Electroforesis en geles de poliacrilamida Integrantes: Kevin Aguirre Cristina Cajas Cinthya Jiménez Tatiana Lara Jairo Quimbita OBJETIVOS: • Manipular adecuadamente los reactivos, materiales y equipos de laboratorio para la preparación de soluciones, que permitan realizar un corrimiento electroforético en geles de poliacrilamida. • Determinar el funcionamiento de los reactivos empleados durante el proceso de electroforesis. • Preparar geles de poliacrilamida que intervienen en el proceso de electroforesis discontinua, y describir su utilidad dentro del mismo. • Realizar una corrida electroforética y determinar la existencia de proteínas separadas en el gel. Poliacrilamida La poliacrilamida es un polímero entrecruzado que forma geles porosos. En la electroforesis, forma la matriz del gel y provoca el retardo dependiente del tamaño que marca la separación. La acrilamida forma polímeros lineales y la bisacrilamida introduce uniones cruzadas Es un soporte empleado para evitar perturbaciones mecánicas Forma geles que permiten buena visualización de las bandas durante tiempo prolongado. Es químicamente inerte, de propiedades uniformes, capaz de ser preparado de forma rápida y reproducible. Tiene la ventaja de que variando la concentración de polímeros, se puede modificar de manera controlada el tamaño del poro. Electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) Proteínas y pequeñas moléculas de RNA PAGE: Proteínas nativas o desnaturalizadas SDS-PAGE: Para separar proteínas desnaturalizadas Técnica popular para separar proteínas Resolución, facilidad de uso y flexibilidad Estos geles han reemplazado a los de almidón por: • Efecto como tamiz molecular • Proporcionan el control del tamaño de sus poros • Presentan adsorción despreciable del material proteico Uso adecuado de poliacrilamida Trabajar bajo vitrina extractora. No inhalar la sustancia. Evítese la generación de vapores/aerosoles. Protección preventiva de la piel. En el caso de no poder sustituir la forma sólida del producto en el proceso de pesada y dilución, usar mascara para polvo de tipo 3. GEL DE POLIACRILAMIDA VS GEL DE AGAROSA Agarosa+poliacrilamida: se consigue una porosidad intermedia. SEMEJANZAS Reutilizable Gran poder de resolución El espécimen se puede añadir a cualquier zona del medio de soporte Agarosa: polisacárido, producto purificado de algas (composición similar al agar-agar). Se disuelve en caliente (50-60°C) y al enfriar solidifica formando un gel, de alta porosidad. Diferencias mezclas complejas de proteínas. En agarosa se puede hacer concentraciones de 1/2 a 2 por ciento de agarosa en una solución tampón. Gel de agarosa puede separar fragmentos de ADN de 200 a 50.000 pares de bases. Poliacrilamida pueden hacer en las concentraciones de 3,5 a 20 por ciento. La gama de gel de acrilamida es mucho más pequeño, menos de 500 pares de bases. La acrilamida es mejor para la separación de proteínas, ya que la resolución es mejor para el gel de agarosa. También se puede utilizar para separar el ADN que difiere únicamente por un solo par de bases. Una ventaja importante de los geles de poliacrilamida es que son químicamente inertes, transparentes y estables en un amplio rango de pHs, temperatura y fuerza iónica. Condiciones necesarias para una corrida electroforética en geles de poliacrilamida • +Voltaje: Excesivo calor • -Voltaje: Pobre separación • Corridas cortas: Impiden que las muestras avancen el espacio necesario para su separación. Voltaje Cantidad de catalizador Tiempo de corrida Pureza de los reactivos • +catalizador: Polimerización rápida deformar las bandas. • -catalizador: Superficie del gel desigual romperse con facilidad. • Empleo de reactivos de alta calidad “grado molecular” y agua des ionizada para hacer geles de alta resolución. Formación del gel de poliacrilamida Polimerización de acrilamida por acción de un agente entrecruzador, bisacrilamida. Formación de radicales libres en el medio Catalizadores: - ión persulfato (S2O8-) persulfato amónico. - TEMED Desgasificación Gel reproducible Se detiene cuando desaparecen los radicales libres del medio Velocidad: concentraciones de ión persulfato y TEMED. Porosidad: poliacrilamida y bis-acrilamida. %Acril/Bis-acrilamida: rango de separación del gel. Menor porcentaje = mejor separación de proteínas grandes. Clasificación PAGE (Electroforesis den geles de poliacrilamida) Función del estado de las proteínas Electroforesis desnaturalizante Las proteínas se someten a migración proporcional carga y tamaño molecular. SDS Electroforesis nativa Migración sin desnaturalización en función de la carga, tamaño y forma. Tris-Glicina (pH=8,3-9,5) Tris-borato (pH=7,0-8,5) Tris-acetato (pH=7,2-8,5) Metodología Resolving Stacking Gel Gel H2O 30% acril:bisacr 1.5 M Tris pH 8.8 10% SDS 10% APS TEMED 10 ml 3.3 5 ml 3.4 4 830 ul 2.5 630 ul 0.1 0.1 4 ul Para 2 geles 50 ul 50 ul 5 ul Para 2 geles Preparación del BIS-Acril AL 30% 𝑉1 : 𝑥 𝐶1 : 40% de bis−acril 𝐶2 : 30% de bis−acril 𝑉2 : 10𝑚𝐿 Para SDS al 10% se tiene: 10𝑔 → 100 𝑚𝐿 𝑥 → 1 𝑚𝐿 𝑥= 10𝑔×1𝑚𝐿 100𝑚𝐿 = 0,1𝑔 en 1mL • CIVI=C2V2 • 40VI=30x10 • VI=7.5ml • Agua= 2.5 ml Para APS al 10% se tiene: 10𝑔 → 100 𝑚𝐿 𝑥 → 1 𝑚𝐿 10𝑔×1𝑚𝐿 𝑥 = 100𝑚𝐿 = 0,1𝑔 en 1mL Reactivos para electroforesis Tris-HCl - Buffer - Alcalinidad SDS - Desnaturalizante - Detergente APS - Catalizador - Radical TEMED - Catalizador - Tasa de polimerización MONTAJE DEL GEL Buffer de carga: • Sacarosa: Peso a la muestra para que precipite al fondo de los pozos. Para la muestra • El azul de bromofenol: Comprobar el progreso de la electroforesis. Marca el "frente de avance". • SDS para desnaturalizar y cubrir a las proteínas de una carga uniformemente negativa • Mercaptoetanol para reducir los puentes disulfuro SDS CORRIDA ELECTROFORÉTICA Buffer de Electroforesis • Tris: mantiene el pH • Glicina: conductor electricidad • SDS: mantiene las proteínas cargadas negativamente Cubrir el tanque con la tapa y conectar los cables de los electrodos en la fuente de poder Tiempo: 1 hora y media aprox. 1. Glicina carga - en el Tampón de electroforesis a pH 8,8. 2. Campo eléctrico Gly, en Stacking Gel, se aleja del electrodo negativo. 3. La Gly pierde carga a pH 6,8 y ralentiza su movimiento. Los iones de cloruro avanzan por delante de la Gly. 4. Aumento de la resistencia, obliga a las proteínas a alejarse, de forma apilada CORRIDA ELECTROFORÉTICA “Frente de avance“: de azul de bromofenol alcanza la parte inferior del gel, se desconecta la fuente. Se retiran los electrodos Se sacan los geles de acrilamida, separando los cristales con una espátula. COLORACIÓN Y VISUALIZACIÓN DE LAS PROTEÍNAS USANDO AZUL BRILLANTE DE COOMASIE Solución Colorante Se deja el gel en agitación suave. Azul de Coomassie Penetre y se fije a las proteínas. • Colorante: 24horas • Decolorante: 7 días Decolorante Atracción electrostática ácido sulfónico: tautómero menos estable del ácido sulfuroso Proteínas RESULTADOS ESPERADOS OBTENIDOS DISCUSIÓN DESTINCIÓN • La solución de destinción fue mal elaborada. • La solución de destinción tenía mucho tiempo de elaboración. DISCUSIÓN BANDAS . • El voltaje que se aplica en los geles de agarosa depende de la resolución requerida y del tamaño de los fragmentos a separar. • Si se cambia el voltaje, los fragmentos cambian su movilidad electroforética, sin que ésta guarde relación con su tamaño. DISCUSIÓN BANDAS . • Pocillos de poliacrilamida mal polimerizado. Mala homogeneización del APS y el TEMED en la solución de poliacrilamida. • La muestra no cayó de forma eficiente y se difundió con el baffer de electroforesis en el momento en que fue depositado en el pocillo. CONCLUSIONES • La correcta manipulación de reactivos, materiales y equipos dentro del laboratorio permitieron realizar un corrimiento electroforético en geles de poliacrilamida. • Se determinó el papel que cumple cada uno de los reactivos empleados durante el proceso de electroforesis. • Los pasos a seguir para la preparación de geles de poliacrilamida que intervienen en el proceso de electroforesis discontinua fueron descritos minuciosamente, así como su utilidad dentro del mismo. • La manipulación del gel bajo condiciones cambiantes no permitió que se pueda determinar la existencia de proteínas separadas en el gel tras el proceso de electroforesis
