BACTERIAS DEL RÍO CALLE-CALLE (SECTOR PISHUINCO), IMPL

Universidad Austral de Chile
Facultad de Ciencias
Escuela de Ciencias
PROFESOR PATROCINANTE
Dr. Eduardo Valenzuela F.
Instituto de Bioquímica y Microbiología
Facultad de Ciencias
“BACTERIAS DEL RÍO CALLE-CALLE (SECTOR PISHUINCO),
IMPLICADAS EN LA DEGRADACIÓN DE CELULOSA.”
Tesis de grado presentada como parte
de requisitos para optar al Grado de
Licenciado en Ciencias Biológicas.
FRANCISCO JAVIER SANDOVAL IRURETA
VALDIVIA – CHILE
201
ÍNDICE DE CONTENIDOS
Pág.
1.
RESUMEN
1
SUMMARY
2
2.
INTRODUCCIÓN
3
3.
MATERIALES Y MÉTODOS
10
3.1
MATERIALES
10
3.1.1 Material Biológico
10
3.1.2 Reactivos
10
3.1.3 Equipos
10
3.1.4 Otros
11
3.2
11
MÉTODOS
3.2.1 Ubicación del área de estudio
11
3.2.2 Recolección de muestras de agua
12
3.2.3 Aislamiento de bacterias celulolíticas
13
3.2.4 Obtención de cepas celulolíticas a distintas concentraciones de celulosa
14
3.2.5 Determinación de cepas celulolíticas hasta el rango de género
15
3.2.5.1 Pruebas bioquímicas
16
3.2.5.2 Tinciones
17
4.
RESULTADOS
18
4.1
Determinación del crecimiento de las cepas celulolíticas a distintas
18
concentraciones en las épocas de invierno y primavera
4.2
Determinación taxonómica de bacterias celulolíticas hasta el rango
género
20
4.2.1 Características de las taxas determinadas
21
5.
DISCUSIÓN
23
6.
CONCLUSIONES
27
7.
BIBLIOGRAFIA
28
8.
ANEXOS
33
INDICES DE FIGURAS Y TABLAS
Pág.
Figura 1.
Estructura química de la celulosa
3
Figura 2.
Estructura de la celulosa: regiones cristalinas y amorfas
4
Figura 3.
Ubicación del área de estudio
11
Figura 4.
Ubicación de las zonas de muestreo
12
Figura 5.
Placas cuadriculadas con colonias bacterianas celulolíticas
15
(5 A); Medición de una colonia bacteriana celulolítica en
agar celulosa (5 B)
Figura 6.
Crecimiento de las colonias bacterianas recolectadas en dos
19
épocas del año (invierno y primavera) sometidas a diversas
concentraciones de celulosa
Tabla 1.
Medición de las colonias de las cepas bacterianas recolecta-
18
das en invierno y primavera, determinado en agar celulosa a
dos concentraciones (5 y 35%)
Tabla 2.
Géneros bacterianos asignados a las cepas cultivadas en AC
a 35%
21
ÍNDICE DE ANEXOS
Pág.
ANEXO 7.1
Medición de las colonias de las cepas bacterianas recolectadas
33
en invierno, determinado en agar celulosa a cuatro concentraciones (5, 10, 15 y 35%)
ANEXO 7.2
Medición de las colonias de las cepas bacterianas recolectadas
33
en primavera, determinado en agar celulosa a cuatro concentraciones (5, 10, 15 y 35%)
ANEXO 7.3
Porcentaje total de cepas bacterianas obtenidas a distintas
concentraciones de celulosa en dos épocas de muestreo
(invierno y primavera)
34
1
1. RESUMEN
La celulosa es el componente más abundante de la biomasa vegetal, existiendo un gran
número de microorganismos celulolíticos, principalmente hongos y bacterias; capaces
de nutrirse de las sustancias orgánicas, degradando y restituyéndolas en forma de CO2
y materia orgánica que son aprovechadas por otros organismos superiores para reiniciar
el ciclo. De este modo desarrollan una acción determinante en el proceso de
mineralización de las sustancias orgánicas, y por ende, su reciclaje. En el presente
estudio las muestras de agua se colectaron desde el río Calle-Calle, sector Pishuinco, en
las épocas de invierno y primavera. Se determinó el crecimiento de las colonias
bacterianas a distintas concentraciones de celulosa. Se obtuvieron 10 cepas bacterianas
para cada época de muestreo correspondiente a los géneros Bacillus, Pseudomonas y
Zooglea, los cuales lograron crecer hasta una concentración en agar celulosa (AC) al
35%. Se determinó que el mayor crecimiento de las colonias bacterianas se obtuvo en
medios con un 5% de celulosa donde se registró un crecimiento sobre 4 mm de ancho y
sobre 5 mm de largo. En contraste, concentraciones al 35% de celulosa se encontraron
diferencias que van desde los 1,2 a 3,4 mm a favor de la concentración al 5% en AC.
Esto indica que el aumento progresivo en la concentración de celulosa resulta en una
disminución en el crecimiento de las bacterias aisladas.
2
SUMMARY
Cellulose is the most abundant component of plant biomass, and there are a large
number of cellulolytic microorganisms, mainly fungi and bacteria can feed on organic
substances, and restoring degraded as CO2 and organic matter that are used by other
higher organisms to restart the cycle. They develop a decisive action in the process of
mineralization of organic substances, and therefore recycling. In this study, water
samples were collected from the river Calle-Calle, sector Pishuinco in the winter or
spring. We determined the growth of bacterial colonies with different concentrations of
cellulose. 10 bacterial strains were obtained for each sampling time corresponding to the
genera Bacillus, Pseudomonas and Zooglea, which managed to grow to a concentration
on cellulose agar (AC) to 35%. It was determined that greatest growht of bacterial
colonies was obtained in media with 5% cellulose where growth was about 4 mm wide
and about 5 mm long. In contrast, concentrations of 35% cellulose found differences
ranging from 1,2 to 3,4 mm for 5% concentration in AC. This indicates that the
progressive increase in the concentration of cellulose results in a decrease in the growth
of bacteria isolated.
3
2. INTRODUCCIÓN
2.1. Composición química de la celulosa
La celulosa (C6H10O5)n es el componente más abundante en la biomasa vegetal, el cual
es degradado por una serie de microorganismos mediante la acción de un conjunto de
enzimas (Ortiz-Caro et al., 2010). Estructuralmente la celulosa es un polisacárido
compuesto de unidades de glucosa enlazadas en una larga cadena lineal, constituida de
unidades β-D-glucopiranosa unidas por enlaces 1,4-glucosídicos como se observa en la
Figura 1 (Carrillo, 2003). Estas cadenas lineales de celulosa interactúan entre sí por
medio de enlaces puentes de hidrógeno dando lugar a la formación de microfibrillas con
regiones altamente ordenadas que le dan las características de insolubilidad, rigidez y
resistencia al ataque enzimático y que se conocen como regiones cristalinas (Mejía et
al., 2002).
Figura 1. Estructura Química de la celulosa (Heldt, 1997).
La composición de la celulosa permite que las regiones cristalinas se encuentren
alternándose con zonas denominadas amorfas, como se observa en la Figura 2 (Carrillo,
2003). La formación de estas regiones ocurre cuando a lo largo del haz de cadenas se
4
rompen los puentes de hidrógenos dando origen a las secciones amorfas, que permiten
su hidratación y el posterior ataque enzimático por microorganismos celulolíticos que
poseen enzimas específicas encargadas para su degradación (Barrera et al., 2009). Cabe
señalar que las zonas cristalinas de la celulosa presentan un polimorfismo acentuado,
debido a la diferente ordenación de las cadenas de celulosa en la red cristalina,
diferenciando dos tipos de celulosas: tipo I ó celulosa nativa y tipo II ó de algodón
mercerizado. El mecanismo de cristalización de las microfibrillas puede dar origen a
dos tipos de celulosa; si las microfibrillas se orientan en forma paralela se sintetiza
celulosa de tipo I, mientras que si el arreglo de las microfibrillas es antiparalela se
obtiene celulosa tipo II (Chávez-Pacheco et al., 2004); siendo la celulosa tipo I
predominante en la naturaleza.
Figura 2. Estructura de la celulosa: regiones cristalinas y amorfas
(Guevara et al., 2003).
5
2.2. Actividad enzimática de los microorganismos sobre la celulosa
La actividad enzimática es el factor más importante en la degradación de celulosa. Los
microorganismos son capaces de sintetizar exoenzimas (celulasas), que van a actuar
sobre la celulosa y la hidrolizarán en productos que pueden ser utilizados como fuente
de carbono y energía (Barrera et al., 2009).
Las fibras de celulosa son degradadas esencialmente por dos sistemas enzimáticos
llamados agregativos y no agregativos. Los sistemas agregativos se presentan en las
bacterias anaerobias y es conocido como celulosoma, el que funciona como estructuras
exocelulares especializadas que catalizan la hidrólisis de la celulosa y hemicelulosa, y
se compone de al menos 14 polipéptidos distintos, incluyendo varias celulasas,
xilanasas y al menos una β-glucosidasa. Los sistemas no agregativos a su vez funcionan
en presencia de oxígeno (aerobiosis) y están compuestos principalmente por tres tipos
de enzimas: (1).- endo-β-1,4-glucanasa que actúa sobre los enlaces β-1,4 en las regiones
amorfas internas de la macromolécula, dando como resultado largos fragmentos
solubles (oligosacáridos). (2).- exo-β-1,4-glucanasa, que permite separar el disacárido
celobiosa desde los extremos de la molécula. (3).- β-glucosidasa que hidroliza la
celobiosa con formación de glucosa (Carrillo, 2003; Ortiz-Caro et al., 2010).
2.3. Características del río Calle-Calle
En la XIV Región de Chile se encuentra el río Calle-Calle el cual nace de la junta de los
ríos San Pedro y Quinchulca, se extiende por 55 Km. considerado un sistema
fluviolacustre con un desarrollo meándrico
con escasas pendientes Consultora en
6
Ingeniería y Desarrollo de Proyectos en Recursos Naturales, Energía y Transporte
(CADE-IDEPE) (2004). Siendo afectado por la influencia de los ciclos maréales
extendiéndose por el río Calle-Calle hasta la localidad de Pishuinco, sin encontrar
intercambio salino en esta zona (Ramírez, 2003). Por ende es considerado una zona
fluvial ya que el agua puede permanecer dulce todo el tiempo (Dyer, 2001). Siendo
caracterizado por su gran vegetación en zonas aledañas y en el mismo cauce fluvial.
2.4. Características de los microorganismos contenidos en los cuerpos de agua
Los microorganismos que habitan los cuerpos de agua juegan un rol importante en los
ciclos biogeoquímicos del planeta, ya que son cuantitativamente esenciales en procesos
de mineralización y de transformación de nutrientes como de materia orgánica (Romaní
et al., 2009). Las bacterias aerobias generalmente mineralizan la celulosa en dos
productos principales CO2 y biomasa. Mientras que en condiciones anaerobias las
bacterias transforman la celulosa siendo incapaces de metabolizarlo dejando productos
de acumulación como CO2, CH4, H2, etanol y ácidos (acético, fórmico, succínico,
butírico y láctico). Siendo estos productos aprovechados por organismos superiores.
(Dworkin et al., 2006)
Las bacterias del agua son el grupo de microorganismos procariontes más diversos y
abundantes, difieren en cuanto a sus características morfológicas, fisiológicas y
preferencias ecológicas. Pueden ser agrupadas de acuerdo a distintas características
como por ejemplo: su forma, capacidad de formar estructuras de resistencia,
requerimientos de oxígeno, pH, reacción a la tinción de Gram, etc. La mayoría de las
bacterias acuáticas son Gram negativas (Sigge, 2005). Su tamaño bacteriano, varía
7
dentro de ciertos rangos de acuerdo a la etapa de crecimiento, medio y condiciones de
cultivo. Por su parte, las formas cocoides, bacilares y vibriones son comunes, la mayoría
de las bacterias del agua son de vida libre, quimiorganótrofos capaces se obtener
nutrientes desde sustratos presentes en la columna de agua, mientras que otras bacterias
establecen relaciones simbióticas con otros organismos (Sigge, 2005).
Las bacterias acuáticas están a su vez afectadas por el ambiente físico y químico
(temperatura, pH, luz y O2), cuyos valores sean superiores o inferiores a los óptimos,
pueden alterar considerablemente el metabolismo, la forma celular y la reproducción de
algunas especies (Madigan et al, 1998; Sigge, 2005).
La temperatura es considerada un factor crítico, que controla el metabolismo bacteriano.
En regiones tropicales la alta temperatura local está asociada a una gran actividad y
abundancia bacteriana, teniendo un efecto directo sobre la acción enzimática. En
primavera y verano las poblaciones bacterianas presentan grandes incrementos en la
superficie del agua; por el contrario en invierno, los procesos se hacen más lento
prolongando la supervivencia de las bacterias aumentando el número de estas, hay que
tomar en cuenta que la luz desciende en esta época y que el número de bacterias es
menor (Fuenzalida, 2006; Maïomouna, 2008; Sigge 2005).
Otro factor no menos importante es el pH, donde la mayoría de las bacterias pueden
crecer dentro de un margen, en su medio, manteniendo al mismo tiempo su pH interno
óptimo prácticamente constante, pero, generalmente las bacterias acuáticas crecen y se
reproducen entre valores de pH que fluctúan entre 6,5 y 8,5. Las aguas al presentar un
pH elevado tendrán un alto porcentaje de carbonatos, bicarbonatos y sales, en tanto
8
aguas con pH bajo estará caracterizados por la disminución del contenido de nutrientes,
provocando que las bacterias tengan que adaptarse a cambios bruscos de manera
eficiente o de lo contrario pueden morir (Fuenzalida, 2006; Maïomouna, 2008; Sigge
2005).
Los microorganismos celulolíticos incluyen hongos y bacterias, aerobios y anaerobios,
mesófilos y termófilos que ocupan una gran variedad de hábitats. Dentro de las
bacterias celulolíticas que habitan los cuerpos de agua, los más abundantes son
representantes de géneros como: Cytophaga; Sporocytophaga; Bacillus; Cellvibrio;
Pseudomonas y Herpetosiphon. (Dworkin et al., 2006; Gaitán & Pérez, 2007).
En base a lo antecedentes expuestos se planteo la siguiente hipótesis de trabajo.
Desde la columna de agua del río Calle-Calle sector Pishuinco; el 60% de las cepas
bacterianas aisladas en cultivos puros tendrán la capacidad de degradar celulosa.
Para aceptar o rechazar la hipótesis se plantean los siguientes objetivos específicos:
-
Aislar y obtener cultivos puros bacterianos desde muestras recolectadas de aguas
del río Calle-Calle sector Pishuinco, durante la estación climática de invierno y
primavera.
-
Determinar del total de las cepas aisladas en cultivo puro que porcentaje son
celulolíticas.
-
Identificar hasta el nivel genero las cepas bacterianas aisladas
9
-
Evaluar el crecimiento microbiano de las cepas celulolíticas a diferentes
concentraciones de celulosa (5; 10; 15 y 35% p/v).
10
3. MATERIALES Y METODOS.
3.1. MATERIALES.
3.1.1 Material Biológico.
Se utilizaron en total 338 cepas bacterianas de las cuales 168 cepas aisladas fueron
colectadas de muestras de agua del río Calle-Calle (sector Pishuinco) en el mes de
Septiembre y 168 cepas extraídas desde muestras de agua del río Calle-Calle (sector
Pishuinco) en el mes de Octubre.
3.1.2 Reactivos.
Los reactivos utilizados en la parte experimental del presente estudio se encuentran
ordenados alfabéticamente: agar-agar, agar celulosa al 2%, agar nitrato, agar peptona al
2%, agua oxigenada (H2O2), alcohol-acetona, cristal violeta, lugol, reactivo de Nitrato,
safranina al 0,25% y solución salina estándar.
3.1.3 Equipos.
Autoclave Huley HL-341, balanza Scout Ohaus, cámara de cultivo Shel lab LI20-2,
lupa estereoscópica Olympus SZ51, microondas Somela Practique 2300 NC,
microscopio óptico Olympus CX-21, refrigerador LG GM-3435C.
11
3.1.4 Otros.
Aceite de inmersión, agua destilada estéril, algodón cardet, asa de siembra, botellas de
vidrio estériles de 250 mL, gradillas de metal, matraz Erlenmeyer de 200, 500 y 1000
mL, mechero, mica cuadriculada, muestras de agua, pie de metro, pipetas volumétricas
de 2 y 5 mL, parafilm, pipetas Pasteur, placas Petri, plumón permanente, portaobjetos,
probetas de 50; 500 y 1000 mL, rastrillo de siembra, tubos de ensayo Venoject
3.2. MÉTODOS.
3.2.1 Ubicación del área de estudio.
El área de estudio (Fig. 3), se localiza en el río Calle-Calle, sector de Pishuinco (39° 48’
S y 73° 03’ W), ubicado a 22 Km de la ciudad de Valdivia, por el camino viejo a la
ciudad de Los Lagos.
Figura 3. Ubicación del área de estudio (Fuente Google Earth 2011).
12
La zona se compone por el río Calle-Calle, el cual se origina de la junta de los ríos San
Pedro y Quinchulca, 8 Km aguas arriba de la ciudad de Los Lagos, siendo el primer
emisario del Lago Riñihue. El río Calle-Calle es el resultado de un complejo sistema
fluviolacustre, en el que las aguas, especialmente de lluvias, son reguladas en los lagos
andinos, originando un caudal abundante y relativamente uniforme durante todo el año.
El cauce fluvial presenta una extensión de 55 Km de forma meándrica y con escasa
pendiente. A su término, rodea la ciudad de Valdivia donde el río pasa a llevar el
nombre del homónimo, para posteriormente desembocar en el océano Pacifico por las
costas de Niebla y Corral (CADE-IDEPE, 2004). El río Calle-Calle en el sector de
Pishuinco tiene un ancho aproximado de 150 m y una profundidad que varia entre los
15 a 20 m.
3.2.2 Recolección de muestras de agua.
La recolección de muestras de agua se realizó entre los meses de Septiembre y Octubre
del 2010, en el río Calle-Calle en el sector de Pishuinco (39° 48’ S y 73° 03’ W) donde
se establecieron 3 estaciones de muestro (Fig.4).
Figura 4. Ubicación de las zonas de muestreo (Fuente Google Earth 2011).
13
La metodología utilizada se describe a continuación: Las muestras de agua fueron
colectadas de forma manual e independiente, desde un bote a 5 m aproximadamente
desde la orilla en botellas de vidrio estériles (de 250 mL de capacidad). Cada botella se
sumergió por completo en la columna de agua, teniendo el cuidado de abrirla sólo
cuando la botella se encuentre sumergida por completo, posteriormente se retiró la tapa
de la botella para permitir el ingreso del agua una vez lleno los envases con 240 mL de
agua se procedió medir la temperatura con un termómetro el que se sumergió en la
columna de agua. Se tomaron seis muestras en total, tres correspondiente al mes de
Septiembre y las restantes al mes de Octubre donde se establecieron los puntos de
muestreo correspondientes. Luego de obtener las muestras de agua, las botellas de
vidrio fueron rotuladas de acuerdo al área de muestreo. Finalmente las muestras de agua
se trasladaron al Instituto de de Bioquímica y Microbiología, Facultad de Ciencias de la
Universidad Austral de Chile para realizar el aislamiento de las cepas bacterianas.
3.2.3
Aislamiento de cepas bacterianas celulolíticas
Cada muestra de agua se proceso individualmente mediante el método de las diluciones
seriadas y posterior siembra en placa (según Madigan, et al., 1998 modificado), como se
indica a continuación: De la muestra correspondiente, utilizando una pipeta estéril se
extrajeron 10 mL de agua y se depositaron en una botella que contenía 90 mL de agua
destilada estéril obteniendo una dilución 10-1, a partir de esta dilución se extrajo con una
nueva pipeta estéril 1 mL y se deposito en un tubo de ensayo que contenía 9 mL de agua
destilada estéril, de esta forma se obtuvo la dilución 10-2. A partir de este tubo de ensayo
previamente agitado y con una nueva pipeta estéril se extrajo 1 mL y se deposito en un
14
nuevo tubo de ensayo con 9 mL de agua destilada estéril, de esta forma se obtuvo la
dilución 10-3. La metodología descrita anteriormente se empleo hasta obtener la dilución
10-4, teniendo cada vez el cuidado de ir agitando el tubo de ensayo respectivo y usando
una nueva pipeta estéril en cada ocasión.
Cada una de las diluciones obtenidas se sembró independientemente y por triplicado en
agar celulosa al 2% (AC). Con ayuda de una pipeta se extrajeron 0,1 mL de la dilución
respectiva, se depositó en cada placa Petri que contenía AC, luego el inóculo se
disemino sobre la superficie del AC utilizando un rastrillo de siembra. Las placas
sembradas se incubaron a 23 °C por 5 días. Al finalizar el período de incubación se
procedió a realizar la obtención de cultivos puros. Sólo se seleccionaron colonias
bacterianas aisladas, las que fueron sembradas en tubos de ensayo inclinados que
contenían AC mediante siembra por estrías. Los tubos de ensayo sembrados se
incubaron a 23 °C por 5 días.
Luego cada cepa obtenida fue sometida a distintas concentraciones de celulosa 5; 10; 15
y 35% respectivamente.
3.2.4 Obtención de cepas celulolíticas a distintas concentraciones de celulosa.
Una vez obtenidas las cepas en tubos inclinados de AC, las cepas bacterianas fueron
sometidas a distintas concentraciones de celulosa 5; 10; 15 y 35% respectivamente,
mediante el método de siembra en placa por cuadricula, la cual se realizó de manera
independiente y por triplicado. Una vez sembradas las placas, estas fueron incubadas a
23 °C por 10 días. Una vez obtenidas las colonias a las distintas concentraciones de AC,
estas fueron medidas (ancho y largo) con un pie de metro observando las colonias
bacterianas en una lupa estereoscópica; las colonias que presentaron crecimiento en
15
medio de AC 5% fueron nuevamente sembradas en un medio de AC 10% repitiendo el
proceso hasta llegar a la concentración deseada AC 35%.
Figura 5. Placas cuadriculadas con colonias bacterianas celulolíticas (5 A); Medición de
una colonia bacteriana celulolítica en agar celulosa (5 B).
3.2.5 Determinación taxonómica de cepas celulolíticas hasta el rango de género.
Las cepas que lograron crecer en AC 35%, fueron nuevamente sembradas en agar
peptona al 2% (AP) por el método de siembra por estría, siendo incubadas a 23 °C por
48 h. De las colonias puras aisladas en AP al 2%, se tomó una pequeña cantidad de
inóculo que fue sembrada en AP contenido en tubos inclinados e incubadas a la misma
temperatura antes señalada. Luego de la incubación se realizó la caracterización
macroscópica de las colonias de las cepas respectiva (color, forma, tamaño, etc.).
Mediante una tinción de Gram se logró establecer la morfología, agrupación y reacción
al Gram. Para establecer el género, al cual pertenecen las cepas en estudio se realizaron
pruebas bioquímicas y tinciones establecidas en los esquemas de clasificación de
Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology (Buchanan et al., 1974), que se señalan
a continuación.
16
3.2.5.1 Pruebas bioquímicas.
a) Prueba de la Catalasa: la catalasa es un enzima que presentan la mayoría de las
bacterias aerobias, cuya función es catalizar la ruptura del agua oxigenada (H2O2),
liberando oxigeno (O2) al medio ambiente. Técnica: en un portaobjeto, se depositó una
pequeña cantidad de inóculo bacteriano en estudio, sobre el se depositó una gota de
agua oxigenada (H2O2). Siendo positiva la reacción si se desprenden burbujas.
b) Prueba de la oxidasa: permite detectar la actividad del citocromo C, esta actividad
se determina mediante la oxidación de un reactivo indicador como el tetra-metil-parafenilendiamina y se traduce por un color que va desde el rosa al púrpura. Técnica: sobre
un papel filtro se depositó una pequeña cantidad de inóculo bacteriano en estudio y a
continuación se depositaran 2 gotas de la solución al 0,5% del reactivo tetra-metil-para
fenilendiamina. Una reacción positiva se traduce por una coloración rosada a violeta
oscuro en la zona del papel en que fue depositado el inóculo bacteriano.
c) Prueba de reducción de Nitratos: la reducción del nitrato a nitrito o nitrógeno es
realizada por los microorganismos anaerobios facultativos, mediante una respiración
anaerobia, en la cual el último aceptor de hidrógeno en la cadena respiratoria es el
nitrato. Técnica: se sembró por picadura una pequeña cantidad de inóculo bacteriano
en estudio, en un tubo que contiene agar nitrato semisólido e incubar los tubos
sembrados a 23 °C por 24 hrs. Luego del período de incubación la reducción del nitrato
se detectara agregando al contenido del tubo 0,5 mL de la solución A y B del reactivo
nitrato. La prueba es positiva cuando el contenido del tubo se torna de color violeta a
café ladrillo.
17
d) Prueba del Rojo Metilo: permite determinar si el microorganismo en estudio realiza
fermentación fórmica tipo ácido mixta. Técnica: se siembra un inóculo de la bacteria en
estudio en tubos que contienen caldo glucosado. Una vez sembrados los tubos se
incuban a 23 °C por 24 hrs y luego se detecta la producción de los ácidos orgánicos
agregando a los tubos 10 gotas del reactivo de Rojo Metilo. La reacción es positiva si el
contenido del tubo se torna de color rojo.
3.2.5.2 Tinciones
a) Tinción de Gram.: permitirá determinar la reacción al Gram de los
microorganismos, según el tipo de pared celular que presentan. Además, permite
determinar la morfología y agrupación que presentan las bacterias. Técnica: en un porta
objeto, se extendió y fijo en un mechero una pequeña cantidad de inóculo bacteriano en
estudio, luego se tiñó con violeta genciana por 2 minutos, se lavó, para agregar lugol
por 1 min, se eliminó el lugol y se volvió a lavar, posteriormente se decoloró por 20 seg
con alcohol- acetona, se lavó y agregó safranina al 0,25% por 10 seg. Finalmente se
lavó y se secó la preparación para ser observada al microscopio.
18
4. RESULTADOS
4.1. Determinación del crecimiento de las cepas celulolíticas a distintas
concentraciones en las épocas de invierno y primavera.
Cuantitativamente el crecimiento de las colonias de las cepas celulolíticas se determinó
de acuerdo al punto 3.2.4 de Material y Métodos. En la Tabla 1, se muestra el promedio
de tres mediciones realizadas a cada colonia.
Tabla 1. Medición de las colonias de las cepas bacterianas recolectadas en invierno y
primavera, determinado en agar celulosa a dos concentraciones (5 y 35%).
Cepas
Invierno
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Agar celulosa en porcentaje
(%)
5
35
A
L
A
L
(mm) (mm) (mm) (mm)
4,4
4,9
5,4
5,7
1,0
0,7
1,0
0,8
2,8
3,3
0,7
0,7
4,5
6,2
1,4
1,6
4,4
5,5
1,1
1,3
5,6
6,0
1,1
1,9
3,7
5,2
1,3
1,5
4,2
5,3
1,9
2,0
5,4
6,1
1,5
1,6
2,2
3,3
1,6
1,7
AC = agar celulosa. A = ancho. L = largo.
Cepas
Primavera
1’
2’
3’
4’
5’
6’
7’
8’
9’
10’
Agar celulosa en porcentaje
(%)
5
35
A
L
A
L
(mm) (mm) (mm) (mm)
4,1
4,2
4,3
5,8
2,0
2,0
2,5
3,3
5,7
6,6
2,0
2,4
4,2
5,4
3,2
3,7
4,0
5,0
1,6
1,6
4,7
5,6
4,2
4,4
4,6
5,2
1,4
1,6
4,0
4,9
2,0
2,3
4,4
5,3
0,7
0,8
5,4
6,4
2,2
2,8
19
En la Tabla 1, matemáticamente se observa que para los tamaños de las colonias existen
diferencias, tanto a las concentraciones de AC ensayadas (5 versus 35%), como al
origen de la cepa bacteriana en cuanto a época se refiere (invierno y primavera). Por
ejemplo, para la cepa 1 al comparar el ancho promedio de las colonias en AC al 5% (4,4
mm) versus el obtenido al 35% (1,0mm), la diferencia es de 3,4 mm a favor del
crecimiento a 5%, es decir a una concentración de 5% de celulosa se obtuvieron siempre
colonias de mayor ancho y largo. Si se comparan los resultados a una misma
concentración pero de acuerdo a la época de muestreo de la colonia, así se tiene que, el
ancho de algunas colonias obtenidas en invierno a una concentración de un 5%, se les
determinaron los menores anchos (3,7; 2,8 y 2,2 mm) versus la totalidad de las cepas de
primavera cultivadas a la misma concentración de celulosa. Para mayor información ver
Anexo 7.1 y 7.2
En la Figura 6 se muestran los valores obtenidos de acuerdo al crecimiento de las
colonias bacterianas, sometidas a distintas concentraciones de celulosa de acuerdo a las
Colonias bacterianas
épocas de la recolección de muestras (invierno y primavera).
180
160
140
120
Invierno
100
Primavera
80
60
40
20
0
2%AC
5%AC
10%AC
Concentracionesde celulosa
15%AC
35%AC
Figura 6. Crecimiento de las colonias bacterianas recolectadas en dos épocas del año
(invierno y primavera) sometidas a diversas concentraciones de celulosa. AC = agar
celulosa.
20
En la Figura 6, se observa que la concentración de celulosa es un factor que limita el
crecimiento de las colonias bacterianas, se observa una disminución gradual la mayor
cantidad de colonias (168 = 100 %) se obtuvo en agar celulosa (AC) al 2% mientras que
la menor cantidad de colonias (10 = 6.0 %) se obtuvo en AC al 35%, para ambas épocas
de muestreo. Para mayor detalle ver anexo 7.3.
4.2. Determinación taxonómica de bacterias celulolíticas hasta el rango género.
En la Tabla 2 se indican los géneros bacterianos los cuales se afiliaron las 20 cepas que
crecieron a una concentración de celulosa de 35% en AC.
Como se puede observar en la Tabla 2 la distribución de las 20 cepas bacterianas, se
restringió a tres géneros, a saber: Bacillus (bacilos Gram positivos esporulados, catalasa
positiva), Pseudomonas y Zooglea (bacilos Gram negativos, no esporulados, catalasa
positiva o débilmente positiva). El mayor número de cepas (17) pertenece al género
Zooglea y el menor número de cepas (1) a Bacillus.
21
Tabla 2. Géneros bacterianos asignados a las cepas cultivadas en AC a 35%
Numero de cepa
Género bacteriano
1
Bacillus
2
Zooglea
3
Zooglea
4
Zooglea
5
Zooglea
6
Zooglea
7
Zooglea
8
Zooglea
9
Zooglea
10
Zooglea
11
Zooglea
12
Zooglea
13
Zooglea
14
Pseudomonas
15
Zooglea
16
Zooglea
17
Zooglea
18
19
Pseudomonas
Zooglea
20
Zooglea
AC = agar celulosa
22
4.2.1 Características de las taxas determinadas
a) Bacillus: Bacilos rectos de 0,3 – 2,2 x 1,2 – 7,0 um. Forman endosporas como
estructura de resistencia. Gram positivos. Movilidad por flagelos. Quimiorganótrofos.
Metabolismo tipo respiratorio ó fermentativo, oxígeno como aceptor terminal de
electrones, en algunas especies puede ser reemplazado por el nitrato. Catalasa positiva,
oxidasa negativa. Crecen a un óptimo de 25 °C. Son considerados saprofitos.
Distribuidos en suelos, aguas dulces y salada. (Buchanan et al., 1974)
b) Pseudomonas: Bacilos rectos o curvos de 0,5 – 1 x 1,5 – 4 um. No forman
estructuras de resistencia. Gram negativos. Movilidad ocurre por flagelos polares.
Quimiorganótrofos. Metabolismo tipo respiratorio no fermentativo, oxígeno como
aceptor terminal de electrones. Algunos pueden utilizar el nitrato como aceptor de
electrones. Catalasa positiva, oxidasa positiva o débilmente negativa. Crecen en un
óptimo de 30 °C. Distribuidos ampliamente en suelos, agua dulce y salada
mineralizando materia orgánica. (Buchanan et al., 1974)
c) Zooglea: Bacilos de 0,5 – 1,0 x 1,0 x 3,0 um. Gram. negativos, sin estructuras de
resistencia. Movilidad por un único flagelo polar. Quimiorganótrofos. Metabolismo tipo
respiratorio no fermentativo, oxígeno ó nitrato como aceptor terminal de electrones.
Catalasa débilmente positiva, oxidasa positiva. Crecen en un óptimo de 28 – 37 °C.
Colonias sin pigmentos, capaces de formar flóculos. Distribuidos de manera libre en
aguas dulces y residuales. (Buchanan et al., 1974)
23
5. DISCUSION
5.1. Evaluar la actividad microbiana de las cepas celulolíticas a diferentes
concentraciones de celulosa.
Al comparar los resultados obtenidos en el punto 4.1, Figura 6 se determinó el
crecimiento de las colonias bacterianas en dos épocas del año (invierno y primavera)
sometidas a diversas concentraciones de celulosa, donde al inicio del muestreo se
obtuvo la mayor presencia colonias (168=100%) al 2% en agar celulosa (AC) para cada
época de muestreo, al ir aumentando paulatinamente la concentración del sustrato se
observó una baja considerable en la presencia de colonias al 5%, (85=50,6% en invierno
y 90=53,6% para primavera) 10%, (66=39,3% y 68=40,4%) 15%, (30=17,9% y
35=20,8) y por último al 35% en AC (10= 6% para ambas épocas). Lo que señala que
no existen diferencias al comparar el crecimiento de colonias bacterianas de acuerdo a
las épocas de muestreo.
Según los resultados, en el punto 4.1, Tabla 1 se determinó el crecimiento de diez
colonias de cepas celulolíticas que lograron crecer a una concentración de 35% en agar
celulosa (AC) para las épocas de invierno y primavera. El crecimiento de las colonias
bacterianas a una concentración de 5% en AC se estimó sobre los 4 mm en cuanto al
ancho y por sobre los 5 mm en cuanto a largo, con excepción de las cepas 3 (2,8 x 3,3
mm) y 10 (2,2 x 3,3 mm), que no superaron estos valores. Considerando estos
resultados y comparándolos con los obtenidos por Mikán y Castellanos (2004), donde el
crecimiento de las cepas bacterianas al 2% en Carboximetilcelulosa (CMC), no
superaron los 3 mm tanto de ancho como largo, se puede determinar que las colonias
24
bacterianas seleccionadas cuentan con una buena capacidad para degradar e hidrolizar la
celulosa. Otro estudio realizado por Ortiz-Caro et al (2010), obtuvo un crecimiento de
las colonias bacterianas sobre los 7 mm de largo como ancho en CMC. Si bien estos
resultados son inferiores a los obtenidos en el presente ensayo en cuanto al largo de las
cepas bacterianas celulolíticas, hay que tener en cuenta que la medición de estas
colonias se realizó al 5% en AC, por ende si las mediciones se hubieran realizados al
2% en AC se podría haber estimado un crecimiento similar o superior a los obtenidos
por Ortiz-Caro et al (2010). Por otra parte, al realizar una comparación en cuanto al
crecimiento en AC 5 y 35% se pudo determinar que al aumentar drásticamente la
concentración de celulosa el crecimiento de las colonias bacterianas se vio perjudicado
por la saturación del medio, como es el caso de todas las cepas ensayadas para ambas
épocas de muestreo. Por ejemplo en el caso de la cepa 1, donde al comparar el ancho
promedio de la colonia en AC al 5% (4,4 mm), versus el obtenido al 35% (1,0 mm), se
encontró diferencias de 3,4 mm a favor del crecimiento al 5% de celulosa. De acuerdo a
esto Wierzba y Nabrdalik (2007) da a entender que la gran actividad celulolítica de
ciertas especies se explica por la alta capacidad de sintetizar enzimas (como celulasas)
que llevan a cabo la hidrólisis de la celulosa y otros polisacáridos. Además propone que
la eficacia y la descomposición de la celulosa depende de la cantidad y la calidad de las
bacterias empleadas. Esto indica que al aumentar la concentración del sustrato las
colonias bacterianas privilegian la síntesis de exoenzimas en vez del crecimiento de las
colonias como tal; sería de gran importancia profundizar en estudios posteriores en la
medición, tanto de los halos de degradación como la determinación de la actividad de
las celulasas, para poder determinar con mayor exactitud si las colonias bacterianas
aisladas presentan un potencial en cuanto a producción de enzimas celulolíticas. Cabe
señalar que existe muy poca información en cuanto a degradación de celulosa en medios
25
saturados. Autores como Castillo-Vázquez et al (2011), Mikán y Castellanos (2004),
Ortiz-Caro et al (2010) y Wierzba y Nabrdalik (2007), realizaron estudios donde sólo se
determinó el crecimiento de las cepas bacterianas a un 2% en CMC, haciendo difícil
comparar los resultados a un 35% en AC.
5.2. Taxonomía de las bacterias celulolíticas aisladas desde muestras de agua.
En el presente estudio, las 20 cepas bacterianas aisladas desde medios con un 35% de
celulosa se clasificaron taxonomicamente en 3 géneros de acuerdo al Manual de
Bergey’s de 1974.
Siendo el género Zooglea el más frecuente (17), en una nueva revisión bibliográfica
realizada según Dworkin et al (2006) este género todavía se encuentra vigente siendo
considerados dentro de la familia Pseudomonaceae, creciendo en ambientes acuáticos
generalmente en aguas residuales industriales y domiciliarias, ricas en oxígeno y
nutrientes orgánicos removiéndolos y degradándolos a productos inocuos. Sin embargo
Botello et al (2005); Dworkin et al (2006) y Mafla (2011) señalan que en aguas costeras
están encargadas de la formación de lodos, encontrándolos en una masa bacteriana
denominada flóculos o matriz zoogleal. Si bien no se a logrado encontrar estudios de la
participación del género Zooglea en la degradación de celulosa en ambientes acuáticos.
El presente ensayo propone que es posible aislar este género y que como tal es un
excelente degradador de celulosa en ambientes acuáticos, por lo que sería de vital
importancia profundizar en estudios posteriores en una descripción taxonómica más
minuciosa sobre este género puesto que solo se conoce su participación en aguas
residuales contaminadas.
26
Los géneros determinados como Bacillus (1) y Pseudomonas (2) en el presente estudio
coinciden con los estudios realizados por Díaz et al., (2007), Heck et al., (2002),
Viviano et al.,(2011) y Wierzba y Nabrdalik (2007) donde se logró aislar y determinar
la capacidad celulolítica de estos géneros bacterianos en muestras de agua.
27
6. CONCLUSIONES
De acuerdo a los resultados presentados y discutidos se desprenden las siguientes
conclusiones:
1. Independiente de la estación de muestreo, del tipo de muestra de agua y de la
época de recolección, es posible aislar desde aguas del río Calle-Calle, sector
Pishuinco, bacterias celulolíticas.
2. Del total de las cepas bacterianas (336) para ambas épocas, el 52% de la cepas se
consideran celulolíticas logrando crecer a un 5% de celulosa, mientras que sólo
el 6% de la muestra se considera celulolíticas a un 35% de celulosa.
3. El mayor crecimiento de las colonias de las cepas bacterianas se obtuvo a una
concentración al 5% en agar celulosa, obteniendo crecimientos sobre 4 mm de
ancho y sobre 5 mm en cuanto a largo.
4. Taxonómicamente, las cepas bacterianas celulolíticas se afiliaron a tres géneros
correspondientes a Bacillus, Pseudomonas y Zooglea.
De acuerdo a lo indicado la hipótesis de trabajo se rechaza ya que no fue posible aislar
más de un 60% de cepas bacterianas celulolíticas. Sólo se pudo obtener un 52% en
condiciones controladas de laboratorio.
28
7. BIBLIOGRAFIA.
Barrera, C., Carlosama, P. & Flores, P. (2009). Aislamiento, selección y preservación
de microorganismos celulolíticos a partir de residuos vegetales en compost
generados en un cultivo crisantemo. Proyecto de Microbiología Industrial.
Facultad de Ciencias Químicas. Universidad Central del Ecuador. 2-4p.
Botello, A., Von Osten, J., Gold-Bouchot, G. & Agraz-Hernández, C. (2005). Golfo de
México contaminación e impacto ambiental: diagnóstico y tendencias.
Universidad Autónoma de Tabasco. 508p.
Buchanan, R. & Gibbons, N. (1974). Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology.
Editorial Baltimore. Williams & Wilkins. Philadelphia. USA. 217-252; 529538pp.
Castillo-Vázquez, P., Ortiz-Caro, M., Nevárez-Moorillón, G., Quinteros-Ramos, A.,
Ballinas-Casarrubias, Ma., Paredes-Lopez, O., Calvillo, C. & Rascón-Cruz, Q.
(2011). Caracterización de bacterias degradadoras de celulosa y almidón.
Universidad Autónoma de Chihuahua. Facultad de Ciencias Químicas. 4-9 p.
Consultora en ingeniería y desarrollo de proyectos en recursos naturales, energía y
transporte. (CADE-IDEPE). (2004). Diagnostico y clasificación de los cuerpos de
agua según objetivos de calidad. Cuenca del río Valdivia. Gobierno de Chile.
Ministerio de obras publicas. Dirección general de aguas. 8, 10, 22, 57pp.
Carrillo, L. (2003). Microbiología Agrícola. Universidad Nacional de Salta Argentina.
Capitulo 3. 3-8p. http://www.unsa.edu.ar/matbib (consultado el 22/06/2011).
29
Chávez- Pacheco, J., Martínez, S., Contreras, M. & Escamilla, E. (2004). Celulosa
bacteriana en Glucanobacter Xylinum: Biosíntesis y aplicaciones. Revista
especializada en Ciencias Químico-Biológicas, 7:18-25. Universidad Nacional
Autónoma de México.
Diaz-Borrego, L., Dupontt, J., Espina, K., Rincón, N. & Atencio, L. (2007). Utilización
de sustratos orgánicos y resistencia a metales pesados por bacterias asociadas a
Lemna spp. Boletín del centro de investigaciones biológicas. 41: 27-42p.
Dworkin, J., Falkow, S., Rosenberg, E., Scheifler, K. & Stackebrandt, E. (2006). The
Prokaryotes. Third Edition. Editorial Springer Science. New York. USA. Volumen
2: 579-585 y Volumen 7: 579-585.
Dyer, K. (2001). Estuarine Circulation. Editorial University of Plymouth, UK. 852854p.
Fuenzalida, K., (2006). Comparación cuali-cuantitativa de bacterias cromógenas
aisladas de dos cuerpos de agua de la provincia de Valdivia. Tesis de grado para
optar al Grado de Licenciado en Ciencias Biológicas. Facultad de Ciencias.
Universidad Austral de Chile. 3-9, 16-18p.
Gaitán, B. & Pérez, P. (2007). Aislamiento y evaluación de microorganismos
celulolíticos a partir de residuos vegetales frescos y en composta generados en un
cultivo de crisantemo (Dendranthema grandiflora). Pontificia Universidad
Javierana. Bogotá. Colombia. 7-14p.
30
Google
Earth.
Software
de
imágenes
satelitales.
http://www.google.es/intl/es/earth/index.html. Fecha de consulta 30-09-2010.
Guevara, C., Páez, A., Zambrano, M. (2003). Determinación de actividad celulolíticas y
establecimiento de un consorcio bacteriano aislado de diferentes regiones y
sustratos del país. Pontificia Universidad Javierana. Bogotá Colombia. 4p.
Heck, J., Hertz, P. & Ayub, M. (2002). Cellulase and Xilanase production by isolated
Amazon Bacillus strains using soybean industrial residue based solid-state
cultivation. Brazilian Journal of Microbiology 33: 213-218p.
Heldt, H. (1997). Plant Biochemistry and Molecular Biology Oxford University Press.
7p.
Madigan, M., Martinko, J., Parker, J. (1998) Biología de los Microorganismos. Décima
edición. Editorial Prentice Hall, Madrid, España. 145-147p.
Mafla, X. (2010). Análisis y mejora de los procesos biológicos para la rehabilitación de
la piscina de lodos activados (PLA) de la refinería estatal esmeraldas (REE).
Departamento de ciencias de la vida ingeniería en biotecnología. Sangolquí.
Ecuador. 4-10p.
Maïmouna, C., Desnues, A., Bouvy, M., Sime-ngando, T., Verling, E. & Bettarel, Y.
(2008). Effects of freshwater and seawater mixing on virio and bacterioplankton in
tropical estuary. Freshwater Biology, 1154-1162 p.
31
Mejía, T., Mujica, F., González, A., Ortega, J., (2002). Protínas con afinidad a celulosa:
una herramienta en biotecnologia. Avance y perspectiva. 21: 267-271
Mikán, J. & Castellanos, D. (2004). Screening para el aislamiento y caracterización de
microorganismos y enzimas potencialmente útiles para la degradación de
celulosas y hemicelulosas. Revista Colombiana de Biotecnología, 6: 58-71.
Ortiz-Caro, M., Muñoz-Castellanos, L., Ballinas-Cassarrubias, L., Calvillo, C. &
Rascón-Cruz, Q. (2010). Caracterización de bacterias degradadoras de celulosa.
VII Congreso del noreste y III Nacional de Ciencias Alimentarias y Biotecnología.
Universidad de Sonora. 98-99p.
Ramírez, J. (2003) Línea base en calidad de agua para la cuenca del río Valdivia.
Trabajo de titulación para optar al titulo de ingeniero de ejecución en ambiente.
Departamento de ingeniería geográfica. Universidad de Santiago de Chile. 7-10p.
Romaní, A., Artigas, J., Camacho, A., Graca, M. & Pascoal, C. (2009) Conceptos y
técnicas en ecología fluvial. Ecología de la Universidad del País Vasco. 170p.
Sigge, D., (2005). Freshwater microbiology: diversity and dynamic interaction of
microorganisms in the freshwater enviroment. John Wiley & Sons Ltd, The
Atrium, Southern Gate, Chichester, West Sussex PO19 8SQ, England 1-537p.
Viviano, F., Medina, L., Ramos, N., Amaíz, L. & Valbuena, O. (2011). Degradación de
celulosa por bacterias de aguas termale de Las Trincheras, Venezuela. Revista
Latinoamericana de Biotecnologia Ambiental 2(1): 18-29p.
32
Wierzba, S. & Nabrdalik, M. (2007). Biodegradation of cellulose in bottom sediments
of Turawa lake. Physicochemical Problems of Mineral Processing, 41: 227-235.
33
8. ANEXOS
8.1 Medición de las colonias de las cepas bacterianas recolectadas en invierno,
determinado en agar celulosa a cuatro concentraciones (5, 10, 15 y 35%)
Cepa
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
5% AC
Diametro mm.
Ancho
Largo
4,4
5,4
4,9
5,7
2,8
3,3
4,5
6,2
4,4
5,5
5,6
6,0
3,7
5,2
4,2
5,3
5,4
6,1
2,2
3,3
10% AC
Diametro mm.
Ancho
Largo
3,0
3,5
3,0
5,1
4,9
5,5
3,4
5,5
1,8
2,2
3,7
5,5
1,3
1,8
1,7
2,5
2,2
2,5
4,0
5,5
15% AC
Diametro mm.
Ancho
Largo
4,8
5,7
5,2
5,7
3,8
4,0
5,3
5,5
3,6
4,0
3,2
3,5
7,1
7,7
3,7
4,0
3,8
4,2
3,8
4,1
35% AC
Diametro mm.
Ancho
Largo
1,0
1,0
0,7
0,8
0,7
0,7
1,4
1,6
1,1
1,3
1,1
1,9
1,3
1,5
1,9
2,0
1,5
1,6
1,6
1,7
AC=agar celulosa
8.2 Medición de las colonias de las cepas bacterianas recolectadas en primavera,
determinado en agar celulosa a cuatro concentraciones (5, 10, 15 y 35%)
Cepa
1’
2’
3’
4’
5’
6’
7’
8’
9’
10’
5% AC
Diámetro mm.
Ancho
Largo
4,1
4,3
4,2
5,8
5,7
6,6
4,2
5,4
4,0
5,0
4,7
5,6
4,6
5,2
4,0
4,9
4,4
5,3
5,4
6,4
AC=agar celulosa
10% AC
Diámetro mm.
Ancho
Largo
1,2
2,1
3,0
3,2
3,8
4,3
3,8
4,0
1,0
1,8
2,4
2,5
3,6
4,3
2,5
3,2
3,6
4,7
3,2
3,9
15% AC
Diámetro mm.
Ancho
Largo
3,8
4,7
1,9
2,2
2,6
3,3
1,0
1,3
0,9
1,6
1,8
3,1
3,4
3,6
2,6
3,2
1,8
2,0
1,3
1,5
35% AC
Diámetro mm.
Ancho
Largo
2,0
2,5
2,0
3,3
2,0
2,4
3,2
3,7
1,6
1,6
4,2
4,4
1,4
1,6
2,0
2,3
0,7
0,8
2,2
2,8
34
8.3 Porcentaje total de cepas bacterianas obtenidas a distintas concentraciones de
celulosa en dos épocas de muestreo (invierno y primavera).
Número de Colonias
acorde a las épocas del
año (muestreos)
Concentración de agar celulosa (AC)
2%
168
5%
85
10%
15%
35%
Invierno
(100%)
168
(50,6%)
90
66 (39,3%)
30 (17,9%)
10 (6,0%)
Primavera
Porcentaje promedio
(100%)
100%
(53,6%)
52,1%
68 (40,5%)
39,9%
35 (20,8%)
19,4%
10 (6,0%)
6,0%
AC= agar celulosa