Electroforesis de proteínas

Electroforesis de proteínas
Introducción general
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La electroforesis es un método de separación basado
en la tasa diferencial de migración de especies
cargadas al estar en un campo eléctrico de DC
La tasa de migración
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Depende de la carga y del tamaño
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La separación se basa en explotar las diferencias en las
proporciones carga-tamaño
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Una serie de métodos muy eficientes y que dan altas
resoluciones
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Principios y teoría de la electroforesis
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Requerimientos básicos
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Un medio conductor (buffer acuoso, electrolito, buffer
de corrida)
Poder aplicar un campo eléctrrico
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Especies cargadas positivamente, que se moverán
hacia el cátodo
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Especies cargadas negativamente, que se moverán hacia el
ánodo
Principios y teoría de la electroforesis
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Requerimientos básicos
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Un medio conductor (buffer acuoso, electrolito, buffer
de corrida)
Poder aplicar un campo eléctrrico
–
Especies cargadas positivamente, que se moverán
hacia el cátodo
–
Especies cargadas negativamente, que se moverán hacia el
ánodo
Dos técnicas básicas
1. Las moléculas están en solución libre: capilares de
calibre pequeño
2. Están en una matriz no conductora (agarosa, gel
de poliacrilamida “PAGE”)
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El calentamiento por corriente es mínimo
El efecto de criba (coladera) del gel permite separar
especies que tengan la misma proporción de carag
contra tamaño, si tienen diferentes tamaños
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La eficiencia de esta técnica depende de
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La mobilidad electroforética μ ep
El flujo electroosmótico del “bulto” de la solución
(EOF)
El calentamiento debido a la resistencia (o
“Calentamiento Joule”)
La movilidad electroforética
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F ef =q×E (La fuerza electroforética, donde q=carga
F fr =6× π ×η ×r×ν ep
η =viscosidad
r=radio
E =campo eléctrico )
(la fuerza de la fricción)
ν ep : velocidad de migración electroforética
F ef =F fr
ν ep =
q×E
6× π ×η ×r×ν ep
ν ep
q
q
μ ep = =
=const ×
E 6× π ×η ×r
r
μ ep : mobilidad electroforética
La velocidad del movimiento está definida por la ecuación:
v=
Eq
ƒ
Dónde E es la fuerza del campo eléctrico, q es la carga neta de la molécula,
f es el coeficiente friccional:
Por lo tanto f depende de la
viscosidad
Del buffer, que depende de
la porosidad
de la matriz, y del tamaño
de la molécula
ƒ=6 π ηΥ
Radio de la molécula
(tamaño)
Coeficiente de viscosidad
La velocidad del movimiento está definida por la ecuación:
v=
Eq
ƒ
Dónde E es la fuerza del campo eléctrico, q es la carga neta de la molécula,
f es el coeficiente friccional:
Por lo tanto f depende de la
viscosidad
Del buffer, que depende de
la porosidad
de la matriz, y del tamaño
de la molécula
ƒ=6 π ηΥ
Radio de la molécula
(tamaño)
Coeficiente de viscosidad
El calentamiento por resistencia (u “óhmico”
o “de Joule”)
La ley de Ohm relaciona el voltaje V, con la corriente I y la resistencia R:
I=
V
R
Podríamos pensar que incrementar la corriente aumentando el voltaje
daría más mobilidad y que hacer experimentos a mayor volatje es mejor
Pero la potencia que se genera es
W =I 2 R
Al aumentar la potencia puede aumentar la producción de calor, lo que conlleva
Convección (y eso provoca una mala separación de las proteínas), una disminución en la viscosidad del medio (y por lo tanto, mayor corriente y aún más calor)
El flujo electroosmótico (EOF)
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Su efecto es más importante en electroforesis de capilar
El EOF se refiere a la migración del “bulto” del líquido hacia
el cátodo
Orígen: se forma una doble capa
Electroforesis en gel
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La matriz es un hidrogel que no sea eléctricamente conductivo y que
contenga buffer
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Agarosa (aplicaciones con aa. Nucléicos)
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Poliacrilamida
Ventajas:
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El gel poroso actúa como criba
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... y limita la difusión de las moléculas de muestra
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Se suprime el EOF
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Se suprime el calentamiento resistivo
Desventajas
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Lento, talachudo y difícilmente automatizable
Electroforesis en gel
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Técnicas:
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Electroforesis en gel nativo: los analitos se
separan de acuerdo a diferencias en movilidad
aparente
En la electroforesis en gel de poliacrilamida y
diodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) la
separación es por tamaño
Isoelectroenfoque (IEF)
Electroforesis en geles bidimensionales (2D-GE)
Los medios para preparar geles
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Agarosa
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Gel de poliacrilamida
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Copolimerización de la acrilamida y la N,N'metilen-bisacrilamida
Iniciadores de la reacción: TEMED
(tetrametiletilendiamina) y Persulfato de amonio
Los medios para preparar geles
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Animación gel desnaturalizante: http://lifesciences.envmed.rochester.edu/media.html
http://www.youtube.com/watch?v=8Io0pN5XGqI
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Gel de poliacrilamida
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Copolimerización de la acrilamida y la N,N'metilen-bisacrilamida
Iniciadores de la reacción: TEMED
(tetrametiletilendiamina) y Persulfato de amonio
Hay un efecto de criba: el tamaño del poro
depende de la [gel] (5 a 20%)
Se adiciona SDS para desnaturalizar y cubrir a las
proteínas de una carga uniformemente negativa
...y mercaptoetanol para reducir los puentes
disulfuro
Los medios para preparar geles
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Gel de poliacrilamida
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Hay un efecto de criba: el tamaño del poro depende de la [gel] (5 a 20%)
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Se adiciona SDS para desnaturalizar y cubrir a las proteínas de una
carga uniformemente negativa
–
...y mercaptoetanol para reducir los puentes disulfuro
Los medios para preparar geles
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El efecto del ion cloro y el ion glicina: permiten que las proteínas se amontonen
en la parte inferior del gel de empacamiento y todas empiecen a entrar en el gel
separador prácticamente al mismo tiempo
Preparación de la muestra de proteína
Preparación de las soluciones del gel
empacador y el gel separador
Vertido de las soluciones de geles en el molde
Cargando las muestras