Puesta a punto de un protocolo de agroinfección en Calibrachoa excellens. El uso de Agrobacterium rhizogenes como una herramienta para el mejoramiento en ornamentales. Gennarelli M. C. 1, Ríos W. 1, Alvarez M. A. 2, Escandón A. S.1 1 Instituto de Floricultura INTA-Castelar. De los Reseros y Nicolas Reppetto s/n, Hurlingham. 2 Fundación Pablo Cassará. Saladillo 2452. Capital. Email: [email protected] Introducción El género Calibrachoa (Solanaceae) comprende 24 especies. En la Argentina existen 12 especies nativas de este género. Entre ellas C. excellens tiene hábito de crecimiento arbustivo o subarbustivo decumbente, es nativa de las provincias de Corrientes y Misiones, en Argentina, y Brasil , encontrándose distribuida hasta los 500 metros de altitud. La planta en su hábitat natural no posee ramificaciones en la base, presenta entrenudos largos y posee una flor muy bonita de tamaño interesante y color fucsia llamativo. A. rhizogenes es una bacteria patógena que habita en el suelo y provoca la enfermedad denominada: raíces en cabellera o "hairy roots", con proliferación de raíces en el sitio de infección. Se produce por la transferencia de un T-DNA del plásmido Ri de la bacteria al genoma de la planta. El T-DNA contiene genes que codifican para la síntesis de opinas, que a su vez codifican para la síntesis de hormonas vegetales y su metabolismo, y los denominados oncogenes, que estimulan la división celular en el sitio de infección. En muchas especies es posible regenerar plantas de las raíces sujetas a la agroinfección, las cuales muestran características fenotípicas particulares. Las alteraciones producidas en las plantas infectadas pueden ser atractivas desde el punto de vista ornamental. Se ha observado: enanismo, ruptura de dominancia apical tanto en tallos como raíces, alteración de la forma de las flores y las hojas, mayor capacidad de enraizamiento, disminución en la producción de polen y semillas y esterilidad en algunos casos. Los genes responsables de estas alteraciones fenotípicas se denominan rol y se los conoce como A, B, C y D. Reportes previos demuestran que A. rhizogenes es una poderosa herramienta alternativa para ser aplicada en el mejoramiento de ornamentales (para revisión ver Casanova et al, 2005). En este contexto, la aplicación A. rhizogenes ofrece ventajas que merecen ser destacadas: 1) no precisa de genes selectivos ni reporteros de la transformación genética, 2) la aparición y el desarrollo de las raíces a partir de los explantos blanco, como señal indicativa de la ocurrencia de un potencial evento positivo de transformación y, 3) en razón que se trata de la aplicación de organismos salvajes para la obtención de transgénicos, estos productos no caen bajo la normativa reguladora de los organismos vegetales genéticamente modificados (OVGMs) (Burachic, com. personal) Objetivo El objetivo del presente trabajo es la puesta a punto de un protocolo de transformación de C. excellens a través del empleo de Agrobacterium rhizogenes. Materiales y Métodos Material vegetal Segmentos nodales de ejemplares de Calibrachoa excellens cultivados bajo condiciones de invernáculo, fueron esterilizados por método estándar de Etanol/lavandina (70% y 9.35g/l de Cl2 activo), respectivamente. Los explantos se cultivaron en medio MS (Murashige and Skoog, 1962) sólido (7g/l de agar Sigma), con 30% de sacarosa y pH 5,7, que fue esterilizado en autoclave a 121ºC 1 atm, por 15 min. La cámara de cultivo se mantuvo a 23 ± 2 ºC y 16 horas luz. Las plantas obtenidas se multiplicaron in vitro y fueron utilizadas como fuente de explantos blanco de Agrobacterium rhizogenes (hojas y porciones de entrenudo libres de la yema axilar). Cepas bacterianas Las cepas de A. rhizogenes LBA 15834, LBA 8490, LMG 155 y A13 fueron usadas para inducir la formación de raíces. Se hicieron crecer (24 hs) en medio YEB (5g/l extracto de carne, 1g/l extracto de levadura, 5g/l peptona, 5g/l sacarosa, 2mM sulfato de magnesio) suplementado con el antibiótico Rifampicina (50 µg/ml) para la cepa LBA 15834 y sin antibiótico para las otras cepas, durante 48 horas a 23±2º C en agitador rotatorio (120rpm). Producción de raíces transformadas La agroinfección se llevó a cabo provocando heridas en los explantos (“n”= 30 por tratamiento) con una aguja embebida en la suspensión de agrobacterias. Para el cocultivo, los explantos tratados y los controles fueron sembrados en placas de Petri conteniendo medio MS sólido diluido al medio e incubados durante 5 días a 23±2ºC en condiciones de oscuridad. Luego se subcultivaron al mismo medio, pero con el agregado de 500 µg/ml de antibiótico Cefotaxima (Duncan®). El ensayo de transformación fue repetido dos veces. Multiplicación de raíces Se seleccionaron las raíces putativamente transformadas en base a su crecimiento activo y con formación de ramificaciones laterales. Se subcultivaron cada 10 días al mismo medio base, la concentración de Cefotaxima se redujo a la mitad cada 3 semanas hasta su completa eliminación del medio de cultivo. Para la propagación de las raíces tratadas y sus controles, ápices de 5 mm de longitud fueron escindidos y cultivados en el mismo medio (MS 0,5X) con y sin el agregado de agar Sigma (7, 0 g/l) y libre de reguladores del crecimiento y Cefotaxima. El cultivo se llevó a cabo en frascos tipo erlenmeyer de 150 ml de capacidad, conteniendo 70 ml de medio. Por su parte, los ápices de raíces cultivados en medio sólido fueron mantenidos en placas de Petri. Las condiciones de cultivo para ambos tratamientos fueron las mismas que se indicaron anteriormente. Resultados y Discusión La Tabla 1 sintetiza los resultados obtenidos, en los que se observan diferencias en las respuestas, tanto entre los explantos utilizados como en la virulencia de las cepas de Agrobacterium probadas; los entrenudos de Calibrachoa excellens no desarrollaron callos ni raíces con ninguna de las cepas evaluadas y fueron descartados por falta de respuesta. Las diferentes cepas de Agrobacterium probadas no mostraron el mismo grado de virulencia, en efecto, las porciones de hojas tratadas con las cepas LMG 155 y LBA 8490 no desarrollaron callos ni raíces y los cultivos fueron descartados entre los 60 y 90 días. Tabla1. Respuesta rizogénica de los explantos de C. excellens frente a distintas cepas de A. rhizogenes. +) Indica la presencia de raíces y su abundancia. -) Ausencia. NE: no ensayado. Cepas LBA 15834 A13 LBA 8490 LMG 155 Exp. Resp. callos raíces callos raíces callos raíces callos raíces Hojas ++++ ++++ ++ + - - ++ - Entrenudos - - - - NE NE NE NE La cepa A13, considerada de gran virulencia por otros autores (Godo et al, 1997) indujo el desarrollo de callos y de una raíz sin ramificaciones y de crecimiento lento, por lo que se infiere que se trató de un falso positivo. Con relación a la cepa LBA15834, a las tres semanas post infección, las hojas tratadas con esta cepa presentaron el desarrollo de callos y raíces cortas y con abundante desarrollo pilífero. La Figura 1 muestra la evolución de las hojas tratadas con la cepa LBA 15834. La Figura 1a, muestra el aspecto inicial de los explantos agroinfectados, donde se observa el desarrollo incipiente de callos, pelos y raíces. La Figura 1b, muestra una raíz aislada del explanto original en una etapa temprana del subcultivo. En la Figura 1c se observa el desarrollo de una raíz agroinfectada con relación al control no tratado luego de 20 días de cultivo, ambas en un medio libre de antibiótico. Por último la Figura 1d muestra el cultivo en medio líquido de una raíz tratada. Se recuperaron 20 eventos putativos de transformación, con una eficiencia, medida como la cantidad de eventos de transformación recuperados con relación al número de explantos agroinfectados, de 20/60. Estos resultados estarían indicando una selectividad respecto a la infección en las cepas de Agrobacterium. En efecto, si bien las cepas LMG 155 y la A13 se mostraron aptas para la agroinfección en rosa (Vereecke, C., com. personal) y Antirrhinum majus (Hoschino et al, 1998), bajo las condiciones de este experimento C. excellens mostró ser refractaria a la infección de las cepas en cuestión. Una de las características del fenotipo de C. excellens es su hábito de crecimiento decumbente; el uso de la tecnología de A. rhizogenes permitiría la obtención de nuevas variedades de C. excellens de mayor compacidad, a lo que se le sumaría la posibilidad de obtener fenotipos con diferentes formas de hojas y flores. a b c d Figura 1. Evolución del cultivo de las hojas de C. excellens tratadas con la cepa LBA 15834 de A. rhizogenes. a) Etapa temprana del cultivo de una hoja agroinfectada, las flechas indican raíces originadas en diferentes eventos de transformación. b) Raíz aislada del explanto original, cultivada en medio sólido. c) Comparación de los desarrollos, luego de 20 días de cultivo, de una raíz agroinfectada y de una control. d) Cultivo líquido de raíces tratadas. Conclusiones -En nuestro país este es el primer trabajo donde se aplica A. rhizogenes en especies de potencial ornamental. -En el presente ensayo la cepa LBA 15834 de A. rhizogenes mostró ser la más virulenta. -Si bien falta la confirmación por medio de un análisis molecular, las raíces recuperadas muestran el típico aspecto de la enfermedad de raíces en cabellera, observándose una ausencia de dominancia apical, gran vigor en el crecimiento y plagiotropismo. -Los resultados obtenidos han demostrado ser muy promisorios para futuros ensayos de transformación. Bibliografía Casanova E, et al. Influence of rol genes in floriculture. Biotechnol Adv. 2005. 23 (1): 3-39. Godo T, et al. Fertile transgenic plants of Nierembergia Scoparia Sendtner obtained by a mikimopine type strain of Agrobacterium rhizogenes. Sci. Hortic.1997; 68:101–11. Hoschino Y, Türkan I, Mii M. Transgenic bialaphos-resistant snapdragon (Antirrhinum majus L.) Produced by Agrobacterium rhizogenes transformation. Sci Hortic 1998;76:37-57. Murashige T, Skoog F. Revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 1962. 15: 473-497. Tepfer D. Transformation of several species of higher plants by Agrobacterium rhizogenes: Sexual transmission of the transformed genotype and phenotype. Cell. 1984; 37:959– 67.