VECTORES DE CLONACIÓN

VECTORES DE CLONACIÓN
Tipos de vectores
-Plásmidos
-Derivados de bacteriófagos
-Cósmidos
- De alta capacidad (P1, PAC, BAC, YAC)
PLÁSMIDOS
-Origen de replicación, genes de resistencia a antibióticos y metales
pesados, de utilización de compuestos, etc.
-Para utilización en ingeniería genética: modificaciones: adición de un
polilinker (sitio de clonación múltiple: MCS), sistemas de selección de
recombinantes.
- Origen de replicación: ejerce un control sobre el número de copias del
plásmido en la célula; control relajado (alto número de copias, independiente
de síntesis de proteína, se regula por ARN y ARN antisentido), control
astringente (bajo número, interviene la proteína del gen repA).
Fenómeno de incompatibilidad:
- En una bacteria donde hay un plásmido no pueden entrar otros plásmidos que
pertenezcan al mismo tipo de incompatibilidad: es decir, que tengan el mismo origen de
replicación. Importante en experimentos de clonación
Plásmidos
pBR322
- Marcadores de selección.
- Un marcador de selección que permite que crezcan sólo las bacterias que
llevan el plásmido: transformantes. Resistencia a ampicilina (ampR), a
cloramfenicol (CmR)
- Un marcador que permite seleccionar aquellos clones donde el plásmido es
recombinante, tiene inserto. En ese marcador se encuentra el MCS
- Inactivación de un gen de resistencia: hace a la bacteria sensible a
un antibiótico, ej. pBR322, gen de resistencia a tetraciclina (tetR)
- -complementación: la bacteria es deficiente en la actividad galactosidasa (gen lacZ), el plásmido tiene un fragmento de la galactosidasa que complementa esa deficiencia (complementación); en presencia de X-gal e IPTG forma colonias
azules. Cuando se introduce un inserto el fragmento de la galactosidasa es interrumpido, no hay complementación: colonias
blancas. pBluescript, pUC18
- Selección directa: presencia de un gen letal en el vector, sólo si es
interrumpido (inactivado) por el inserto la bacteria puede crecer.
Selección de recombinantes en vectores plasmídicos, -complementación
VECTORES DERIVADOS DEL
FAGO 
VECTORES DERIVADOS DEL FAGO 
Ciclo del fago 
- Ciclo lítico y lisogénico
- Ciclo lítico: el ADN se replica y forma
concatémeros. 48 kb
- Pueden empaquetarse moléculas de ADN
con 78% - 105% de la longitud del genoma
- Región dispensable: no afecta al ciclo lítico
- Vectores derivados de :
- Sustitución o reemplazamiento
- Inserción
- Genes red y gam confieren fenotipo Spi+
VECTORES DERIVADOS DEL FAGO 
Vectores de sustitución
8-23 kb
Vectores de inserción
0,5-10 kb
-gt11
SP6
SfiI
(43'0)
XbaI
XhoI
EcoRI
BamHI
NotI
SacI
SacI
NotI
BamHI
EcoRI
XhoI
XbaI
T7
(0'0)
Sfi I
brazo izquierdo (20 kpb)
región central
(14 kpb)
dispensable
λ-GEM-12
brazo
(9 kpb)
derecho
VECTORES DE ALTA CAPACIDAD
CÓSMIDOS
- Plásmidos que contienen los sitios
cos del fago  para empaquetamiento
in vitro
- Pueden infectar E. coli, pero no
lisarla, se comportan como plásmidos,
selección por resistencia a ampicilina
- Admiten tamaños entre 35-45 kb
- El ADN para la genoteca se digiere
parcial con Sau3AI y se desfosforila, o
por selección de tamaño en gel de
PFGE
- Rastreo: igual que una genoteca en
plásmidos
BACs: BACTERIAL ARTIFICIAL CHROMOSOMES
- Molécula de ADN circular de unas 7 kb con un marcador de selección (CmR), un
replicón derivado del factor F (oriS) y tres genes que aseuran la partición de las copias
entre las céllas hijas. Sitio de clonación BamHI en fragmento lacZ: permite selección por
color. No hay límite de tamaño para el empaquetamiento: tamaño medio 120 kb. El ADN
para la genoteca se digiere parcial con Sau3AI y se hace selección de tamaño en gel de
PFGE. El vector se corta con BamHI y se desfosforila.
- Rastreo: mediante hibridación de arrays ordenados o por PCR en pooled libraries
YACs: YEAST ARTIFICIAL CHROMOSOMES
- Molécula de ADN lineal con los elementos de un cromosoma de levaduras que le
permiten funcionar como tal: origen de replicación ARS1, telómeros. Un marcador de
selección en cada brazo que asegura que el DNA foráneo esté flanqueado por ambos
brazos. Selección de transformantes usando una cepa auxótrofa de uridina y triptófano, y
de recombinantes mediante color. Tamaño medio de los insertos 250-400 kb.