2.1. Clonación del AON

Tipos de vectores de donación
Los plásmidos y los fagos pueden transportar fragmentos pequeños de ADN, por lo que son
útiles para clonar genomas pequeños.
Cuando el tamaño del genoma
es mayor, se utilizan unos vectores de clonación especiales,
formados por ADN del fago A y
ADN de un plásmido que se llaman cósmidos y que pueden
transportar fragmentos de ADN
mucho mayores.
Todavía existen otros vectores
con mayor capacidad de transportar fragmentos, como los
YAC y los BAC, que son cromosomas artificiales de levaduras
y de bacterias respectivamente.
2.1. Clonación del AON
La donación de un fragmento
de ADN consiste en la obtención
muchas copias idénticas de dicho fragmento.
El primer paso en el proceso de clonación del ADN consiste en la construcción
de un ADN recombinante formado por el fragmento de ADN que se desea clonar y un vector de donación.
Un vector de donación
entrar en una bacteria
plicarse en ella.
es una molécula de ADN pequeña capaz de
(normalmente
Escherichia coli) y de autorre-
Existen diversas clases de vectores de clonación: los plásmidos, los virus bacteriófagos A, los cósmidos, los YAC y los BAC. El procedimiento general de clonación es esencialmente similar en todos ellos, pero debido a su mayor facilidad de manejo, los plásmidos son los vectores de clonación más utilizados. El
proceso de donación es el siguiente:
•
Obtención de los plásmidos recombinantes (ADN que se desea clonar
unido al plásmido) e incubación con un cultivo de bacterias, en las condiciones adecuadas para que cada una de ellas pueda incorporar como máximo un plásmido recombinante. Este proceso se denomina transformación.
•
Eliminación de las bacterias que no hayan sido transformadas. Esto es posible gracias a que los plásmidos que se utilizan como vectores de clonación
llevan un gen de resistencia a un antibiótico, que hace que las bacterias que
portan el plásmido recombinante sean resistentes y capaces de sobrevivir en
un medio al que se añada dicho antibiótico. Las demás, que no portan el
plásmido recombinante y, por tanto, no han sido transformadas, mueren.
•
Mantenimiento de las bacterias transformadas en condiciones de crecimiento. Conforme las bacterias se duplican, se duplica también el número
de plásmidos recombinantes y los fragmentos de ADN que llevan insertado.
Esquema
del procesode clanaciónde un
fragmento
deADN enunplásmido.
Trasvarios ciclosde crecimiento,
cada bacteria •
transformada
originaungrupodebacterias
idénticas,
queproceden
deella(clan)y que
crecen
juntasformando
unacolonia.
Todas las bacterias de un clan heredan el mismo plásmido recombinante
el mismo fragmento de ADN insertado. El conjunto de copias de un fragmento de ADN se denomina clan de ADN.
,
,
Cultivo de Escherichia coli
Bacteria no~trañ;formada
(muere en medio
de cultivo con antibiótico)
Bacteria transformada
(sobrevive en medio
de cultivo con antibiótic
Transformación
Rotura de las bacterias
Fragmento de ADN
para donar
de
Plásmido recombinante
y aislamiento de los plásmidos
recombinantes.
Clon de bacterias
transformadas