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10.2 PCR anidada
10.2.1 iniciadores utilizados
Iniciador
Secuencia
Temp. de
Contenido de G+C
Temp. de hibridación
Tamaño del
fusión (°C)
(%)
óptima (°C)
amplicón (pb)
52
1015
52
883
53
900
62
944
69
591
67
767
Gen
AH1 A
CAGATGCAGACACAATATGT
HA
55
40
AH1 FII
AAACCGGCAATGGCTCCAAA
HA
72
50
AH3 A
CAGATTGAAGTGACTAATGC
HA
55
40
AH3 DII
GTTTCTCTGGTACATTCCGC
HA
62
50
BHA A
GTGACTGGTGTGATACCACT
HA
56
50
BHA DII
TGTTTTCACCCATATTGGGC
HA
65
45
AH1 B
ATAGGCTACCATGCGAACAA
HA
63
45
AH1 EII
CTTAGTCCTGTAACCATCCT
HA
55
45
AH3 B
AGCAAAGCTTTCAGCAACTG
HA
63
45
AHE CII
GCTTCCATTTGGAGTGATGC
HA
65
50
BHA B
CATTTTGCAAATCTCAAAGC
HA
61
35
BHA CII
TGGAGGCAATCTGCTTCACC
HA
68
55
Referencia: Stock et al, 1998
10.2.2 Mezcla de reacción de la primera PCR
La mezcla de reacción se preparó en tubos de 250 µL:

4 µL de 10x PCR buffer

4 µL de 10x iniciadores de la primera amplificación

0.2 µL de Taq DNA polimerasa de Roche

32 µL de agua destilada

10 µL de la solución de transcripción inversa realizada en el paso anterior.
10.2.3 Mezcla de reacción de la segunda PCR
La mezcla de reacción se preparó en tubos de 250 µL:

4.8 µL de 10x PCR buffer

4.8 µL de 10x iniciadores de la segunda amplificación

4.8 µL de 2 mM dNTPs

0.2 µL de Taq DNA polimerasa

33.6 µL de agua destilada

2 µL de los productos de la primera amplificación
10.2.4 Solución 10x PCR Buffer

100 µL de solución 1 M TRIS– HCl con pH de 8.3

25 µL de solución 2 M de KCl

35 µL de solución 1 M de MgCl2

840 µL de H2O destilada
10.2.5 Solución 2 mM dNTPs

10 µL de solución 100 mM de cada nucléotido

460 µL de H2O DEPC al 0.1%
10.2.6 Solución 10x Iniciadores de la primera amplificación
Inicialmente se prepararon soluciones stock de los iniciadores, diluyéndose 10 µL
de la solución concentrada 0.5 mM en 190 µL de H20 destilada. Para preparan la solución
de 10x Iniciadores, se

10 µL de solución stock de cada iniciador

440 µL de H2O destilada
10.2.7 Solución 10x Iniciadores de la segunda amplificación
Inicialmente se prepararon soluciones stock de los iniciadores, diluyéndose 20 µL
de la solución concentrada 0.5 mM en 180 µL de H20 destilada. Para preparan la solución
de 10x iniciadores, se

50 µL de solución stock de cada iniciador

200 µL de H2O destilada