuestra la presencia de
RNA mensajeros, la de las secuencias de péptidos generada por espectrometria
de masas (MS) muestra la existencia de proteínas. Esta información también se
puede utilizar para el descubrimiento de nuevos marcos de lectura y es válida
incluso para los genomas ya
anotados y bien caracterizados de organismos
modelo como la mosca, el humano, el ratón, Arabidopsis y el arroz. (Agrawal et al.,
2012)
Durante los últimos años se han llevado a cabo mejoras sustanciales en el estudio
proteómico de diferentes organismos que implican avances en las técnicas
utilizadas, mejoras en la reproducibilidad y capacidad de almacenamiento,
tratamiento y búsqueda de datos relacionados con proteínas e imágenes de geles
bidimensionales. En la actualidad existen dos herramientas fundamentales para el
estudio de conjuntos de proteínas, la electroforesis bidimensional y la
espectrometría de masas. El desarrollo de estas técnicas ha favorecido la
aparición de numerosas aplicaciones prácticas en el estudio de plantas,
incluyendo el estudio de proteínas implicadas en rutas metabólicas del
metabolismo secundario, señalización celular, transporte y catálisis. La principal
ventaja que aportan estos avances es que se trata de técnicas de alto rendimiento
para la separación e identificación de proteínas, que permiten un estudio integral
de un gran número de proteínas en un único experimento. Para la separación de
mezclas complejas de proteínas, la herramienta más ampliamente utilizada es la
electroforesis bidimensional (2-DE) en geles de acrilamida (SDS-PAGE)
(Kumarathasan et al. 2005).
La segunda categoría del análisis proteómico puede denominarse “proteómica
comparativa”, donde el objetivo no es identificar el conjunto completo de proteínas
en una muestra particular, sino más bien caracterizar las diferencias entre
poblaciones diferentes de proteínas. Este enfoque es algo análogo al perfil
30
comparativo de microarreglos de ADN. Por ejemplo comparar la población de
proteínas de plantas normales con la de plantas mutantes, o tejidos en diferentes
etapas del desarrollo o de las respuestas diferenciales a estímulos externos biótico
o abióticos (Rose et al., 2004)
3.3.1 Separación de las proteínas.
La herramienta más empleada en la separación de componentes proteicos es la
electroforesis en geles de poliacrilamida con el denaturante dodecil-sulfato sódico
(SDAS-PAGE), que separa las proteínas de acuerdo a su peso molecular
(Rabilloud 2000).
La electroforesis bidimensional (2D) es una técnica de alta resolución que es
capaz de separar mezclas complejas de proteínas en un único evento
experimental. Esta técnica introducida en 1975 por O’ Farrel, consiste en la
migración y separación de las proteínas en una primera dimensión de acuerdo a
su punto isoeléctrico (pl), mediante isoelectroenfoque (IEF), y en una segunda
dimensión según su peso molecular (MW) mediante electroforesis en gel de
acrilamida en presencia de dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) (Figura 1). Al
aplicar un campo eléctrico, las moléculas con carga neta positiva son atraídas
hacia el cátodo y las moléculas con carga neta negativa son atraídas hacia el
ánodo. En la medida en que las moléculas de proteína se van acercando a su
punto isoeléctrico, van perdiendo carga eléctrica hasta llegar al valor de pH
cercano a cero (Simpson 2003).
La combinación de geles utilizando diferentes rangos de pH, puede, mostrar un
porcentaje elevado del conjunto de proteínas presentes en la muestra analizada.
El desarrollo de gradientes preestablecidos de pH (IPG ”Immobilized pH Gradient
Strips”) utilizados en la primera dimensión (IEF) ha contribuido sustancialmente a
la gran acogida de la técnica de electroforesis bidimensional, en particular, y al
estudio de la proteómica, en general (Görg et al. 1988). Estos gradientes
inmovilizados de pH han dado lugar a una gran reproducibilidad de las
31
separaciones proteicas entre experimentos, permitiendo una mejor comparación
estadísticamente significativa de los resultados. En la actualidad se dispone de un
amplio rango de gradientes de pH para el isoelectroenfoque, incluso con una
unidad de pH de diferencia y con extremos comprendidos entre pH 3.2 a pH 12.0.
Figura1. Esquema de la obtención de un proteoma
Esto permite al investigador incrementar la capacidad de separar proteínas
presentes en muestras muy complejas.
Tras la separación de las proteínas mediante electroforesis bidimensional, es
necesario aplicar un método de tinción que sea capaz de revelar la presencia y
posición de las diferentes proteínas representadas como manchas o puntos
proteicos en el gel de acrilamida. Los métodos más utilizados son la tinción con
azul de coomasie, la tinción con nitrato de plata y la marcación con fluorocromos.
32
La tinción con azul de coomasie es simple y rápido, sin embargo no tiene una
buena sensibilidad en comparación con otros métodos basados en el revelado de
proteínas con nitrato plata o fluoróforos. La tinción con azul de coomasie es capaz
de revelar la presencia de proteína con una concentración de 100 nanogramos por
cada punto proteico (Neuhoff et al. 1988). Los protocolos de tinción con plata son
mucho más sensibles (hasta 1 nanogramo de proteína por punto), sin embargo,
resultan mucho más laboriosos y no son compatibles con la espectrometría de
masas. Se han comenzado a utilizar tinciones y marcajes fluorescentes (SyproRuby, Cy3, Cy5) que presentan una sensibilidad comparable a la plata y permite el
análisis posterior de las proteínas mediante espectrometría de masas. También se
han desarrollado programas para comparar las imágenes de los geles
bidimensionales (2D-PAGE) y facilitar la identificación y cuantificación de manchas
de proteínas entre diferentes muestras. Un avance reciente es la detección de las
manchas proteicas mediante marcadores fluorescentes usando fluorocromos
derivados de la cianina (CyDye), utilizados en el método conocido como gel de
electroforesis diferencial (“DIGE” Difference gel electrophoresis, por sus siglas en
inglés) (Tonge et al.2001). En esta técnica se pueden utilizar hasta tres
fluorocromos derivados de la cianina (denominados Cy2, Cy3 y Cy5), que portan
un grupo éster reactivo con el que se unen covalentemente al grupo ε-amino de
los residuos lisina de las proteínas.
Así, las proteínas son marcadas antes de la segunda electroforesis y se pueden
analizar hasta tres muestras distintas a la vez, mediante marcación de cada una
de ellas con un fluorocromo distinto. Una de estas muestras puede ser un
estándar interno constituido por cantidades equimolares de las otras dos muestras
que participan en el experimento que, marcada con uno de los fluorocromos,
puede proporcionar un patrón de comparacion con las proteínas presentes en las
dos muestras en estudio. Tras el marcaje, las dos muestras y el estándar interno
son mezcladas y sometidas a una electroforesis en la que comparten el mismo gel
bidimensional, ya que, gracias a las distintas longitudes de onda de excitación y
emisión que presentan los fluorocromos, se puede adquirir un mapa proteico
33
bidimensional único para cada una de las muestras marcadas (Tonge et al.2001).
Para esto se hace uso de un escáner de fluorescencia con el que, al mismo
tiempo que se lleva a cabo la excitación de cada fluorocromo, se captura la
imagen resultante tras la emisión de la fluorescencia inducida.
Esta técnica permite la detección de diferencias cuantitativas en la acumulación
proteica de distintas muestras en un solo gel, lo que, a la vez que mejora la
reproducibilidad de los resultados y reduce el consumo de tiempo y reactivos. La
sensibilidad de los marcadores CyDye es similar a la obtenida por la tinción de
plata y Coomassie, pero el rango dinámico alcanzado es mucho más amplio.
Los geles bidimensionales una vez teñidos, deben ser escaneados con la finalidad
de obtener una imagen digital. La obtención de esta imagen permite la detección
de proteínas, eliminación del ruido de fondo, creación de geles promediados,
estimación del punto isoeléctrico y peso molecular de cada uno de las proteínas
presentes en el gel, determinación de la intensidad de las manchas proteicas,
cuantificación y comparación del patrón de manchas generado por diferentes
geles (Simpson 2003). Los resultados obtenidos del análisis permiten la
comparación cualitativa de los perfiles de proteínas e identificar los cambios en la
acumulación como consecuencia de un tratamiento o condición biológica de las
muestras en estudio. Aquellas proteínas de interes se recuperan del gel
recortando las manchas proteicas de los geles bidimensionales, para su
identificación posterior mediante secuenciación por epectrometría de masas.
(Christou y Klee 2004)
3.3.2 Identificación de proteína por espectrometría de masas
De manera similar al avance técnico de la electroforesis en dos dimensiones, los
adelantos en la identificación de proteínas mediante espectrometría de masas han
contribuido al desarrollo que ha tenido la proteómica en los últimos años. El
método de Edman fue la técnica principal de identificación de proteínas y fue
34
usado con un éxito considerable, no obstante ser un método lento (un péptido al
día) y poco sensible (Pappin, 1996). En estos aspectos, sensibilidad y velocidad, y
haciendo uso de las bases de datos genómicas y proteicas, la espectrometría de
masas ha
permitido el análisis rutinario de muestras complejas en muy poco
tiempo.
La espectrometría de masas es una técnica analítica que mide la relación cargamasa (m/z) de iones basándose en su comportamiento en un campo magnético.
La muestra es convertida en iones y vaporizada haciendo uso de técnicas como
desorción/ionización asistida por láser (MALDI) o ionización por electrospray (ESI).
MALDI es una técnica de ionización por pulsos que puede ionizar biomoléculas de
gran tamaño al utilizar la energía de un láser para disolver e ionizar la muestra en
presencia de una matriz capaz de absorber la luz. En la técnica ESI, las muestras
son ionizadas a presión atmosférica al hacer fluir la muestra por un capilar en
presencia de una corriente eléctrica.
La técnica de identificación de proteínas comprende la digestión de la proteína en
péptidos, análisis por MALDI y búsqueda en bases de datos. Cada proteína en la
base de datos es digerida teóricamente, generando miles de péptidos teóricos.
Los datos experimentales de masas de péptidos, la huella digital de masas de
péptidos, son comparados con las masas teóricas, con lo que se calcula y se
asigna una calificación (Waestermeier 2008). Esta calificación refleja la similaridad
entre las masas teóricas y experimentales, la proteína más probable será
entonces la que presente la mayor correspondencia entre los péptidos
experimentales y teóricos. Adicionalmente este análisis puede realizarse en
tandem, para esto el equipo debe ser capaz de seleccionar un determinado
fragmento y someterlo a una nueva fragmentación y análisis.
35
3.3.3 Interpretación de los datos
El análisis consiste en la utilización de herramientas informáticas que son capaces
de comparar los listados de masas generados en forma experimental mediante el
empleo de la técnica de MALDI-TOF (huella peptídica) con las masas teóricas
resultantes de digerir con tripsina las secuencias disponibles en bases de datos.
Los espectros MS-MS son característicos de cada uno de los péptidos, y permiten
su identificación “in silico” en bases de datos (Klein y Thongboonkerd 2004).
Ninguna de las dos técnicas (huella peptídica o fragmentación) son de
aplicabilidad universal y sin embargo la disponibilidad de ambas hace de la
espectrometría de masas una buena herramienta para la identificación sistemática
de proteínas (Baldwin 2004).
Los continuos y rápidos avances en las técnicas y herramientas informáticas
utilizadas para el estudio de conjuntos de proteínas y de los procesos bioquímicos
implicados han arrojado información valiosa acerca del origen de diferentes
alteraciones que pueden sufrir los organismos vivos. A pesar de que la
identificación de proteínas utilizando análisis de manchas que proceden de geles
bidimensionales mediante espectrometría de masas se ha establecido como una
herramienta ampliamente utilizada, la cantidad y la calidad de las identificaciones
obtenidas utilizando estas técnicas depende en gran medida de la existencia
previa de bases datos con gran parte de la información genética del organismo
estudiado. Por este motivo existe una necesidad de secuenciar el mayor número
de organismos posibles y de aumentar el nivel de conocimientos sobre la
naturaleza de las proteínas que codifican (Larsen y Roepstorff 2000).
3.4
Antecedentes de proteómica en Coffea arabica y Hypothenemus
hampei
Se realizo un análisis proteómico comparativo de dos estados fisiológicos de la
broca del café (Hypothenemus hampei), incluyendo la utilización de la técnica de
electroforesis en dos dimensiones, evaluando el diferencial de proteínas entre
36
adultos y larvas de la broca. Esta comparación permitió identificar 35 manchas
proteicas diferenciales o sobre-acumuladas entre adultos y larvas las cuales
fueron secuenciadas por espectrometría de masas. De las 35 proteínas
diferenciales y sobreacumuladas que identificaron, tres presentaron homología
con proteínas de choque térmico, dos de transporte, tres en procesos de
oxidación-reducción, dos en biosíntesis de proteínas, tres en regulación de la
expresión génica, dos que participan en la degradación de ARN y proteínas, ocho
proteínas que participan en procesos metabólicos de carbohidratos y respiración
celular, una de acción antioxidante y una implicada en la respuesta inmune. La
información obtenida en este trabajo fue el inicio de investigaciones para descifrar
los mecanismos biológicos que utiliza la broca en los procesos de desarrollo,
reproducción y asimilación del alimento y que ayudarán en un futuro a diseñar
mecanismos de control genético contra esta plaga del café (Rubio 2008).
Con el fin de entender mejor el contenido de proteínas del endospermo de las
especies comerciales Coffea arabica (Arabica) y Coffea canephora (Robusta) se
analizó la proteína principal de almacenamiento de las semillas de café por
electroforesis bidimensional y microsecuenciación de péptidos. Las manchas de
polipéptidos más abundantes observados en los perfiles proteomicos de las
semillas maduros de café correspondieron a subunidades de la misma proteína,
que existe como múltiples isoformas con puntos isoeléctricos variables. Se
encontró una significativa similitud en la secuencia con la familia de proteínas de
almacenamiento 11S de plantas. Las diferencias entre los perfiles proteómicos de
Arabica y Robusta indicaron una familia secundaria de proteínas 11 S en algunas
variedades de este último. La existencia de múltiples formas de punto isoeléctrico
puede indicar que una familia multigénica codifica para estas proteínas. (Rogers et
al.1999).
También se ha estudiado el proteoma en embriones cigoticos en diferentes etapas
de desarrollo de la semilla. Cosecharon embriones de Coffea arabica y a partir de
geles bidimensionales identificaron varias proteínas por espectrometría de masas
como quinasas, factores de transcripción y enzimas involucradas en el
37
metabolismo del desarrollo embrional. Los resultados suministraron información
sobre el desarrollo del café que en un futuro podría usarse para mejorar el
crecimiento y el desarrollo de las plantas de café o mediante las estrategias
moleculares (Franco et al.2009).
La proteómica diferencial en clones de Coffea canephora bajo condiciones de
déficit hídrico, se realizó por Salgado (2007). Este trabajo tuvo como objetivo
verificar la respuesta adaptativa de los clones al estrés hídrico e identificar
proteínas responsables por el mismo. Los estudios del proteoma indicaron que
que uno de los mecanismos de aclimatación al estrés hídrico usado por C.
canephora sería la fotorespiración. Los resultados muestran la existencia de
mecanismos de adaptación a un posible daño oxidativo, aumentando la expresión
de chaperonas moleculares y proteínas del fotosistema, como también el
incremento de la expresión de isoformas de la subunidad grande de Rubisco. Solo
en el clon tolerante, bajo déficit hídrico, fue observada una mayor acumulación de
una quinona reductasa mientras que no se alteró la expresión de la glutamina
sintetasa. Se sugirió que la primera enzima tendría un papel importante en el
mecanismo antioxidativo asociado a la resistencia al déficit hídrico de este clon y
que la segunda enzima estaría asociada mantener la asimilación del amonio y la
fotorespiración bajo condiciones de sequía.
38
4.
4.1
MATERIALES Y METODOS
Localización
Está investigación se llevó a cabo en los laboratorios del Centro Nacional de
Investigaciones de café “Pedro Uribe Mejía”, Cenicafé-Plan Alto, (Chinchiná,
Caldas, Colombia) de la Federación Nacional de Cafeteros de Colombia.
4.2
Material Biológico
De un lote de tres años que se encuentra en la Estación Experimental Naranjal de
Cenicafé donde están sembrados los dos genotipos, se recolectaron frutos
maduros completamente rojos de las introducciones Caturra y CCC 534 y se
beneficiaron. Las semillas se secaron hasta una humedad del 14%, y se
guardaron a –80°C, hasta que se realizó la extracción de las proteínas.
Todos los procedimientos se realizaron a 4 ºC y con guantes para evitar la
degradación de proteínas y la contaminación con queratinas de la piel humana.
4.3
Extracción de proteínas de la semilla de Coffea arabica
Las semillas de CCC 534 y Caturra fueron transferidas a nitrógeno liquido 40
gramos de cada una por 30 minutos, posteriormente fueron molidas en un molino
criogénico hasta obtener un polvo fino, que se recogió en tubos de microcentrífuga
(ver Anexo 1).
La limpieza se efectuó con el Kit ReadyPrep 2-D Clean-up (Bio-Rad, Hércules,
California), que elimina contaminantes que puedan interferir en el proceso de
isoelectroenfoque (Anexo 2).
39
La adecuación del método de extracción y limpieza de las proteínas se evaluó por
medio de electroforesis unidimensional. Para evitar interferencias en la separación
electroforética, se evaluaron tres protocolos con el fin de eliminar los tejidos
grasos (lípidos); los protocolos realizados fueron los siguientes: (1) precipitación
con TCA acetona, lavado solo con el kit comercial (Maldonado et al. 2008) (2)
semillas sumergidas en hexano, extracción con PBS y precipitación con TCA, dos
lavados adicionales con acetona durante el lavado con el kit Comercial, (3)
semillas sumergidas en hexano, extracción con PBS, inclusión de lavados con
acetona durante el lavado con el kit comercial (Rubio 2008). El tratamiento con
hexano al 98% por 5 minutos, se realizó para extraer las ceras cuticulares de las
muestras. Los lavados adicionales con acetona se realizaron para mejorar la
limpieza de las muestras y poder extraer la mayor cantidad de lípidos que
contienen las semillas de café.
4.3.1 Protocolo 1
• A la muestra se le realizaron tres lavados de polvo de acetona,luego se
agrego fenol cloroformo y posteriormente la extracción se realizó con PBS
• La muestra se resuspendió en 2 ml de una solución ácido tricloroacético
(TCA) al 10% en acetona y ditiotreitol (DTT) al 0.07% y se centrifugó a
13200 r.p.m.Las muestras se limpiaron con el kit Clean-up (Anexo 2), se
tomaron alícuotas de 200µl, en tubos de 2ml y se les adicionó a cada una
1000 µl de acetona en relación 1:5 (muestra: acetona).
• Una vez adicionada la acetona, se realizó una agitación mecánica por un
minuto.
• Se centrifugó la muestra a 13.200 rpm durante 10 minutos a 4ºC y luego se
descartó el sobrenadante.
40
• Al terminar el lavado con acetona, se adicionaron 200 µl de buffer de
solubilización y se dejo incubar por dos días a 4 ºC para que las proteínas
se solubilizaran.
4.3.2 Protocolo 2
• Las semillas se sumergieron en hexano al 98% por 5 minutos, luego
transferidas
separadamente
en
nitrógeno
liquido
por
30
minutos,
posteriormente fueron molidas en un molino criogénico hasta obtener un
polvo fino, que se recogió en tubos de microcentrífuga, se resuspendió en 2
ml de una solución amortiguadora de PBS y se centrifugó a 13200
r.p.m.durante 5 minutos a 4ºC, se tomo el sobrenadante y se le agregó la
solución de precipitado ácido tricloroacético (TCA) al 10% en acetona y
ditiotreitol (DTT) al 0.07%, se dejó toda la noche a -20ºC para que las
proteínas se precipitaran.
• Las muestras se limpiaron con el kit Clean-up (Anexo 2), se tomaron
alícuotas de 200µl, en tubos de 2ml y se les adicionó a cada una 1000 µl de
acetona en relación 1:5 (muestra: acetona).
• Una vez adicionada la acetona, se realizó una agitación mecánica por un
minuto.
• Se centrifugó la muestra a 13.200 rpm durante 10 minutos a 4ºCy luego se
descartó el sobrenadante.
• Se realizaron dos adiciones de acetona para mejorar la limpieza de la
muestra.
• Al terminar el lavado con acetona, se adicionaron 200 µl de buffer de
solubilización y se dejo incubar por dos días a 4 ºC para que las proteínas
se solubilizaran.
41
4.3.3 Protocolo 3
• Las semillas se sumergieron en hexano al 98% por 5 minutos, luego
transferidas
separadamente
en
nitrógeno
liquido
por
30
minutos,
posteriormente fueron molidas en un molino criogénico hasta obtener un
polvo fino, que se recogió en tubos de microcentrífuga, se suspendió en 2
ml de una solución amortiguadora PBS y se centrifugó a 13200
r.p.m.durante 5 minutos a 4 ºC
• Las muestras se limpiaron con el kit Clean-up (Anexo 2), se tomaron
alícuotas de 200µl, en tubos de 2ml y se les adicionó a cada una 1000 µl de
acetona en relación 1:5 (muestra: acetona).
• Una vez adicionada la acetona, se realizó una agitación mecánica por un
minuto.
• Se centrifugó la muestra a 13.200 rpm durante 10 minutos y luego se
descartó el sobrenadante.
• Se realizaron dos adiciones de acetona para mejorar la limpieza de las
muestras.
• Una vez terminado el segundo cambio de acetona, se adicionaron 200 µl de
buffer de solubilización y se dejó incubar por dos días a 4 ºC para que las
proteínas se solubilizaran.
La concentración de la proteína fue determinada por el método de Bradford, para
lo cual se usó el Kit Protein AssayTM. Se determinó la concentración de proteína
(µg de proteína/µl de muestra) en un espectrometro UNICAM UV/VIS
Spectrometer UV 2 (Anexo 3).
42
4.4
Separación de las proteínas por Eletroforesis Bidimensional (2-D)
Esta técnica utiliza dos estrategias electroforéticas: (1) separación de acuerdo a su
punto isoeléctrico en la primera dimensión (IEF) y (2) separación por tamaño
molecular en la segunda dimensión (SDS-PAGE).
4.4.1 Primera dimensión: Isoelectroenfoque (IEF)
Los geles de gradiente de pH inmovilizado (IPG) sin carga eléctrica (método
pasivo) durante 12 horas con la cantidad de proteína establecida dependiendo de
la longitud de los geles IPG que se van utilizar. Los geles fueron ubicados en una
bandeja rehidratación, donde se sumergieron en aceite mineral con el fin de evitar
la evaporación de la muestra y la precipitación de la úrea (ver Anexo 4). La función
de la rehidratación no solo es la de rehidratar el gel si no la de mantener las
proteínas en solución durante el proceso de isoelectroenfoque.
La separación de las proteínas por punto isoeléctrico, se realizó utilizando geles
IPG en un equipo de isoelectroenfoque PROTEAN IEF Cell(Biorad). Se utilizaron
geles de 7 y 17 cm. de longitud marca ReadyStripTM IPG Strip (Biorad), con un
rango de pH 3-10 y para el isoelectroenfoque se utilizaron tres programas de
corrida (ver Anexo 5).
Después de la separación, se equilibraron los geles IPG para realizar la segunda
dimensión, incubandólos durante 15 minutos con una solución de equilibrio (TrisHCl pH 8.8, 50mM; urea 6M, glicerol 30% v/v, SDS 2% w/v, DTT.2%). Luego se
retiraron de la bandeja de rehidratación, se drenó el exceso de DTT y se volvieron
a colocar durante 15 minutos en la bandeja con la misma solución de equilibrio
sustituyendo el DTT por iodoacetamida 2.5% (ver anexo 6).
Para realizar los experimentos de proteomica comparativa entre la variedad
Caturra y la introducción CCC 534 se utilizaron geles de pH inmovilizado
ImmobilineTM DryStrip (GE Healthcare Bio-Science) con una longitud de 24cm y
43
un rango de pH de 3-10 no lineal(NL). Lo que permite una mejor separación de las
manchas proteicas.
Las muestras de Caturra y CCC 534 se trabajaron con dos repeticiones para tener
reproducibilidad en los tratamientos y para dar un soporte estadístico a las
pruebas de comparación que realiza el programa PDQuest de las diferentes
manchas proteicas presentes en las dos muestras.
4.4.2 Segunda dimensión SDS-PAGE
Para la migración de las proteínas electroenfocadas en los geles IPG de 7 cm se
utilizó la cámara de electroforesis vertical Mini-PROTEAN 3 Cell (Bio-Rad), para
los geles de 17 cm, la cámara de electroforesis vertical PROTEAN II xi Cell (BioRad), y para los geles de 24 cm, el sistema vertical PROTEAN plus DodecaTM
(Bio-Rad).
Los geles IPG se lavaron en una probeta que contenía 25 ml de una solución
amortiguadora de corrida para retirar el exceso de solución de equilibrio (Anexo 7).
Los geles IPG se colocaron horizontalmente de forma que quedaran en contacto
con la parte superior de los geles de poliacrilamida al 12% y se sellaron mediante
la adición de agarosa para evitar que queden orificios o burbujas entre los dos
geles que ofrezcan resistencia al paso de la corriente y produzcan efectos
indeseados en la migración de las proteínas. La separación electroforética se
efectuó en el sistema de electroforesis vertical según el tamaño del gel IPG con
una fuente de poder Power PacTM HC (Bio-Rad) a 0.02 mA/gel.
4.4.3 Tinción
Para detectar las manchas proteicas en los geles se utilizaron dos métodos de
tinción: el Coomassie coloidal-Coomassie G-250 este colorante fue usado en la
etapa de estandarización de los mapas proteomicos- y el Sypro RubyTM (Bio-Rad,
44
Hércules, California) Estas dos tinciones no afectan la identificación de las
proteínas por espectrometría de masas.
Para la tinción con azul de Coomassie, después de la electroforesis los geles se
sumergerieron completamente en solución de fijación. A continuación se
sumergieron durante toda la noche en la solución de azul de Coomassie. Por
último se destiñeron con ayuda de un agitador y utilizando frecuentes cambios con
agua ultrapura hasta que los puntos aparecen perfectamente contrastados sobre
el fondo del gel. (Anexo 8).
Los geles que se tiñeron con SYPRO-Ruby, se fijaron por tres horas en agitación
constante. Posteriormente se retiró el fijador y se les adicionó el SYPRO-Ruby, se
agitaron durante toda la noche y luego se incubaron en el post fijador por dos
horas. Después de la post-fijación los geles se sumergieron en agua ultrapura,
realizando dos lavados por gel cada uno de una 1 hora.
4.5
Digitalización y análisis de las imágenes de los geles bidimensionales
Los geles teñidos con Coomasie Coloidal y con el fluorescente SYPRO-Ruby
fueron escaneados utilizando el escáner PharoxFXTM que tiene un láser interno
que emite luz a 532 nm. El PharoxFXTM pueden escanear a resoluciones de 50,
100, 200, y 800 micrómetros.
4.6
Electroforesis de diferencial en gel (DIGE)
4.6.1 Marcaje de proteínas primera y segunda dimensión
Tanto en el marcaje de las proteínas como en el análisis de imagen se siguieron
los protocolos propuestos por el fabricante (GE Healthcare) (Anexo10). En
resumen, se tomaron 50 µg del extracto de proteínas de Caturra y CCC 534 y
fueron incubadas, según el diseño (Tabla 1), con 350 pmol de los marcadores
45
fluorescentes Cy3 ó Cy5 disueltos en dimeltilformamida al 99.8% (Sigma) durante
30 minutos sobre hielo y en la oscuridad. La reacción de marcaje fue detenida
mediante adición de 10 µl de lisina 10mM, incubándose las muestras durante 10
minutos adicionales. Un estándar interno se elaboró mezclando en cantidades
iguales (25 µg) de las proteínas de las dos introducciones de café y marcadas con
el fluorocromo Cy2. Tras la reacción, las proteínas de Caturra, CCC534 y el
estándar interno fueron combinados en un mismo vial de acuerdo al diseño
descrito en la tabla1.
Las muestras marcadas se aplicaron en geles IPG para el isoelectroenfoque
(Figura2). Después de la separación, los geles fueron escaneados con un equipo
provisto con fuente de luz laser con diferentes longitudes de onda. Las imágenes
de las mezclas de proteína que comigraron se compararon y se evaluaron en cada
gel. La habilidad de separar más de una muestra en un simple gel, permite la
aplicación de un estándar interno en cada gel para cada proteína en una mezcla
compleja: uno de los marcadores es aplicado sobre una mezcla del pool de
alícuotas de todas las muestras del experimento. Mediante una co-separación de
esta mezcla en cada gel, un estándar interno es creado para una detección
confiable y reproducible y una adecuada valoración de los cambios en los niveles
de acumulación de proteínas. El análisis de las imágenes es llevado a cabo por
medio de un programa computacional, que permite la codetección de puntos de
proteína a través de las diferentes muestras y el estándar interno.
Tabla 1. Diseño del experimento de electroforesis diferencial con DIGE.
Estándar Interno
Muestra1
(Cy2)
(Cy3)
25 µg de Cat + 25 µg de CCC 534
50 µg de
Caturra
Exp 1
Gel 1
46
Muestra2
(Cy5)
50 µg de
CCC 534
Gel 2
25 µg de Cat + 25 µg de CCC 534
50 µg de
CCC 534
50 µg de
Caturra
Figura 2. Dibujo esquemático del concepto de electroforesis en gel diferencial usando el
marcaje de proteínas con fluorocromos. Las proteínas provenientes de los diferentes
tejidos son premarcadas con CY3 y CY5. Se crea un estándar interno mediante la mezcla
de alícuotas de todas las muestras usadas en el experimento y se marca con el
fluorocromo CY2.
4.6.2 Adquisición de la imagen y análisis de datos
Los geles fueron escaneados, para capturar la imagen resultante de la
fluorescencia emitida por los fluorocromos Cy2, Cy3 y Cy5, respectivamente,
unidos a las proteínas incluidas en cada gel. La imagen procedente de la señal
Cy2 fue escaneada usando luz de excitación de 488 nm y un filtro de emisión
520nm; la de la señal Cy3 se obtuvo con luz de excitación de 532 nm y filtro de
emisión 580nm y la de la señal Cy5 con luz de 633 nm y filtro de emisión 670nm,
siendo todos los geles escaneados a una resolución de 50 µm. Para el análisis
47
proteómico comparativo, se seleccionaron e incorporaron en el programa
computacional “PDQuest Advanced 2-D Analysis Software” (Bio-Rad) dos
imágenes digitales de los mapas proteómicos de CCC 534 y dos de Caturra
(Figura 3). El programa elaboró un gel virtual “Master Gel” que reunía las manchas
proteicas de todos los geles CCC 534 y Caturra y les asignó un código, con el cual
e evaluaron las proteínas que estuvieran diferenciales y mas abundantes en los
grupos estudiados (Figura 4).
Luego de agrupar las imágenes en el programa y generar el “Master Gel”, se
estableció la cantidad de manchas proteicas presentes en cada gel, consiguiendo
detectar y analizar las manchas divergentes entre los geles de CCC 534 y Caturra;
estableciendo la abundacia de cada mancha para cada genotipo.
4.7
Identificación de las proteínas.
El valor de abundancia por densidad óptica de cada mancha proteica fue
examinado con el fin de realizar las diferentes comparaciones entre los mapas
proteómicos de CCC 534 y Caturra. La presencia de manchas proteicas
diferenciales entre los dos genotipos (Figura 3). La presencia de manchas
proteicas diferenciales entre los dos genotipos, fue analizado con la ayuda de la
plataforma informática PDQuest determinando la densidad óptica y comprobando
la presencia-ausencia de cada mancha
en los diferentes geles (Figura 4).
Simultáneamente se valoraron las manchas proteicas con sobreabundancia en
CCC 534 y Caturra.
Una vez realizado el análisis de los geles y seleccionadas las principales manchas
proteicas diferenciales y mas acumuladas en el genotipo CCC 534,utilizando una
prueba t –student con una probabilidad al 95%, se procedió con el corte de 14
proteinas diferenciales y 21 proteinas mas acumuladas en CCC 534 (Tabla 2)
48
Figura 3. Plataforma del programa PDQuest para el análisis comparativo de los mapas
proteómicos bidimensionales realizados a semillas de Caturra (barra inferior color rojo) y
CCC 534 (barra inferior verde). El Gel Máster (barra inferior de color blanco).
Figura 4. Gel Máster construido a partir de comparaciones entre los geles
bidimensionales de semillas de Caturra y CCC 534.
49
La recolección de las manchas proteicas seleccionadas, de los mapas
proteómicos se realizó en placas multipozo estériles (96 pozos/placa), mediante el
sistema automatizado EXQuestTM Spot-Cutter (Bio-Rad™); a partir de los geles
preparativos cargados con 1mg de proteína del genotipo CCC534. Una vez se
cortaron todas las manchas, la placa multipozo se retiró del equipo, se selló con
una película de plástico adherente y se guardó a -80 ºC hasta el procesamiento de
las muestras en el espectrómetro de masas.
Tabla 2. Códigos de las manchas proteicas de CCC 534 enviadas a secuenciación por
espectrometría de masas.
Nº
Acumuladas
Nº
Especifico
Mancha en CCC 534 Mancha en CCC 534
4
SSP 1001
1
SSP 1714
5
SSP 1007
2
SSP 1625
6
SSP 1103
3
SSP 2241
7
SSP 5416
12
SSP 1318
8
SSP 1303
13
SSP 1319
9
SSP 5417
18
SSP 2410
10
SSP 1201
22
SSP 6922
11
SSP 5506
23
SSP 6926
14
SSP 1306
24
SSP 6938
15
SSP 2202
25
SSP 7905
16
SSP 2205
26
SSP 7816
17
SSP 5301
27
SSP 7819
19
SSP 2508
28
SSP 7921
20
SSP 1603
34
SSP 7007
21
SSP 2701
29
SSP 7502
30
SSP 5506
31
SSP 6503
32
SSP 6308
33
SSP 8501
35
SSP 7602
*SSP: Standard Spots: Número único asignado a cada punto en el gel master
50
Para la identificación, las muestras de proteínas en las placas multipozos fueron
secadas al vacio en un equipo Labconco Fruzone6 y enviados al Laboratorio de
Espectrometría de Masas de la Universidad de Stanford (Palo Alto, California)
para la secuenciación de novo (www.mass-spec.stanford.edu). La secuencia
primaria de aminoácidos obtenida de cada muestra se comparó con bases de
datos genómicas y/ó proteómicas existentes para plantas dicotiledóneas, así como
con la base de datos de ESTs (Expressed Senqueces Tags) de café, desarrollada
en Cenicafé, identificando la máxima homología. Los resultados fueron recibidos
para visualización a través del software Scaffold 3, donde para cada punto de
proteína secuenciado, lista la cantidad de proteínas posibles con las cuales
presentó homología para cada base de datos. Los parámetros que utiliza el
programa para presentar los resultados son: mínimo número de péptidos únicos
desde 1 a 5, probabilidad de identificación de proteína mínima desde 20% a
99.9%, y probabilidad de identificación de péptidos mínima desde 0 a 95%.
También se realizó una identificación de las secuencias primarias utilizando el
programa MASCOT (www.matrixscience.com).
4.8
Clasificación de las proteínas por función
La identificación de las proteínas se realizó mediante el estudio de secuencias
homólogas, fundamentada en el hecho de que muchas proteínas de plantas se
encuentran altamente conservadas. Así, proteínas que comparten secuencias
similares, pueden desempeñar la misma función. Es por esto, que las bases de
datos suelen identificar secuencias homólogas en diferentes especies facilitando la
tarea de identificación y de asignación de la función (Thiellement et al. 1999).
Para la identificación de las secuencias primarias de las proteínas, se utilizó el
programa MascotTM (Matrix Science), que se basa en un algoritmo de búsqueda
denominado MOWSE (Molecular Weigth Search). Los criterios utilizados para la
identificación positiva de cada una de las proteínas se basaron principalmente en
la utilización de parámetros como la masa péptidica obtenida mediante
51
espectrometría de masas y su correspondencia con las masas de péptidos
resultantes de digestiones teóricas de proteínas en las bases de datos (“peptides
matched”), los mejores valores reportados en la prueba MOWSE (“individual ions
scores”) que superaron la probabilidad asociada a cada búsqueda (“score”) y el
porcentaje de secuencia de la proteína candidata que cubren las masas de los
péptidos que se pudieron identificar (“expect”). Cuanto mayor sea el valor de esos
tres parámetros (matches, score y Expect), mayor es la probabilidad de una
identificación correcta (Tablas 3 y 4).
El modelo MOWSE permite calcular la probabilidad del emparejamiento de los
datos experimentales y de una entrada de una base de datos aleatorios, tal como
lo hacen los algoritmos de búsqueda de secuencias por homología (Perkins et al.
1999). Para evitar que los valores de probabilidad se suministren en notación
científica (ya que los valores probalisticos suelen ser muy pequeños), el modelo
proporciona el valor de -10*log10 (P), de donde P es la citada probabilidad del
emparejamiento aleatorio. Por ejemplo: -10*log10(5x10-8)= 73.01. De este modo,
las puntuaciones obtenidas que queden por debajo del orden de 70 puntos para
una base de datos de este tamaño se considerarán no significativas, y
puntuaciones como 354 y 113 representaran identificaciones homólogas o
altamente significativas (Pappin et al. 1993).
Con las secuencias identificadas para cada mancha proteica, se utilizaron las
bases de datos Swiss Prot, NCBI, IterProScam, CATH Protein Structure
Classification. Además, las secuencias peptídicas fueron comparadas con las
bases de datos de varias librerías de Café propiedad de la Federación Nacional de
Cafeteros.
52
5. RESULTADOS
5.1
Extracción, limpieza y concentración de las proteínas
De los tres protocolos realizados para la extracción y limpieza de las proteínas
(Figura 5), el protocolo 2 fue el que mostró mejores resultados (Figura 5b),
sumergiendo las semillas con hexano al 95%, extracción de proteínas con la
solución amortiguadora PBS y precipitando con TCA acetona e incorporando dos
lavados con acetona durante la limpieza con el kit Clean-up. Con los protocolos 1
y 3 no hubo degradación proteica pero se obtuvo una menor concentración de
proteína (Figura 5 a y c)
Figura 5. Electroforesis unidimensional de proteínas de semillas de Caturra (SDS, Gel
10% a 0.01 mA). a) proteínas extraídas y precipitadas con TCA (2.76µg/uL) y purificadas
con el kit Clean-up (Biorad). b) proteínas extraídas con PBS (15.63 µg/ul) y precipitadas
con TCA y purificadas con el kit Clean-up. c) proteínas extraídas con PBS (7.56 µg/uL) y
purificadas con el kit Clean-up. Cada pozo (5µl) de muestra.
Con el protocolo 1, la concentracion de proteína extraída en Caturra dio un valor
promedio de 2.76µg/uL; el protocolo 2 presentó un valor promedio de 15.63 µg/ul y
en el protocolo 3 se obtuvo un valor promedio de 7.56 µg/uL. Por los resultados
53
obtenidos con el protocolo 3, se realizó la extracción de proteínas de semillas de
café inicialmente se sumergieron en Hexano al 98%, posteriormente se muelen, se
le adiciona una solución amortiguadora PBS y se dejan precipitando con TCA y
finalmente se incorporan dos lavados con acetona durante la purificación con el kit
Clean-Up, con este protocolo se logró obtener una mayor concentración de
proteínas, y una buena integridad como se observa en la Figura 6.
En promedio se extrajeron 27.4 µg/uL de proteína del genotipo CCC 534 y 24.6
µg/uL del genotipo Caturra.
Catu rra
CCC534
Figura 6. Electroforesis unidimensional de semillas de café de las introducciones CCC
534 y Caturra, proteínas extraídas con PBS, precipitadas con TCA y purificadas con el Kit
Clean-Up (SDS, Gel 10%). (5µl de muestra por carril)
La preparación de las muestras para la extracción de proteínas fue vital en la
obtención de mapas proteómicos reproducibles así como la observación del mayor
54
número de proteínas en las dos introducciones. Este método de extracción de
proteínas contempla la eliminación de compuestos no proteicos (principalmente
los lípidos componentes del tejido graso). Aunque en la literatura se encuentran
métodos para la extracción, limpieza y separación de proteínas, estos no han sido
utilizados en semillas de café. La gran cantidad de tejido graso de las semillas es
el principal obstáculo para purificar las proteínas. El tratamiento con Hexano al
98% y los dos lavados adicionales con acetona para la purificación de las
proteínas, eliminaron considerablemente los lípidos y sales que dificultaban
enfocar las proteínas en los geles bidimensionales.
5.2
Separación de las proteínas por Electroforesis Bidimensional (2-D)
Las proteínas isoelectroenfocadas se separaron por peso molecular (2-D) en geles
procesados en cámaras de electroforesis vertical de diferentes tamaños, de
acuerdo al tamaño de los geles IPG, revelando una gran variedad de especies
proteicas, bien definidas (Figura 7, 8 y 9). En los geles bidimensionales más
pequeños las proteínas no fueron perfectamente separadas por isolectroenfoque
observándose manchas de proteínas isoelectroenfocadas conectadas con
manchas horizontales a lo ancho del gel (“rayas horizontales”). Sin embargo, la
separación por peso molecular permitió obtener manchas de proteínas bien
definidas. (Figura 7). Estos resultados permitieron concluir que, aunque en el
extracto de proteínas podrían quedar remanentes de compuestos que interfirieren
con el isolectroenfoque, las proteínas formaron manchas discretas distribuidas en
el gel y por lo tanto estos extractos eran óptimos para ser utilizados en geles
bidimensionales más grandes. En los geles bidimensionales de 17 cm las
proteínas tuvieron mejor resolucón isoelectroforética observándose manchas
proteicas mejor separadas en los geles y menor presencia de “rayas horizontales”
(Figura 8). En los geles de 24 cm se observó que las proteínas de las semillas de
las dos introducciones mostraron una buena focalización y distribución en el gel
(Figura 9) y que el protocolo desarrollado hasta el momento permitiría el análisis
de la expresión diferencial de estos dos genotipos.
55
+ kDa
(+) 3
(-10)
+ kDa
(+) 3
(
-kDa
(-10)
(
a
-kDa
b
Figura 7. Electroforesis bidimensional de proteínas de semillas de Café. a) mapa
proteomico de semillas de café de la introducción CCC 534; b) mapa proteomico de
semillas de café variedad Caturra. La primera dimensión se realizó geles pH de 3-10 de
7cm. La segunda dimensión se corrió en una cámara Mini-Protean en geles de
poliacrilamida al 12% con SDS. Tinción con Sypro-Ruby. Concentración de proteína
100µg .
Figura 8. Mapa proteomico de semillas de café variedad Caturra. La primera dimensión
se realizó con geles IPG pH de 3-10 de 17cm. La segunda dimensión se corrió en una
cámara Protean-Cell (Bio-Rad) en geles de poliacrilamida al 12% con SDS. Tinción con
Azul de Coomasie. Concentración de proteína 300µg.
56
(+) 3
(+) 3
(-) 10
(-) 10
+
kDa
+ kDa
a
kDa
kDa
bb
Figura 9. Electroforesis bidimensional de proteínas de semillas de Café. a) mapa
proteomico de semillas de café variedad Caturra; b) mapa proteomico de semillas de café
de la introducción CCC 534. La primera dimensión se realizó con geles IPG de pH de 3-10
de 24cm. La segunda dimensión se corrió en una cámara Dodeca-Cell Bio-Rad. en geles
de poliacrilamida al 12% con SDS. Tinción con Sypro-Ruby. Concentración de proteína
400µg.
5.3
Proteómica Diferencial entre semillas de Caturra y CCC 534
En la Figura 10 se observa las imágenes obtenidas de los geles bidimensionales
de las proteínas marcadas con los fluorocromos Cy2/Cy3/Cy5. Las muestras se
separaron en geles preparativos de 24 cm y se observó una buena focalización de
las proteínas. Se obtuvieron 6 imágenes de los 2 geles que se corrieron y que
correspondieron a las proteínas provenientes de la mezcla de proteínas de las dos
introducciones (estándar interno marcado con cy2), proteínas del genotipo CCC
534 (marcado con cy5 ó Cy3) y del fenotipo caturra (marcada con Cy5 o Cy3).
Usando el software PDquest fueron detectadas un total de 230 manchas proteicas
en la comparación entre los mapas proteómicos entre Caturra y CCC 534. De los
230 puntos, 105 fueron comunes a todos los geles. Un total de 58 puntos fueron
determinados como diferenciales usando una significancia de p < 0.05. Se
encontraron 14 manchas proteicas diferenciales en CCC 534 y 11 manchas en
57
Caturra, además se encontraron 12 proteinas acumuladas diferencialmente en
Caturra y 21 en CCC 534
5.3.1 Análisis de las imágenes
Una vez obtenidas las imágenes de cada muestra, se realizó el emparejamiento y
la normalización de cada mancha proteíca teniendo en cuenta que eran
experimentos de DIGE que incluían un estándar interno para cada uno utilizando
el software PDQuest Advanced 2-D Analysis Software (Bio-Rad). Se evaluó la
densidad óptica de cada proteína y se comparó mediante la Prueba t-student con
un nivel de significancia del 95%. Se obtuvieron 35 proteínas estadísticamente
diferenciales en el genotipo CCC534 con relación a Caturra, Las manchas más
significativas para la investigación fueron las que correspondieron a proteínas
exclusivas o acumuladas en el genotipo CCC 534. Se identificaron catorce (14)
proteínas específicas del genotipo y 21 acumuladas con relación a Caturra.
Para el análisis se tuvieron en cuenta sólo las diferencias presentes en las dos
repeticiones y que fueran estadísticamente, significativos (p<95%), usando la
prueba t-student.
Concluidos los análisis de las proteínas diferenciales en cada introducción, se
seleccionaron 14 proteínas diferenciales en CCC 534 y 21 proteínas más
acumuladas en CCC 534 que fueron enviadas a secuenciación de novo por
espectrometría de masas (Tabla 2, Figura 11).
58
Figura 10. Patrones electroforéticos de proteínas de los extractos de semillas de Caturra
y CCC 534 con la técnica 2D-DIGE. (a) las proteínas marcadas se observan en todos los
fluorocromos. (b) Cy5, para la muestra de proteína de Caturra (50µg). (c) Cy3, para la
muestra de proteína de CCC 534. (50µg). (d) Cy2, mezclando cantidades iguales de todas
las proteínas como estándar interno (25 µg Caturra+25 µg CCC534).
5.3.2 Identificación de las proteínas
Los datos de masas obtenidos con la espectrometría se analizaron por
comparación con las bases de datos del National Centre Biotechnology
Information (NCBI), y de la base de Expressed Sequende Tags (EST) de Café,
mediante el programa Mascot (Matriz Science, Londres, UK) (http://www.matrix science.com). Este programa compara los valores teóricos y experimentales de
péptidos depositados en bases de datos, sometidos a una digestión virtual,
generando una lista de posibles péptidos candidatos que coinciden con la mancha
proteica analizada.
59
Figura 11. Gel preparativo de semillas de la introducción CCC 534, indicando las
manchas proteicas aisladas para identificación por espectrometría de masas. Cada gel
con 1.0mg de proteína, teñidos con Sypro Rubi
En las Tablas 3 y 4, se muestran los resultados de los análisis de homología de
las secuencias obtenidas para las 35 proteínas con la base de datos de proteínas
de café y de plantas dicotiledóneas. Se seleccionó el que presentó mayor
probabilidad de identificación de proteína y siempre teniendo la probabilidad de
identificación de péptidos mínima en 95%, además de que el peso molecular
corresponda o se aproxime al experimental.
60
40
35
30
25
20
CCC534
Caturra
15
10
5
1714
1625
2241
101
1007
1103
5416
1303
5417
1201
5506
1318
1319
1306
2202
2205
5301
2410
2508
1603
2701
6922
6926
6938
7905
7816
7819
7921
7502
5506
6503
6308
8501
7007
7602
0
Figura 12. Ilustración de proteínas sobreacumuladas y proteínas diferenciales
identificadas en semillas de CCC534 y Caturra. Cada barra representa el valor medio de
dos replicas.
Las proteínas identificadas se clasificaron según los criterios GOA (Gene Ontology
Annotation). De las 14 proteínas diferenciales de CCC 534, cinco de estas
proteínas participan en la actividad oxidorreduccción, dos son proteínas de unión
de ATP constituyentes del citoesqueleto, una proteasa, una proteina de
almacenamiento de semillas, un inhibidor de alpha amilasa, una metiltransferasa,
una de unión ARNr y dos que interviene en la unión de GTP (Tabla 3 y 4). De las
21 proteínas identificadas en CCC 534 que estaban acumuladas, se encontró tres
proteínas de función desconocida, tres proteasas, dos proteínas implicadas en la
unión de ARN, dos proteínas de defensa, dos oxidoreducción, una lipoxigenasa,
una que participa en el transporte de electrones, una glicosiltransferasa, cuatro
transferasas, otra de unión al ion Mg y otra involucrada en la unión de ATP.
Un 91% de las secuencias estudiadas dieron homología con secuencias de
proteínas de plantas, lo que era de esperarse ya que la probabilidad de éxito en
las identificaciones aumenta al utilizar bases de datos de secuencias de
61
organismos filogenéticamente próximos y organismos modelos en biología vegetal
(como es el caso de Arabidopsis thaliana). Es por esta razón que muchas de las
identificaciones de proteínas descritas en este trabajo corresponden a especies
vegetales diferentes a café, incluyendo: Lycopersicum esculemtum, Arabidopsis
thaliana y Oryza sativa ya que se encuentran secuenciadas completamente, lo que
hace que su base de datos sea más robusta y está totalmente anotada.
La clasificación de las proteínas estudiadas según su función putativa se presenta
en la Figura 13 y nos muestra que la gran mayoría de las proteínas evaluadas en
este trabajo presentan actividad oxidoreductasa.
3%
3%
Desconocida
9%
6%
Unión de ATP
3%
9%
Oxidoreductasa
3%
transferasa
3%
Proteína de defensa
6%
Unión de ARN
Actividad GTPasa
23%
Actividad lipoxigenasa
Transporte de electrones
17%
Unión GTP
Glicosiltransferasa
15%
Unión de iones de magnesio
Figura 13. Clasificación de las proteínas identificadas en CCC534, de acuerdo a la
función en la cual intervienen.
62
En la Tabla 3 se exponen las homologías de las proteínas identificadas, su
función, la cantidad de péptidos identificados, el porcentaje de cobertura y la
accesión a las bases de datos Genbank y en Swiss-Prot.
La identificación de proteínas mediante el estudio de secuencias homólogas (o
comparación de sus masas) se puede llevar a cabo basándonos en el hecho de
que muchas proteínas de plantas se encuentran altamente conservadas. Así,
proteínas que comparten secuencias similares, es probable que desempeñen la
misma función. Por esta razón, las bases de datos suelen identificar secuencias
homólogas en diferentes especies que pueden facilitar las tareas de identificación
y de asignación de la función. La continuación del estudio genómico de diferentes
especies vegetales que se están llevando a cabo en la actualidad sin duda
facilitará la identificación de un número de proteínas cada vez mayor (Thiellement
et al. 1999)
63
Tabla 3. Proteínas de CCC534 identificadas con la base de datos de plantas y de café
Tabla 4. Proteínas de CCC534 identificadas con la base de datos de plantas y de café
65
6. DISCUSIÓN
A pesar que dentro del género Coffea no se conocen genotipos resistentes a la
broca, trabajos previos han identificado genotipos de Coffea arabica que
tuvieron significativamente menor oviposición que el testigo, la variedad
Caturra. La menor oviposición podría deberse a la existencia de factores
antinutricionales en el grano, o a un desbalance de nutrientes adecuados para
una buena reproducción del insecto (Maxwell 1972, Papaj 2000, Nation 2001,
Hodin 2009).
Se seleccionó la introducción CCC 534 por presentar una respuesta
consistente a lo largo de varias evaluciones, con relación a una menor
oviposición con respecto a Caturra. Vargas (2006), observó que cuando las
hembras de brocas fueron criadas sobre la variedad susceptible la introducción
CCC 534 no se destacó y cuando fueron criadas sobre el mismo material
evaluado si presentó diferencias significativas.
En laboratorio, cuando las hembras son criadas sobre la introducción
susceptible la capacidad reproductiva del insecto es igual ya sea que crie
posteriormente sobre las introducciones o el testigo, pero cuando son criadas
sobre etíopes, algunas introducciones tienen la tasa reproductiva, la tasa
intrínseca de crecimiento y la tasa finita de crecimiento significativamente
inferiores al testigo, y el tiempo de duplicación superior mientras el tiempo
generacional es igual (Vargas 2006).
Aunque las diferencias no son muy altas, si estos factores antinutricionales,
que reducen la oviposición, se pudieran transferir a variedades comerciales de
café, este efecto acumulado en varias generaciones reduciría notablemente las
poblaciones del insecto. Esta variedad haría más eficiente y económico el
manejo del insecto, al retardar el tiempo en que la población alcanza los niveles
en que se hacen necesarias otras medidas de control. Un estudio comparativo
del proteoma de las semillas de estos dos
genotipos permitiría identificar
proteínas que pudieran tener efectos antinutricionales en la broca.
Actualmente, la mejor manera de analizar un proteoma es a través de los
mapas generados por electroforesis bidimensional. Esta técnica ha mejorado
mucho con el tiempo debido al uso de geles con gradientes inmovilizados de
pH (Görg et al. 2000), la disponibilidad de diferentes gradientes de pH, y la
introducción de nuevos detergentes para mejorar la solubilización de proteínas
(Henningsen et al. 2002). Es por esto que el uso de técnicas para la separación
e identificación de proteínas en el mundo, así como la obtención de mapas
proteómicos de tejidos vegetales ha aumentado, destacándose trabajos en
proteómica comparativa sobre resistencia a factores abióticos como estrés a
sequía o estrés salino y a factores bióticos como resistencia a patógenos.
Los factores limitantes en proteómica son la solubilización de proteínas, la
pobre resolución de las proteínas, la dificultad de obtener mapas de gran
resolución con los gradientes estrechos de pH, la identificación de proteínas de
bajo número de copias y la dificultad de analizar proteínas por debajo de 10
KDa y por encima de 150 KDa.
La preparación adecuada de muestras para la extracción de proteínas fue vital
en la obtención de mapas proteómicos reproducibles así como la visualización
del mayor número de proteínas contenidas en las semillas de las dos
introducciones. Este método de extracción de proteínas contempló la
eliminación de compuestos de naturaleza no proteica (Lípidos, sales), la
disociación completa de las interacciones entre proteínas; tal como ha sido
demostrado en otras investigaciones por Granier y Van del Walle (1988) y
Stasyk et al.(2001). Aunque en la literatura se encuentran metodologías para la
extracción, limpieza y separación de proteínas, éstas no han sido utilizadas en
semillas de café en la cual, gran cantidad de tejido graso es el principal
obstáculo para la limpieza de las proteínas. El sumergir las semillas en hexano
al 98% por 5 minutos antes de macerarlos y realizarle dos lavados con acetona
en el protocolo de la limpieza de las proteínas, mejoraron considerablemente la
eliminación de lípidos y sales que causaron dificultades para enfocar las
proteínas en los geles bidimensionales.
67
Los resultados de esta investigación muestran que si existieron diferencias en
el perfil de proteínas en el genotipo CCC534, en comparación con el genotipo
Caturra. A continuación se describe cada una de las proteínas diferencialmente
acumuladas las cuales se agruparon de acuerdo a la actividad bioquímica y
posible funcionalidad en la semilla.
6.1
Proteínas con actividad oxidoreductasa
En las semillas de CCC 534, las proteínas identificadas que presentan sobreacumulacion y están involucradas en la actividad oxidoreducción fueron: Auxina
inducida por la proteína PCNT115 (N° 19), la mono-dehidroascorbato reductasa
(N° 29) y la (S)-2-hidroxi-ácido oxidasa ( N° 33) (Fig 11; Tabla 3).
Las proteínas específicas en el genotipo CCC 534 y que no estaban presentes
en el genotipo Caturra fueron: Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa2
citosólica (N° 12), Citocromo P450 71D6 (N° 23), citocromo c oxidasa
subunidad 1 (N° 25), Succinato deshidrogenasa [ubiquinona] flavoproteína
subunidad 2 (N° 27) y alcohol deshidrogenasa (N° 28) (Fig 11; Tabla 3). Estos
resultados indican diferencias entre los dos genotipos en las proteínas
relacionadas con las oxidaciones y reducciones biológicas que intervienen en
los procesos de respiración y fermentación. Las oxidoreductasas son
importantes a nivel de algunas cadenas metabólicas, como la escisión
enzimática de la glucosa, fabricando también depósitos de energía en forma
de ATP.
La enzima gliceraldehido-3-fosfatasa deshidrogenada (GAPDH) que se
encuentra como diferencial en CCC534, desempeña un papel importante tanto
en la glicolisis como en la glucogénesis, ya que cataliza la oxidación y
fosforilación del aldehído gliceraldehido-3-fosfato a 1,3 difosfoglicerato (Huang
et al.1989). La enzima (GAPDH), existe como un tetrámero de subunidades
idénticas, la cual contiene 2 dominios funcionales conservados: un dominio de
unión a NAD y un dominio catalítico altamente conservado (Dugaiczyk et al.
1983). Esta enzima ha sido localizada en uniones con actina y tropomosina y
desempeña un papel importante en el ensamblaje del citoesqueleto al
68
proporcionar una estructura para el correcto posicionamiento de la enzima
glicolitica, esto permite el tránsito eficiente de los metabolitos hacia la enzima
(Dugaiczyk et al. 1983). Además la GAPDH presenta diversas funciones no
glicolíticas que son favorables, dependiendo de la localización subcelular en la
que se encuentra esta enzima. Por ejemplo, la translocación del GAPDH hacia
el núcleo acciona un mecanismo de señalización para programar la muerte
celular o apoptosis (Berry y Boulton 2000). Esta proteína esta involucrada en
procesos de maduración y germinacion de semillas.
Citocromo P450 y Citocromo c oxidasa, se identificaron de manera diferencial
en las semillas de la introducción CCC534, estas proteínas en las plantas son
importantes para la biosíntesis de varios compuestos como hormonas, de
señalización, de defensa y ácidos grasos, es una enzima que se encuentra
involucrada en la actividad de transporte de electrones (Bak et al. 2011).
Citocromo c oxidasa es el componente de la cadena respiratoria que cataliza la
reducción del oxígeno a agua. Cytochrome P450, específicamente a la CYP74,
convierten los ácidos grasos hidroxiperosi en oxilipinas, que son compuestos
con funciones de señalización en el desarrollo de la planta y en defensa,
algunos de estos compuestos ejercen una actividad antifúngica o antimicrobial
(Morant et al.2003). Adicionalmente se encuentran implicados en la biosíntesis
de pigmentos, volátiles, antioxidantes y compuestos de defensa aleloquímicos,
incluyendo compuestos fenólicos y sus conjugados, flavonoides, cumarinas,
lignanos,
glucosinolatos,
glucósidos
cianogénicos,
benzoxazinonas,
isoprenoides y alcaloides (Schuler y Werck-Reichhart 2003; Morant et al. 2003;
Mizutani y Otah, 2010). Además de sus sustratos fisiológicos, el citocromo
P450 metaboliza y desintoxica xenobióticos como plaguicidas y contaminantes
(Werck-Reichhart et al. 2000; Morant et al. 2003; Powles y Yu 2010). Están
relacionados con funciones de respuesta temprana que conducen a la
producción de moléculas de señalización de estrés y funciones de respuestas
finales que conducen a la síntesis de compuestos protectores (Shuler et al.
2006)
La proteína Succinato deshidrogenasa [ubiquinona] flavoproteína subunidad 2
(SDH) fue diferencial en CCC534, la cual cataliza la oxidación del succinato. El
69
complejo está formado por cuatro subunidades: una subunidad de masa
molecular 70KDa que contiene FAD unido covalentemente a un residuo de
histidina, una unidad de 30KDa que contiene tres centros ferro sulfurados y dos
proteínas hidrofóbicas pequeñas (Ackrell et al 1978). Succinato-ubiquinona
forma parte del ciclo de ácido tricloroacético y menaquinol-fumarato
oxidorreductasa (QFR) utilizado para la respiración anaerobia por Escherichia
coli, son estructural y funcionalmente relacionadas a la membrana complejos
de enzimas. Esta proteína desempeña un papel desconocido en la respuesta
del estrés abiótico.Se conoce como el complejo II, tiene una doble función y
desempeñan un papel importante tanto en el ciclo del ácido tricarboxílico y en
la cadena respiratoria aeróbica
mediante la catálisis de la oxidación de
succinato a fumarato y la reducción de ubiquinona a ubiquinol respectivamente
(Araújo et al. 2011).
Araújo y sus colaboradores
han descubierto que la represión de las
subunidades hierro sulfuro de SDH (SDH2) en tomate tiene un aumento
combinado de la conductancia estomática, tasa de fotosíntesis y el crecimiento.
Fuentes et al. 2006 analizaron SDH en plantas de Arabidopsis que presentaban
expresión de la subunidad comprometida flavoproteína de SDH (SDH1) y
desmostró que una actividad leve en la actividad mitocondrial de SDH tuvo un
impacto positivo en el rendimiento fotosintético de plantas sometida a
condiciones ambientales controladas que impiden el estrés hídrico.
Se ha detectado un aumento de la transcripción de SDH1 en genotipos
tolerantes a sequía que se correlacionó con un aumento en la concentración de
ácido abscísico. Esta respuesta fisiologica podría ser una estrategia utilizada
por los genotipos resistentes a sequias para evitar la desecación del tejido,
reduciendo al mínimo la pérdida de agua a través del cierre de los estomas en
las primeras etapas de deshidratación posteriormente, el potencial hídrico foliar
disminuye debido a condiciones de estrés mayores, la planta reacciona
haciendo un ajuste osmótico para mantener el tejido en actividad metabólica y
permitir la recuperación de la fotosíntesis sobre el cese de las condiciones de
sequía (Acevedo et al. 2013)
70
Gleason et al. 2011 recientemente ha presentado pruebas genéticas de SDH
que participa en la localización de ROS mitocondrial que regula el estrés de la
planta y las respuesta de defensa y concluyó que el complejo II que es una
fuente de H2O2 mitocondrial a la defensa de la planta frente a patógenos
fúngicos y bacterianos.
La ultima proteína diferencial fue “Alcohol deshydrogenasa ADH”, la cual es
una enzima glicolítica que ha sido caracterizada en plantas con floración y es
esencial para el metabolismo anaeróbico; en Arabidopsis thaliana y maíz, se ha
demostrado que el estrés por oxígeno y por frío induce la transcripción de los
promotores ADH (Fukuda et al.2005). Las ADH son un sistema enzimático de
localización mayoritariamente citoplasmático ampliamente distribuido en
numerosos organismos pertenecientes a todos los reinos en los que se
clasifican los seres vivos (Jörnvall et al. 1993).
Uno de los factores responsables de la tolerancia a la inundación es la
actividad del alcohol deshidrogenasa (ADH), que aumenta su actividad bajo
diferentes condiciones de estrés, incluyendo anoxia (Rizal y Karki 2011)
La auxina inducida por la proteína PCNT115, se identificó como sobreacumulada en CCC534. Las hormonas vegetales se sabe que tienen efectos
pleiotrópicos sobre el crecimiento y el desarrollo. Por ejemplo, la forma naturalde la auxina, IAA, influye en la división celular, la elongación celular, y
diferenciación (Brummell y
Hall 1987). Las auxinas podrían inducir a la
actividad fosfolipasa en las membranas vegetales (Andre y Scherer 1991). La
Auxina desempeña un papel crítico en la dominancia apical, y en la iniciación
de raíces laterales y la emergencia (Casimiro et al., 2001). Promueve la
elongación principalmente aumentando la extensibilidad de la pared celular.
Una de las acciones importantes de las auxinas es inducir el transporte de
protones a la pared celular por estimulación de la H+-ATPasa de la membrana
plasmática. La proteína inducida por la auxina está implicada en el
metabolismo energético. Las auxinas se conocen como un regulador negativo
de la expresión de defensa de varios genes. Una gran parte de los genes
inducidos por auxina en un largo plazo contiene factores MYC que son
71
previamente caracterizados por su capacidad de respuesta al ácido abscísico
(ABA), peróxido de hidrógeno (H2O2) y otros factores de estrés como la sequía
y la salinidad (Pufky et al. 2003)
Otras
proteína
sobre-acumulada
en
semillas
de
CCC
534
es
la
monodehidroascorbato reductasa (MDAR), en las plantas es un componente
del ciclo de glutatión ascorbato que es uno de los sistemas antioxidantes
principales de células de plantas para la protección contra los daños
producidos por las especies reactivas de oxígeno (ROS). La actividad de
MDAR ha sido descrita en varios comportámientos celulares, tales como
cloroplastos, mitocondrias, citosol, glioxisomas, hoja y peroxisomas (Leterrier
2005) y está proteína se encuentra relacionada con estrés abiótico. El análisis
de la expresión en diferentes órganos de la planta por transferencias Northern
blot mostró que las frutas tenían el mayor nivel de MDAR. Es la única enzima
conocida donde utiliza los radicales orgánicos como sustratos (Eastmond
2007).
Y la ultima proteína sobre acumulada que se encuentra relacionada con la
actividad oxidoreductasa es la (S)-2-hidroxi-ácido oxidasa, familia de
homólogos FMN dependientes de alfa-hidroxiácido enzimas oxidantes, se
produce tanto en procariotas como en eucariotas. Los miembros de esta familia
en las plantas incluyen b2 flavocitocromo (FCB2), glicolato oxidasa (GOX),
lactato de monooxigenasa (LMO), mandelato deshidrogenasa (MDH), y la
oxidasa de larga cadena hidroxiácido (LCHAO). Glicolato oxidasa es una de las
enzimas clave en la fotorrespiración donde se oxida glicolato a glioxilato,
cataliza la oxidación de L-lactato de etilo y dióxido de carbono (Jones et al.
2000)
6.2
Proteasas y proteínas de defensa
En las semillas de CCC 534 se identificaron tres proteínas que pertenecen a la
familia de proteasomas.
72
La proteína (N° # 2, Fig. 11; Tabla 4) proteasomas subunidad alfa tipo-5 se
identificó como diferencial en CCC534 y como sobre acumuladas se
identificaron las proteínas proteasoma subunidad alfa tipo-2-B (punto # 8) y
Proteasoma subunidad beta tipo, putativa (punto # 8) (Fig. 11; Tabla 3).
El proteasoma es un complejo de proteinasa multicatalítico que se caracteriza
por su capacidad para escindir los péptidos con Arg, Phe, Tyr, Leu, Glu y
adyacentes al grupo pH neutro o ligeramente básico. El proteosoma tiene una
actividad proteolítica dependiente de ATP. Es un complejo de enzima
multisubunidades que desempeña un papel central en la regulación de las
proteínas que controlan el ciclo celular. La funcion principal del proteasoma es
degradar proteinas de forma selectiva asociadas al complejo de señalización
de ubiquitina (Kisselev y Goldberg 2001). Estas proteínas participan en los
procesos de degradación de proteínas malformadas, papel regulador como
parte del sistema ubiquitina, diferenciación celular, sistema inmunológico
(inmunoproteosoma), regula el ciclo celular, defensa contra toxinas, asociada a
la hidrólisis de ATP, maquinaria degradativa de proteínas: La actividad
proteasoma se ha correlacionado con la activación de las reacciones de
defensa de las plantas (Suty et al. 2003).
En las semillas el proteosoma aumenta en la maduración, disminuye en la
germinación. Se ha demostrado que las células exhiben tasas de aumento de
la proteólisis tras la exposición de agentes oxidantes a inductores de estrés, el
proteosoma puede degradar proteínas innecesarias para proteger la semilla de
los daños. El aumento constante del proteosoma durante la maduración, y el
tratamiendo de desecación podría implicar que las proteínas intracelulares son
modificadas oxidativamente por los radicales libres y oxidantes relacionados y
estas proteínas modificadas selectivamente y preferentemente degradadas por
enzimas proteolíticas intracelulares. La modulación de la respuesta al estrés
por deshidratación es conocido por ser dependiente en el control de la
degradación celular y el mantenimiento de la calidad de los proteomas por el
sistema ubiquitina-proteoma (Huang et al. 2012).
73
El complejo proteico (proteasoma) está formado por dos componentes
principales: un conjunto de dos subunidades multiproteicas con función
catalítica y una subunidad, también multiproteica, con función reguladora, con
velocidades de sedimentación de 20S y 19S respectivamente (Konstantinova et
al., 2008).
El complejo 20S está constituido por dos copias de 14 subunidades cada una,
con un peso molecular global de 700KDa (1dalton=1uma, unidad de masa
atómica). Las 14 subunidades son homólogas, adoptando la misma estructura
en conjunto. Las 28 subunidades del complejo 20S están formadas cada una
por cuatro anillos de 7 subunidades. La estructura espacial adopta el aspecto
de barril.
Los componentes de los anillos exteriores del barril se denominan α; y los de
los anillos internos del barril se denominan β, quedando una estructura α1-7
β1-7 β1-7 α1-7. Los centros activos de la proteasa se sitúan en los anillos β del
interior del barril que contienen los aminoácidos treonina o serina en el extremo
N-terminal. Los grupos hidroxilo (-OH) de treonina o serina se convierten en
nucleofílicos (-O-) con la ayuda de los grupos amino convertidos en amonio (NH3+). Los grupos nucleofílicos reaccionan con los grupos carbonilo de los
enlaces peptídicos formando derivados acilos de las enzimas (acil-enzima).
Este proceso permite secuestrar los centros activos proteolíticos de los
sustratos potenciales difundiendo en el interior del barril, como de una planta
carnívora se tratase. Se produce la digestión de la proteína hasta la formación
de péptidos de entre 7 y 9 aminoácidos. (Konstantinova et al., 2008; Tanaka
2009).
En las eucariotas los proteosomas suelen encontrarse en el núcleo y en el
citoplasma y representan un importante mecanismo por el cual las células
controlan la concentración de determinadas proteínas mediante la degradación
de las mismas (Hendil et al. 2002).
En las células vegetales, que en general poseen tasas de división menores a la
de otros organismos eucarióticos, la degradación controlada de proteínas por el
proteasoma desempeña un importante papel en la regulación de la actividad
74
genética. En una célula eucariótica se calcula mas del 90% de las proteínas de
vida corta son degradadas por este sistema (Lam 1996). Cuando una planta se
encuentra en algún tipo de estrés abiótico algunas proteínas pueden sufrir
daños en su estructura, dando como consecuencia un mal funcionamiento. En
estas situaciones dicho complejo es el encargado de degradar a las proteínas
que han sido afectadas por el estrés y que ya no pueden ser reparadas por
algún tipo de chaperona. En reportes previos se ha observado que el
proteasoma también tiene una participación en el mecanismo de regulación de
rutas hormonales en plantas (Lorenzo y Solano 2005).
En CCC 534 se sobre-acumuló la proteína (N° # 10 Fig. 11; Tabla 4) Leucina
aminopeptidasa 1, cloroplástico, la cual esta presuntamente implicada en el
procesamiento de facturación y regulación de las proteínas intracelulares, es
una enzima ubicua.
Las leucina aminopeptidasas (LAP) están relacionadas con daño mecánico, por
infección por patógenos y plagas de insectos (Pautot et al. 1993). Una amplia
variedad de actividades aminopeptidasa se han detectado en los animales,
planta, y células procariotas. La actividad aminopeptidasa se ha localizado
extracelularmente (Kenny et al., 1987), dentro de las vacuolas, en el citoplasma
y dentro de los cloroplastos (Liu y Jagendorf 1986). LAP es un hexámero con
un peso molecular de 327 kD Esta enzima se compone de 6 subunidades
idénticas de 54 kD y cada subunidad se une a dos iones de Zn2+ (Carpenter y
Harrington 1972).
Se encontró que los ARNm que codifican la LAP exoproteásica son inducibles
en respuesta de defensa de la planta (Pautot et al., 1993). Un incremento en
las actividades aminopeptidasas se ha correlacionado con la degradación de
proteínas de almacenamiento (Kermode et al., 1985) y senescencia de hojas
en algunas plantas (Carrasco y Carbonell 1990). En ambos contextos, se cree
que las aminopeptidasas actúan en conjunto con las endoproteasas para
ayudar en la movilización de proteínas, después de la germinación de semillas,
las proteínas se movilizan y utilizan como fuente C y N para el desarrollo de la
plántula. Es probable que las LAP puedan tener un papel activo en la
75
regulación de la degradación de la proteína ubiquitina-dependiente durante la
respuesta del estrés de la planta, ya que el residuo N-terminal de un polipéptido
influye fuertemente en su vida media e hidrolizan los residuos N-terminales de
las proteínas a diferentes velocidades, dependiendo de la especificidad del
sustrato (Varshavsky 1992). Estas proteínas pueden estar implicadas en la
rápida rotación de las proteínas comprometidas a la muerte celular: LAP puede
acelerar la rotación de proteínas en las células que responden a la señales de
heridas para suministrar un número adecuado de aminoácidos para la
traducción de las proteínas abundantes relacionadas con defensa. La inducción
de LAP después de la infección y heridas puede inactivar proteínas esenciales
para el crecimiento de patógenos o de insectos (Walling y Gu 1996).
La proteína (N° # 4, Fig 11; Tabla 3) que fue sobre-acumulada en CCC 534
presentó una alta homología con Alérgeno Bet v I, se ha demostrado que
poseen actividad ribonucleasa, alergenos de plantas que se expresan en altos
niveles en las frutas, hortalizas y semillas y como proteínas que pertenece a la
familia PR-10 (proteínas de plantas relacionadas con patogénesis) cuya
expresión es inducida por la infección por patógenos, heridas o estrés abiótico.
A la familia Bet v I allergen, pertenecen un número de proteínas
estructuralmente relacionadas y parecen estar implicadas en la respuesta de
defensa a patógenos (Breiteneder et al.1989), es posible que las proteínas PR
puedan poseer la actividad ribonucleasa y degradar los ARN celulares y por lo
tanto contribuir a la muerte celular hipersensible, y bloquear la propagación del
patógeno a otra partes de la planta infectada (Swoboda et al, 1996). La función
biológica de esta proteína está relacioanada con la unión de lípidos, como el
tráfico de membranas a componentes (Radauer et al. 2008), la expresión de
estas proteínas en las plantas puede ser inducida por el estrés, aunque los
niveles elevados de estas proteínas se encuentran también en tejidos
reproductivos como el polen, frutos o semillas.
Esta proteína con actividad de RNAsa puede ayudar a las plantas durante la
muerte celular programada en torno a los sitios de infección o de actuar
directamente sobre los patógenos (Liu y Ekramoddoullah 2006). Son proteínas
que no son resistentes al calor o la digestión, se produce de acuerdo al grado
76
de madurez de las plantas y puede causar síntomas por la inhalación y la
ingestión.
En semillas de CCC 534 también se detectó sobre-acumulada una proteína de
defensa (N° # 32, Fig. 11; Tabla 3), proteína de resistencia a enfermedades
LRR/ transmembrana del receptor de quinasa PS4, esta proteína es un
miembro de resistencia a enfermedades clase 5. Esta clase contiene no-TIRNBS-LRR caracterizada por un LRR extracelular, una región que abarca la
membrana, y un dominio quinasa serina citoplasmática. Ejemplos de esta clase
incluye el gen Xa-21 a partir de arroz, que confiere resistencia a Xanthomonas
oryzae pv. oryzae. (Hammond-Kosack y Jones 1997). Este receptor quinasa
está implicado en el reconocimiento de la señal a la respuesta inmune innato
en la planta, implica una serie de eventos de fosforilación asociados con una
cascada de MAP-quinasa (Asai et al, 2002).
Y la última proteína diferencial en semillas de CCC534, que se encuentra
relacionada con proteínas de defensa es el inhibidor de alfa amilasa. Los
inhibidores de alfa amilasas privan a los insectos de nutrientes necesarios para
su crecimiento y desarrollo. Estos interfieren con las enzimas digestivas de los
insectos, y por lo tanto hacen la digestión menos eficiente (Gatehouse y
Gatehouse 1998; Richardson 1991).
Se ha demostrado que los inhibidores de las α-amilasas provenientes de dos
especies de leguminosas Phaseolus vulgaris y P. Coccineus, son proteínas que
bloquean la actividad de las amilasas digestivas de Hypothenemus hampei
(Valencia et al.2000), siendo los genes de estas proteínas candidatos
promisorisos para conferir resistencia a esta plaga.
Las α-amilasas son enzimas hidrolíticas ampliamente distribuidas en la
naturaleza, encontradas en animales, plantas y microorganismos. Pertenecen a
la familia 13 de las glicanohidrolasas (Koukiekolo et al., 1999) y están
encargadas de la degradación de polisacáridos unidos por enlaces α-1,4, como
lo son el almidón y el glucógeno. También tienen utilización biotecnológica para
la degradación de almidón, y en química sintética para la producción de
oligosacáridos por transglicosilación (Franco et al., 2002). Las α-amilasas se
77
encuentran en semillas de leguminosas y gramíneas (Richardson 1991) y se
han purificado de semillas de trigo, fríjol, maíz y Amaranthus sp., en busca de
sus propiedades insecticidas contra coleópteros (Valencia et al. 2000).
Las α -amilasas constituyen una familia de endo-amilasas, que catalizan la
hidrólisis de almidón, componente importante de diversas semillas que son
alimento de varios insectos. El grano de café, fuente de alimento para larvas y
adultos de la broca del café, H. hampei, contiene 10% de almidón en su
composición bioquímica total (Siveltz 1977).
Estos inhibidores son glicoproteínas de bajo peso molecular que se acumulan
en vacuolas especializadas en la fase media de desarrollo de la semilla. Al ser
proteínas de semillas, son excelentes candidatos para ser expresadas
heterólogamente en tejidos homólogos como la semilla del café, donde ocurre
el desarrollo biológico de la broca. Esto es particularmente importante porque
inhibidores de α-amilasas, como el αAI de fríjol, para poder ser activo, es
necesario que en la semilla ocurran cambios postraduccionales como la
glicosilación y proteólisis, y crear así un sitio de unión a la enzima blanco.
Chrispeels (1997) registra que cuando los genes de proteínas de semilla son
expresados en plantas heterólogas, los productos de la trangénesis son
correctamente procesados y transportados hasta las vacuolas especializadas
para lo formación de un inhibidor de amilasas activo.
Algunos inhibidores de α-amilasas inhiben la actividad tanto en insectos como
en mamíferos, otros inhiben solamente las α-amilasas de insectos como los
aislados de trigo, maíz y Amaranthus spp., entre otros (Franco et al. 2002;
Gatehouse et al. 1999). También hay especificidad en el género del insecto, ya
que la formación del complejo inhibidor más amilasa tiene un pH óptimo de 5.5
y por esta razón inhibe amilasas en el medio ácido del intestino de insectos del
orden Coleoptera pero no en el alcalino del orden Lepidoptera (Chrispeels
1997).
Valencia et al. (2000) encontraron mediante ensayos espectrofotométricos y
zimogramas de inhibición, que inhibidores de α-amilasas de frijol (P. vulgaris y
78
Phaseolus coccineus L.) bloquean la actividad de las α-amilasas de la broca del
café.
6.3
Proteínas involucradas en transferasas
La proteína homocisteina S- metiltransferasa 1 (N° # 5, Fig 11; Tabla 3)
pertenece a las metiltransferasas, es un aminoácido que contiene azufre
formado durante el metabolismo de la metionina, cataliza la transferencia de
metilo de la S-metilmetionina (SMM) para adenosil-L-homocisteína (AdoMet).
La degradación SMM (por HMT-1, HMT-2, HMT-3 y 4-HMT) y biosíntesis (por
MMT1) constituyen el ciclo de SMM en las plantas, que probablemente se
requiera para lograr el control a corto plazo del nivel de AdoMet
S-Metilmetionina (SMM) es un compuesto único en las plantas que se ha
encontrado en muchas angiospermas (Paquet et al. 1995). Es sintetizado por
transferencia de la S-adenosilmetionina (Adomet) a la metionina (Met),
produciendo (SMM) y S-adenosylhomo-cisteina (AdoHcy).
Esta reacción es catalizada por la S-adenosilmetionina: Met S-metiltransferasa
(MMT) y es esencialmente irreversible (James et al.1995). SMM se puede
reconvertir a Met mediante la transferencia de un grupo metilo a la
homocisteina (Hcy). La Homocisteina (Hcy) se deriva de la metionina (Met) y
puede ser metilado a la reforma Met o participar en la biosíntesis de cisterna a
través de la vía de transulfuración
La proteína sobre-acumulada en CCC 534 (N° #15, Fig 11; Tabla 3) presenta
una alta homología con la proteína unida a gránulo de almidón sintasa 1,
cloroplástico (GBSS), es una proteína específica de semilla, se requiere para la
síntesis de amilosa en el endospermo, pertenece a las glicosiltransferasas que
son enzimas que catalizan la transferencia de residuos de azúcar a partir de un
sustrato donante activados a un aceptor de molécula. Es responsable de la
formación de las cadenas muy largas en amilopectinas, que son los principales
tipo α-glucanos en almidón. El almidón tiene dos tipos de polímeros de glucano:
amilosa, que tiene glucano α-1 ,4-ligado predominantemente lineal, y
79
amilopectina, cuyas cadenas vinculadas de α-1 ,4- se ramifica extensamente
con 1,6 –vínculos (Hanashiro et al. 2008).
La Proteína sobre-expresada UTP- glucosa-1- fosfato uridililtransferasa, es la
fórmula universal activa de la glucosa, cataliza la formación reversible de UTP
glucosa y pirofosfato de glucosa-1-fosfato y UTP en un Mg2+ dependiendo de la
reacción (Turnquist y Hansen 1974). En eucariotas, el producto de la enzima
UDP-glucosa sirve como el compuesto donador de glucosilo en la síntesis de
polisacáridos de almacenamiento y como glucógeno en los animales, de
polisácaridos estructurales como la celulosa en las plantas, es la forma
principal de transporte de los carbohidratos en plantas. Desempeña un papel
central como donante glucosilo en las vías metabólicas celulares. Esta
relacionada con respuesta al estrés salino
En semillas de CCC 534 se encontró diferencialmente la proteína (N° # 22, Fig
11;
Tabla
3),
que
presenta
una
alta
homología
con
–5-
methyltetrahydropteroyltriglutamate- homocisteina metiltransferasa (MHMT) es
una enzima que cataliza la reacción química. Los dos subtratos de esta enzima
son -methyltetrahydropteroyltri-L-glutámico y ácido L-homocisteína, mientras
que sus dos productos son tetrahydropteroyltri-L-glutámico y ácido L-metionina.
Esta enzima pertenece a la familia de las transferasas, específicamente
aquellos transfiriendo de un carbono del grupo metiltransferasa. Esta proteína
participa en el metabolismo de la metionina. Dispone de 2 cofactores:
ortofosfato y zinc. Está involucrada en la síntesis de metionina, la cual
desempeña un rol importante en el estrés salino (Bedford & Richard 2005). La
sobre regulación de MHMT se espera que mejore la biosíntesis de metionina y
la subregulación de RMT3, puede reducir el consumo de adomet en la
mutilación de arginina de proteínas. Los cambios de estas dos enzimas pueden
causar la acumulación de metionina y de Adomet en el hongo, que podría
satisfacer la creciente demanda en los procesos relacionados con estrés por
tolerancia, tales como la síntesis de hormonas y modificaciones de la pared
celular.
80
Aspartato aminotransferasa citoplasmática (AAT), es una proteína que está
sobre acumulada en CCC534, la cual es importante para el metabolismo de los
aminoácidos y el ciclo de Krebs-relacionados con ácidos orgánicos. En las
plantas, está involucrada en el metabolismo del nitrógeno y en los aspectos de
carbono y el metabolismo energético. Es una enzima de piridoxal-5’ fosfato
dependiente que es de importancia critica para la función celular en
procarioticas y eucarioticas. Además cataliza la transaminación reversible del
grupo amino de glutamato en la posición 2 de oxalacetato, produciendo
aspartato y c –cetoglutarato (Givan 1980). Esta reacción es un paso esencial
en la biosínteis y la degradación de aspartato en todas las especies (Cooper y
Meister 1985).
La enzima AAT tiene funciones únicas en las células vegetales. Por ejemplo,
en algunas plantas C4, AAT es parte de una ruta bioquímica que permite a
estas especies separar espacialmente la incorporación inicial de CO2 en
compuestos orgánicos de la actividad de ribulosa bifosfato carboxilasa
(Rubisco), reduciendo de este modo el proceso aparentemente inútil de la
fotorrespiración (Hatch y Mau 1973). Otra función de las AAT en las plantas es
la asimilación de amonio derivado de los nitratos del suelo, la fotorrespiración,
o fijación simbiótica de nitrógeno en los nódulos de las raíces de leguminosas.
AAT está involucrado tanto en el metabolismo del nitrógeno, en los aspectos
del carbono y el metabolismo energético. En las plantas, AAT es funcional
como un homodímero. Las plantas contienen varios isoenzimas de AAT; al
menos uno se encuentra en el citoplasma y otros se han encontrado en las
mitocondrias, los cloroplastos, peroxisomas y glioxisomas (Givan 1980).
6.4
Proteínas involucradas en la unión de ATP
La proteína diferencial presente en CCC534 (N° # 1, Fig.11; Tabla 3), fue
identificada como una Actina 11. Se ha descrito que esta proteína globular
forma los microfilamentos, uno de los tres componentes fundamentales del
citoesqueleto de las células eucariotas, se expresa en todas las celulas del
cuerpo y especialmente en las musculares ya que está implicada en la
81
contracción muscular, cuando interactuá con la miosina. Puede encontrarse en
forma libre, denominada actina G, o se polimeriza en microfilamentos o actina
F, que son esenciales para funciones celulares como la movilidad
y la
contracción de la célula durante la división celular (Hermman 1993). La actina
no muscular se encuentra prácticamente en todas las células eucariotas y es
importante para dar forma a la celula, asi como intervenir en la movilidad y
transporte intracelular (Kabsch y Vandekerckhove 1991). Estas funciones son
de vital importancia para el desarrollo de la planta, porque la restricción de las
paredes celulares rígidas dicta que la morfogénesis en las plantas se produce
en gran medida a través de la división celular asimétrica y expansión (Rusell
1993).
Se encuentra agrupada dentro de las familias de las kinasas, donde su
participación a nivel molecular, se da en procesos de apoptosis, de
transcripción, traducción y síntesis de ácidos nucleicos, en la dinámica del
citoesqueleto y en la respuesta inmune (Yang et al. 2003).
En las plantas, la actina desempeña un papel esencial en muchos procesos,
incluyendo streaming, posicionamiento frente al citoplasma de orgánulos,
extensión de punta de crecimiento y el crecimiento del tubulo de polen (Staiger
et al. 1994).
6.5
Proteínas de choque térmico
En semillas de CCC 534 se identificaron dos proteínas de choque térmico, una
diferencial (N° # 3, Fig 11; Tabla 3) proteína relacionada con cloroplastos de
membrana de choque térmico 70 kDa y otra sobre-acumulada proteína de
choque térmico 70 kDa (N° # 31, Fig 11; Tabla 3), que corresponde a las
proteínas de choque térmico 70
Las Hsp se unen a los grupos hidrófobicos de polipéptidos nacientes. Tiene
una molécula de ATP adjunto, en el que por su forma tiene una alta afinidad
por la cadena desplegada. La proteína Hsp70 responde a varios factores de
estrés oxidativo abarcados por la fruta. HSP70s son una importante clase de
82
chaperonas implicadas en el plegamiento de proteínas y orgánulos de
transporte. Desempeñan un papel importante en las respuestas al estrés
biótico y abiótico, al cadmio, el frío, el calor, y los virus. Estas proteínas se
localizan en el núcleo, nucleolo, apoplasto, cloroplasto, la pared celular y la
membrana plasmática cuando las plantas se someten estrés y han sido
implicados en la pre-montaje ribosoma (Boston et al. 1996), puede desempeñar
un papel en el transporte de polipéptidos a través de la membrana envolvente y
en el cloroplasto.
Las Hsp tienen dos funciones principales: a) bajo condiciones fisiológicas,
funcionan como chaperonas moleculares y median en el plegado y ensamble
de otras proteínas intracelulares, ayudan a la prevención de asociaciones
inapropiadas de las proteínas, evitan el plegado prematuro, auxilian en el
transporte y en la localización intracelular, realizan mantenimiento de las
proteínas que se encuentran en forma inactiva y sirven también para la
degradación, secreción y regulación de proteínas (Feder y Hofmann 1999); b)
bajo condiciones de estrés, son sintetizadas en respuesta a una gran variedad
de agresines celulares como el etanol, hipoxia, metales pesados, cambios en el
pH, infección e inflamación desacoplamiento de la fosforilación oxidativa,
inhibición del transporte de electrones, transtornos hemodinámicas, hormonas
esteroides y errores en la síntesis de proteínas, entre otros (Lindquist 1992;
Freeman et al. 1999). Algunos tipos de Hsp son mantenidos en altos niveles en
células no estresadas y son requeridas para los procesos celulares de
biosíntesis, procesado y transporte de proteínas a las vías de transducción
(Pratt 1998).
La familia de las Hsp 70 está involucrada en una gran cantidad de funciones,
sus miembros específicos están localizados en el citosol, la mitocondria y el
retículo endoplasmático, se ha encontrado que esta familia participa en la
traducción y translocación de proteínas, proteólisis y plegado de proteínas,
además suprime la agregación y reactivan a las proteínas desnaturalizadas.
Otras funciones adicionales son la reactivación del ARNm después del estrés
proteotóxico y la interacción con inmunosupresores (Morimoto et al. 1994).
83
En plantas las Hsp70 se expresen en respuesta a las condiciones ambientales
de estrés tales como el calor, frío y sequia, así como factores químicos y otros
factores de estrés. La sobreacumulación de genes Hsp70 se correlaciona
positivamente con la adquisición de termotolerancia y resulta en una mayor
tolerancia a la sal, agua y altas temperaturas (Alvim 2001).
6.6
Proteínas involucradas en la unión ARN
La proteína #11 y # 17 que estuvo sobre-acumulada en CCC 534, ambas
presentaron una alta homología con Maturase K (matK). Por lo general, codifica
en el gen tRNA trnK intrón. Es probable que permite el empalme de sus propios
cloroplastos y otros intrones del grupo II. Los intrones del grupo II son comunes
en los organelos celulares de las plantas. La mayoría de las plantas del grupo II
se autoemplaman, pero requieren de la ayuda de factores de empalme
proteínicos, conocidos como maturases. En plantas superiores, las maturases
están codificadas en los genes nucleares, pero de lo contrario se codifica por
intrones organoides (Vogel y Hess 1999).
Su función principal es que son necerias para el empalme eficiente de múltiples
intrones del grupo II.
6.7
Proteína de Unión de ARNr
La proteína diferencial identificada en CCC 534 (N° # 26 Fig 11; Tabla 3)
pertenece a la proteína 30S ribosomal proteínas S4, cloroplástico, es una de
las principales proteínas de unión a rRNA, se une directamente a 16S rRNA
donde se nuclea montaje del cuerpo de la subunidad 30S Con S5 y S12
desempeña un papel importante en la precisión de la traslación: Las proteínas
S4 son un componente esencial de los ribosomas. La subunidad ribósomica 30
S es responsable de la iniciación de la traducción y por lo tanto sería un sitio
apropiado para la intervención reguladora.
84
6.8
Proteínas con actividad lipoxigenasa
La proteína (N° #7) sobre acumulada en CCC 534 (Fig 11. Tabla 3) pertenece a
Semilla linoleato 9S-lipoxigenasa, las lipoxigenasas
en plantas
están
involucrados en diversos aspectos de la fisiología de la planta incluyendo
crecimiento y desarrollo, la resistencia a plagas y la senecencia o respuesta a
heridas. La función en la defensa contra plagas parece estar involucrada en la
síntesis de diferentes compuestos de señalización, actividad antimicrobial o el
desarrollo de respuesta hipersensible (Porta y Rocha 2002). Las lipoxigenasas
se han asociado con algunos procesos en varias etapas de desarrollo de la
planta y con la movilización de lípidos durante la germinación (Feussner et al.,
2001). También tiene una función como proteína de almacenamiento durante el
crecimiento vegetativo, normalmente se presenta en las semillas de las plantas
(Siedow 1991).
Lipoxigenasa es una enzima que forma hidroperóxidos mediante la introducción
de oxigeno molecular sobre ácidos grasos que contienen una estructura cis,
cis-1,4
penatadieno
para
formar
hidroperóxidos
(Siedow
1991).
Los
hidroperóxidos producidos se convierten en compuestos diferentes asociados
con los procesos fisiológicos como el crecimiento, la maduración de los frutos y
las respuestas a factores bióticos y abióticos (Brash 1999).
Los tejidos de las plantas cuando son
dañadas mecánicamente o por
patógenos, se someten a la degradación de los lípidos, que son los
hidroperóxidos de productos iniciales que resultan de la acción de la
lipoxigenasa (Silva et al.2001). Los Hidroperóxidos producen aldehídos, que
inhiben el crecimiento de hongos, protozoos y los insectos en la planta (Croft et
al. 1993) que participan en el proceso de señalización y la división celular en
respuesta a lesiones en las plantas (Zimmennam y Croudon 1979).
6.9
Proteínas de transporte de electrones
La proteína sobreexpresada identificada en CCC 534 (N° # 9 Fig. 11; Tabla 3)
presenta una alta homología con proteína L del centro de reacción del
85
fotosistema II, está relacionado con la fotosintesis, junto con el retículo
endoplásmico y la membrana interna de las mitocondrias, es una de las
membranas principales de la exportación de proteínas de la célula fotosintética
(Eichacker y Henry 2001). Su biogénesis depende de una expresión génica
estrictamente coordinada tanto en el cloroplasto y el citosol y en la impotancia
nuclear de subunidades codificadas en el cloroplasto. La coordinación de la
expresión génica está garantizada por un número diferente de factores de
biogénesis, que intervienen en diferentes pasos de la expresión génica de la
cascada, creando así un marco regulatorio complejo (Barkan y GoldschmidtClermont 2000). El fotosistema II está incrustado en la bicapa lipídica de los
tilacoides de membrana.
6.10
Proteínas de almacenamiento
Una proteína de almacenamiento fue única en CCC 534 (N° #13 Fig. 11; Tabla
3) presentó alta homología con globulina 13S, siendo esta una proteína que se
ha detectado en el endospermo de plantas mono y dicotiledóneas como una
proteína de reserva importante (Nair y Adachi 2002). Son sintetizados y
ensamblados durante un proceso complejo que implica una serie de
modificaciones post-traduccionales ya que las proteínas son transportadas y
depositadas dentro de las vacuolas de almacenamiento de proteínas (Shotwell
y Larkins 1989). Las proteínas de almacenamiento son relativamente ricas en
residuos de aminoácidos en glutamina, glicina, leucina y ácido glutámico,
respectivamente, con 11%, 10%, 9% y 7.5% del peso molecular total. Su
contenido es relativamente bajo en la cisteína amino ácidos de azufre (1%) y
metionina (0,6%), lo que sugiere un papel limitado de estos amino ácidos como
precursores de aromas y sabores del café. Este tipo de proteínas de las
semillas están asociados con los mecanismos de defensa que las plantas han
desarrollado contra la acción de las plagas y agentes patógenos (Pereira et al.
2000).
86
6.11
Proteína involucrada con la Unión de iones de Magnesio
La sobre-acumulación en CCC 534 de la proteína # 20 (Fig. 11; Tabla 3) que
pertenece a la Enolasa, es una enzima glicolítica esencial que cataliza la
conversión de 2-fosfoglicerato a fosfoenolpiruvato, esta enzima está presente
en todos los tejidos y organismos capaces de glicólisis o fermentación (Van Der
Straeten et al. 1991), está relacionada con estrés salino (Yan et al. 2005), el
único paso de deshidratación en la vía glicolítica.
En la mayoría de las plantas superiores, enolasa, como otras enzimas
glicolíticas, están presentes como múltiples isoformas localizadas en el citosol y
en los plástidos (Gottilieb 1982). Desempeña papeles especializados durante el
desarrollo de la planta, en los tejidos no fotosintéticos, y en condiciones de
anaerobiosis.
6.12
Proteínas involucradas en la Unión de GTP
En semillas
de CCC534 se encontraron dos
proteínas
que fueron
diferencialmente involucradas en la unión de GTP: la proteína factor de
elongación Tu y la proteína de unión de GTP SAR 1.
La proteína diferencial identificada en semillas de CCC534 (N° # 24 Fig.11;
Tabla 3) presentó alta homología con factor de elongación Tu, es esencial para
la traducción del mRNA en proteínas. Es una proteína (45-46kD) que
desempeña un papel importante en la fase de elongación de la síntesis de
proteínas en bacterias y organelos incluyendo mitocondria y plastidos en
plantas. La expresión de
EF-tu ha sido estudiado en varias especies de
plantas en repuesta a estrés abiótico que incluyen temperaturas altas y bajas,
salinidad, déficit de agua y contaminantes, se asocia con los ribosomas
cíclicamente durante la fase de elongación de la síntesis de proteínas, y
cataliza la formación del enlace acilo entre el entrante residuo de aminoácido y
la cadena peptídico (Felix y Boller 2003).
87
La elongación es el proceso mediante el cual se forma la cadena polipeptídica
que compondrá la proteína traducida a partir del RNA mensajero. Se
distinguen tres etapas: Unión del tRNA cargado, formación del enlace
peptídico, y traslocación. EF1 es responsable de la unión de GTP-dependiente
de las aminoacil-ARNt a los ribosomas. EF1 se compone de cuatro
subunidades: la cadena alfa que se une a GTP y aminoacil ARNt-, la cadena
gamma que probablemente desempeña un papel en el anclaje del complejo a
otros componentes celulares y las cadenas beta y delta (o beta '). Esta
subfamilia es la subunidad alfa, y representa la contrapartida de EF-Tu
bacteriano para las arqueas (aEF1-alfa) y eucariotas (eEF1-alfa). eEF1-alfa
interactúa con la actina del citoesqueleto eucariota y por lo tanto puede jugar
un papel en la transformación celular y la apoptosis (Riis et al. 1990).
La proteína # 34 (Fig 11; Tabla 4) presentó una alta homología con la proteína
de unión a GTP SAR 1, la cual esta implicada en el transporte desde el retículo
endoplásmico al aparato de Golgi, se asocia con una amplia gama de procesos
de crecimiento y desarrollo además de su papel en la defensa de las plantas
(Suharsono et al. 2002). Son interruptores importantes entre un ciclo activo y
un estado inactivo, asegurando un flujo vectorial de la información sobre el
gasto de trifosfato de guanosina (GTP). Se encuentra en el citosol y unido a la
membrana del reticulo endoplasmatico. Estas proteínas actúan como
interruptores moleculares en las vias de transducción de señales, la proteína
interactúa con los objetivos celulares promocionando una respuesta. SAR 1 es
esencial para la formación de vesículas de transporte de la membrana del
reticulo endoplasmatico (Oka et al, 1991).
88
7. CONCLUSIONES
De los resultados obtenidos en el presente trabajo se puede concluir:
• Se logró adecuar la técnica de extracción de proteínas de semillas de
café al obtener un conjunto proteico con baja concentración de sales y
libre de compuestos que interfieren en el adecuado isoelectroenfoque de
las mismas.
• La extracción de proteínas de la semilla del café, con el propósito de
utilizarlas
en
separaciones
iso-electroforéticas,
requiere
de
.un
procedimiento para eliminar ceras cuticulares y lípidos de la semilla.
• Se obtuvieron mapas proteicos de semillas de café, con un alto grado
de calidad y resolución, que permitieron hacer un análisis comparativo
confiable debido a la reproducibilidad del protocolo establecido.
• El 94 % de las 35 proteínas identificadas fueron homólogas a proteínas
de plantas, lo que permite tener un elevado nivel de confianza acerca de
la identidad y la función putativa de las proteínas evaluadas.
• Se logró la combinación de la electroforesis bidimensional y el análisis
por espectrometría en masas para identificar cambios en la abundacia
de las proteínas de la semilla de dos introducciones de café que inducen
cambios en el comportamiento oviposicional de la broca.
• El 23 % de las proteínas identificadas en la introducción CCC534 están
relacionadas con procesos de maduración, germinación, y desecación
de la semilla.
• Se
identificaron
las
proteínas
13S
Globulina,
inhibitor
de
amilasa/endoquitinasa, linoleato 9S-lipoxigenasa y alérgeno Bet v I, las
cuales están relacionadas con factores antinutricionales de la semilla.
89
8. PERSPECTIVAS
Se sugiere
evaluar las 4 proteínas “antinutricionales” en bioensayos de
laboratorio con el fin de confirmar su función y utilizarlas en el desarrollo de
marcadores para hacer selección asistida en el desarrollo de variedades con
resistencia a esta plaga.
90
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114
ANEXOS
ANEXO 1:
Extracción de proteínas de las semillas de variedades de Coffea
arabica
Preparación de las muestras de interés y extracción de las proteínas:
1. Material a estudiar: semillas de café.
2. Se recolectan frutos maduros de de cada una de las introducciones, se
benefician y se secan hasta que tengan una humedad aproximada del
14%.
3. Las semillas se sumergen en hexano durante cinco minutos con el fin de
retirarles las ceras que los cubren.
4. Se retiran del hexano y se dejan secar al ambiente.
5. Una vez secos, se depositan en nitrógeno líquido para evitar la
degradación y se llevan al molino criogenico para obtener un polvo fino.
6. Se recoge este polvo en tubos de microcentrifuga de 2ml limpios
(sumergidos previamente en nitrógeno líquido), se llena el tubo hasta la
mitad y se resuspende cada muestra en 1ml de Buffer PBS.
Preparación de la Solución amortiguadora PBS 1X pH 7.3
NaCl
2,5g
KCl
0,0625g
Na2HPO4
0,36g
KH2PO4
0,0625g
Agregar a 250 ml de agua destilada
115
7. Se maceran con pistilo cada una de las muestras
8. Se sonican en frío durante 10 minutos.
Nota: En todos estos pasos mantener la muestra en frío (hielo) para evitar
la degradación de las proteínas.
9. Centrifugar a 13200 r.p.m a 4°C por 10 minutos.
10. Recuperar el sobrenadante y depositarlo en un tubo de microcentrifuga
de 2ml limpio.
11. Depositar el tubo de nuevo en la centrífuga y centrifugar a 13200 r.p.m a
4°C durante 5 minutos, recuperar de nuevo el sobrenadante y
depositarlo con el resto.
12. Adicionarle al sobrenadante solución de precipitación hasta completar
2ml.
13. Dejar precipitando toda la noche a –20°C.
Preparación Solución de precipitación
Ácido Tricloroacético 10% 2,5g
DTT 0.07%
2,8 mg
Agregar a 25 ml de acetona fría. El DTT se adiciona justo antes de
utilizarlo y se debe tener refrigerado.
116
ANEXO 2
Limpieza de las proteínas de semillas de café:
La limpieza y purificación de las proteínas se hace con el kit ReadyPrep 2-D
Clean-up de Bio-Rad™ y acetona fría, con el fin de eliminar contaminantes
como lípidos, sales, ácido nucleíco, fenoles, entre otros, que pudieran interferir
durante el proceso de isoelectroenfoque de las muestras:
1.
Centrifugar a 13200 r.p.m a 4°C durante 10 minutos las muestras que
han quedado en precipitación a –20°C durante la noche, con el fin de
descartar el sobrenadante y recuperar el pellet que se ha formado.
2.
Adicionar 300µl del agente precipitante 1, mezclar por vórtex e incubar
durante 15 minutos en hielo (4ºC).
3.
Adicionar 300µl del agente precipitante 2 y mezclar por vórtex.
4.
Centrifugar a 13200 r.p.m. durante 5 minutos para formar pellet.
Remover y descartar inmediatamente el sobrenadante con la ayuda de
una pipeta para que no se disperse el pellet.
5.
Depositar el tubo de nuevo en la centrifuga y centrifugar a 13200 r.p.m.
durante 30 segundos para colectar el líquido residual. Con una pipeta
remover el sobrenadante remanente.
6.
Adicionar 40µl del agente de lavado 1 y centrifugar a 13200 r.p.m.
durante 5 minutos. Remover y descartar el sobrenadante con la ayuda
de una pipeta.
7.
Adicionar 25µl de agua ultrapura al pellet. Hacer vórtex durante 20
segundos. Las proteínas se dispersarán pero no se disolverán en el
agua.
117
8.
Adicionar 1ml del agente de lavado 2 (enfriado previamente a –20°C) y
simultáneamente adicionar 5µl del aditivo de lavado 2. Hacer vórtex
durante 1 minuto.
9.
Incubar el tubo por 30 minutos a -20ºC. Realizar vórtex de 30 segundos
cada 10 minutos durante el período de incubación.
10.
Después del periodo de incubación, centrifugar el tubo a 13200 r.p.m.
durante 5 minutos para formar pellet. Remover y descartar el
sobrenadante.
11.
Lavados con ACETONA
Una vez descartado el sobrenadante, adicionar 1ml de acetona fria,
hacer vórtex de 30 segundos y centrifugar el tubo a 13200 r.p.m. durante
10 minutos para formar pellet, removiendo y descartando el
sobrenadante. Repetir de nuevo este paso dos veces mas.
12.
Centrifugar nuevamente durante 30 segundos para descartar el líquido
residual.
13.
Secar el pellet durante unos minutos a temperatura ambiente.
14.
Resuspender el pellet en 120µl buffer de solubilización (Tabla 1). El
buffer de solubilización contiene úrea 7M; tioúrea 2M; dithiothreitol (DTT)
50mM; y el búfer de rehidratación contiene además CHAPS 4% (p/v) y
anfolitos (pH 3-10; 5-8 ó 4-7) 0.2% (v/v).
15.
Incubar a 4°C por lo menos unos dos días.
16.
Después del periodo de incubación, sonicar por 10 minutos y centrifugar
a 13200 r.p.m. durante 10 minutos a temperatura ambiente.
17.
Recuperar el sobrenadante en un tubo de microcentrífuga nuevo.
18.
Si no se utiliza inmediatamente almacenar a -70ºC.
Tabla 1. Preparación del Buffer de solubilización y de rehidratación.
Úrea 7M
500µl
1ml
2ml
0,21g
0,42g
0,84g
118
Tioúrea 2M
0,076g
0,152g
0,304g
CHAPS 4%
0,02g
0,04g
0,08g
DTT 50mM
0,004g
0,0076g
0,0154g
2,5µl
5µl
10µl
Anfolitos
0,2%
Completar el volumen indicado con agua ultrapura. El DTT y los anfolitos deben
agregarse inmediatamente antes del proceso de rehidratación de las tiras de
isoelectroenfoque.
119
ANEXO 3:
Curva de calibración
Espectrofotómetro
para
cuantificación
de
proteínas
en
Preparación de los estándares: Se adicionan los siguientes volúmenes a celdas
de espectrometría
Estándar BSA (Bovine Serum Albumin) stock 1.44µg/µl (Bio-Rad).
Volumen
estándar (BSA)
(ul)
Volumen
agua
destilada
(ul)
Volumen
Protein
Assay 1x
(ul)
Volumen
final (ul)
0µl (Blanco)
200
800
1000
0.5
199.5
800
1000
1
199
800
1000
2
198
800
1000
3
197
800
1000
4
196
800
1000
5
195
800
1000
6
194
800
1000
10
190
800
1000
12
188
800
1000
16
184
800
1000
20
180
800
1000
Protein Assay Dye Reagent de Bio-Rad que se diluye previamente en agua en
una relación 1:4
Los estándares se pueden almacenar a –20°C.
Determinación de la cantidad de proteína en una muestra:
120
-
Adicionar a la celda 195 µl de agua destilada
-
Adicionar 5ul de muestra.
-
Adicionar a la celda 800 ul de Protein Assay
Dye Reagent 1x de Bio-
Rad (que se ha diluido previamente en agua a una relación de1:4).
Preparación de los blancos. Se preparan dos blancos
-
Adicionar 200 ul de agua destlada.
-
Adicionar a la celda 800 ul de Protein Assay Dye Reagent 1x de Bio-Rad
La lectura se lleva a cabo en el espectrofotómetro Thermo Scientific NanoDrop
2000; se hace la curva utilizando agua destilada como blanco y Protein Assay
Dye Reagent 1x que se utiliza para preparar los estándares, como referencia,
luego se leen los estándares (máximo siete), y ya con la curva lista se leen las
muestras.
Antes de realizar las lecturas se deben homogenizar bien las
muestras y dejar reposar durante 5 minutos.
121
ANEXO 4
Rehidratación de las tiras de isoelectroenfoque con las proteínas
solubilizadas:
1.
Al volumen que contiene la cantidad de proteína que se quiere enfocar
añadirle el volumen requerido con buffer de rehidratación (Tabla 1)
mezclando bien con pipeta, como se indica en la tabla 3 y adicionar también
azul de bromofenol.
Tabla 1. Rango recomendado de proteína a cargar en las tiras IPG.
Longitud de la tira IPG
7 cm
17 cm
24 cm
Volumen de rehidratación por
tira
125ul
300ul
450ul
Cantidad de proteína
tinción con plata
para
5-20ug
50-80ug
80-150ug
Cantidad de proteína
tinción con Sypro Ruby
para
5-20ug
50-80ug
80-150ug
Cantidad de proteína para
tinción con Azul de Coomasie
G-250
50-100
ug
200400ug
400-800ug
Tiras de Bio-Rad y Amershan.
NOTA: La máxima cantidad de proteínas con que puede cargarse cada tira IPG
es 500 ug para 7cm, 3 mg para 17cm y 4mg para 24cm.
2.
Adicionar los volúmenes requeridos (según la longitud de las tiras) de cada
tratamiento a pozos diferentes en una bandeja de rehidratación. Cada
muestra se debe pipetear a lo largo del pozo para que quede
uniformemente distribuida.
122
3.
Colocar las tiras de la longitud indicada sobre las muestras previamente
esparcidas en cada uno de los pozos. El gel de acrilamida que queda
expuesto una vez se retira el acetato protector de la tira debe quedar en
contacto con la muestra (o sea boca abajo). Verificar que no queden
burbujas entre la muestra y la tira, ya que si esto ocurre puede afectar la
adecuada rehidratación de la tira. Tapar la bandeja de rehidratación.
4.
Dejar
que
las
muestras
rehidraten
las
tiras
durante
una
hora
aproximadamente.
5.
Agregar aceite mineral a cada pozo que contenga tiras para evitar la
evaporación de las muestras durante el resto del proceso de rehidratación.
6.
Cubrir la bandeja de rehidratación con papel aluminio y dejar 12 horas.
123
ANEXO 5
Enfoque Isoeléctrico (IEF) de las proteínas (Primera dimensión):
1.
Al cumplirse al menos 12 horas del proceso de rehidratación retirar la
bandeja de rehidratación.
2.
Colocar un electrode wick (papel filtro) humedecido previamente con
10µl de agua ultrapura sobre el cátodo y el ánodo de cada pozo que
vaya a contener una tira en la bandeja de isoelectroenfoque. Estos
papeles
filtro
permiten
la
remoción
de
sales
durante
el
isoelectroenfoque. Estas sales pueden causar que el voltaje y la
corriente introducidos en el programa de enfoque no se alcancen o lo
hagan pero muy lentamente.
3.
Colocar las tiras sobre papel filtro del lado del acetato protector de tal
manera que drene el aceite mineral que se usó durante la rehidratación.
4.
Colocar las tiras dentro de los pozos que contengan los electrode wicks.
El gel de acrilamida debe quedar en contacto con los wicks y con los
electrodos. Verificar la correcta polaridad durante la transferencia. El
lado de la tira con el signo + debe quedar en contacto con el ánodo (+)
de la bandeja de isoelectroenfoque.
5.
Cubrir cada una de las tiras con aceite mineral para evitar la
deshidratación de las tiras. Retirar las burbujas que queden entre la tira
y el fondo de cada pozo ya que si esto ocurre se puede afectar el
adecuado enfoque de la tira.
6.
Colocar la tapa de la bandeja de rehidratación y cerrar la tapa de la
Protean IEF Cell.
7.
Correr el programa de isoelectroenfoque correspondiente a la longitud
de las tiras utilizadas:
124
Programas de isoelectroenfoque utilizados:
Para tiras IPG de Bio-Rad de 7cm:
Rehidratacion: Pasiva
Temperatura de enfoque: 20°C
“TIRAS 7CM”
Voltaje
Paso 1
Paso 2
250
4000
Curva acumulacion
voltaje
Rapido
Rapido
Tiempo
1hora
20000V acumulados
Para tiras IPG de Bio-Rad de 17cm:
Rehidratacion: Pasiva
Temperatura de enfoque: 20°C
“CORNELL 2
STEP”
Paso 1
Paso 2
500
10000
Curva acumulacion
voltaje
Lineal
Rapido
Paso 3
500
Rapido
Voltaje
Para tiras IPG de Amersham de 24cm:
Rehidratacion: Pasiva
Temperatura de enfoque: 20°C
“TIRAS
24CM”
Curva acumulacion
Voltaje
voltaje
Paso 1
500
Lineal
Paso 2
500
Lineal
Paso 3
1000
Lineal
Paso 4
8000
Lineal
Paso 5
8000
Lineal
Tiempo
30 minutos
70000V
acumulados
Indefinido
Tiempo
1 hora
1 hora
1 hora
3 horas
65500V
acumulados
Se recomienda cambiar los electrode wicks unas dos veces más después de
iniciar el isoelectroenfoque para incrementar la eficiencia de este.
125
Sí durante el isoelectroenfoque se observa que las proteínas no están
enfocando correctamente, se puede pausar el programa y reacomodar las tiras
para eliminar burbujas o para corregir un mal contacto entre alguna tira y sus
respectivos electrodos; igualmente cuando el amperaje esté muy bajo se debe
cambiar los electrode wicks.
8.
Una vez finalizado el isoelectroenfoque se puede proceder a equilibrar
las tiras o se pueden almacenar en una bandeja de rehidratación bien
sellada a –20°C durante una semana protegidas de la luz. Si se
almacenan, se debe recubrir cada tira con aceite mineral.
126
ANEXO 6
Equilibración de los geles IPG enfocados
1. Remover las tiras enfocadas de la Protean IEF Cell o sí las tiras habían sido
congeladas, dejarlas alcanzar la temperatura ambiente. En ambos casos
retirar el aceite mineral colocando las tiras del lado del acetato sobre papel
filtro.
2. Incubar cada tira, en la cantidad correspondiente de solución de equilibrio 1
conteniendo DTT (Tabla 2) durante 15 minutos con agitación suave en
oscuridad. Luego retirar las tiras de la bandeja de rehidratación, drenar el
exceso de buffer de equilibrio con DTT y volver a colocar las tiras en la
bandeja con la cantidad apropiada de solución de equilibrio 2 con
iodoacetamida (IAA) (Tabla 2). Incubar durante 15 minutos con agitación
suave en la oscuridad; las tiras se deben ubicar en la bandeja de
rehidratación con el gel hacia arriba para que haya un mejor contacto de la
solución con la muestra. Se puede preparar una solución stock de equilibrio
sin DTT ni iodoacetamida la cual es estable a temperatura ambiente durante
6 meses. El DTT y la iodoacetamida deben ser adicionados inmediatamente
antes de equilibrar las tiras y se debe desechar el material no utilizado.
Tabla 1. Preparación del buffer de equilibrio para muestras
isoelectroenfocadas.
Para preparar 25ml
Urea 6M
9g
SDS (20%)
2.5ml
Tris/HCl 1,5M pH
8,8
0,825ml
Glicerol (50%)
10ml
127
Completar el volumen indicado con agua ultrapura.
Al volumen requerido de solución de equilibrio se le debe agregar DTT a una
concentración final del 2% y IAA a una concentración final del 2.5%.
Tabla2. Volúmenes de buffer de equilibrio para tiras enfocadas
Volumen de
solución por tira
Solución
1
Solución
2
DTT 2%
IAA 2,5%
Tiras 7cm 2,5ml
0,05g
0,062g
Tiras 17cm 6,0ml
0,12g
0,15g
Tiras 24cm 8,0ml
0,16g
0,2g
3. Mientras las tiras se están equilibrando, calentar la solución de agarosa de
revestimiento (overlay) (agarosa 1% disuelta en buffer de corrida TGS 1x y
azul de bromofenol 0,1% (w/v)) en un horno microondas hasta que se
derrita.
128
ANEXO 7
Electroforesis SDS-PAGE (Polyacrylamide Gel Electrophoresis). Segunda
dimensión
Preparación de los geles de acrilamida para SDS-PAGE:
Sistema Mini-PROTEAN® 3 Cell. Compatible con tiras de 7cm (Tabla 1 y Tabla
2).
Tabla 1. Preparación de geles de separación de acrilamida al 12% para SDSPAGE.
Volumen
5ml
10ml
15ml
20ml
Solución
(1gel)
(2 geles)
(3 geles)
(4 geles)
Agua ultrapura
1,7ml
3,3ml
5,0ml
6,6ml
Acrilamida/Bis 30%
2,0ml
4,0ml
6,0ml
8,0ml
Tris 1,5M pH 8,8
1,3ml
2,5ml
3,8ml
5,0ml
SDS 10%
50µl
100µl
150µl
200µl
APS 10%
50µl
100µl
150µl
200µl
TEMED 100%
2µl
4µl
6µl
8µl
La concentración final de cada uno de los componentes es: Acrilamida/Bis
12%, Tris 0,39M, SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) 0,1%, APS (Ammonium
Persulfate) 0,1% y Temed 0,04%.
Tabla 2. Preparación de geles de concentración de acrilamida al 4% para SDSPAGE.
Volumen
1.7ml
3.3ml
5ml
6.7ml
Solución
(1gel)
(2 geles)
(3 geles)
(4 geles)
Agua ultrapura
1,0ml
2,0ml
3,0ml
4,0ml
Acrilamida/Bis 30%
220ul
440ul
660ul
880ul
Tris 0,5M pH 6,8
420ul
840ul
1,26ml
1,68ml
SDS 10%
17µl
34µl
51µl
68ul
APS 10%
8,5µl
17µl
25,5µl
34ul
TEMED 100%
1,7ul
3,4µl
5,1µl
6,8ul
La concentración final de cada uno de los componentes es: Acrilamida/Bis 4%,
Tris 0,12M, SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) 0,1%, APS (Ammonium Persulfate)
0,05% y Temed 0,1%.
Sistema PROTEAN® II xi Cell. Compatible con tiras de 17cm o de 24cm si se
recortan un poco los bordes de las mismas (Tabla 3 y Tabla 4).
129
Tabla 3. Preparación de geles de separación de acrilamida al 12% para SDSPAGE.
Volumen
50ml
75ml
100ml
150ml
Solución
(1 gel)
(2 geles)
Agua ultrapura
16,7ml
25,1ml
33,5ml
50,2ml
Acrilamida/Bis 30%
20,0ml
30,0ml
40,0ml
60,0ml
Tris 1,5M pH 8,8
12,5ml
18,7ml
25,0ml
37,5ml
SDS 10%
500µl
750µl
1,0ml
1,5ml
APS 10%
250µl
375µl
500µl
750µl
TEMED 100%
25µl
37.5µl
50µl
75µl
La concentración final de cada uno de los componentes es: Acrilamida/Bis
12%, Tris 0,375M, SDS 0,1%, APS (Ammonium Persulfate) 0,05% y Temed
0,05%.
Tabla 4. Preparación de geles de concentración de acrilamida al 4% para SDSPAGE.
Volumen
10ml
20ml
30ml
40ml
Solución
(1gel)
(2 geles)
(3 geles)
(4 geles)
Agua ultrapura
6,0ml
12,0ml
18,0ml
24,0ml
Acrilamida/Bis 30%
1,32ml
2,64ml
3,96ml
5,28ml
Tris 0,5M pH 6,8
2,5ml
5,0ml
7,5ml
10,0ml
SDS 10%
102ul
204µl
306ul
408ul
APS 10%
51ul
102µl
153µl
204ul
TEMED 100%
10,2ul
20,4µl
30,6µl
40,8ul
La concentración final de cada uno de los componentes es: Acrilamida/Bis 4%,
Tris 0,12M, SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) 0,1%, APS (Ammonium Persulfate)
0,05% y Temed 0,1%.
Sistema PROTEAN PlusTM DodecaTM Cell. Compatible con tiras de 17cm y de
24cm (Tabla 5 y Tabla 6).
Tabla 5. Preparación de geles de separación de acrilamida al 12% para SDSPAGE.
562
787
101 112 123 135
Volumen (ml) 337,5 450
675
900
,5
,5
3
5
8
0
11
12
4
5
6
7
8
9
10
Solución
3 gel
gel gel
gel gel gel gel gel gel gel
e
e
Agua
150 188
301
414
113
226 264
339 377
452
ultrapura
,6
,3
,3
,3
Acrilamida/Bi
135
180 225 270 315 360 405 450 495 540
s 30%
Tris 1,5M pH
112 140 168
281 309 337
84,4
197 225 253
8,8
,5
,6
,7
,2
,3
,4
SDS 10%
10, 11, 12, 13,
3,4
4,5 5,6 6,7 7,8 9,0
1
2
4
5
130
APS 10%
TEMED 100%
1,7
2,2 2,8 3,4 3,9 4,5 5,1 5,6 6,2 6,7
0,1 0,1 0,1 0,2 0,2 0,2 0,2 0,3 0,3
0,08
1
4
7
0
2
5
8
1
4
La concentración final de cada uno de los componentes es: Acrilamida/Bis
12%, Tris 0,375M, SDS 0,1%, APS (Ammonium Persulfate) 0,05% y Temed
0,025%.
Tabla 6. Preparación de geles de concentración de acrilamida al 4% para SDSPAGE.
Volumen
10ml
20ml
30ml
40ml
Solución
(1gel)
(2 geles)
(3 geles)
(4 geles)
Agua ultrapura
6,0ml
12,0ml
18,0ml
24,0ml
Acrilamida/Bis 30%
1,32ml
2,64ml
3,96ml
5,28ml
Tris 0,5M pH 6,8
2,5ml
5,0ml
7,5ml
10,0ml
SDS 10%
102ul
204µl
306ul
408ul
APS 10%
51ul
102µl
153µl
204ul
TEMED 100%
10,2ul
20,4µl
30,6µl
40,8ul
La concentración final de cada uno de los componentes es: Acrilamida/Bis 4%,
Tris 0,12M, SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) 0,1%, APS (Ammonium Persulfate)
0,05% y Temed 0,1%.
Preparación del buffer Tris-HCl 1,5M pH 8,8:
A 90,7g de tris se le adicionan 250ml de agua ultrapura, se agita con magneto y
se le adiciona HCl 1N hasta que el pH baje a 8.8. Una vez alcanzado el pH se
afora la solución a 500ml.
Tabla 7. Preparación Buffer de Corrida TGS 1x
Sistema
MiniPROTEAN® 3
Cell
PROTEAN®
II xi Cell
PROTEAN
PlusTM
DodecaTM Cell
1 litro
2 litros
23 litros
Tris Base
25mM
3g
6g
70g
Glicina
14.4g
28.8g
331.7g
SDS (1%)
1g
2g
23g
131
Completar el volumen requerido con agua ultrapura. La concentración final de
cada uno de los componentes en el buffer 1x es: Tris 25mM, Glicina 192mM y
SDS 0,1% (w/v).
SDS-PAGE al 12% de las muestras enfocadas y equilibradas:
1.
Una vez completado el tiempo en la solución de equilibrio, introducir
brevemente cada tira en una probeta que contenga buffer de corrida TGS
1x para retirar el exceso de solución de equilibrio.
2.
Con ayuda de pinzas, colocar cuidadosamente cada tira entre los dos
vidrios del gel. Por convención el lado ácido (+) de las tiras debe quedar al
lado izquierdo del gel.
3.
Adicionar lentamente la solución de agarosa de revestimiento sobre cada
tira de isoelectroenfoque y su respectivo gel teniendo cuidado de no
introducir burbujas. La agarosa no debe estar demasiado caliente ya que
puede dañar las tiras y los geles.
4.
Permitir que la agarosa se solidifique. Luego introducir los geles en la
cámara de electroforesis.
5.
Asegurarse que la cámara de electroforesis contenga el buffer de corrida
TGS 1x.
6.
Introducir en la fuente de poder las condiciones de corrida correspondientes
a cada sistema de electroforesis (Tabla 1).
Tabla 1. Condiciones de corrida para los diferentes sistemas SDS-PAGE.
Longitud de la
7cm
17cm
24cm
tira
MiniSistema de
PROTEAN®
PROTEAN PlusTM
PROTEAN® 3
electroforesis
II xi Cell
DodecaTM Cell
Cell
16mA/gel
70V durante 30
Condiciones de 150-200 Voltios
durante 30
min., luego 150corrida
constantes
min., luego
200V durante 6
132
Tiempo
estimado de
corrida
1 hora
24mA/gel
durante
6horas
horas
6½-8 horas
6½-8 horas
Los sistemas PROTEAN® II xi Cell y PROTEAN PlusTM DodecaTM Cell
deben ser utilizados en conjunto con un equipo de recirculación de agua
que mantenga la temperatura a 15°C.
7.
Parar la corrida electroforética una vez el frente de corrido del azul de
bromofenol haya alcanzado el borde inferior de los geles.
8.
Desmontar el sistema respectivo. Dejar tiñendo los geles en la solución
correspondiente dependiendo del sistema de tinción que se vaya a emplear.
133
Anexo 8
Fijación y tinción de los geles bi-dimensionales:
Tinción con Sypro® Rubi (Bio-Rad):
Solución fijadora para tinción con Sypro® Rubi
-
400ml de metanol
-
500ml de agua ultrapura
-
100ml de ácido acético
Solución Post-tinción Sypro® Rubi
-
100ml metanol
-
840ml de agua ultrapura
-
60ml de ácido acético
Los geles se deben dejar agitando en la solución fijadora por lo menos una
hora (para geles pequeños de 7cm) y más de tres horas para geles grandes
(17 y 24cm). En la solución de Sypro® Rubi se deben dejar tiñendo al menos
unas 5 horas para geles pequeños y preferiblemente toda la noche para geles
grandes. La solución de post-tinción se debe dejar en los geles como mínimo 1
hora y después pasar los geles por varios cambios de agua ultrapura de 1 hora
cada uno. Todos estos procesos deben hacerse en un agitador orbital.
Se necesitan entre 60 y 100ml de solución para cubrir un gel pequeño y al
menos 250ml para cubrir geles de 20 x 20 cm y 25 x 20 cm.
Tinción con Coomassie Coloidal:
134
Solución Fijadora Coomasie coloidal
-
50ml metanol
-
35ml ácido acético
-
415ml agua ultrapura
Solución de Coomassie coloidal
-
Sulfato de amonio (10%) 100g
-
Coomasie G250 (0.1%)
-
Agua ultrapura
800ml
-
Ácido fosfórico (2%)
20ml
-
Metanol (20%)
200ml
1g
Adicionar el sulfato de amonio y el Coomassie G250 a 400ml de agua ultrapura
hasta disolver el sulfato. Luego adicionar el ácido fosfórico seguido por
adiciones pequeñas de metanol, hasta adicionarlo todo. Por último se adicionan
los otros 400ml de agua ultrapura.
Los geles se deben dejar agitando en la solución fijadora por lo menos una
hora (para geles pequeños de 7cm) y más de tres horas para geles grandes
(17 y 24cm). En la solución de Coomassie coloidal se deben dejar tiñendo al
menos unas 5 horas para geles pequeños y preferiblemente toda la noche para
geles grandes. Luego de retirar la solución de tinción se deben lavar los geles
en agua ultrapura durante 1 hora. Todos estos procesos deben hacerse en un
agitador orbital.
Se necesitan entre 60 y 100ml de solución para cubrir un gel pequeño y al
menos 250ml para cubrir geles de 20 x 20 cm y 25 x 20 cm.
135
ANEXO 9:
Electroforesis Diferencial en Geles Bidimensionales de proteínas de
semillas de variedades de Coffea arabica.
Kit: CyDye DIGE Fluor Labelling Kit for Minimal Samples of Amershan (Ref.:
25-8010-65).
Las proteínas a marcar con los fluorocromos, se deben solubilizar primero en
un buffer lysis. La concentración de la proteína se debe determinar usando un
método de cuantificación de proteína estándar. Los fluorocromos, son luego
añadidos a la proteína solubilizada de modo que 50ug de proteína sea marcada
con 400pmol de fluorocromo. La reacción es incubada en hielo y en la
oscuridad por 30 minutos.
Cuando se manipulan las proteínas es importante mantenerlas todo el tiempo
en hielo, y utilizar materiales plásticos, debido a que muchas proteínas se
adhieren al vidrio.
Se recomienda que la reacción de marcaje, se realice en la oscuridad en tubos
de microcentrífuga, y evitar a toda costa que las proteínas marcadas se
expongan a fuentes de luz.
Solubilización de las proteínas en un buffer lysis compatible con CyDye
DIGE minimal labelling:
1. Una vez obtenido el pellet de proteínas, se procede a resuspenderlo en
un búfer lysis compuesto de Tris 30mM, Urea 7M, Tiourea 2M, Chaps
4% (w/v), a pH 8.5.
2. Después de resuspendido el pellet de proteínas, se debe chequear que
el pH sea de 8.5 con una tira indicadora de pH, antes de proceder a
136
marcar las proteínas. Si el pH se encuentra por debajo de 8, se debe
ajustar con hidróxido de sodio 50mM.
3. Luego se procede a realizar la cuantificación de las proteínas, en este
caso mediante el método Bradford, utilizando en espectrofotómetro.
Reconstitución de CyDye en dimetilformamida (DMF):
Antes de proceder al marcaje de las muestras, se debe reconstituir los
fluorocromos en dimetil formamida de alta pureza (≤0.005% H2O, ≥99.8%
pureza). Una vez reconstituidos los fluorocromos, estos dan un color: CY2amarillo; CY3-rojo, CY5-azul.
1. Tomar un pequeño volumen de DMF de su contenedor original y
depositarlo en un tubo de microcentrífuga nuevo.
2. Sacar el CyDye del ultracongelador (-15 a –30 °C) y dejarlo por 5
minutos a temperatura ambiente.
3. Después de los 5 minutos, adicionar el volumen específico de DMF a
cada nuevo vial de CyDye, para obtener una solución stock de 1mM.
4. Luego realizar vortex vigorosamente por 30 segundos.
5. Finalmente centrifugar el tubo a 12000rpm durante 30 segundos.
6. El fluorocromo está listo para ser utilizado.
Nota: La solución stock CyDye no utilizada debe ser almacenada entre
–
15°C a –20°C, tan pronto como sea posible y en la oscuridad.
Nota: Después de reconstituido el CyDye, es solamente estable por dos meses.
Preparación de la solución de CyDye usada para marcar proteínas:
137
1. Realizar un spin en una microcentrífuga brevemente a las soluciones
stock 1mM de CyDye reconstituidas en DMF en el paso anterior.
2. Adicionar un volumen de esta solución Stock a 1.5 volúmenes de DMF
de alta pureza, para obtener una solución de 400uM de CyDye.
Nota: Se recomienda marcar 50ug de proteína con 400pmol de CyDye; entre
100pmol y 1000pmol por 50ug de proteína puede ser usado.
A continuación se muestran algunos ejemplos de diluciones de CyDye que
pueden ser usadas, la recomendada se encuentra en negrilla:
Volumen
de Volumen de DMF Volumen
total Concentración
Stock CyDye (ul)
adicionado (ul)
(ul)
CyDye (pmoles/ul)
1
4
5
200
2
3
5
400
2
2
4
500
1
1
1
1000
Las soluciones de trabajo son estables solamente por una semana y
almacenadas entre –15°C y –30°C.
Marcaje de las proteínas:
1. Adicionar un volumen de muestra de proteína equivalente a 50ug a un
tubo de microcentrífuga.
2. Adicionar 1ul de la solución diluida de CyDye a un tubo de
microcentrífuga conteniendo la muestra de proteína.
3. Mezclar y centrifugar brevemente en una microcentrífuga. Dejar en hielo
por 30 minutos en la oscuridad.
138
4. Adicionar 1ul de lisina 10mM para detener la reacción. Mezcle mediante
pipeteo y centrifugue brevemente en una microcentrífuga.
5. Deje por 10 minutos en hielo en la oscuridad.
6. Las muestras pueden ser almacenadas por lo menos tres meses a
–
70°C en la oscuridad.
Cargando las muestras en las tiras IPG
1. Después de que las muestras de proteínas han sido marcadas con los
CyDye, adicionar en un volumen igual, buffer 2x (urea 8M, DTT 130mN,
CHAPS 4%, anfolitos de pH requerido).
2. Mezclar las muestras de proteínas marcadas y que van a ser separadas
mediante electroforesis bidimensional en el mismo gel.
3. Ajustar el volumen necesario para cada tira IPG con buffer de
rehidratación.
4. Proceder a realizar la primera y segunda dimensión.
Nota: El volumen total de proteína marcada, debe ajustarse al volumen total
requerido para cada tira IPG utilizando buffer de rehidratación.
Ejemplo:
Una muestra de proteína marcada con un CyDye:
20ul
Adicionar un volumen igual de buffer muestra 2X:
20ul+20ul
Adicionar tres muestras juntas:
40ulx3
Volumen total:
120ul
Una tira IPG de 24cm necesita un volumen total de 450ul entonces se debe
adicionar (450ul-120ul)= 330ul de buffer de rehidratación.
139
El procedimiento para la electroforesis bidimensional, es el mismo que se
maneja para muestras que no han sido premarcadas.
140