TP SDS-PAGE

Química Biológica I TP 7: Electroforesis en geles de poliacrilamida PAGE
OBJETVOS
- Utilizar el método electroforético SDS-PAGE para separar los componentes de una mezcla,
según su tamaño.
-Calcular gráficamente la masa molecular aparente de proteínas por comparación con
proteínas patrones, en un gráfico de distancia vs. Log Mw aparente.
FUNDAMENTOS
La electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) es una técnica muy apreciada en la
separación de proteínas y ácidos nucleicos, permitiendo separaciones por densidad de carga o
por tamaño molecular
Los geles sirven de tamices moleculares que potencian la separación. Las moléculas más
pequeñas que los poros se desplazan fácilmente a través del gel. Las moléculas mucho
mayores quedan casi inmóviles y las moléculas de tamaños intermedios se desplazan a
través del gel con diversos grados de dificultad.
Los geles de poliacrilamida son los soportes de elección para la electroforesis porque son
químicamente inertes y se forman con facilidad mediante polimerización de la acrilamida.
Además variando la concentración de acrilamida y metilenbisacrilamida se pueden conseguir
tamaño de poro controlados.
El tipo de gel que se realizará en el práctico es llamado discontinuo o tipo Laemli, que se
basa en utilizar dos tipos de geles, el primero llamado de siembra, estaqueo o staking,
preparado en buffer tris clorhidrico pH 6,8, y el segundo llamado de resolución, corrida o
running, preparado con buffer tris pH 8,8. Los buffers de ánodo y cátodo son de pH 8,3,
debiendo contener el segundo glicina o tricina. El primer gel, staking, es un gel de baja
concentracion (4%), es decir de poro grande, en donde a pH 6,8 los iones Cl- se ubican por
delante de las proteínas, formándose un borde de arrastre por detrás de las proteínas, formado
por glicina, que resulta entonces en una zona de baja conductividad permitiendo que la
muestra se concentre y llegue al gel de running, en cuyo pH se invierte la ubicación de
corrida de la glicina y el Cl- y se producirá la separación de las proteínas en este gel. El
dodecil sulfato de sodio (SDS) conocido también como lauril sulfato, es un detergente
aniónico capaz de romper las interacciones no covalentes, el cual se agrega en la preparación
de la muestra con un agente reductor, Mercaptoetanol para reducir los puentes disulfuro de
tal manera de desnaturalizar la proteína. Los polipéptidos desplegados se unen al SDS
cargándose negativamente, siendo en general, la cantidad de SDS unido proporcional al peso
molecular del polipéptido e independiente de su secuencia. La unión es aproximadamente de
una molécula de SDS cada dos aminoácidos, cubriendo en exceso toda carga neta (al pH en
que se está trabajando), siendo entonces la relación carga/masa similar para todas las
proteínas, pudiéndose separar estas por su masa molecular (y no por su densidad de carga)
por acción de los poros del gel.
Así, los complejos SDS- proteína formados se someten a electroforesis sobre gel de
poliacrilamida. La dirección de la corrida es vertical descendente. Las bandas se visualizan
cuando se tiñen con colorante Azul de Coomasie. Las proteínas pequeñas se desplazan
rápidamente y las proteínas grandes permanecen arriba cerca del punto de aplicación. El
desplazamiento es proporcional al logaritmo de su masa pudiendo realizarse una curva de
calibración de pesos moleculares.
Utilizando proteínas de peso molecular conocido, y midiendo las distancias de corrida,
podemos graficar log pM /distancia recorrida, lo que da una recta. Si medimos la distancia
recorrida por una muestra incógnita podremos determinar el pM (llamado aparente) de la
proteína. Para esto las proteínas deberán poder verse, para lo cual primero serán coloreadas,
siendo el colorante más usado el Coomassie Brilliant Blue R250, con posterior decoloración
en un sistema de solventes.
PARTE EXPERIMENTAL
1- Determinación del PM de una proteína homogénea
Se siembra una proteína homogénea. Luego del revelado se compara la distancia recorrida
por la misma respecto del colorante marcador del frente, con la distancia recorrida por las
proteínas patrones de PM que fueron sembradas en carriles adyacentes.
Se construye un gráfico de log PM en función de la distancia recorrida en cm. y por
interpolación se obtiene el PM desconocido.
Proteína del Patrón
Masa molecular
Fosforilasa b
97,4 KDa
Seroalbumina bovina
66,2 KDa
Ovoalbúmina
45,0 KDa
Anhidrasa carbónica
31,0 KDa
Inhibidor tripsina
21,5 Kda
Lisozima
14 Kda
2- Resolver y graficar
Se determinó el PM de una proteína X analizándola simultáneamente con proteínas patrones,
mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. La corrida electroforética se llevo a cabo a
pH 8,0 y en presencia de SDS. Los resultados fueron los siguientes:
PROTEINA
DISTANCIA RECORRIDA (cm)
Seroalbúmina
Quimiotripsina
Citocromo C
Proteína X
3,0
4,7
5,7
4,1
PM (Da)
68.000
23.000
12.000
¿?
a- Haga un diagrama del gel indicando la posición de las distintas proteínas. Indique en el
diagrama el punto de siembra de la muestra y la posición del ánodo y cátodo.
b- Calcule el PM de la proteína X.
c- Si la electroforesis se realiza en poliacrilamida, a pH 8,0, sin SDS, ¿podría calcular el PM
de la proteína X de la misma manera que en b?. ¿Por qué?.
APLICACIONES
φ DETERMINACIÓN DE TAMAÑOS
MOLECULARES
φ ESTUDIOS DE HETEROGENEIDAD
MOLECULAR (VARIANTES
GENÉTICAS)
φ INTERACCIONES (AGREGACIÓN,
DISOCIACIÓN, LIGANDORECEPTOR)
φ IDENTIFI
φ MODIFICACIONES POSTTRADUCCIONALES
(GLICOSILACIÓN,
FOSFORILACIÓN)
φ ISOENZIMAS
φ CONTROL DE CALIDAD
φ ADULTERACIÓN DE ALIMENTOS
PLICACIONES
φ DETERMINACIÓN DE TAMAÑOS
MOLECULARES
φ ESTUDIOS DE HETEROGENEIDAD
MOLECULAR (VARIANTES
GENÉTICAS)
φ INTERACCIONES (AGREGACIÓN,
DISOCIACIÓN, LIGANDORECEPTOR)
φ IDENTIFICACIÓN (REACCIONES ANTÍGENOANTICUERPO)
φ ESTRUCTURA (PROTEÍNAS OLIGOMÉRICAS,
PUENTES
DISULFUROS)
φ MODIFICACIONES POSTTRADUCCIONALES
(GLICOSILACIÓN,
FOSFORILACIÓN)
φ ISOENZIMAS
φ CONTROL DE CALIDAD
φ ADULTERACIÓN DE ALIMENTOS