Redalyc.Clonación del cDNA del gen de la insulina humana en

Revista CENIC. Ciencias Biológicas
ISSN: 0253-5688
[email protected]
Centro Nacional de Investigaciones Científicas
Cuba
García Reyes, Berenice; Montes Horcasitas, María del Carmen; Ramos Ramírez, Emma Gloria; Ariza
Castolo, Armando; Pérez Vargas, Josefina; Gómez Guzmán, Octavio; Calva Calva, Graciano
Clonación del cDNA del gen de la insulina humana en raíces aéreas de Brassica oleracea var italica
(brócoli)
Revista CENIC. Ciencias Biológicas, vol. 41, 2010, pp. 1-9
Centro Nacional de Investigaciones Científicas
Ciudad de La Habana, Cuba
Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=181220509063
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Revista CENIC Ciencias Biológicas. 41, No. Especial, 2010
Cloning of the human insulin cDNA gene in hairy roots of Brassica oleracea var italica
(broccoli)
Clonación del cDNA del gen de la insulina humana en raíces aéreas de Brassica
oleracea var italica (brócoli)
Berenice García Reyes1, María del Carmen Montes Horcasitas1, Emma Gloria Ramos
Ramírez1, Armando Ariza Castolo2, Josefina Pérez Vargas3, Octavio Gómez Guzmán1, and
Graciano Calva Calva*,1
1
Biotecnología y Bioingeniería, Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto
Politécnico Nacional. Avenida Instituto Politécnico Nacional 2508, Colonia San Pedro
Zacatenco, México D. F. Código Postal 07360. Tel: 01 (55) 57473800 Ext. 4348.
[email protected], [email protected]
2
Química, Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico
Nacional. Avenida Instituto Politécnico Nacional 2508, Colonia San Pedro Zacatenco, México
D. F. Código Postal 07360. Tel: 01 (55) 57473800 Ext. 3727
3
Tecnológico de Estudios Superiores de Ecatepec. División Ingeniería Bioquímica, Posgrado
en Ingeniería Bioquímica. Av. Tecnológico S/N. Colonia Valle de Anáhuac, Ecatepec de
Morelos, Estado de México, Código Postal 55210. Tel: 50002300
RESUMEN. La insulina humana es una proteína de actividad hormonal que regula los
niveles de glucosa en sangre. Cuando la insulina falla se desarrolla el padecimiento
conocido como diabetes. La insulina se ha expresado en bacterias, levaduras, hongos,
células animales y sistemas vegetales por biotecnología vegetal. En este trabajo
presentamos los resultados del uso de raíces transformadas de Brassica oleracea var italica
(Brocoli) para producir insulina humana. Materiales y Métodos: El cDNA del correspondiente
gen humano fue transfectado a Brocoli via Agrobacterium rhizogenes LBA9402 con el vector
pCAMBIA1105.1. La transformación del tejido de raíces fue confirmada por PCR, reacciones
de restricción y ensayos de β-glucuronidasa. Resultados y Discusión: La presencia del cDNA
correspondiente a preproinsulina y proinsulina fue β-glucuronidasa positiva para varias de
las líneas. Aunque el rendimiento fue variable, cinco líneas mostraron valores apropiados
con potencial para ser usadas como modelo de estudio en la producción en biorreactores.
ABSTRACT. The human insulin is a protein with hormonal activity that regulates the glucose
levels in blood. When insulin fails appears the diabetes decease. Insulin has been expressed
in bacteria, yeast, fungi, animal cells, and in vegetal systems through plant biotechnology. In
this work we present the results of using hairy roots cultures of Brassica oleracea var italica
(Broccoli) to produce the human insulin. The cDNA from the corresponding human gen was
transfected into Broccoli via Agrobacterium rhizogenes LBA9402 with the pCAMBIA1105.1
vector. PCR, restriction reactions, and β-glucuronidase assay were used to demonstrate the
transformation of the hairy root tissue. The presence of the cDNA for preproinsulin and
proinsulin was β-glucuronidase assay positive for several strains. Although yield was
variable, five strains showed proper values with potential to be used as model to study the
production in bioreactors.
Palabras claves:: raíces transformadas, biotecnología vegetal, Insulina, proteínas
heterólogas, proteínas terapéuticas.
Keywords: hairy roots, plant biotechnology, Insulin, heterologous protein, therapeutic
proteins.
INTRODUCCION
La insulina es una proteína con actividad hormonal que regula los niveles de glucosa en la
sangre, aunque también participa en la regulación de otros procesos fisiológicos como la
utilización de algunos nutrientes, estimulación de la síntesis de glucógeno, aminoácidos,
proteínas y consumo de lípidos1. Las deficiencias en su modo de acción se dan cuando su
biosíntesis es insuficiente y deficiente, provocando alteraciones en sus funciones
fisiológicas, directamente la concentración de glucosa en la sangre, produciendo así el
padecimiento conocido como diabetes. Esta es una enfermedad metabólica crónica
caracterizada por alteraciones en metabolismo de la glucosa, grasas y proteínas. La insulina
humana recombinante se ha expresado en diversos organismos, incluyendo bacterias,
levadura, hongos, células y órganos de animales y plantas transgénicas2. Actualmente su
producción comercial se ha limitado a microorganismos como Escherichia coli y
Saccharomyces cerevisiae, sin embargo los sistemas basados en biotecnología vegetal en
algunos casos ofrecen ventajas tanto en producción, como en bioseguridad y economía.
Debido a ello, para varias proteínas con actividades biológicas la biotecnología vegetal se ha
propuesto como alternativa de producción real y económicamente viable3. Esas
biotecnologías basadas en plantas pueden utilizar plantas transgénicas completas o sus
células, tejidos u órganos cultivados en biorreactores de manera similar a los sistemas de
fermentación para microorganismos4. De lo anterior, en este trabajo se dan los resultados
sobre el establecimiento de cultivos de raíces transformadas para la producción de insulina
humana con el objetivo de coadyuvar a la creciente demanda de esta proteína debida al
aumento de la población que presenta problemas de diabetes. Como modelo vegetal se
utilizó Brassica oleracea var. italica debido a la disponibilidad de la metodología para su
transformación y su alta capacidad natural de acumulación de proteína.5
MATERIALES Y METODOS
cDNA
Se aisló a partir de la clona 3950204 (Open Biosystems, USA) de E. coli llevando el cDNA
del gen de la insulina humana (Ins) insertado en el plásmido pDNR-Lib. La extracción del
plásmido se llevo a cabo mediante el kit PureLinkTM (Invitrogen K2100-10). Una vez obtenido
el plásmido se determino su concentración y pureza haciendo una dilución 10:1000
plásmido-agua α y midiendo absorbancia en un espectrofotómetro CAMSPEC (mod. M330)
a 260 nm y 280 nm respectivamente. El cDNA se liberó del plásmido pDNR-Lib con las
enzimas de restricción EcoR I, y Xho I.
PCR
Para la amplificación por PCR se usó un termociclador TECHNE (mod. TC312) y el kit
PlatinumR Super Mix High Fidelity (Invitrogen 12532-016) bajo condiciones de 94 ºC 30 s de
desnaturalización, 60 ºC 1 minuto de alineamiento y 70 ºC 1 minuto de extensión, en 40
ciclos. Los oligos directo y reverso fueron diseñados en este trabajo y contienen en sus
secuencias bases correspondientes con la enzima Eco31 combinada con las enzimas Nco I,
Bgl II para los oligos directo y reverso respectivamente y finalmente en la secuencia se
incluyen bases que corresponden a las regiones del cDNA para preproinsulina y proinsulina
por separado.
Inserción del cDNA en pCAMBIA
Se recuperó el vector binario pCAMBIA 1105.1 de una cepa de E. coli (adquirido de la casa
CAMBIA.ORG) mediante el kit comercial de miniprep PureLinkTM (Invitrogen K2100-10). Una
vez obtenido el plásmido se caracterizó con varias enzimas de restricción que liberan
fragmentos conocidos observando los resultados por electroforesis en gel de agarosa. Las
enzimas de restricción Nco I, Bgl II y Eco31 I fueron usadas para generar extremos
cohesivos en el vector binario pCAMBIA1105.1 en una relación de 1:1 U de enzima-µDNA
para las enzimas Nco I, Bgl II (Figura 1A); y el cDNA amplificado anteriormente en una
relación 1.5:1 U de enzima-µDNA para la enzima Eco31.
Fig. 1. Vector binario pCAMBIA 1105.1 y comparación esquemática de los amplificados
preproinsulina y proinsulina utilizados para generar los constructos finales. (A) Vector
pCAMBIA 1105.1, (B) Amplificados preproinsulina y proinsulina. Los colores en los
fragmentos esperados representan las secuencias de la señal para translocación a retículo
endoplásmico (naranja), cadena B (verde), péptido C (negro) y cadena A (azul).
Una vez obtenido el DNA se comprobó que la reacción de restricción se efectuaba haciendo
una ligación entre los mismos fragmentos; vector-vector amplificado-amplificado y la
formación de los constructos, vector-preproinsulina y vector-proinsulina (Figura 1B). Se
utilizó una T4 DNA ligasa (Invitrogen 15224-025) y varias relaciones de vector-vector,
amplificado-amplificado y vector-amplificado observando los resultados por electroforesis en
gel de agarosa. Para la amplificación de los constructos obtenidos se usó la cepa de E.coli
DH5α transformada por electroporación utilizando las mezclas de ligación (vectorpreproinsulina y vector-proinsulina) y células electrocompetentes en una celda de
electroporación de 2mm bajo condiciones de 25 μF, 2.5 kV, 200 Ω por 25 ms. Se incubaron
por 3-4 hrs las células electroporadas y se propagaron en medio de cultivo LB (Luria-Bertani)
con estreptomicina (100 µg/ml). Se seleccionaron aleatoriamente clonas resultantes bajo
esta selección, para obtener el constructo por extracción plasmídica mediante el kit
PureLinkTM (Invitrogen K2100-10). Este plásmido se usó como templado para comprobar la
integración del amplificado de interés (preproinsulina y proinsulina) al vector pCAMBIA
1105.1 por PCR. Se selecciono una clona PCR positiva de cada constructo (pCppINS-bgr y
pCpINS-bgr) para extraer los constructos y transferirlos por electroporación a Agrobacterium.
Transformación de Agrobacterium
Se usó la cepa de Agrobacterium rhizogenes LBA9402 la cual contiene el plásmido pRi-1855
del tipo agropina,6,7 que induce la formación de raíces transformadas mediante la
transferencia del TRi-DNA de dicho plásmido. Dicha cepa transformada por electroporación,
bajo las condiciones ya mencionadas, resultó en cepas de Agrobacterium rhizogenes
pC1105.1, Agrobacterium rhizogenes pCppINS-bgr y Agrobacterium rhizogenes pCpINS-bgr.
La presencia de los plásmidos en las clonas correspondientes se llevo acabo de la misma
forma que con las clonas de E. coli. Estas cepas de Agrobacterium rhizogenes se usaron
para la transfección del T-DNA contenido en cada constructor a plántulas de Brócoli e inducir
líneas de raíces transformadas con el cDNA correspondiente.
Transfección del cDNA a Brócoli
Fueron plántulas de Brócoli obtenidas mediante la germinación de semillas en medio B5
(Gamborg; Sigma-Aldrich G5768) adicionado con vitaminas (Sigma-Aldrich M7150) y 1.8 g/l
de fitagel®. Las plántulas de 3-4 semanas de germinación y sin hojas verdaderas se usaron
para la transfección por punción, la cual desencadena las señales químicas entre plantaagrobacterium promoviendo la transfección del TRi-DNA del plásmido bacteriano al genoma
de la planta. 6 Por otro lado, plántulas mayores a un mes y con hojas verdaderas se usaron
para la obtención de explantes de raíces para el establecimiento de cultivos de raíces no
transformadas en medio SH (Schenk y Hildebrandt; Sigma-Aldrich S6765) adicionado con
vitaminas (Sigma-Aldrich S3766) y sin reguladores del crecimiento.
Prueba de la transformación del tejido radical
Se utilizó el ensayo de actividad de GUS colocando un fragmento de tejido radical en 230 µl
de buffer de tinción (50 mM NaHPO4 pH 7, 0.5 % Triton X-100, 10 mM EDTA) y 20 µl de XGluc (20 mM X-Gluc en DMF). Se sometió al vació por 10 min 3 veces, se incubo a 37 ºC 16
h y se observo el tejido bajo microscopio óptico a 25, 100, 160 y 200 X según el caso.
Prueba de la presencia del cDNA en el tejido vegetal
Se utilizó la amplificación por PCR de los fragmentos de preproinsulina y proinsulina con los
oligos correspondientes a partir del DNA genómico del tejido vegetal. Este se extrajo del
tejido mediante la técnica reportada por Rouhibakhsh,8 y se utilizo como templado para la
PCR utilizando un termociclador TECHNE (mod. TC312) con el kit PlatinumR Super Mix High
Fidelity (Invitrogen 12532-016), con las condiciones mencionadas arriba.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Obtención del cDNA
Con el uso de oligos diseñados para añadir al cDNA del gen ins la secuencia
correspondiente a las enzimas Nco I, Bgl II y Eco 31 I, la cual reconoce secuencia de
nucleotidos anteriores al sitio de corte y realiza el corte en las secuencias correspondientes
a los sitios de Nco I y Bgl II, se logró amplificar dos fragmentos contenidos en el cDNA del
gen ins con el tamaño de 495 y 364 pb correspondientes para la secuencia del cDNA de la
preproinsulina y proinsulina respectivamente (Figura 2). Estos dos amplificados fueron
denominados ppINS-bgr y pINS-bgr respectivamente. Debe señalarse que el cDNA del gen
ins corresponde a la secuencia de la preproinsulina, mientras el fragmento correspondiente
a la proinsulina carece de la región codificante para el péptido señal.
Fig. 2. Productos de PCR del vector pDNR-Lib-Ins amplificado con los oligos prepro y pro
insulina diseñados en este trabajo. Carril 1, ppINS-bgr; carril 2, pINS-bgr.
Inserción del cDNA en pCAMBIA
El vector pCAMBIA 1105.1 se digirió con las enzimas Nco I y Bgl II (Figura 1). Los sitios para
estas enzimas se encuentran después del promotor 35s y antes del gen GUSplus que
codifica para la β-glucuronidasa y son complementarios a los que poseen los fragmentos
ppINS-bgr y pINS-bgr amplificados arriba para la prepro y proinsulina. Después de la
restricción se procedió a establecer las condiciones para la ligación del vector con los
fragmentos. Se encontró que es necesario mantener una relación (µg) vector:fragmento de
4:1 y un exceso de la enzima de ligación utilizando 3 μl (Figura 3). Los plásmidos
resultantes fueron denominados pCppINS-bgr y pCpINS-bgr.
Fig. 3. Condiciones y productos de las reacciones de ligación del los fragmentos ppINS-bgr
y pINS-bgr con el vector pCAMBIA 1103.1 previamente digerido con las enzimas Nco I y Bgl
II. Los plásmidos resultantes se denominaron pCppINS-bgr y pCpINS-bgr para la prepro y
proinsulina respectivamente.
Clonación de los plásmidos pCppINS-bgr y pCpINS-bgr en E. Coli y Agrobacterium
Se clonaron en células electrocompetentes de Escherichia coli DH5α por electroporación.
Las clonas fueron propagadas en medio LB con estreptomicina y su transformación se
comprobó por extracción del DNA plasmídico y la amplificación de los fragmentos ppINS-bgr
y pINS-bgr por PCR con los oligos prepro y pro insulina (Figura 4). La presencia del cDNA
respectivo fue positiva en todas las clonas probadas. Además el fragmento preproinsulina
amplificado del vector pCppINS-bgr se sometió a restricción con la enzima Nco I liberando
un fragmento de 422 pb correspondiente al cDNA de preproinsulina desde el sitio ATG como
se esperaba (Figura 5). Esto se realizó primero en E. coli con la finalidad de aumentar y
conservar las construcciones para posteriormente generar las cepas correspondientes de
Agrobacterium rhizogenes para la transfección del cDNA a Brócoli. Las clonas resultantes de
Agrobacterium rhizogenes se seleccionaron como se describió para E. coli, sin embargo en
este caso se usó estreptomicina a una concentración cinco veces mayor.
Fig. 4. Amplificación por PCR de los fragmentos ppINS-bgr (A) y pINS-bgr (B) con los oligos
diseñados para la amplificación del cDNA de la preproinsulina y proinsulina a partir del DNA
plasmídico extraído de varias clonas de E. coli transformadas con las construcciones
pCppINS-bgr y pCpINS-bgr respectivamente.
Fig. 5. Liberación desde el sitio ATG del segmento del cDNA de 422 pb de la preproinsulina
por restricción con Nco I del fragmento obtenido por amplificación por PCR a partir del vector
pCppINS-bgr contenido en E. coli.
Inducción de raíces transformadas
Las plántulas con 3-4 semanas de edad consideradas como jóvenes fueron utilizadas para
la inducción de raíces aéreas por punción con la cepa silvestre de Agrobacterium rhizogenes
LBA9402 y con la misma transformada con el vector pCAMBIA 1105.1 y con los plasmidos
pCppINS-bgr y pCpINS-bgr (Figura 6). Los explantes de hipocotilo con raíces aéreas en el
punto de punción se incubaron en medio SH con cefotaxima para evitar la colonización de
Agrobacterium y propagar las raíces aéreas. De las raíces propagadas posteriormente se
establecieron cultivos en medio líquido (Figura 6-C). Paralelamente a estas actividades las
plántulas que no fueron punzadas y que alcanzaron mayor cantidad de raíces fueron
utilizadas para establecer líneas de raíces no transformadas en cultivo líquido, los cuales
fueron utilizadas como control (Figura 6-A).
Fig. 6. Cultivo de raíces no transformadas (A) y transformadas de Brócoli (C). B, plántulas
de Brócoli de 3-4 semanas de edad mostrando las raíces aéreas inducidas después de 2
semanas de haber sido punzadas con Agrobacterium.
Una vez que se establecieron los cultivos sumergidos de las líneas no transformadas y las
transformadas con Agrobacterium rhizogenes LBA9402 y con Agrobacterium rhizogenes
pCAMBIA 1105.1 y por otro lado con Agrobacterium rhizogenes
pCppINS-bgr y
Agrobacterium rhizogenes pCpINS-bgr se comparó la morfología de los tejidos de raíz de
cada línea, además se utilizó como presión de selección la resistencia a higromicina y se
seleccionaron con base a la reacción de GUS en todas las líneas (Figura 7).
Fig. 7. Diferencias morfológicas, de resistencia y de expresión de GUS en cultivos de raíces
no transformadas y transformadas con Agrobacterium rhizogenes LBA9402 y con
Agrobacterium rhizogenes pCAMBIA 1105.1. Las micrografías tomadas se realizaron a 100X
en todos los casos.
Los cultivos de raíces no transformadas mostraron un crecimiento típico, pilosidad normal y
sensibilidad a la higromicina, dado que únicamente se desarrollaron en ausencia de esta y al
aplicar la reacción GUS esta resultó negativa (Figura 7-A). Estos resultados fueron los
esperados debido a que estos cultivos no poseen resistencia a higromicina ni contienen el
gen de la β-glucuronidasa. Por otra parte, los cultivos de raíces transformadas inducidas con
la cepa Agrobacterium rhizogenes LBA9402 silvestre mostraron las características de un
crecimiento acelerado y una alta pilosidad debido a la transferencia del TRi-DNA del
plásmido pRi1855 que posee esta cepa. Por supuesto estos cultivos también mostraron
sensibilidad a higromicina y dan reacción de GUS negativa (Figura 7-B). Esto debido a que a
pesar de ser cultivos de raíces transformadas, no poseen la capacidad de resistencia a
higromicina ni de la expresión de β-glucuronidasa para la reacción GUS que están en el
vector pCAMBIA 1105.1 y por lo tanto en los plásmidos pCppINS-bgr y pCpINS-bgr. Así, los
cultivos de raíces inducidas con la cepa Agrobacterium rhizogenes pCAMBIA 1105.1
mostraron las características de un crecimiento acelerado y alta pilosidad, resistencia a
higromicina y actividad de β-glucuronidasa, razón por la cual estos cultivos crecen y se
desarrollan en presencia de higromicina y fueron GUS positivos (Figura 7-C).
Los resultados del análisis de la actividad de β-glucuronidasa en varias 9 líneas de raíces
aéreas transformadas con la construcción pCppINS-bgr que lleva el cDNA para
proproinsulina, y de 5 líneas de raíces transformadas con la construción pCpINS-bgr,
mostraron que varias de ellas expresaban positivamente el gen GUS (Figura 8). De ellas, las
líneas pp7, pp8 y pp9 que contienen el cDNA para preproinsulina, y las p1, p2, p3 y p4 que
contiene el cDNA para proinsulina mostraron expresión fuerte de β-glucuronidasa y por lo
tanto deben estar expresando también el cDNA correspondiente. Las diferencias en los
niveles de expresión se puede deber a la manera aleatoria en la que es insertado al genoma
el fragmento de T-DNA que a su vez contiene el cDNA. Esto podría explicar por que la
actividad de β-glucuronidasa fue positiva tanto en el tejido como en el medio de cultivo de
algunas líneas (pp8, p2, p3, p4 y p5), mientras en otras como las líneas pp7 y pp9 la
expresión fue intracelular, e inclusivo diferencial dentro del tejido. Estos resultados
demuestra que el rendimiento de los productos de le expresión del DNA foráneo es muy
variable, sin embargo varias de las líneas demuestran expresión suficiente que podrían
permitir dar seguimiento a las proteínas correspondientes e iniciar estudios para la
producción en biorreactores.
Fig. 8. Ensayo de GUS para las líneas de raíces transformadas con Agrobacterium
rhizogenes pCppINS-bgr y Agrobacterium rhizogenes pCpINS-bgr. Obsérvese la expresión
de β-glucuronidasa tanto en el tejido como en el medio para la línea pp8, p2, p3, p4, p5 a
diferencia de las líneas pp7 y pp9 que expresan actividad de β-glucuronidasa sólo en
algunas partes del tejido y no el medio de reacción.
CONCLUSIONES
Se establecieron cultivos varias líneas de raíces transformadas con los fragmentos del cDNA
del gen Ins que codifican para la preopro y proinsulina. Los niveles de expresión evaluados
por la actividad de β-glucuronidasa son adecuados para dar seguimiento a las estructuras de
las proteínas correspondiente y utilizar estas líneas en estudios encaminados a su
producción en biorreactores de laboratorio.
AGRADECIMIENTOS
El primer autor agradece a CONACYT por la beca otorgada para realizar el presente
proyecto.
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