papel de las neuronas glutamatérgicas del área del hipotálamo

PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATOLICA DE CHILE
Facultad de Ciencias Biológicas
Programa de doctorado en Ciencias Biológicas
Mención Biología Celular y Molecular
PAPEL DE LAS NEURONAS GLUTAMATÉRGICAS DEL
ÁREA DEL HIPOTÁLAMO LATERAL EN LA RECAÍDA A
COCAÍNA INDUCIDA POR ESTRÉS
VERÓNICA ANDREA NOCHES GALLARDO
MAYO 2014
PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATOLICA DE CHILE
Facultad de Ciencias Biológicas
Programa de doctorado en Ciencias Biológicas
Mención Biología Celular y Molecular
PAPEL DE LAS NEURONAS GLUTAMATÉRGICAS DEL
ÁREA DEL HIPOTÁLAMO LATERAL EN LA RECAÍDA A
COCAÍNA INDUCIDA POR ESTRÉS
Tesis entregada a la Pontificia Universidad Católica de Chile como parte de los
requisitos para optar al Grado de Doctor en Ciencias con mención en Biología
Celular y Molecular
Por
VERÓNICA ANDREA NOCHES GALLARDO
DIRECTORA DE TESIS:
DRA. KATIA GYSLING CASELLI
COMISION DE TESIS:
DRA. MARÍA ESTELA ANDRÉS C.
DR. FERNANDO TORREALBA L.
DR. LUIS AGUAYO H.
MAYO 2014
Dedicada a Mis Amores
Andrés Salgado Saavedra y
Amanda Salgado Noches
AGRADECIMIENTOS
Quiero agradecer de manera muy especial a la Dra. Katia Gysling, quien ha sido una gran
mentora para llevar a cabo este trabajo de tesis. Agradezco su ayuda y variadas discusiones en
temas científicos, que lograron ser un gran pilar en mi desarrollo profesional. También doy
gracias por su preocupación constante, no sólo en el ámbito laboral, si no, también en el ámbito
personal.
También agradezco a la Dra. María Estela Andrés, por su gran ayuda en la discusión del
trabajo de tesis y también por su cariño demostrado a través de su preocupación en mi vida
personal.
A los miembros de la comisión de tesis, por sus innumerables aportes durante la defensa
del proyecto de tesis, el avance de tesis y finalmente la defensa de tesis.
A la gran familia del Laboratorio de Biología Celular y Molecular de la Adicción, con
quienes compartí grandes años de mi vida y formación. Gracias a todos sus miembros por el
apoyo incondicional En especial a la Sra. Lucy Chacoff, Sra. Soledad García y Don Héctor. Sin
duda, el laboratorio no podría funcionar sin su gran ayuda.
A mis amigos y compañeros de laboratorio Raquel Ibañez, Georgina Renard, Paula Slater,
Javier Fuenzalida, Roberto Munita, Elias Blanco, Francisca Martínez y Katherine Araya, por
todos los momentos de discusión científica y las muchas experiencias de vida compartidas; por
las jornadas llenas de alegrías y a veces penas, que hacían del laboratorio un segundo hogar.
A la Dra. Ulrike Heberlein por recibirme en su laboratorio del Ernest Gallo Clinic and
Research Center at UCSF. San Francisco‐California. Estados Unidos. Durante mi pasantía
doctoral el año 2011.
A mi amado esposo Andrés, quien ha estado en todo éste proceso, ha sido testigo de mis
alegrías y frustraciones siendo un apoyo incondicional en cada paso.
A mi bella familia, quienes gracias a Dios han estado presentes en cada momento. A mi
padre quien me enseñó la perseverancia, a mi madre quien me enseñó a tener fortaleza, a mi
hermana quien me enseñó a mirar la vida con optimismo y alegría. A mis sobrinos Antonia y
Felipe, quienes me enseñan día a día la simplicidad del cariño. A mis suegros y cuñados, gracias
por su constante preocupación y apoyo.
FINANCIAMIENTO
Esta tesis recibió los siguientes apoyos de financiamiento:
1. Beca para estudio de doctorado en Chile, CONICYT, años 2008-2011
2. Beca de Extensión para estudios de Doctorado en Chile, CONICYT, año 2012
3. Beca de residencia para alumnos de doctorado, Vicerrectoría de Investigación (VRI), P.
Universidad Católica de Chile, años 2012-2013.
4. Beneficio de asistencia a congresos internacionales, Vicerrectoría de Investigación (VRI)
y Dirección de Postgrado, P. Universidad Católica de Chile. Año 2012.
5. Beca ISN Committee for Aid and Education in Neurochemistry, apoyo Pasantía Doctoral
en el Extranjero.
6. Proyectos Núcleo Milenio Estrés y Adicción: NEDA (P10-063-F), Fondecyt (1110392)
de la Dra. Katia Gysling.
7. Beca MECESUP, apoyo Pasantía Doctoral en el Extranjero, año 2011.
8. Beca Participación en reuniones de sociedades científicas nacionales y en congresos
internacionales, a realizarse en Chile año académico 2010. CONICYT.
9. Beca VRI para asistencia a congreso internacional, año 2012.
10. Beca de apoyo del Departamento de Ciencias Biológicas año 2013.
INDICE DE CONTENIDOS
INDICE DE FIGURAS …………………………………………………………………….. iv
INDICE DE TABLAS……………………………………………………………………….
v
ABREVIATURAS…………………………………………………………………………… vi
RESUMEN…………………………………………………………………………………... xi
ABSTRACT………………………………………………………………………………… xiv
I. INTRODUCCION………………………………………………………………………… 1
1.1 Adicción y el Sistema Dopaminérgico Mesocorticolímbico……………………….……
1
1.2 Adicción a Cocaína …………………………………………………………..…….…...
5
1.3. Recaída a la búsqueda de droga por estrés ………………………………………........
8
1.3.1. Estrés………………………………………………………...............................……
8
1.3.2. Hormona Liberadora de Corticotrofina……………………………………………..
9
1.3.3. Hormona Liberadora de Corticotrofina y Adicción ………………………………..
10
1.3.4. ¿Desde qué área proviene el glutamato responsable de la recaída a la búsqueda de droga
en respuesta a estímulos estresantes? ……………………………………………………..
13
1.4. Área del Hipotálamo Lateral …………………………………………………………
14
1.4.1. Área del Hipotálamo Lateral y Adicción …………………………………………..
15
HIPÓTESIS ………………………………………………………………………………..
17
OBJETIVO GENERAL .…………………………………………………………………..
17
OBJETIVOS ESPECÍFICOS ……………………………………………………………...
17
II. MATERIALES Y MÉTODOS …………………………………………………………
18
ii
2.1. Droga y Animales ……………………………………………………………………..
18
2.2. Preferencia de Lugar Condicionado (CPP) ……………………………………..…….
18
2.3. Microdiálisis …………………………………………………………………………... 20
2.4. Cromatografía Liquida de Alta Eficiencia (HPLC) ……………………………..........
23
2.5. Cirugía para implantación de cánulas guía …………………………………………… 24
2.6. Inactivación reversible de las neuronas del HL …………………………………….… 25
2.7. Microdiálisis en ratas freely moving durante CPP ……………………………………. 27
2.8. Preparación de Sinaptosomas ………………………………………………………...
28
2.9. Inmunofluorescencia en Sinaptosomas ………………………………………………
29
2.10. Extracción de Proteínas ……………………………………………………………..
30
2. 11. Western Blot ...………………………………………………………………………
33
2.12. RT-PCR ……………………………………………………………………………..
35
2.13. Análisis Estadísticos ………………………………………………………………...
37
III. RESULTADOS ………………………………………………………………………..
38
3.1. Conexión anatómica entre el HLA y el VTA ………………………………………...
38
3.2. CRH-R2 se expresa en aferencias glutamatérgicas al VTA provenientes del HLA….
40
3.3. En la muestra de sinaptosomas del VTA se observan varicosidades reselladas que
contienen Orx ………………………………………………………………………………. 47
3.4. CPP como modelo de recaída a la búsqueda de cocaína inducida por estrés ………… 49
3.5. Liberación de glutamato y DA en ratas freely moving durante CPP …………………
50
3.6. Participación de las neuronas provenientes de HLA y que expresan CRH-R2 en la recaída
a la búsqueda de droga inducida por estrés ………………………………………………… 54
IV. DISCUSION……………………………………………………………………………. 59
iii
4.1. Aferencia glutamatérgica desde el HLA hacia el VTA ……………………….……… 59
4.2.
Expresión de CRH-R2 en terminales glutamatérgicos del VTA que provienen del
HLA…...…………………………………………………………………………….……… 60
4.3. Varicosomas del VTA inmunoreactivos para orexina ………………………………… 63
4.4. Recaída a la búsqueda de cocaína inducida por estrés en CPP ……………………….. 64
4.5. Microdiálisis freely moving en ratas sometidas a CPP ………………………………… 65
4.6. La actividad de las neuronas del HLA es esencial para la recaída a la búsqueda de la
droga inducida por estrés …………………………….…………………………………….. 66
4.7. Modelo de trabajo ……………………………………………………………………… 67
V. CONCLUSIONES ………………………………………………………………………. 71
VI. PROYECCIONES ……………………………………………………………………… 72
VII. ANEXOS ………………………………………………………………………………. 73
7.1. Condicionamiento en CPP de ratas canuladas versus ratas no canuladas .…………….. 73
7.2. Silenciamiento de CRH-R2 mediante shRNA …………………………………………. 73
Ensayos in vitro ……………………………………………………………………… 76
Ensayos in vivo ……………………………………………………………………… 78
REFERENCIAS …………………………………………………………………………….. 84
iv
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Circuito Dopaminérgico Mesocorticolímbico …………………..………………… 4
Figura 2. Mecanismo de Acción de la Cocaína ……………………….…………………….. 7
Figura 3. Distribución de CRH y CRH-R1, CRH-R2 y sus ligandos …….……………….… 11
Figura 4. Preferencia de Lugar Condicionado (CPP) ...……………………..……………… 21
Figura 5. Postura representativa de sondas de microdiálisis ………………………………... 22
Figura 6. Postura representativa de cánulas guías ………………………………………….. 26
Figura 7. Esquema de preparación Sinaptosomal ...……………………..………………….. 31
Figura 8. Liberación de glutamato en el VTA inducida por la estimulación del HLA.……... 39
Figura 9. Análisis de la preparación de sinaptosomas de VTA …………………………….. 42
Figura 10. Inmunofluorescencia en Sinaptosomas provenientes del VTA de rata ..………... 43
Figura 11. RT-PCR de mRNA extraído del HLA y Western Blot de proteínas extraídas del
HLA y de sinaptosomas del VTA …………………………………………………………... 46
Figura 12. Inmunofluorescencia de Varicosomas ………………………………………….. 48
Figura 13: Preferencia de Lugar Condicionado (CPP) ……………………………………... 51
Figura 14: Comportamiento individual en CPP …………………………………………….. 52
Figura 15. Liberación de glutamato y DA en ratas freely moving durante CPP .................... 53
Figura 16. Inactivación de las neuronas del área del HL de ratas condicionadas a cocaína.... 55
Figura 17. Comportamiento individual en CPP de ratas B/M y Vehículo tratadas con
cocaína.................................................................................................................................
57
v
Figura 18. Efecto de la administración intra VTA de CRH sobre los niveles extracelulares de
glutamato en el VTA de ratas previamente expuestas al protocolo de administración repetida
de cocaína ..............................................................................................................................
58
Figura 19. Modelo del papel de las neuronas glutamatérgicas del HLA en la recaída a cocaína
inducida por estrés ................................................................................................................. 70
Figura 20. Ratas canuladas antes del condicionamiento versus ratas no canuladas .............. 75
Figura 21. Mapa del Vector Lentiviral de CRH-R2 .............................................................. 77
Figura 22. Expresión endógena de CRH-R2 en células PC12 ............................................... 80
Figura 23. Expresión de GFP en células PC12 infectadas con virus de shRNA CRH-R2 y
shRNA SCR ........................................................................................................................... 81
Figura 24. Knockdown de CRH-R2 en células PC12 determinado por Q-PCR ...................
82
Figura 25. Inyección de Lentivirus en el HLA ...................................................................... 83
INDICE DE TABLAS
Tabla I. Soluciones para la preparación de Sinaptosomas ………………………………….. 31
Tabla II. Gradiente de Percoll ……………………………………………………………….. 31
Tabla III. Anticuerpos utilizados para Inmunofluorescencia de Sinaptosomas …………….. 32
Tabla IV. Anticuerpos utilizados para Western Blot……………………………………….. 34
Tabla V. Condiciones de Reacción de PCR y Partidores …………………………………... 36
vi
ABREVIATURAS
aa
Aminoácidos
ACTH
Hormona Adenocorticotrofina
Amb
Núcleo Ambiguo
AMG
Amígdala
AMPA
ácido alfa-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiónico
AON
Núcleo Olfatorio Anterior
AP
Área Postrema
Apit
Pitutaria Anterior
ARC
Núcleo Arcuato
B/M
Baclofeno/Muscimol
Basal G
Ganglio Basal
BLA
Amigdala Basolateral
BNST
Lecho de la Estría Terminal
bp
pares de bases
BSA
Albúmina Sérica de Bovino
CC
Cuerpo Calloso
cDNA
DNA complementario
CeA
Núcleo Central de la Amigdala
Cereb
Cerebelo
CingCx
Corteza Cingulada
CoA
Núcleo Cortical de la Amigdala
Cocaína-HCL
Clorhidrato de Cocaína
vii
CPP
Preferencia de Lugar Condicionado
CRH
Hormona Liberadora de Corticotrofina
CRH-BP
Proteína de Unión a CRH
CRH-R 1 y 2
Receptor 1 y 2 de CRH
CyC
Ciclofilina
CH3CN
Acetonitrilo
DA
Dopamina
DAérgico
Dopaminérgico
DAT
Transportador de Dopamina
DBB
Banda diagonal de Broca
DG
Giro Dentado
DMH
Hipotálamo Dorsomedial
DNA
Ádico Desoxirribonucléico
EDTA
Ácido Etilendiaminotetraacético
EPSCs
Corrientes Excitatorias Postsinápticas
FrCx
Corteza Frontal
FS
Footshock
GABA
Ácido Gamma-aminobutírico
GPCR
Receptores acoplados a Proteína G
HL
Hipotálamo Lateral
HLA
Área del Hipotálamo Lateral
HPA
Hipotálamo-Pituitaria-Adrenal
HPLC
Cromatografía Liquida de Alta Eficiencia
viii
i.c.v
intra cerebro ventricular
i.p
intra peritoneal
IC
Coliculo Inferior
IO
Olivo Inferior
IPit
Pitutaria Intermediaria
KD
knockdown
KDa
Kilo Dalton
KRF
Krebs-Ringer Fosfato
LC
Locus Cerulius
LDT
Núcleo Laterodorsal Tegmental
LSO
Oliva Lateral Superior
LTP
Potenciación a Largo Plazo
MA
Núcleo Medial de la Amígdala
MePO
Área Preóptica Mediana
mRNA
RNA mensajero
MS
Septum Medial
NAc
Núcleo Acumbens
NMDA
N-metil D-aspartato
NMDAR
Receptor N-metil-D-aspartato
NTS
Núcleo del Tracto Solitario
OB
Bulbo Olfatorio
OccCx
Corteza Occipital
Orx
Orexina
ix
Ox1R y 2R
Receptores de Orexina 1 y 2
PAG
Periacueductal Gray
ParCx
Corteza Parietal
PBS
Buffer Fosfato Salino
PCA
Acido Perclórico
PCR
Reacción en Cadena de la Polimerasa
PeF
Hipotálamo perifornical
PFA
Paraformaldehído
PFC
Corteza Prefrontal
PG
Pontino Gray
PKC
Fosfolipasa C-proteína quinasa C
PPit
Pitutaria Posterior
PPT
Núcleo pedúnculopontino
PSD95
Densidad Post Sináptica de 95KDa
R
Núcleo Rojo
RN
Núcleo Rafe
RNA
Ácido Ribonucléico
rRNA
RNA ribosomal
RT
Transcriptasa Reversa
RT-PCR
Transcripción Reversa- Reacción en Cadena de la Polimerasa
S.E.M
Error estándar
SC
Coliculo Superior
SCR
shRNA scramble
x
SDS
Dodecil Sulfato de Sodio
SGII
Secretogranina II
shRNA
short hairpin RNA
SIN I
Sinapsina I
SN
Sustancia Nigra
SNC
Sistema Nervioso Central
SON
Núcleo Supraóptico
SOP
Núcleo Paraolivary Superior
SP5n
Núcleo Trigémino Espinal
STX I
Sintaxina I
Thal
Tálamo
UCN
Urocortina
v/v
porcentaje volumen/volumen
Veh
Vehículo
vGluT
Transportador Vesicular de Glutamato
VMH
Hipotálamo Ventromedial
VP
Pálido Ventral
VTA
Área del Tegmento Ventral
xi
RESUMEN
La búsqueda compulsiva de drogas de abuso lleva consigo cambios fisiopatológicos en
el cerebro de quién es adicto. Un adicto que lleva largos periodos de abstinencia, puede recaer
a la búsqueda de drogas, ya sea por claves ambientales, por consumo de una nueva dosis de
droga o por estímulos estresantes. En los últimos años se ha avanzado mucho en el
conocimiento de los mecanismos neurobiológicos que subyacen a la adicción. Sin embargo,
aún no se conocen el/los mecanismo(s) que determinan las alteraciones neuroquímicas
responsables de la recaída a la búsqueda de drogas por estímulos estresantes.
Las drogas psicoestimulantes, tienen como blanco de acción, principalmente el Área
del Tegmento Ventral (VTA) del cerebro medio, específicamente las neuronas dopaminérgicas
que conforman el sistema dopaminérgico (DAérgico) mesocorticolímbico inervando la corteza
prefrontal y estructuras límbicas sub-corticales que contribuyen a la adquisición y expresión
de conductas relacionadas con la recompensa, novedad, motivación y con el poder adictivo de
las drogas de abuso. El sistema DAérgico mesocorticolímbico también es activado por estrés a
través de mecanismos mediados por la liberación de la hormona liberadora de corticotrofina
(CRH). El sistema CRH se ha involucrado en la recaída a la búsqueda de droga gatillada por
estrés. Se ha mostrado que un estímulo estresante induce la liberación de CRH en VTA y que
éste gatilla un aumento de glutamato en este núcleo, sólo en ratas con experiencia a cocaína.
La evidencia indica que CRH induce la liberación de glutamato y la consecuente liberación
aumentada de dopamina, a través de la activación de receptores CRH-R2.
xii
El VTA recibe aferencias glutamatérgicas desde regiones corticales y subcorticales. La mayor
aferencia glutamatérgica al VTA, de origen subcortical, se origina en el área del hipotálamo
lateral (HLA).
Se ha mostrado que la aferencia glutamatérgica del HLA al VTA es crítica en la
recaída por claves ambientales y que la exposición a estímulos estresantes potencia la recaída
al consumo de drogas inducida por claves ambientales.
En base a los antecedentes disponibles, surgen las siguientes preguntas: ¿Desde qué
núcleo proviene el glutamato liberado por la acción de CRH en el VTA?, ¿Qué aferencia(s)
glutamatérgica(s) al VTA, expresa(n) CRH-R2? Para contestar estas preguntas se propuso la
siguiente hipótesis de trabajo: “Las aferencias glutamatérgicas del área del hipotálamo lateral
al VTA, juegan un papel clave en la recaída al consumo de cocaína inducida por estrés”.
Para desarrollar esta hipótesis en primer lugar se determinó si los terminales
glutamatérgicos provenientes del HLA expresan el receptor CRH-R2 utilizando una
preparación sinaptosomal del VTA de ratas e inmunofluorescencia para CRH-R2, Orexina
(Orx) como marcador de neuronas del HLA y vGluT2.
En segundo lugar se analizó la
liberación de glutamato y dopamina en el VTA mediante microdiálisis in vivo en ratas que
recaen a la búsqueda de droga por estrés usando el paradigma de preferencia de lugar
condicionado (CPP). En Tercer lugar se determinó la participación de las neuronas del HLA
en la recaída al consumo de cocaína inducido por estrés inactivando reversiblemente las
neuronas del HLA.
Los resultados muestran que la estimulación del HLA aumenta los niveles
extracelulares de glutamato en el VTA confirmando la existencia de una conexión anatómica
de fenotipo glutamatérgico entre el HLA y el VTA. Además, mediante triple
xiii
inmunofluorescencia para vGluT2, CRH-R2 y OrxA en sinaptosomas de VTA de ratas
control, se documentó la existencia en el VTA de terminales glutamatérgicos que expresan
CRH-R2 y OrxA. Estos resultados sugieren fuertemente que los terminales glutamatérgicos
del VTA que expresan CRH-R2 provienen del HLA.
Finalmente,
la
inactivación
reversible
de
las
neuronas
del
HLA
con
baclofeno/muscimol (B/M) inhibió significativamente la recaída a la búsqueda de cocaína
inducida por estrés en ratas que han sido entrenadas en CPP. Datos preliminares muestran que
la inyección de B/M en el HLA bloquea la liberación de glutamato en el VTA.
En conclusión, los resultados de la tesis muestran que la vía glutamatérgica del HLA al
VTA expresa receptores CRH-R2 en los terminales nerviosos en el VTA. Además, sugieren
que la vía HLA-VTA juega un papel clave en la recaída a la búsqueda de cocaína inducida por
estrés.
xiv
ABSTRACT
The compulsive seeking of drugs of abuse involves physiopathological changes in the
addicted brain. In addicts, after long periods of abstinence, the relapse to drug seeking can be
triggered by environmental cues, consumption of a new dose of drug or stressful stimuli.
There are several studies about the role of stress in relapse, however, the mechanisms of the
neurochemical changes responsible for relapse to drug seeking induced by stressful stimuli are
still unknown.
The main target of psychostimulant drugs is the ventral tegmental area (VTA),
specifically the dopaminergic neurons that form part of the mesocorticolimbic dopamine
system.VTA neurons innervate the prefrontal cortex and subcortical limbic structures that
contribute to the acquisition and expression of behaviors associated with reward, novelty,
motivation and the addictive power of drugs abuse. The mesocorticolimbic dopaminergic
system is also activated by stress through the release of corticotrophin releasing hormone
(CRH), leading to relapse to drug seeking. CRH release in the VTA, induced by stressful
stimuli, triggers an increase in glutamate levels only in rats with cocaine experience. The
evidence suggests that CRH induces glutamate release and the consequent increase in
dopamine release through the activation of CRH-R2 receptors.
The VTA receives glutamatergic afferents from cortical and subcortical regions. The
most prominent glutamatergic subcortical afference is originated in the Lateral Hypothalamic
Area (LHA). In addition, it has been shown that the LHA afference to VTA is critical in
relapse to drug seeking induced by environmental cues and that exposure to stress potentiates
relapse induced by environmental clues.
xv
The aforementioned evidence leads to the questions: What VTA glutamatergic(s)
afference(s) express CRH-R2? To answer this question, we proposed the hypothesis:
"Glutamatergic afferences from the lateral hypothalamic area to the VTA play a key role in
cocaine stress-induced relapse".
First, we determined whether VTA glutamatergic terminals from the HLA express
CRH-R2 receptors using a
rat VTA synaptosomal preparation and immunofluorescence
against CRH-R2, Orx a LHA neuron marker and vGluT2. Second, we analyzed the release of
glutamate and dopamine in the VTA by in vivo microdialysis in rats that relapse to drug
seeking behavior in response to a stressful stimulus, using the conditioned place preference
paradigm (CPP). Third, we investigated the involvement of LHA neurons in stress-induced
relapse by reversibly inactivating LHA neurons.
The results show that the stimulation of the HLA increases extracellular levels of VTA
glutamate further confirming the existence of a glutamatergic anatomical connection between
LHA and VTA. In addition, the presence of CRH-R2 receptors in VTA glutamate nerve
terminal originated from HLA was documented by triple immunofluorescence for vGlut2,
CRHR2 and OrxA in rat VTA synaptosomes. The expression of CRH-R2 in the HLA was
documented by RT-PCR and Western blotting. These results strongly suggest that VTA
glutamatergic terminals expressing CRHR2 are originated in the HLA.
Finally, the reversible inactivation of HLA neurons with baclofen/muscimol (B/M)
significantly inhibited stress-induced relapse to drug seeking behavior tested in the CPP
paradigm. Preliminary data show that injection of B/M in LHA blocks VTA glutamate release.
xvi
In conclusion, the results of this thesis show that the glutamatergic pathway from the
HLA to VTA expresses CRH-R2 receptors in its nerve terminals within the VTA. In addition,
the data suggest that the HLA-VTA pathway plays a key role in stress-induced relapse to drug
seeking behavior.
I.
INTRODUCCION
1.1.
ADICCIÓN Y EL SISTEMA DOPAMINÉRGICO MESOCORTICOLÍMBICO
La drogadicción es más que sólo el consumo de drogas y se define como un patrón
compulsivo de la búsqueda de drogas. Es una enfermedad cerebral crónica y recurrente,
caracterizada por una alta tasa de recaída (Robinson y Berridge, 2003; Le Moal y Koob,
2007). Este desorden crónico reincidente, además de estar caracterizado por compulsión a la
búsqueda e ingesta de la droga, se caracteriza por la pérdida de control en el límite de la
ingesta y por un estado emocional negativo (disforia, ansiedad e irritabilidad) cuando el acceso
a la droga es impedido, generándose dependencia (Koob y Le Moal, 2005).
La adicción a drogas es progresiva, primero hay un efecto agudo de la droga, que se
asocia con un sistema dopaminérgico (DAérgico) mesocorticolímbico sensibilizado. El
segundo estado corresponde a la transición desde el uso recreacional hacia patrones de uso
característicos de la adicción. Esta transición se asocia con cambios en la función neuronal por
la administración repetida y disminuida al pasar los días o semanas, luego de descontinuar el
uso de drogas y en tercer lugar el estado final de la adicción, caracterizado por el descontrol en
la búsqueda de la droga y el placer reducido por los recompensantes naturales (Koob y Le
Moal, 1997; Kalivas y Volkow, 2005).
2
Las drogas adictivas actúan sobre la circuitería neuronal involucrada en placer,
motivación y aprendizaje (Kalivas y Volkow, 2005; Nestler, 2005; Kauer y Malenka, 2007).
El circuito de la motivación incluye al sistema DAérgico mesocorticolímbico, que consiste en
neuronas DAérgicas que proyectan desde el Área del Tegmento Ventral (VTA) hacia el
Núcleo Acumbens (NAc) y el Tubérculo Olfatorio, así como el Septum, Amígdala e
Hipocampo. Este subgrupo de proyecciones se conoce como sistema DAérgico mesolímbico.
Las neuronas del VTA medial que proyectan hacia las cortezas Prefrontal (PFC) Medial,
Cingulada y Peririnal, se conocen como el sistema DAérgico mesocortical (Robinson y
Berridge, 2003; Wise, 2004; Lammel y cols. 2008). La liberación de DA promueve el inicio
de respuestas adaptativas para la motivación y al hacerlo, facilita cambios que establecen
asociaciones aprendidas con el evento. El VTA contiene en su mayoría neuronas DAérgicas,
que reciben aferencias excitatorias desde la PFC, núcleo Laterodorsal Tegmental (LDT), el
Area del Hipotálamo Lateral (LHA) y del Lecho de la Estría Terminal (BNST), entre otras.
Estas neuronas DAérgicas son inhibidas por interneuronas GABAérgicas que generan
respuestas mediadas por el receptor de GABAA, así como, por proyecciones GABAérgicas
desde el NAc y el Pálido Ventral (Fig. 1) (Kauer y Malenka, 2007).
El VTA es un núcleo heterogéneo en cuanto a la naturaleza química de sus neuronas,
en el cual se han encontrado poblaciones de neuronas DAérgicas, GABAérgicas y una
población de neuronas que expresa el RNA mensajero (mRNA) de vGluT2, lo que da cuenta
de la presencia de neuronas glutamatérgicas (Yamaguchi y cols. 2007). Glutamato, es el
mayor neurotransmisor excitatorio del sistema nervioso central (SNC) y se almacena en
vesículas sinápticas en los terminales nerviosos. Su almacenamiento se debe a una familia de
proteínas denominadas transportadores vesiculares de glutamato (vGluTs) (Takamori y cols.
3
2000). Existen tres isoformas de estos transportadores, vGluT1, vGluT2 y vGluT3 (Bai y cols.
2001; Herzog y cols. 2001). vGluT1 se expresa preferencialmente en neuronas
glutamatérgicas de la corteza y del hipocampo. vGluT2, en cambio tiene una expresión
restringida a núcleos subcorticales y vGluT3 se expresa en los núcleos del Raphe y en glías
(Fremeau y cols. 2004). Esta distribución diferencial de las distintas isoformas del
transportador permite utilizarlas para distinguir entre neuronas glutamatérgicas corticales
(vGluT1) de las de origen subcortical (vGluT2) (Geisler y cols. 2007).
Las drogas de abuso liberan DA desde las neuronas DAérgicas del VTA, tal y como lo
hacen los recompensantes naturales, sin embargo, las drogas adictivas a diferencia de los
recompensantes naturales, cambian las características físicas del cerebro. La exposición a
drogas produce un proceso definido como sensibilización. Cuando un animal es expuesto a
repetidas dosis de una droga psico-estimulante, éste responde de manera diferente a la
disponibilidad y aplicación de la droga, respecto a un animal naïve. En el animal con
experiencia a la droga, la administración de una droga adictiva resulta en una mayor elevación
de los niveles de DA y un aumento en su actividad locomotora, respecto a inyectar la misma
dosis de la droga en un animal naïve. (Robinson y Berridge, 1993; Boileau y cols, 2006;
Leyton, 2007).
Aunque la circuitería cerebral de la adicción es compleja, es un hecho que el sistema
DAérgico mesocorticolímbico es sustrato para la adaptación neuronal que subyace a la
adicción. Además las interacciones entre drogas adictivas y plasticidad sináptica en diferentes
regiones del cerebro pueden contribuir a aspectos específicos de la adicción, como la
recompensa, la extinción y quizás de manera más importante, la recaída a la búsqueda de
drogas.
4
Figura 1. Circuito dopaminérgico Mesocorticolímbico. Esquema simplificado del cerebro
de rata, en el que se destacan las aferencias y eferencias más prominentes del VTA. En rojo,
proyecciones dopaminérgicas (DAérgicas); En azul, proyecciones glutamatérgicas; En
naranjo, proyecciones GABAérgicas y en verde, proyecciones orexinérgicas. VTA: área del
tegmento ventral; AMG: amígdala; BNST: núcleo de la estría terminal; LDTg: núcleo
tegmental laterodorsal; LH: hipotálamo lateral; PFC: corteza prefrontal; VP: pálido ventral.
Modificado de Kauer y Malenka (2007).
5
1.2. ADICCIÓN A COCAÍNA
Se han descrito tres mecanismos celulares por los cuales las drogas adictivas aumentan
los niveles mesocorticolímbicos de DA. La nicotina despolariza las neuronas DAérgicas de
manera directa; los opioides, las benzodiacepinas y canabinoides actúan indirectamente
inhibiendo interneuronas GABA de manera pre y post sináptica; la cocaína y anfetamina
actúan sobre el transportador de dopamina (DAT) en terminales axonales y en dendritas de
neuronas DAérgicas, por lo tanto los niveles de DA en el VTA, NAc y PFC se ven
aumentados (Kuhar y cols. 1991; Lüscher y Malenka, 2011).
La cocaína tiene múltiples acciones farmacológicas, tanto en el SNC, como en
periferia. La cocaína potencia la acción de neurotransmisores como DA, ya que la unión de
cocaína al DAT inhibe la recaptación de DA y por lo tanto aumentan los niveles extracelulares
de dicha catecolamina, sobre activando las células receptoras (Rothman y Baumann, 2003)
(Fig.2). También actúa como anestésico local bloqueando los canales de sodio y calcio
gatillados por voltaje, y canales de potasio activados por calcio (Brain y Coward, 1989). El
clorhidrato de cocaína se disocia en solución a pH fisiológico y la cocaína libre cruza la
barrera hematoencefálica para ejercer su acción activando el sistema DAérgico
mesocorticolímbico (Wise y cols. 2008).
Ungless y cols. el año 2001 mostraron que una sola exposición a cocaína in vivo,
induce potenciación a largo plazo (LTP) de corrientes mediadas por receptores AMPA (ácido
alfa-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiónico) en sinapsis excitatorias de neuronas
DAérgicas en el VTA. Dicha potenciación se observa incluso 5 días después de la exposición
a cocaína, pero no 10 días después y se bloquea cuando se administra un antagonista del
6
receptor NMDA (N-metil D-aspartato) junto con cocaína. Por lo tanto, la exposición de
cocaína in vivo genera LTP en sinapsis excitatorias de neuronas DAérgicas del VTA.
La capacidad que tiene la cocaína para producir motivación y euforia, pérdida de
control y respuesta compulsiva a las claves relacionadas con la droga, se debe al impacto que
tiene en regiones interconectadas del sistema mesocorticolímbico. Las drogas adictivas
median sus propiedades reforzantes actuando en el sistema DA mesocorticolímbico, que como
ya se detalló al principio, incluye el núcleo del VTA y sus blancos de acción como el NAc y la
PFC. Todas las drogas adictivas incrementan la DA en las áreas de proyección del VTA
(Nestler 2005). La activación de las neuronas DAérgicas o el aumento de DA inducido por el
bloqueo del transportador, genera la motivación por continuar con el consumo. La función
natural de esta respuesta es ayudar a mantenernos enfocados en actividades que promueven la
supervivencia y la reproducción. La cantidad de receptores activados por DA en el NAc
después de una dosis de cocaína puede exceder la cantidad asociada a recompensantes
naturales, aumentando la motivación por su consumo (Koob y cols. 1998; Hyman y Malenka,
2001).
El sistema límbico también incluye centros importantes de la memoria, como el
hipocampo y la amígdala. La actividad de estos centros de la memoria es clave para el
aumento en la motivación al consumo inducido por claves ambientales asociadas al consumo,
como personas, lugares y elementos asociados con la droga (Volkow y cols. 2003; Nestler y
Malenka 2004).
7
Figura 2. Mecanismo de Acción de la Cocaína. La cocaína inhibe el transportador de
Dopamina (DAT), disminuyendo la recaptura de Dopamina (DA) desde el espacio sináptico y
provocando un incremento en la concentración extracelular de DA (Modificado de Kuhar y
cols. 1991).
8
1.3. RECAIDA A LA BUSQUEDA DE DROGA POR ESTRÉS
La recaída se define como la reincidencia al consumo de drogas luego de un periodo de
abstinencia. Esta es una de las características principales de la adicción y el mayor problema
en clínica para su tratamiento. Luego de un periodo de abstinencia, la recaída se presenta en
individuos que son confrontados a estímulos ambientales que se asocian al consumo de la
droga (Grimm y See, 2000; Weiss y cols. 2001), a una nueva dosis de droga (Neisewander y
cols. 1996; McFarland y Kalivas, 2001), o a estímulos estresantes (Erb y cols. 1996; Ahmed y
Koob, 1997) (Shalev y cols. 2002; Aguilar y cols. 2009). A pesar de que existen numerosos
estudios en relación a este último punto, aún no se conocen el/los mecanismo(s) que
determinan las alteraciones neuroquímicas responsables de la recaída a drogas inducida por
estímulos estresantes.
1.3.1. Estrés
El término estrés fue acuñado originalmente por el fisiólogo Hans Selye, en los años
30´s para denominar la respuesta que se gatilla en un individuo frente a estímulos estresantes.
Sin embargo, también se usa para denominar al estímulo que gatilla dicha respuesta. Los
estímulos estresantes perturban la homeostasis fisiológica y para recuperar esta homeostasis se
activan mecanismos que incluyen al menos tres componentes. Primero la respuesta a estrés es
mediada parcialmente por la activación de la hormona liberadora de corticotrofina (CRH) que
es liberada por las neuronas del núcleo paraventricular del hipotálamo, provocando la
secreción de la hormona adenocorticotrofina (ACTH) desde la pituitaria anterior, que a su vez
causa un incremento en la síntesis y liberación de glucocorticoides desde la glándula adrenal.
9
Esto forma parte del eje Hipotálamo-Pituitaria-Adrenal (axis HPA) (Herman y cols. 2003).
Segundo, el estrés activa el sistema simpático generando la liberación de epinefrina y
norepinefrina y en tercer lugar, el estrés incrementa la expresión de CRH en sitios extra
hipotalámicos (Uhart y Wand, 2009).
1.3.2. Hormona Liberadora de Corticotrofina
CRH fue aislado y caracterizado en 1981 como un péptido hipotalámico que estimula
la secreción de corticotrofina y β-endorfina (Vale y cols. 1981). CRH es un neuropéptido de
41 amino ácidos (aa) generado por la escisión del C-terminal de pre-pro CRH. Este precursor
es de 196 aa y se encuentra en una gran variedad de especies. CRH se distribuye
abundantemente en el SNC, siendo su mayor sitio de expresión el núcleo paraventricular del
hipotálamo, la corteza cerebral, el cerebelo, la amígdala, hipocampo y el BNST. En la
periferia, CRH se expresa en la glándula adrenal, testículo, placenta, intestino, bazo, timo y
piel (Dautzenberg y Hauger, 2002).
CRH forma parte de una familia de ligandos y receptores, que en mamíferos también
incluye a los neuropeptidos urocortina I (UCNI), UCN II y UCN III, sus receptores CRH-R1 y
CRH-R2 y CRH-BP, una proteína de unión a CRH (Bale y Vale, 2004).
Los receptores de CRH pertenecen al subtipo clase B de receptores acoplados a
proteína G (GPCR), fundamentalmente ligado a la activación de adenilil ciclasa a través de
proteína G, aunque también se ha visto que tienen señalización tejido específica a través de
otros segundos mensajeros (Blank y cols. 2003). CRH-R2 tiene dos variantes de splicing,
CRH-R2α y CRH-R2β encontradas en roedores y humanos y una tercera variante de splicing
CRH-R2γ, encontrada sólo en humanos. CRH tiene diez veces más afinidad por CRH-R1, que
10
por CRH-R2; UCNI, tiene la misma afinidad por ambos receptores; UCNII y UCNIII tienen
mayor selectividad por CRH-R2. El receptor CRH-R2 une UCNI con una alta afinidad, (100
veces > que CRH), por lo tanto se ha hipotetizado que UCNI es el ligando endógeno para
dicho receptor, fig. 3 (Dautzenberg y Hauger 2002; Bale y Vale 2004).
1.3.3. Hormona Liberadora de Corticotrofina y Adicción
El CRH cumple un papel importante en conductas adictivas relacionadas con estrés y
que involucran al sistema DAérgico mesocorticolímbico. Kalivas y cols, (1987) mostraron que
luego de una inyección de CRH intra VTA de ratas, se genera un aumento en la actividad
locomotora espontánea, correlacionada con un aumento de cFos en neuronas del VTA, lo cual
indica que existen neuronas del VTA que responden a CRH. También se ha mostrado que una
exposición repetida a cocaína, aumenta la respuesta locomotora a la inyección intra cerebro
ventricular (i.c.v) de CRH (Erb y cols. 2003). Además se ha establecido mediante microscopía
electrónica que CRH se concentra en terminales axónicos en el VTA, formando sinapsis sobre
neuronas DAérgicas y no DAérgicas (Tagliaferro y Morales, 2008).
11
Figura 3. Distribución de CRH y CRH-R1, CRH-R2 y sus ligandos. Distribución de (a)
mRNA de CRH (puntos rojos), (b) mRNA de CRH-R1 (puntos rojos) y CRH-R2 (cuadrados
azules) en una sección sagital de cerebro de roedor (Modificado de Reul y Holsboer, 2002).
En (c) se muestran los ligandos de los receptores CRH-R1, CRH-R2 y el péptido de unión a
CRH, CRH-BP, la flecha segmentada indica que CRH tiene menor afinidad por el receptor
CRH-R2 que por CRH-R1 (Modificado de Dautzenberg y Hauger, 2002) (Abreviaturas en
índice).
12
Otra evidencia importante en relación al neuropéptido CRH y la adicción se relaciona
con la recaída a la búsqueda de droga, inducida por estrés. Mediante el paradigma de auto
administración de droga en ratas, se mostró que CRH en el VTA juega un papel fundamental
en la reinstalación de la conducta de búsqueda de droga inducida por un estímulo estresante.
Durante el estímulo estresante, CRH es liberado en el VTA, generando la liberación de
glutamato y la consecuente activación del circuito DAérgico mesocorticolímbico sólo en ratas
que han tenido experiencia con cocaína, gatillándose la recaída a la búsqueda de la droga por
estrés (Wang y cols. 2005). En este mismo trabajo se demostró que la inyección de un
antagonista de CRH intra VTA inhibe el restablecimiento de la búsqueda de droga inducida
por estrés (Wang y cols. 2005). Posteriormente, el mismo grupo demostró que este
restablecimiento de la búsqueda de cocaína inducida por estrés y la concomitante liberación de
glutamato y DA en el VTA, eran bloqueados por un antagonista selectivo del receptor CRHR2 y no de CRH-R1 administrados intra VTA, indicando que CRH-R2 es el receptor
involucrado en la eficacia del estrés para gatillar el restablecimiento antes mencionado (Wang
y cols. 2007).
Evidencia experimental, obtenida midiendo corrientes excitatorias postsinápticas
(EPSCs) en neuronas DAérgicas del VTA en rebanadas de cerebro medio de ratón, muestra
que CRH induce la potenciación de la transmisión sináptica mediada por NMDAR (receptor
N-metil-D-aspartato) en neuronas DAérgicas del VTA y que involucra al receptor CRH-R2 y
la activación de la vía PKC (fosfolipasa C-proteína quinasa C). Por lo tanto, la respuesta
DAérgica a glutamato sería potenciada por CRH a través de un mecanismo que involucra
CRH-R2 (Ungless y cols. 2003).
13
De acuerdo a la información anatómica existente, el CRH en el VTA se encuentra en
terminales axónicos provenientes del BNST, el núcleo de la amígdala central y el núcleo
paraventricular del hipotálamo (Rodaros y cols. 2007; Sinha 2008). Sin embargo, aún se
desconoce cuál(es) de las neuronas glutamatérgicas que inervan el VTA es la que participa(n)
en la recaída inducida por estrés. Tampoco se conoce el origen de las neuronas que coexpresan CRH y glutamato (Tagliaferro y Morales, 2008).
1.3.4. ¿Desde qué área proviene el glutamato responsable de la recaída a la
búsqueda de droga en respuesta a estímulos estresantes?
La liberación de glutamato en el VTA inducida por CRH luego de un estímulo
estresante en ratas con experiencia a cocaína es primordial para la activación de neuronas
DAérgicas. Sin embargo, aún no se ha aclarado la procedencia de estas neuronas
glutamatérgicas, ni tampoco es claro qué aferencias glutamatérgicas expresan el receptor
CRH-R2, que permite su activación inducida por la liberación de CRH en el VTA.
Geisler y colaboradores (2007), identificaron el origen de las aferencias
glutamatérgicas al VTA mediante el uso de traza retrograda inyectada en el VTA, en conjunto
con Hibridación in situ para vGluT1, vGluT2 y vGluT3. Debido a que la expresión de los
vGluTs está segregada, expresándose vGluT1 esencialmente en neuronas corticales y vGluT2
en neuronas subcorticales (Fremeau y cols, 2004), es posible distinguir la inervación de origen
cortical vs subcortical. Los datos de Geisler y cols. (2007) señalan que alrededor del 20 % del
glutamato en el VTA proviene de la corteza y el otro 80% proviene de distintos núcleos subcorticales, de los cuales el área del hipotálamo lateral (LHA) es la más prominente.
14
1.4. AREA DEL HIPOTÁLAMO LATERAL
El hipotálamo es un área crítica para la expresión de tres clases de conductas básicas:
ingesta de alimento, defensiva y reproductiva. El hipotálamo se encuentra localizado en la
sección ventral del diencéfalo y se divide en cuatro regiones rostrocaudales: área preóptica,
supraóptica, tuberal y mamilar. El hipotálamo tuberal, tiene regiones dorsal y ventral. Los
núcleos principales de la zona dorsal son el hipotálamo dorsomedial (DMH), el hipotálamo
perifornical (PeF) y el hipotálamo lateral (LH) que en conjunto componen lo que se denomina
el Área del Hipotálamo Lateral (LHA). El LHA es la fuente principal de neuronas
orexinérgicas (Sakurai y cols. 1998). En la región ventral, se distingue el hipotálamo
ventromedial (VMH) y el núcleo arcuato (ARC) (Swanson 2000).
Las regiones laterales del hipotálamo tuberal son importantes para promover apetito y
búsqueda de drogas, mientras que las regiones mediales son importantes para inhibir la
motivación y la búsqueda de drogas (Stellar, 1954; DiLeone y cols. 2003). Un ejemplo de esto
es la alimentación que es mediada por el LH y se considera como un evento motivante
excitatorio, mientras que la saciedad, es mediada por el hipotálamo medial y se considera
como evento motivacionalmente inhibitorio (Anand y Brobeck 1951; Olds y cols.1960). Se ha
demostrado que el neuropéptido Orexina (Orx) o Hipocretina, sería el responsable del evento
motivante excitatorio en el LH frente a la alimentación (Sakurai y cols 1998).
La Orx comprende dos péptidos distintos, provenientes de un precursor común llamado
prepro-orexina, OrxA de 33 aa y OrxB de 28 aa de longitud, ambos con afinidad por dos
receptores diferentes, llamados receptor de orexina 1 (Ox1R) y receptor de orexina 2 (Ox2R).
El receptor Ox1R une OrxA con más alta afinidad que OrxB, mientras que el receptor Ox2R,
15
une ambos neuropéptidos con igual afinidad (de Lecea y cols 1998; Sakurai y cols, 1998). Las
neuronas que expresan Orx están localizadas en subregiones de la parte tuberal del hipotálamo
(Peyron y cols. 1998).
1.4.1. Área del Hipotálamo Lateral y Adicción
Las neuronas del LHA y en especial las de la región más lateral del LHA (LH) han
sido implicadas en las conductas de búsqueda de drogas. Mediante estudios que usan
inmunohistoquímica del gen temprano c-Fos como marcador de actividad neuronal, se ha
mostrado que el LHA es importante para el restablecimiento y recaída de la búsqueda de
droga; por ejemplo, para el restablecimiento de la búsqueda de alcohol y cocaína inducido por
claves ambientales (Dayas y cols. 2008; Hamlin, y cols 2006).
El sistema orexinérgico es importante para el restablecimiento de la búsqueda de droga
y se ha visto que la administración sistémica de SB 334867, un antagonista del receptor Ox1R,
previene el restablecimiento de la búsqueda de cocaína y alcohol inducido por claves
ambientales (Smith y cols. 2010). El sistema orexinérgico también se ha relacionado con el
restablecimiento de la búsqueda de droga inducida por estrés. Boutrel y cols. (2005),
realizaron inyecciones i.c.v del antagonista SB 334867 y observaron un bloqueo de la recaída
a la búsqueda de cocaína inducida por un estímulo estresante como el footshock.
Harris y cols. (2005), mostraron que las neuronas orexinérgicas del LH tienen un papel
importante en la conducta de la búsqueda de droga utilizando el paradigma de Preferencia de
Lugar Condicionado (CPP). Ellos mostraron un incremento de cFos en neuronas orexinérgicas
del LH y no de las otras subregiones del LHA en ratas con CPP a morfina, cocaína o comida.
16
Debido a que existe una conexión anatómica entre el LHA y el VTA y que ambos
núcleos están involucrados en la búsqueda y recaída a la búsqueda de drogas de abuso, hemos
pensado que las neuronas glutamatérgicas del área del LHA que inervan el VTA son un buen
candidato como mediadoras de la recaída al consumo de cocaína inducida por estrés. La
evidencia que nos lleva a plantear la importancia de dicha conexión glutamatérgica es la
siguiente:
-
La aferencia glutamatérgica subcortical más abundante hacia el VTA proviene del
LHA (Geisler y cols. 2007).
-
Las neuronas del LHA, han sido involucradas en motivación, aprendizaje y es un
núcleo clave en recompensa (Nakamura y Ono, 1986).
-
El LHA fue una de las primeras áreas del cerebro que se relacionaron con el placer,
demostrado por auto estimulación eléctrica (Olds y Milner 1954).
-
Las neuronas del LHA expresan el mRNA de CRH-R2 (Van Pett y cols. 2000).
-
La activación de CRH-R2 determina la liberación de glutamato en VTA y gatilla la
recaída a la búsqueda de droga inducida por estrés (Wang y cols. 2007).
-
Mediante estudios de un perfil de expresión de genes en ratas expuestas a cocaína, se
demostró que el área involucrada en el circuito de la recompensa que presenta mayor variación
en la expresión de genes es el LHA (Ahmed y cols. 2005).
-
La evidencia existente indica que la activación de las neuronas del LHA está asociada a
la preferencia por claves ambientales asociados a la droga (Harris y cols. 2005).
-
La exposición a estímulos estresantes potencia la recaída a la búsqueda de droga por
claves ambientales (Buffalari y See, 2009).
17
HIPÓTESIS
En base al conjunto de antecedentes señalados se propone la siguiente hipótesis de trabajo:
“LA AFERENCIA GLUTAMATÉRGICA DEL ÁREA DEL HIPOTÁLAMO LATERAL
AL VTA JUEGA UN PAPEL CLAVE EN LA RECAÍDA AL CONSUMO DE COCAÍNA
INDUCIDA POR ESTRÉS”
OBJETIVO GENERAL
Estudiar el papel de la aferencia glutamatérgica proveniente del área del LH hacia el VTA en
la recaída a la búsqueda de droga por estrés.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Objetivo Específico 1: Determinar si los terminales glutamatérgicos provenientes del LHA,
expresan el receptor CRH-R2. En sinaptosomas provenientes del VTA de ratas controles se
realizará inmunofluorescencia para CRH-R2, Orx como marcador de neuronas del LHA y
vGluT2.
Objetivo Específico 2: Determinar si el paradigma de preferencia a lugar condicionado es útil
para estudiar recaída a la búsqueda de cocaína producida por un estímulo estresante.
Objetivo Específico 3: Determinar la participación de las neuronas del LHA en la recaída al
consumo de cocaína por estrés. Analizar el efecto de la inactivación reversible de las neuronas
del LHA en la recaída al consumo de cocaína por estrés.
18
II.
MATERIALES Y METODOS
2.1. Droga y Animales
La cocaína-HCL utilizada corresponde a una donación del NIDA (The National
Institute on Drug Abuse), USA y se cuenta con la autorización de uso del Instituto de Salud
Pública de Chile (ISP). La Cocaína fue disuelta en 0,9% suero salino estéril.
Se utilizaron ratas machos Sprague Dawley de entre 250-260 g. manipuladas según las
“Normas y Principios para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio” que establece la
Sociedad de Neurociencias, USA y de acuerdo a la normativa de la comisión de Bioética de la
Facultad de Ciencias Biológicas (PUC). Los animales fueron obtenidos desde el bioterio de la
Facultad, mantenidos con un ciclo de 12hrs. de luz y 12hrs. de oscuridad, con agua y comida
ad libitum. Se evaluaron dos grupos: Grupo Cocaína, el que recibió 15mg/Kg de cocaína-HCL
(Clorhidrato de cocaína) intra peritoneal (i.p.) dos veces al día durante 7 días y un Grupo
Control, que recibió suero salino (NaCl 0,9%) dos veces al día durante 7 días. Para evaluar el
estado adictivo de las ratas que se utilizaron en estudios neuroquímicos y moleculares de este
proyecto de tesis se utilizó el paradigma experimental de Preferencia de Lugar Condicionada
(CPP) (Tzschentke, 2007).
2.2. Preferencia de Lugar Condicionado (CPP)
El paradigma de CPP (del inglés, Conditioned Place Preference), ha sido utilizado para
estudiar el fenómeno de recaída a la búsqueda de drogas de abuso en animales de
experimentación (Calcagnetti y cols 1995; Tzschentke 2007). En este procedimiento los
19
animales fueron entrenados para adquirir la preferencia al lugar en que se les administró la
droga, distinto al que prefirieron en un comienzo sin la droga y luego fueron sometidos a un
proceso de extinción de la preferencia.
El equipo de CPP consta de tres cajas, dos de ellas (blanca y negra), son llamadas de
condicionamiento y la tercera, es la caja neutral de inicio, ubicada en medio de las cajas de
condicionamiento. En un comienzo las ratas fueron sometidas a un Pre Test de 15 min., luego
de 2 min. de exploración. El Grupo Cocaína fue entrenado a un condicionamiento con
cocaína 15mg/Kg i.p. dos veces al día (9:00hrs y 16:00hrs) durante 7 días en el compartimento
blanco, por un periodo de 30 min. Por otra parte el Grupo Control fue sometido a CPP con
una inyección de salino i.p. dos veces al día (9:00hrs y 16:00hrs) durante 7 días. El Grupo
Control, fue entrenado en el compartimento negro en la mañana y en el compartimento blanco
en la tarde, para evitar que asocien la inyección de salino con una caja determinada. Pasados
los 7 días de condicionamiento, se realizó un Test de CPP donde se dejó el paso libre a través
de los tres compartimentos durante 15 min., luego de 2 min. de exploración, para evaluar si
adquirieron la conducta de preferencia al lugar asociado con cocaína (lugar pareado a la droga)
en el caso del grupo cocaína. Al siguiente día ambos grupos comenzaron un periodo de
extinción de 14 días en los que recibieron salino i.p. dos veces al día (9:00hrs y 16:00hrs).
Transcurrido el periodo de extinción, se evaluó si las ratas habían perdido la preferencia por el
lugar asociado a la droga, en un Test de Extinción, de 15 min. de libre exploración. Posterior a
esto, ambos grupos fueron sometidos a estrés con series de 15 min. de 0.5seg. de footshock
impredecibles, administrados en intervalos de entre 40 ± 30 seg. La intensidad del shock fue
ajustada para cada animal, a un nivel bajo el umbral de la conducta de freezing (0.3-0.6mA)
(Wang y cols. 2005). Posteriormente se procedió a evaluar el Test de Recaída para cada
20
animal (Fig. 4). Las cajas de CPP fueron confeccionadas de madera enchapada, cuyas medidas
son para los compartimentos de condicionamiento (Blanco y Negro) de 30x30x30 cm3, ambos
con puertas removibles de 12 cm de ancho y para el pasillo (Café) se utilizaron medidas de
15cm de largo x 30cm de alto x 20cm de ancho.
2.3. Microdiálisis
Las ratas se anestesiaron con Hidrato Cloral (400 mg/kg, i.p) y se colocaron en un
aparato estereotáxico (Stoelting, Wood Dale, IL, USA) para implantar unilateralmente una
sonda de microdiálisis (CMA12/microdiálisis) en el VTA y otra sonda de microdiálisis en el
LH. Las coordenadas para la instalación de la sonda en VTA fueron: ángulo 12° coronal;
5,2mm posterior a bregma, 2,1mm lateral y 7,9mm ventral y de LH: ángulo 14° sagital;
0,5mm posterior a bregma, 1,8mm lateral y 8,0mm ventral (Paxinos y Watson, 2007). Se dejó
un periodo de 90 min de estabilización de las sondas implantadas con infusión de solución
KRF (120 mM NaCl, 2,4mM KCl, 1,2 mM CaCl2, 0,9 mM NaH2PO4 y 1,4 mM Na2HPO4,
pH=7,4) a una velocidad de 2µl/min. utilizando una bomba de perfusión (Harvard Apparatus,
inc. Massachusetts, USA). Pasado el tiempo de estabilización, se recolectaron muestras cada
10 min. A los 40 min. se estimuló con K+110mM a través de la sonda instalada en el LH y se
analizó la respuesta neuroquímica del VTA. Las muestras se recibieron en Acido Perclórico
(PCA) 0,2N. Una vez finalizado el experimento, las ratas se decapitaron para confirmar la
correcta posición de las sondas. Los cerebros se removieron y se mantuvieron en 4% de
paraformaldehído (PFA) por 24 horas, y a continuación se realizaron cortes coronales de
50µm de espesor en vibrátomo (Sectioning System series 3000); y luego se tiñeron con Cresyl
Violeta para determinar por análisis histológico la instalación de la sonda (Fig. 5).
21
Figura 4. Preferencia de Lugar Condicionado (CPP). En la parte superior de (a) se puede
observar el Pre Test/Test, que consiste en el paso libre del animal a través de los
compartimentos, con el fin de evaluar su preferencia durante 15min. En la parte inferior de (a),
se observa que durante el protocolo de condicionamiento, la rata que recibe la droga es dejada
30 min. post inyección en el compartimento blanco, mientras que la rata que recibe salino, es
dejada el mismo tiempo, pero en el compartimento negro por la mañana y blanco por la tarde.
La extinción se realiza de igual modo que el condicionamiento, pero se reemplaza la droga por
salino. En (b) se grafica el protocolo de condicionamiento, extinción y recaída por estrés.
22
Figura 5. Posición representativa de sondas de microdiálisis. En la parte superior de la
figura se muestra la representación de la posición de sonda de microdiálisis en LH. En la parte
inferior de la figura se muestra la representación de la posición de la sonda de microdiálisis en
VTA. Ambas posiciones para realizar microdiálisis son unilaterales.
23
Para los experimentos de microdiálisis en los que se midió la inactivación de las
neuronas del LHA por Baclofeno/Muscimol (B/M, Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri.
USA) en ratas anestesiadas y que recibieron un estímulo con CRH en VTA para simular el
estímulo estresante que recibirían ratas in vivo, se procedió de la siguiente manera: Luego de
implantar las sondas de microdiálisis de 100 KDa en el LH y VTA, con las coordenadas antes
mencionadas, se esperó 90 min de estabilización y luego se procedió a recolectar basales de 10
min, para posteriormente perfundir mediante la sonda de microdiálisis implantada en LH
Vehículo (Veh.) durante 10 min. y en los posteriores 10min. se perfundió 10µM del péptido
CRH (C3042, Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri. USA) en el VTA durante 40 min. en
ratas tratadas con 15mg/Kg de cocaína durante 7 días, dos veces al día. En el caso de las ratas
que recibieron la inactivación con B/M, se procedió de igual manera antes mencionada, pero a
cambio de Veh. inyectado en el LH, se perfundió B/M (0,05mM/0,5µM respectivamente)
(Aono y cols. 2008, Saigusa y cols. 2008) durante 10 min.
A través de las sondas de microdiálisis se perfundió solución KRF con albúmina sérica
de bovino (BSA) al 0,01%, para evitar que el péptido CRH se pegue a los tubos.
2.4. Cromatografía Liquida de Alta Eficiencia (HPLC)
Las muestras de microdiálisis se analizaron mediante HPLC acoplado a detección
amperométrica para determinar los niveles extracelulares de DA y HPLC acoplado a un
detector fluorométrico (Lindroth y Mopper 1979) para la detección de glutamato. Como fase
móvil para la detección de DA se utilizó: NaH2PO4 100 mM, EDTA 1mM, ácido 1octansulfónico 1,7 mM y Acetonitrilo (CH3CN) 3,5% v/v ajustado a pH=2,3. Se utilizó una
columna Sepstick microbore, a una velocidad de flujo a través de la columna de 80 µL/min y
24
loop de 10uL. El potencial de oxidación utilizado fue de 650 mV, a una sensibilidad del
equipo de 0,5 nA. (Sotomayor y cols, 2005). Para la determinación de los niveles
extracelulares de glutamato, se utilizó como fase móvil: NaH2PO4 100mM y CH3CN 14,5%
v/v ajustado a pH=5,7. Se utilizó una columna YMC, con gradiente isocrática y loop de 20uL
(Forray y cols, 1999).
2.5. Cirugía para implantación de cánulas guía
Las ratas se anestesiaron mediante inyección i.p. de 100mg/Kg de Ketamina más
20mg/Kg de Xilazina y se colocaron en el aparato estereotáxico para implantación de la cánula
guía de inyección (26 GA, 11 mm) o cánula guía para sonda de microdiálisis (CMA 12 Guide
Cannula; Harvard Apparatus). La cánula se cementó al cráneo mediante fijación con tornillos
de 1mm de profundidad (Plastics One, Virginia, USA y Harvard Apparatus, Massachusett,
USA). El cemento dental para la fijación de los tornillos se obtuvo de productos dentales
Marche (Santiago, Chile).
Luego de la cirugía se le administró a cada rata, como medida profiláctica, el
antibiótico enrofloxacino 5% (10mg/Kg i.p. Chemie, Santiago, Chile) y el anti-inflamatorio
ketoprofeno 1% (0,2 mg/Kg i.p. Sanofi) por tres días. Se permitió una semana de recuperación
antes de iniciar los experimentos.
Las cánulas guías para la inyección se posicionaron bilateralmente en el LH según el
Atlas de Paxinos y Watson (2007) utilizando las siguientes coordenadas: ángulo de 8° coronal;
3.6 mm posterior a bregma; 3 mm lateral y 7.0 mm ventral. Las cánulas guías fueron
posicionadas 1mm por sobre el sitio de infusión.
25
Las cánulas guías para las sondas de microdiálisis se posicionaron de manera unilateral
en el VTA según el Atlas de Paxinos y Watson (2007) utilizando las siguientes coordenadas:
ángulo 12° coronal; 5,2mm posterior a bregma, 2,2mm lateral y 6,7mm ventral.
Una vez finalizado el experimento, las ratas se decapitaron para confirmar la correcta
posición de las sondas (Fig. 6).
2.6. Inactivación reversible de las neuronas del LH
Se determinó el efecto de la inactivación reversible de las neuronas del LH en la
recaída al consumo de cocaína inducida por estrés. La inactivación se realizó con una
inyección bilateral en el LH de los agonistas GABAB y GABAA, baclofeno/muscimol (B/M.
Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri. USA). Este bloqueo se realizó en ratas que fueron
entrenadas en CPP (grupo control y grupo cocaína), a las cuales (posterior al
condicionamiento) (Ver Discusión) se les implantó una cánula guía con el fin de realizar la
inyección de inactivación una vez terminada la extinción del condicionamiento a cocaína y
previo al estrés. La inyección se realizó por medio de una bomba de infusión, a través de la
cual se
inyectó una combinación de B/M (1mM/0,1mM respectivamente) o con Buffer
Fosfato Salino como vehículo (Veh, pH=7.2) en volúmenes de 0,5uL en 2 min. por lado,
esperando 2 min. antes de retirar la jeringa (Fuchs y cols. 2008; Marchant y cols. 2009).
Luego de la inyección con B/M, las ratas previamente condicionadas a cocaína y con
14 días de extinción, fueron sometidas a footschock y se evaluó la recaída a la búsqueda de
droga por estrés en el CPP. (McFarland y cols. 2004; Marchant y cols. 2009).
26
Figura 6. Posición representativa de cánulas guías. En la parte superior de la figura se
muestra la representación de la posición bilateral de cánulas guías para inyección de
baclofeno/muscimol en el hipotálamo lateral. En la parte inferior de la figura se muestra la
representación de la posición unilateral de cánula guía para sonda de microdiálisis en VTA.
27
2.7. Microdiálisis en ratas freely moving durante CPP.
Como se describió anteriormente, a éstas ratas se les implantó una cánula guía de
microdiálisis en el VTA. En un comienzo las ratas fueron operadas y puestas en parejas en las
cajas de mantención antes de comenzar con el protocolo de CPP. Debido a que los animales se
comían entre si las cánulas guía se decidió mantenerlas separadas. Sin embargo, cuando
permanecían aisladas en sus cajas de mantención luego del post operatorio, no se
condicionaron a cocaína en CPP (ver Discusión). Por lo tanto, para llevar a cabo ésta
metodología se procedió a operar las ratas después del protocolo de condicionamiento a la
droga.
Para estos experimentos se utilizaron sondas de microdiálisis de 2 mm de longitud de
membrana con un cutoff de 100 KDa (CMA) las que fueron puestas en la cánula guía de
microdiálisis. Se dejó un periodo de 90 min. de estabilización de la sonda, con la rata en su
caja de mantención, perfundiendo a través de la sonda solución KRF (120 mM NaCl, 2,4mM
KCl, 1,2 mM CaCl2, 0,9 mM NaH2PO4 y 1,4 mM Na2HPO4, pH=7,4) a una velocidad de 0,5
μl/min. y luego de éste periodo se comenzó con la recolección de 2 basales cada 10 min. y a
un flujo de 2µl/min. Posteriormente, la rata fue puesta en las cajas de CPP para evaluar el Test
de Extinción donde se recolectaron 2 muestras de 10 min cada una y luego la rata fue sometida
a footshock donde se recolectó una muestra de 10 min, para posteriormente evaluar la recaída
en CPP, recolectando 2 muestras finales de 10 min. cada una. Todas las muestras fueron
recolectadas en 3µl de PCA 0,2N. Las muestras recolectadas se guardaron a -20ºC y luego se
analizaron por HPLC para determinar los niveles extracelulares de DA y glutamato.
28
2.8. Preparación de Sinaptosomas
Se sacrificaron las ratas por decapitación y sus cerebros fueron puestos en suero salino
a 4°C, para posteriormente realizar una microdisección del núcleo VTA. Para obtener
sinaptosomas se utilizó centrifugación diferencial y un gradiente discontinuo de Percoll, según
lo descrito por Nagy y Delgado-Escueta (1984), con modificaciones de Rodrigues y cols.
(2005) y Araya y cols. (2007). Este protocolo permite obtener sinaptosomas con baja cantidad
de densidades postsinápticas (Rodrígues y cols, 2005). El VTA aislado de manera bilateral fue
puesto en un homogenizador de vidrio Potter en 500µL de solución 1 (Tabla I), para luego ser
homogenizado en 6 intervalos de 5 segundos cada uno a 4°C a 1000 rpm. Luego se llevó a un
volumen final de 1,5 mL con Solución 1 y se centrifugó (Centrifuga HERMLE Z 233MK-2) a
1000 x g durante 10 minutos a 4°C (dos veces). Posteriormente el sobrenadante se centrifugó a
17000 x g durante 20 minutos a 4°C. El pellet obtenido se resuspendió en 70 µl de solución 5
(Tabla I) hasta completa homogenización. El gradiente de Percoll se realizó depositando en un
tubo eppendorf de 1,5 ml, (levemente inclinado en hielo) 300 µl de solución de Percoll
(coloide de PVP-sílicagel, Sigma Aldrich) al 23 %; seguido de 300 µl de Percoll al 10 %.
Finalmente, sobre estas dos fases formadas se añadió la mezcla de 230 μl de Percoll al 3 %
más el pellet disuelto en los 70 µl de solución 5 (Tabla I y Tabla II). Conservando el ángulo de
inclinación, se centrifugó a 15000 x g durante 20 minutos a 4°C cuidando que la aceleración y
desaceleración de la velocidad de la centrífuga sea lenta para evitar desarmar las fases de la
gradiente. Luego se retiró cuidadosamente el tubo de la centrifuga para recuperar los
sinaptosomas, visibles como una banda de color crema localizada en la interfase 10% - 23%.
La fracción sinaptosomal fue lavada con solución 6 (Tabla I) en igual volumen a la fracción
obtenida y luego se centrifugó a 24000 x g durante 20 minutos a 4°C (2 veces) (Ver figura 7).
29
Finalmente los sinaptosomas (pellet obtenido de los lavados anteriores) se resuspendieron en
solución 6, para evitar que revienten y puedan ser utilizados para realizar inmunofluorescencia
o western blot y cuantificación de proteínas.
2.9. Inmunofluorescencia en Sinaptosomas
Los sinaptosomas (15µg/µl de proteína) se adhirieron a cubre objetos con poli-DLisina (0,1mg/ml. SIGMA-Aldrich) y se incubaron por 24 horas a 37°C en humedad, con
100µL de Solución 6 (Tabla I) agregados por el borde del cover. Al día siguiente se fijaron
con PFA 4%/Sacarosa 10% en PBS 1x por 15 minutos a temperatura ambiente y agitación.
Luego se lavaron 3 veces por 5 min. con solución A (Glicina 20mM en PBS 1x) y agitación.
Posteriormente se permeabilizaron con solución de Triton x-100 0,2% en solución A por 10
minutos a temperatura ambiente, con agitación. Se lavaron 2 veces durante 5 min. con
Solución A y agitación. Posteriormente, se bloquearon a temperatura ambiente utilizando
solución B (BSA al 4% en PBS 1x) por 1 hora a temperatura ambiente. Luego se incubó con
Anticuerpos primarios (Tabla III) por 1 hora a temperatura ambiente, luego se lavaron 3 veces
de 10 min. con solución A y se incubaron con anticuerpos secundarios (Tabla III) durante 1
hora. Posteriormente, se lavaron 3 veces de 5 min. con solución A. Se secaron los covers a
temperatura ambiente, protegidos de la luz, y se montaron con medio Dako Fluorescent
Mounting Medium (Dako North America, Inc). Las muestras se observaron al microscopio de
fluorescencia confocal Olympus Fluoview 1000 del Servicio de Microscopía Electrónica de la
Facultad de Ciencias Biológicas de la Pontificia Universidad Católica de Chile. La
cuantificación de la inmunoreactividad y colocalización de los sinaptosomas se analizó con el
30
programa Image J, plugin Macros Count-Colocalize (http://rsbweb.nih.gov/ij/) (Ciruela y cols,
2006).
2.10. Extracción de Proteínas
El LHA se microdisectó bilateralmente y se extrajo proteínas para su análisis por
Western blot. También se colectaron muestras para determinar proteínas de cada etapa de la
preparación de sinaptosomas del VTA: P1, SN1, 3%, 23%, SN2, FSP (Fracción Sinaptosomal
Pura). Las muestras obtenidas se depositaron en un tubo eppendorff que contenía tampón de
lisis (RIPA: 25 mM Tris-HCl pH=7,6, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% deoxicolato de sodio,
0.1% SDS, Thermo Scientific Rockford.IL) con inhibidor de proteasas en tabletas (Complete
Mini, Roche), mantenido a 4°C. Las muestras mantenidas en frío se homogenizaron mediante
sonicador de pistón (Ultrasonic Cell Disrrupter, Kontes) en 3 pulsos de 5-10 seg cada uno.
Luego se dejaron reposar durante 20-30 min. en hielo. Las muestras homogenizadas se
centrifugaron a 14.000 rpm durante 30 min a 4 °C, se recolectó el sobrenadante y se procedió
a la cuantificación de proteínas mediante el kit Micro-BCA (Acido Bicinconínico, Pierce)
siguiendo las instrucciones del fabricante.
31
Figura 7: Esquema de preparación Sinaptosomal. En la figura se muestran los principales
pasos del protocolo de preparación de sinaptosomas. P1 y P2, Pellet 1 y 2 respectivamente;
SN1 y SN2, Sobrenadante 1 y 2 respectivamente. La banda de color amarilla, indica el lugar
donde se encuentra la fracción de sinaptosomas luego de centrifugar la gradiente de Percoll.
Tabla I: Soluciones para la preparación de Sinaptosomas
Solución 1
HEPES 10mM; Sacarosa 320 mM; EDTA 3 mM; pH 7,4
Solución 2
Sacarosa 2,5 M
Solución 3
50l de solución 2 + 450l de solución de Percoll
Solución 4
HEPES 10 mM; Sacarosa 250 mM; EDTA 3 mM; pH 7,4.
Solución 5
HEPES 10mM; Sacarosa 320 mM; pH 7,4
Solución 6
Sacarosa 320mM
Tabla II: Gradiente de Percoll
Solución al 3%
38l de solución 3 + 762 l de solución 4
Solución al 10%
124 l de solución 3 + 876 l de solución 4
Solución al 23%
284 l de solución 3 + 716 l de solución 4
32
Tabla III: Anticuerpos utilizados para Inmunofluorescencia de Sinaptosomas
Anticuerpos Primarios
Código
CRH-R2 (c-15) α-Goat
CRH-R2 α-Rabbit
Orexina A α-Goat
Orexina A α-Mouse
PSD 95 α-Mouse
SC-20550
Ab 75168
SC-8070
Secretogranina II α-Rabbit
Sinapsina Ia/b (H-170) αRabbit
Sintaxina I α-Mouse
vGluT2 α-Mouse
Ab 12241
SC-20780
Anticuerpos Secundarios
Alexa Fluor® 488 Donkey
Anti-Goat
Alexa Fluor® 488 Donkey
Anti-Rabbit
Alexa Fluor® 594 Donkey
Anti-Goat
Alexa Fluor® 647 Donkey
Anti-Mouse
Cy3 Donkey Anti- Rabbit
75-028
MAB 336
75-067
Compañía
Santa Cruz Biotecnology, INC
Abcam
Santa Cruz Biotecnology, INC
UC
Davis/NIH
NeuroMab
Facility
Abcam
Santa Cruz Biotecnology, INC
Dilución
1/500
1/500
1/1000
1/1000
1/1000
1/1000
1/1000
Código
Millipore Corporation
UC
Davis/NIH
NeuroMab
Facility
Compañía
1/2000
1/500
Dilución
A11055
Invitrogen life technologies
1/200
A21206
Invitrogen life technologies
1/200
A11058
Invitrogen life technologies
1/200
A31571
Invitrogen life technologies
1/200
711-165152
Jackson InmunoResearch
1/200
33
2. 11. Western Blot
Las proteínas se separaron mediante electroforesis vertical en un gel de poliacrilamidaSDS 8%-Urea 8% para detectar CRH-R2 y un gel de poliacrilamida-SDS 10% para las otras
proteínas, en tampón de corrida (Tris-Base 25 mM, Glicina 192 mM, SDS 10%) a 70 V hasta
que el frente alcanzó el gel resolutivo y luego a 100 V. Se detuvo la electroforesis cuando el
frente de migración se cayó del gel.
Finalizada la electroforesis, se realizó la transferencia a una membrana de nitrocelulosa
de 0,2 μm durante 1:30 hrs. con tampón de transferencia frío (Tris-Base 25 mM, glicina 192
mM, 20% metanol) a 340mA constante. Al terminar la transferencia, las membranas se
bloquearon durante 4 h. para CRH-R2 o durante 1 h. para las otras proteínas, en solución de
bloqueo (5% Leche en PBS 1X; 0,1% Tween20) con agitación. Luego se incubaron las
membranas con anticuerpo primario (Tabla IV) preparado en solución de bloqueo durante toda
la noche a 4°C con agitación. Se realizaron 3 lavados de 15 min. cada uno con PBS 1X – 0,1%
Tween20 con agitación. Luego las membranas se incubaron con anticuerpo secundario (Tabla
IV) en 5% Leche en PBS 1X durante 1 hora con agitación. Posteriormente las membranas se
lavaron 3 veces con PBS 1X-0,1% Tween20 durante 10 min. cada lavado y luego 2 veces con
PBS 1X por 15 min cada vez.
El revelado de las membranas se realizó con el Kit SuperSignal West Pico
Chemiluminescent Substrate (Pierce Biotechnology, USA) incubando las membranas durante
5 min en oscuridad, luego se expusieron a un film y se reveló en un procesador radiográfico
(X-OMAT 1000, KODAK).
34
Tabla IV: Anticuerpos utilizados para Western Blot
Anticuerpos Primarios
CRH-R2 (c-15) α-Goat
PSD 95 α-Mouse
Código
SC-20550
75-028
Compañía
Dilución
Santa Cruz Biotecnology, INC
UC
Davis/NIH
NeuroMab
1/500
1/10000
Facility
Sintaxina I α-Mouse
vGluT 2 α-Mouse
MAB 336
75-067
Millipore Corporation
UC
Davis/NIH
1/10000
NeuroMab
1/200
Facility
Anticuerpos Secundarios
Peroxidase-Conjugated
Código
Compañía
Dilución
715-035-151
Jackson InmunoResearch
1/4000
705-035-147
Jackson InmunoResearch
1/4000
AffiniPure Donkey AntiMouse IgG
Peroxidase-Conjugated
AffiniPure Donkey AntiGoat IgG
HRP: Horseradish Peroxidase.
35
2.12. RT-PCR
Se realizó un análisis de la expresión de RNA mensajero en el LHA. Para llevar a cabo
la extracción de RNA, se realizó una microdisección bilateral del LHA y se depositó en tubos
eppendorff que contenían TRIZOL a 4°C. Se utilizó el protocolo recomendado por el
fabricante de TRIZOL (Invitrogen; Massachusetts, USA). Una vez obtenido el precipitado, se
resuspendió en 15µl de agua ultra pura (IDT, Iowa, USA) y se procedió a realizar un protocolo
para la eliminación de DNA genómico con DNAsaI (Ambion life technologies) según el
protocolo del fabricante. Se analizó la integridad del mRNA mediante gel de agarosa al 1% y
tinción con Syber Green (Invitrogen, life technologies). Las muestras de RNA se observaron a
la luz UV para visualizar las bandas de rRNA 28s y 18s. El mRNA se conservó a -80°C hasta
su uso.
Los mRNA obtenidos, se convirtieron a cDNA utilizando el protocolo recomendado
por el fabricante de la enzima Transcriptasa Reversa MMulV (Thermo Scientific). El cDNA
obtenido fue conservado a -20°C para análisis posteriores.
Las reacciones de PCR se realizaron utilizando partidores que reconocen de manera
específica CRH-R2, Orx y Ciclofilina, este último utilizado como control (Blanco y cols.
2006). Las condiciones de reacción y los partidores se muestran en la Tabla V. Todos los
PCRs se realizaron con la enzima Platinum®Taq DNA Polymerase (Invitrogen, life
technologies). El producto de PCR fue analizado en geles de agarosa al 2% y tinción con
Syber Green, utilizando un marcador de pares de bases de 100bp. Los productos se observaron
a la luz UV.
36
Tabla V. Condiciones de Reacción de PCR y Partidores.
Transcrito
CRH-R2
ORX
CyC
Condiciones de Reacción
- 3 min. desnaturación inicial a 94°C.
-Touchdown 15 ciclos de amplificación
(94°C por 30 seg., 65°C – 55°C por 30
seg, 72ºC por 30 seg.) Luego 20 ciclos
de amplificación (94°C por 30 seg.,
55°C por 30 seg., 72ºC por 30 seg.) y
extensión final de 10 min. a 72ºC.
- 3 min. desnaturación inicial a 94°C.
-35 ciclos de amplificación (94°C por
30 seg., 55°C por 30 seg, 72ºC por 30
seg.) y extensión final de 10 min. a
72ºC.
- 3 min. desnaturación inicial a 94°C.
-30 ciclos de amplificación (94°C por
30 seg., 58°C por 30 seg, 72ºC por 30
seg.) y extensión final de 10 min. a
72ºC.
Partidores
F: 5ˋ-AAGAGCTGCTTTTGGACGGCT-3ˋ
R: 5ˋ-GGCGATTCGGTAATGCAGGTCA-3ˋ
F: 5ˋ-CTTGGGTATTTGGACCACTG-3ˋ
R: 5ˋ-ACGTCTTCTGGCGACAGCAG-3ˋ
F: 5ˋ-CGTGCTCTGAGCACTGGGGAGAAA-3ˋ
R: 5ˋ-ATGCCTTCTTTCACCTTCCCAAAGAC-3ˋ
F: Forward; R: Reverse; ORX: Orexina; CyC: Ciclofilina.
37
2.13. Análisis Estadísticos
Para los análisis de prueba del test de CPP se utilizó el Test one-way repeatedmeasures ANOVA, con un post hoc test Newman-Keuls Multiple Comparison.
Para los análisis de participación de las neuronas provenientes de LH en la Recaída a la
búsqueda de droga inducida por estrés en CPP, se utilizó una comparación de T test entre la
recaída de las ratas tratadas con cocaína e inyectadas con Vehículo en el LH y ratas tratadas
con cocaína e inyectadas con B/M en LH. A éste test se le realizó una corrección de Welch.
Para los análisis de Microdiálisis de la conexión neuroquímica entre LH y VTA, se
realizó una comparación de T test con una corrección de Mann Whitney.
Las ratas con tratamiento de cocaína en CPP, se consideraron condicionadas si pasaban
un tiempo mayor en el compartimento pareado a la droga (Compartimento Blanco)
equivalente a dos desviaciones estándar del Grupo Control (Ratas Salino).
Los datos fueron analizados y graficados usando el Software GraphPad Prism 5.
38
III.
RESULTADOS
3.1. Conexión anatómica entre el LHA y el VTA
Mediante microdiálisis in vivo se observó un aumento en los niveles de glutamato en el
VTA luego de la estimulación de las neuronas del LHA confirmando la existencia de una
conexión anatómica de fenotipo glutamatérgico entre el LHA y el VTA, y se dimensionó su
impacto en el VTA. Para llevar a cabo este experimento se utilizaron ratas anestesiadas a las
que se les implantó una sonda de microdiálisis en el LHA y otra en el VTA. Como muestra la
figura 8, la estimulación en el LHA mediante la perfusión de K+110mM a través de la sonda
de microdiálisis aumentó significativamente los niveles de glutamato extracelular en el VTA
sugiriendo la existencia de una inervación glutamatérgica significativa desde el LHA al VTA.
Luego de observar la existencia de la inervación glutamatérgica entre el LHA y el
VTA, se analizó si estas neuronas expresan el receptor CRH-R2 en dichos terminales como
base anatómica para sustentar la hipótesis que CRH induce la recaída a la búsqueda de cocaína
por estrés activando receptores CRH-R2 ubicados en terminales glutamatérgicos originados
en el LHA. Como estrategia experimental se utilizó una preparación de sinaptosomas de VTA
desprovista de elementos postsinápticos descrita por Rodrigues y cols. (2005).
39
Liberación de Glutamato en VTA
200
% Liberación Glutamato
*
150
100
50
0
Basales
Estímulo
Figura 8. Liberación de glutamato en el VTA inducida por la estimulación del LHA. Se
observa el aumento en los niveles extracelulares de glutamato en VTA, luego del estímulo con
110mM de K+ en el LHA, respecto a los niveles basales antes del estímulo. Los datos se
expresan como porcentaje del basal. El nivel de glutamato extracelular en condiciones basales
fue de 5,3 ± 0,5 pmol/ul. Cada columna representa el promedio ± S.E.M de 3 animales, *p
<0.05. (T test con una corrección de Mann Whitney).
40
3.2. CRH-R2 se expresa en aferencias glutamatérgicas al VTA provenientes del
LHA
Se realizó inmunofluorescencia de sinaptosomas provenientes de VTA utilizando
anticuerpos contra CRH-R2; Orx como marcador de terminales provenientes del LHA
(Sakurai y cols, 1998; Peyron y cols. 1998; Hervieu y cols. 2001), y contra vGluT2, marcador
de terminales glutamatérgicos de origen subcortical (Geisler y cols. 2007). Los sinaptosomas
son terminales sinápticos aislados desde neuronas, que se obtienen por centrifugación
diferencial (Whittaker y cols. 1964). En ellos se encuentran elementos presinápticos que se
resellan unidos a fragmentos de membranas postsinápticas que conservan elementos
postsinápticos como las densidades postsinápticas. Estos sinaptosomas llevan a cabo
reacciones anabólicas y catabólicas características de células intactas, así como procesos
específicos de neuronas, como despolarización en respuesta a estimulación eléctrica,
liberación y recaptación de neurotransmisores (Erecińska y cols. 1996). Se ha descrito una
modificación de la preparación que permite obtener sinaptomas que sólo conservan la parte
presináptica de una sinapsis (Rodrigues y cols. 2005).
En primer lugar y para determinar que las preparaciones sinaptosomales obtenidas del
VTA estaban desprovistas de densidades post sinápticas, se analizó la presencia de PSD95,
marcador postsináptico y de Sintaxina I o Sinapsina I, marcadores presinápticos. En la figura
9a se observa, mediante Western Blot, la disminución de la proteína PSD95 a lo largo de la
preparación de sinaptosomas. Además se confirmó la disminución de PSD95 mediante
inmunofluorescencia en los sinaptosomas del VTA (Fig. 9b), existiendo un 4,6 ± 0,3 % de
sinaptosomas que tienen PSD95 respecto al total de sinaptosomas marcados (Fig. 9c).
41
Luego se realizó doble inmunofluorescencia para CRH-R2 y vGluT2. Como se observa en
la Fig. 10a, un total de 14,6% ± 5,9% de sinaptosomas que expresan CRH-R2 colocalizan con
vGluT2. El número de sinaptosomas positivos para vGluT2 es significativamente mayor que
los sinaptosomas marcados con CRH-R2, sugiriendo que los que expresan CRH-R2 se
encuentran concentrados en un subgrupo de aferencias glutamatérgicas subcorticales al VTA.
Para determinar si los terminales que contienen CRH-R2 se originan en el LHA, se realizó
doble inmunofluorescencia para CRH-R2 y Orx. Como se observa en la Fig. 10b, el 7,6% ±
2,6% de los sinaptosomas del VTA expresaron doble marca para CRH-R2 y OrxA.
Luego se realizó doble inmunofluorescencia contra OrxA y vGluT2 para analizar cuántos
de los terminales glutamatérgicos en el VTA provienen precisamente del LHA. Se observó
que el 25,3% ± 8,7% de los sinaptosomas del VTA que expresan vGluT2 colocalizan con
OrxA (Fig. 10c). También se realizó triple inmunofluorescencia para vGluT2, CRH-R2 y
OrxA. Como se observa en la Fig. 10d, el 3,6% ± 1,2% de los sinaptosomas presentaron triple
colocalización. Este resultado, sugiere fuertemente que los terminales glutamatérgicos que
expresan CRH-R2, provienen del LHA. El bajo porcentaje de colocalización observado podría
deberse a que no todos los terminales provenientes del LHA expresan OrxA.
Además mediante RT-PCR se confirmó que en el LHA se expresan ambos, el mRNA de
CRH-R2 y de Orx (Fig. 11a). Los productos de PCR fueron secuenciados y se confirmó que
correspondían al fragmento esperado (data no mostrada). Además, mediante Western Blot se
evidenció que vGluT2 y CRH-R2 están presentes en LHA y en sinaptosomas del VTA (Fig.
11b).
42
Figura 9. Análisis de la preparación de sinaptosomas de VTA. En (a) se observa el
Western blot de la preparación de sinaptosomas de VTA, donde P1: Pellet 1; SN1:
Sobrenadante 1; 3%: Fracción del 3% de la gradiente de Percoll; 23%: Fracción del 23% de la
gradiente de Percoll; SNF: Sobrenadante Final. Se cargaron 10µg de proteína por carril. En
(b), se observa la inmunofluorescencia de sinaptosomas de VTA, utilizando anticuerpos contra
Sinapsina I, como marcador pre sináptico y PSD95 como marcador post sináptico (el tamaño
de sinaptosomas varía entre 0,5µm-2,5µm). En (c), se muestra el promedio del porcentaje de
sinaptosomas ± S.E.M. de 5-7 campos desde 3 preparaciones sinaptosomales diferentes. El
total de sinaptosomas corresponde a la suma de sinaptosomas SIN I (sinapsina I) positivos y
PSD 95 positivos, de los cuales un 95,1%, corresponden a SIN I y el 4,9% a PSD 95.
43
44
45
Figura 10. Inmunofluorescencia en Sinaptosomas provenientes del VTA de rata. En la
figura (a) se observa colocalización en los terminales que expresan CRH-R2 y vGluT2, donde
el 20,9% corresponde a CRH-R2 y el 79,1% a vGluT2. En (b) se muestra la colocalización de
sinaptosomas que expresan OrxA y CRH-R2, donde el 68,5% corresponde a OrxA y el 31,5%
a CRH-R2. En (c), se observa la colocalización de sinaptosomas que expresan Orx A y
vGluT2 donde el 40,6% corresponde a OrxA y el 59,4% corresponde a vGluT2y en (d), se
observa triple colocalización donde un 34,1% corresponde a Orx, un 16,7% a CRH-R2 y un
49,2% a vGluT2 en sinaptosomas de VTA. El tamaño de los sinaptosomas varía entre 0,5µm2,5µm. Todos los gráficos muestran el promedio del porcentaje de sinaptosomas ± S.E.M. de
6-8 campos, desde 3 preparaciones sinaptosomales diferentes.
El total de sinaptosomas corresponde a la suma de sinaptosomas de cada preparación.
46
Figura 11. RT-PCR de mRNA extraído del LHA y Western Blot de proteínas extraídas
del LHA y de sinaptosomas del VTA. En (a), se muestra la presencia del transcrito de CRHR2 de 300pb y de Orexina (ORX) de 196pb, utilizando como control Ciclofilina (Cyc) de
300pb en el área del Hipotálamo Lateral (LH). La ausencia de enzima Transcriptasa Reversa
(-RT) y el control de PCR con H2O confirmaron la especificidad de las bandas observadas. pb:
pares de bases. En (b), se muestra la expresión de proteínas CRH-R2 y vGluT2 en la fracción
sinaptosomal pura (FSP) de VTA y en la muestra de LHA. Se cargaron 60µg de proteínas.
47
3.3. En la muestra de sinaptosomas del VTA se observan varicosidades reselladas
que contienen Orx
Al momento de realizar las inmunofluorescencias en sinaptosomas de VTA y para
dilucidar si los terminales provenientes del LHA expresan el receptor CRH-R2, se observó la
presencia de sinaptosomas con una forma diferente y con un mayor tamaño cercano a los 2µm,
y que en su mayoría expresaban OrxA. Revisando la literatura, se encontró que en el año
1978, Jonakait y cols. demostraron que se podían aislar varicosidades axonales reselladas
desde el sistema nervioso entérico usando una gradiente de sacarosa y Ficoll. Por otra parte,
Balcita-Pedicino y Sesack, el año 2007, demostraron mediante microscopía electrónica que la
mayoría de la inmunofluorescencia contra Orx en el VTA se observa en fibras de paso con
abundantes varicosidades y que sólo una pequeña proporción de los axones Orx-positivos
hacen sinapsis en las dendritas o somas de las neuronas DAérgicas y GABAérgicas del VTA.
Esto se correlaciona bien con las bajas proporciones de sinaptosomas con triple marca (Orx,
CRH-R2 y vGluT2) encontrados en el VTA.
En base al trabajo de Jonakait y cols. (1978), se decidió evaluar la presencia de
Secretogranina II (SGII) en los sinaptosomas Orx-positivos (Fig.12). SGII es una proteína de
la familia de las cromograninas, involucrada en el empaquetamiento y destinación de
hormonas y neuropeptidos a vesículas de secreción (Huttner y cols. 1991; Ozawa y Takata,
1995). Los resultados obtenidos muestran que un 32% de sinaptosomas son OrxA positivos y
un 68% expresan SGII, con una colocalización del 22% del total de sinaptosomas marcados.
Del total de sinaptosomas OrxA positivos, el 70,32% de los sinaptosomas también expresan
SGII. A las varicosidades reselladas obtenidas por la técnica de extracción de sinaptosomas, se
les denominó “varicosomas”.
48
Figura 12. Inmunofluorescencia de Varicosomas. En la figura se muestran sinaptosomas de
un tamaño cercano a los 2µm y con una estructura física diferente a los sinaptosomas
comúnmente encontrados en VTA. Se observa que la mayoría de los sinaptosomas que
expresan Orexina (OrxA), colocalizan con Secretogranina II (SGII). El gráfico muestra el
promedio del porcentaje de sinaptosomas de 6-8 campos, desde una preparación sinaptosomal.
El total de sinaptosomas corresponde a la suma de sinaptosomas.
49
3.4. CPP como modelo de recaída a la búsqueda de cocaína inducida por estrés
Como modelo de recaída a la búsqueda de cocaína por estrés se utilizó el paradigma de
CPP, el cual se puso a prueba.
Para realizar este experimento, se escogió un grupo control y un grupo cocaína (con un
n=6 en cada grupo) luego de realizar el Pre Test durante 15 min., las ratas tuvieron una mayor
preferencia inicial por el compartimento negro, por lo que la administración de cocaína-HCL
(15mg/Kg i.p.), fue administrada pareada al lado blanco, contrario al lado de la preferencia
inicial. Luego de los 7 días de condicionamiento, las ratas fueron sometidas a un protocolo de
extinción, durante 14 días con una inyección i.p. de salino, dos veces al día y finalizado el
proceso de extinción, las ratas fueron sometidas a estrés por footshock durante 15 min. con 0,5
mA. y pulsos de 0,5mseg, cada 40 ± 30 seg. Como se observa en el gráfico de la Fig. 13, las
ratas condicionadas con cocaína en el Test de Condicionamiento menos el tiempo del Pre Test,
prefirieron en promedio mayoritariamente el compartimento blanco (5,72 ± 1,10 minutos),
comparado con el grupo control (0,01 ± 0,3 minutos). Luego de 14 días de extinción, las ratas
entrenadas con cocaína, disminuyen el tiempo en el compartimento blanco comparado con el
Test de Condicionamiento (1,05 ± 0,75 minutos), siendo similar al tiempo del Test de
Extinción del grupo control (0,28 ± 0,16 minutos). Finalmente, los datos indican que el
método de CPP permite medir la recaída a la búsqueda de droga por estrés, ya que luego de
realizar el Test de Recaída post footshock, aumenta el promedio de tiempo que las ratas del
grupo cocaína prefieren el compartimento blanco, acercándose al tiempo en que
permanecieron en dicho lugar luego del condicionamiento (6,88 ± 1,78 minutos). Durante el
Test de Recaída, el grupo control permanece en promedio -0,42 ± 0,21 minutos en el
compartimiento blanco.
50
Cada animal, tanto del grupo cocaína como del grupo control, tiene un comportamiento
individual diferente en cuanto a los tiempos de condicionamiento, extinción y recaída, sin
embargo es posible visualizar que en conjunto el grupo cocaína se condiciona a la búsqueda de
cocaína, luego extingue su conducta cuando la droga deja de ser administrada y deja de asociar
el lado blanco con la droga y recaen a la búsqueda de droga tras un estímulo estresante. De
igual modo es interesante visualizar el comportamiento individual de cada rata en el
compartimento blanco y como muestra la figura 14, cada animal del grupo cocaína se
condiciona, extingue su conducta y recae. Los animales del grupo salino no varían
significativamente su preferencia por los compartimentos, de hecho no prefieren el
compartimento blanco, ya que nunca asociaron el efecto de alguna droga con el lugar.
3.5. Liberación de glutamato y DA en ratas freely moving durante CPP
El análisis de la liberación de glutamato y DA de VTA en ratas freely moving durante
CPP se realizó en ratas que han sido entrenadas en CPP y condicionadas a la droga. Se les
implantó la cánula guía sólo a las ratas que tienen preferencia por el lugar asociado a la droga,
para luego de tres días de recuperación, comenzar con el periodo de extinción (Ver Discusión).
La ejecución de este experimento presentó una serie de dificultades técnicas en su
realización. Los datos mostrados en la Fig. 15 se obtuvieron en dos ratas condicionadas a
cocaína y que cumplieron con los tiempos esperados de condicionamiento, extinción y recaída
(Fig. 15c). Sin embargo, la liberación de glutamato en el VTA, no es clara (Fig. 15a) y la de
DA tiene una tendencia al aumento (Fig. 15b).
51
Test - Pre Test
Compartimento Blanco
*
10
*
8
Tiempo (minutos)
Ratas Cocaína
Ratas Salino
6
4
2
Sal. Rec.
Coca Rec.
Sal. Ext.
Coca Ext.
Sal. Cond.
-2
Coca Cond.
0
Figura 13: Preferencia de Lugar Condicionado (CPP). Se observa la diferencia en tiempo
(minutos) del Test realizado luego de 7 días de condicionamiento (Cond.) con 15mg/Kg de
cocaína-HCL para ratas Cocaína (Barras Negras) o Salino para ratas Control (Barras Verdes) y
el Pre Test. Ext.: corresponde a la diferencia entre el Test de Extinción y el Pre Test, luego de
14 días de inyección con salino. En Recaída (Rec.) por estrés se ve la diferencia entre el Test
Recaída luego de 15 min. de footshock y el Pre Test. Cada columna representa el promedio ±
S.E.M de 6 animales, *p <0.05. (Test one-way repeated-measures ANOVA, con un post hoc
test Newman-Keuls Multiple Comparison).
52
Test - Pre Test
Compartimento Blanco
Coca 1
15
Coca 2
Coca 3
Coca 4
Tiempo (minutos)
10
Coca 5
Coca 6
Salino 1
Salino 2
5
Salino 3
Salino 4
Salino 5
Salino 6
0
Cond.
Ext.
Rec.
-5
Figura 14: Comportamiento individual en CPP. El gráfico muestra el comportamiento
individual de cada animal en CPP, durante el condicionamiento (Cond.), la extinción (Ext.) y
la recaída (Rec.). Cada punto corresponde a la diferencia de tiempo en minutos entre el Test y
el Pre Test, tanto de ratas tratadas con 15mg/Kg de cocaína (puntos negros), como de ratas
control, tratadas con solución salina (puntos verdes), sólo del compartimento blanco.
53
Figura 15. Liberación de glutamato y DA en ratas freely moving durante CPP. Se
recolectaron 2 muestras basales en la caja de mantención de la rata; luego 2 muestras durante
el test de extinción en las cajas de CPP; una muestra durante el footshock (FS) y dos muestras
durante el test de recaída. Cada muestra fue recolectada durante 10min. con una perfusión de
2uL/min. En (a) se observa un leve aumento de liberación de glutamato en VTA durante y
luego del FS; en (b) se observa una tendencia al aumento en la liberación de DA en VTA
durante y luego del FS. En (c) se observa el condicionamiento, extinción y recaída de las dos
ratas de manera individual a las que se les analizó la liberación de neurotransmisores en VTA.
En (a) y (b) se muestra el promedio de porcentajes de 2 ratas.
54
3.6. Participación de las neuronas provenientes de LHA y que expresan CRH-R2
en la recaída a la búsqueda de droga inducida por estrés
Con el fin de determinar la participación de las neuronas del LHA en la recaída al
consumo de cocaína por estrés, se realizó una inactivación reversible de las neuronas del LHA
con una inyección bilateral de los agonistas GABAB y GABAA, baclofeno/muscimol (B/M)
respectivamente. Luego de la inyección con B/M o Vehículo (Veh.), las ratas previamente
condicionadas a cocaína y con 14 días de extinción, fueron sometidas a footschock y se evaluó
la recaída a la búsqueda de droga por estrés en el CPP. Se evaluó el tiempo de
condicionamiento a la búsqueda de cocaína, el tiempo de extinción y la recaída tanto en los
animales del grupo Veh., como del grupo B/M. Como muestra el gráfico de la figura 16,
ambos grupos se condicionaron al lugar pareado a la droga permaneciendo un tiempo de 6,4±
1,2 minutos para el grupo Veh. y 6,7 ± 1,3 minutos para el grupo B/M. También se observa
que en ambos grupos se extinguió la conducta de preferencia por el compartimento blanco,
alcanzando 1,0 ± 0,6 minutos el grupo Veh. y 1,5 ± 0,8 minutos el grupo B/M. Lo interesante
es que luego de la inyección de Veh. en el área del LH, este grupo recae a la búsqueda de
cocaína inducida por estrés, pasando 10,1 ± 1,9 minutos en el compartimento asociado a la
droga, pero el grupo al que se le inyectó B/M en el LHA, no recae a la búsqueda de droga tras
un estímulo estresante, disminuyendo su tiempo en el compartimento blanco, incluso en
relación a su Pre Test (-0,3 ± 0,2 minutos). Por lo tanto, las neuronas del LHA tienen un papel
importante en la recaída a la búsqueda de cocaína inducida por estrés en ratas que han sido
entrenadas en el paradigma de CPP.
55
Test - Pre Test
Compartimento Blanco
Ratas tratadas con cocaína
15
***
Inyección en HL
con Vehículo
Inyección en HL
con B/M
Tiempo (minutos)
10
5
B/M Rec.
B/M Ext.
B/M Cond.
Veh. Rec.
Veh. Ext.
-5
Veh. Cond.
0
Figura 16. Inactivación de las neuronas del área del LH de ratas condicionadas a
cocaína. Las rata fueron sometidas al protocolo de condicionamiento a cocaína (15mg/Kg) en
las cajas de CPP, luego se les extinguió la preferencia por el lugar pareado a la droga por 14
días y antes del footshock, para analizar su recaída, se les inyectó de manera bilateral
Baclofeno/Muscimol (B/M) (1mM/0,1mM respectivamente) o Vehículo (Veh.) en el área del
LH (0,5uL en 2 min/lado con una bomba de perfusión). Veh. Cond. ó B/M Cond:
Condicionamiento del grupo Veh. ó B/M; Veh. Ext. ó B/M Ext: Extinción del grupo Veh. ó
B/M; Veh. Rec. ó B/M Rec.: Recaída del grupo Veh. ó B/M. Grupo Veh: n=6; Grupo B/M:
n=10. ***p<0.0001. (T test con corrección de Welch).
56
Al evaluar el comportamiento individual de cada animal, se observó que todos los
animales se condicionaron al lugar pareado a la droga (Fig. 17). Algunas ratas permanecieron
menos tiempo en el compartimento blanco, pero igualmente son ratas condicionadas, ya que
sus tiempos son mayores a dos desviaciones estándar que las ratas que recibieron salino. Se
observó extinción de la preferencia adquirida en todas las ratas, pero sólo las ratas que
recibieron una inyección de vehículo intra LHA, recayeron a la búsqueda de droga luego del
estímulo estresante. Las ratas que recibieron inyección con B/M en el LHA, permanecieron
tiempos similares a sus propios test de extinción en la caja pareada con la droga (Fig. 17).
Como se mencionó en el punto 3.5, medir la liberación de glutamato y DA en ratas
freely moving en CPP, generó bastantes problemas técnicos, por lo tanto, se decidió realizar
experimentos de liberación de glutamato tras la inactivación con B/M en ratas anestesiadas,
simulando el estrés por footshock con la perfusión de CRH en el VTA.
En la figura 18, se muestran los resultados de dos animales a los que se les administró
de manera forzada 15mg/Kg de cocaína i.p durante 7 días, dos veces al día y tras 1 día de
abstinencia, se les realizó la microdiálisis. A una rata se le perfundió vehículo a través de la
sonda de microdiálisis implantada en LHA y a la otra, se le perfundió B/M durante 10
minutos. Luego se perfundió, CRH intra VTA a ambas ratas durante 40 min. Consistente con
lo observado por Wang y cols. (2005), la perfusión intra VTA de CRH aumentó la liberación
de glutamato en el VTA en la rata que no recibió la inyección de B/M en el LHA. En cambio,
en la rata que recibió una inyección de B/M en el LHA, no se observó efecto de CRH. Estos
datos preliminares sugieren que
glutamatérgica desde el LHA al VTA.
CRH induce la liberación de glutamato de la vía
57
Test - Pre Test
Compartimento Blanco
Ratas tratadas con cocaína
Veh. 1
Veh.2
Veh. 3
15
Veh. 4
Veh. 5
Tiempo (minutos)
Veh. 6
10
B/M 1
B/M 2
B/M 3
5
B/M 4
B/M 5
B/M 6
0
B/M 7
B/M 8
Cond.
Ext.
Rec.
-5
B/M 9
B/M 10
Figura 17. Comportamiento individual en CPP de ratas B/M y Vehículo tratadas con
cocaína. El gráfico muestra el comportamiento individual de cada animal en CPP, durante el
condicionamiento (Cond.), la extinción (Ext.) y la recaída (Rec.). Cada punto corresponde a la
diferencia de tiempo en minutos entre el Test y el Pre Test, tanto de ratas a las que se les
inyectó vehículo (Veh.) en el LH antes del footshock (puntos naranjos), como ratas a las que se
les inyectó baclofeno/muscimol (B/M) en el LH antes del footshock (puntos azules). Se
muestra el comportamiento de cada animal sólo en el compartimento blanco.
58
Liberación de glutamato en VTA
Ratas con Cocaína (7d. coca + 1d.abst)
8
Iny. Vehículo en HL y
CRH en VTA
pmol/uL
6
B/M
o Veh.
Iny. B/M en HL y
CRH en VTA
4
2
CRH
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Tiempo (min)
Figura 18. Efecto de la administración intra VTA de CRH sobre los niveles
extracelulares de glutamato en el VTA de ratas previamente expuestas al protocolo de
administración repetida de cocaína. Tras inyectar 10µM de CRH en VTA. La infusión de
CRH en el VTA de ratas anestesiadas se hizo 10 min después de inyectar una mezcla de
baclofeno y muscimol (B/M) en el LHA. Los puntos naranjas muestran el resultado de una
rata que recibió una inyección de vehículo (Veh.) en el LHA. Los puntos azules muestran los
resultados de una rata que recibió una inyección de B/M en el LHA.
59
IV.
DISCUSION
4.1. Aferencia glutamatérgica desde el LHA hacia el VTA
Las aferencias glutamatérgicas al VTA tienen un papel importante en la regulación de
la actividad de las neuronas DAérgicas y se ha visto que la acción glutamatérgica en el VTA
es crítica para el efecto de drogas de abuso. Harris y Aston-Jones (2003) observaron que la
inyección de antagonistas de los receptores NMDA y AMPA en el VTA, antes de la prueba de
CPP, bloquea el desarrollo de la conducta de preferencia por el lugar asociado a cocaína, lo
que indica que la actividad glutamatérgica en el VTA puede ser crucial en el aprendizaje de
asociar el ambiente con la droga. De igual manera, Harris y cols. (2004), observaron que la
plasticidad asociada a glutamato en el VTA, es necesaria para el condicionamiento a morfina
en CPP.
Geisler y cols. (2007), identificaron el origen de las aferencias glutamatérgicas que
proyectan al VTA, combinando traza retrograda inyectada en VTA con hibridación in situ con
sondas específicas para vGluTs 1, 2 y 3. Ellos observaron que los mRNAs de los tres vGluTs
están distribuidos con poca o nula colocalización entre ellos y que se encuentran en distintas
áreas del cerebro. Ellos mostraron que la aferencia glutamatérgica al VTA de origen
subcortical (vGluT2 positivas) más abundante correspondía al LHA. Interesantemente, el LHA
ha sido relacionado al procesamiento de gratificación (Harris y cols. 2005; 2007). Además, se
ha mostrado que es la región del cerebro que presenta mayores modificaciones
transcripcionales luego de un tratamiento repetido con cocaína (Ahmed y cols. 2005).
60
En éste trabajo de tesis, se confirmó mediante neuroquímica, la existencia de una
conexión glutamatérgica entre el LHA y VTA. Al estimular el LHA con K+110mM se provoca
un aumento significativo en los niveles extracelulares de glutamato en el VTA (Fig. 8). En el
desarrollo de esta tesis se analizó si esta conexión era trascendental en la recaída a la
búsqueda de cocaína tras un estímulo estresante.
4.2. Expresión de CRH-R2 en terminales glutamatérgicos del VTA que provienen
del LHA
Una vez que se confirmó la conexión glutamatérgica entre el LHA y VTA, se determinó
si los receptores CRH-R2 se expresan en los terminales glutamatérgicos del VTA provenientes
del LHA. Los resultados mostraron que hay gran cantidad de sinaptosomas de VTA que
expresan el neuropéptido Orx, lo que da cuenta de la presencia de neuronas orexinérgicas que
proyectan desde el LHA hacia el VTA. Además se observó la presencia de receptores CRHR2 en terminales del VTA glutamatérgicos que contienen OrxA. Sin embargo, solo se observó
un bajo número de terminales del VTA que expresaran vGluT2, Orx y CRH-R2. El hecho de
que no se haya encontrado un alto número de terminales glutamatérgicos que expresaran
CRH-R2 y OrxA, puede deberse a que no todas las aferencias desde el LHA al VTA sean
glutamatérgicas y viceversa. También es posible que este bajo número se deba a diferencias en
la localización subcelular de las tres proteínas en estudio en los mismos terminales. Orx se
almacena en vesículas grandes a diferencia de vGluT2 que se expresa en vesículas pequeñas.
Rosin y cols. (2003) examinaron la colocalización entre la inmunoreactividad de Orx y el
mRNA para vGluT2 y detectaron que alrededor de un 50% de las neuronas que son
orexinérgicas, además expresan el mRNA de vGluT2, por lo tanto, hay otro 50% de la
61
población de neuronas Orx positiva que proyectan al VTA que no están acompañadas de
glutamato. Ellos realizaron el mismo protocolo con mRNA de GAD 67 (glutamato
descarboxilasa 67), pero ninguna de las neuronas orexinérgicas eran GABAérgicas. Rosin y
cols. analizaron glutamato y GABA, basados en la evidencia de Hökfelt y cols. (2000) que
muestra que las neuronas peptidérgicas utilizan dichos neurotransmisores como su transmisor
primario.
Como se mencionó anteriormente, los resultados obtenidos con sinaptosomas
documentan la expresión de receptores CRH-R2 en terminales glutamatérgicos del VTA
provenientes del LHA. Estos datos anatómicos son consistentes con los resultados de
expresión del mRNA (mediante RT-PCR) y de proteína (mediante Western blot) de CRH-R2
en el LHA, obtenidos en esta tesis. Anteriormente se había reportado que el LHA expresaba
niveles bajos del mRNA de CRH-R2 usando hibridación in situ (Chalmers y cols. 1995; Van
Pett y cols. 2000). La diferencia en la magnitud de expresión del receptor CRH-R2 en el LHA
entre los trabajos anteriores y esta tesis puede deberse a la diferente metodología utilizada.
¿Qué zona específica del LHA estaría involucrada en la recaída a la búsqueda de cocaína
por un estimulo estresante? ¿Tiene Orx un papel importante en la recaída a la búsqueda de
droga por estrés? Las respuesta a éstas interrogantes aún no son del todo claras. Harris y cols.
(2005), determinaron que la estimulación por footshock induce un aumento de c-Fos en las
neuronas orexinérgicas de las subregiones PeF y DMH, pero no de LH del LHA. Sin
embargo, otros autores han propuesto que la activación de las neuronas del LHA puede ser
secundaria a la respuesta gratificante y no la responsable de dicha respuesta (Boutrel y cols.
2005; revisado en Harris y Aston-Jones, 2006).
62
Como se mencionó en el punto 4.1, se ha demostrado que una inyección de cocaína
induce LTP en neuronas dopaminérgicas del VTA, dependiente de la activación de receptores
NMDA (Ungless y cols. 2001; Borgland y cols. 2004, 2006). Esta transmisión vía glutamato y
plasticidad en el VTA son importantes para el CPP de cocaína y morfina (Harris y AstonJones, 2003; Harris y cols. 2004). Hay trabajos que muestran que la Orx estaría involucrada,
interactuando en la función de glutamato en neuronas DAérgicas del VTA. Esta interacción
puede ser significativa en la conducta asociada a drogas de abuso. Borgland y cols. el 2006
mostraron que la plasticidad inducida por cocaína en neuronas DAérgicas del VTA, depende
de inputs orexinégicos, ya que cuando se co-administra el antagonista del receptor Orx 1, SB
334867 (SB) con cocaína, se bloquea el LTP dependiente de glutamato en las neuronas
DAérgicas del cerebro medio. Además mostraron que la inyección de SB sistémica o
directamente en el VTA bloquea el desarrollo de sensibilización locomotora que se observa
luego de inyecciones repetidas de cocaína. Por lo tanto, Orx tiene un papel importante en la
plasticidad de neuronas DAérgicas del VTA. Aston-Jones y cols. (2009) señalan que los
inputs glutamatérgicos al VTA podrían ser modulados por Orx.
Como se mencionó anteriormente, Rosin y cols. (2003) mostraron que al menos el 50%
de las neuronas Orx del LHA co-expresan Orx y glutamato. La co-liberación de estos
neurotransmisores podría producir un aumento del manejo excitatorio del VTA desde el LHA.
63
4.3. Varicosomas del VTA inmunoreactivos para orexina
Balcita-Pedicino y Sesack (2007) demostraron, mediante microscopía electrónica, que la
Orx en el VTA se encuentra principalmente en fibras de paso con abundantes varicosidades y
que sólo una pequeña proporción de la Orx se observa en terminales axónicos que hacen
sinapsis en dendritas o somas de las neuronas DAérgicas y GABAérgicas del VTA. Existe
evidencia que muestra que al igual que los terminales axónicos, las varicosidades se pueden
resellar cuando se hace una preparación sinaptosomal. Jonakait y cols. (1978) demostraron que
se podían aislar varicosidades axonales reselladas desde el sistema nervioso entérico usando
ultracentrifugación diferencial con una gradiente de sacarosa o Ficoll. Por lo tanto, es posible
que con el protocolo utilizado en esta tesis para resellar sinaptosomas de VTA, se resellen
también varicosidades que contengan Orx. Esto se correlaciona bien con las bajas
proporciones de sinaptosomas con triple marca (Orx, CRH-R2 y vGluT2) encontrados en el
VTA y el alto porcentaje de sinaptosomas de mayor tamaño a los que hemos llamado
“varicosomas” que expresan Orx y el marcador de vesículas grandes SGII (70,3%). Además,
al realizar inmunofluorescencia de sinaptosomas de VTA contra Orx y SIN I (marcador
presináptico), se observa que el 41,2 % de los sinaptosomas que expresan SIN I, son Orx
positivos, lo que se relaciona con lo visto por Balcita-Pedicino y Sesack (2007). Torrealba y
cols. (2003), mostraron que las aferencias orexinérgicas que proyectan hacia las neuronas
tuberomamilares presentan una segregación espacial de las vesículas orexinérgicas y
glutamatérgicas. Ellos observaron que la inmunoreactividad para Orx se localiza en vesículas
de centro denso, mientras que glutamato está en vesículas sinápticas pequeñas, fenómeno
similar al que podría estar ocurriendo en el VTA.
64
Por otro lado, SIN I, está preferencialmente asociada con la superficie citoplasmática de
vesículas sinápticas pequeñas (Matteoli y cols. 1988), lo que explicaría el menor porcentaje de
colocalización entre Orx y SIN I en sinaptosomas del VTA.
4.4. Recaída a la búsqueda de cocaína inducida por estrés en CPP
El protocolo utilizado para analizar la recaída a cocaína por un estímulo estresante como
footshock, demuestra su utilidad y consistencia para realizar este tipo de análisis. Sin embargo,
en el CPP, no todas las ratas sometidas a condicionamiento, se condicionan a cocaína, ya que
de las ratas entrenadas, una de cuatro no aumentó su tiempo de permanencia en el
compartimento blanco. Uno de los datos importantes de analizar al momento de condicionar
ratas en CPP, fue el de la exploración en las cajas de CPP durante el Pre Test. Se vio una
correlación entre las ratas Exploradoras (E) y Condicionadas (C) versus ratas No Exploradoras
(NE) y No Condicionadas (NC). Las ratas E son aquellas que salen del compartimento negro
hacia el pasillo, incluso explorando por bajos segundos el compartimento blanco. Las ratas
NE, no salen del compartimento negro durante todo el Pre Test. Por lo tanto, se comenzó a
utilizar éste criterio para condicionar a un grupo determinado de ratas. Sólo las ratas E, se
condicionaron a cocaína.
Inicialmente se decidió que las ratas que se utilizarían para los experimentos de análisis
neuroquímico en VTA de las ratas sometidas a CPP, serían primero sometidas a la
implantación de las cánulas guías para las sondas de microdiálisis en el VTA, antes del
condicionamiento. Para nuestra sorpresa, ninguna rata previamente canulada se condicionó a
cocaína (Ver Anexo 7.1). Una posible explicación es que las ratas se mantuvieron aisladas en
cajas individuales luego de la operación. Al parecer la socialización es un factor importante en
65
la preferencia de lugar asociada con cocaína. Schenk y cols. (1986) mostraron que si las ratas
se mantienen en cajas individuales por seis semanas, antes del condicionamiento, muestran
insensibilidad a cocaína en CPP, contrario a lo que ocurre con las ratas que se mantienen en
grupos de cuatro. Ellos concluyeron que el ambiente social temprano puede influir en el
desarrollo del sistema nervioso, afectando la sensibilidad a la dependencia inducida por drogas
en ratas adultas. Otros estudios muestran que las ratas mantenidas en grupo son más sensibles
que las ratas aisladas; por ejemplo, para el efecto recompensante de morfina y heroína en CPP
(Schenk y cols. 1983; Wongwitdecha y cols. 1996; Condereau y cols. 1997). Aun no se
conocen las razones del por qué las ratas aisladas son menos sensibles al condicionamiento de
drogas. Smith y cols. (2003), han propuesto que un factor que podría estar involucrado, es la
biodisponibilidad distinta de la droga en ambos grupos, ya que los animales mantenidos en
ambientes enriquecidos o en grupo, tienen bajo peso, hígados pequeños y capilares cerebrales
de mayor calibre que los animales aislados, lo que conlleva a una mejor biodisponibilidad de
la droga.
Se intentó poner dos ratas por caja, pero como se muestra en el Anexo 7.1, las ratas se
muerden la cánula guía entre ellas. Por lo tanto, el procedimiento que se llevó a cabo fue
condicionar primero las ratas y luego operar sólo las ratas que tienen preferencia por el lugar
asociado a la droga, para luego de tres días de recuperación, comenzar con el periodo de
extinción.
4.5. Microdiálisis freely moving en ratas sometidas a CPP
Como se observa en los datos de la figura 15, no hay un efecto evidente del footschock
sobre los niveles extracelulares de glutamato en el VTA (Fig. 15a) y en el caso de DA se
66
observó una tendencia al aumento (Fig. 15b). Este procedimiento tuvo bastantes dificultades
técnicas, entre ellas, la dificultad de maniobrar las mangueras de entrada y salida de la sonda
de microdiálisis durante CPP. Las mangueras de entrada y salida de la perfusión intra VTA,
debían ser de aproximadamente un metro de largo. Dicho largo, podría extender el tiempo de
salida del contenido extracelular de VTA, por lo tanto, los niveles de glutamato y DA
detectados durante cada test, podrían no corresponder a los niveles reales del momento en que
se realiza cada test. Otro factor que influye en la realización de CPP es la presencia del
investigador muy cerca de las cajas de condicionamiento y el hecho de tener mangueras
manipuladas por el investigador durante la microdiálisis y los tests de CPP, hace inevitable la
cercanía al animal, lo cual puede afectar su conducta durante el test.
4.6.
La actividad de las neuronas del LHA es esencial para la recaída a la
búsqueda de la droga inducida por estrés
Se determinó que las neuronas del LHA participan en la recaída al consumo de cocaína
por estrés, mediante la inactivación reversible de las neuronas del LHA con una inyección
bilateral de B/M. Como muestra la figura 16, el grupo al que se le inyectó B/M en el LHA, no
recae a la búsqueda de droga tras un estímulo estresante. Por lo tanto, las neuronas del LHA
tienen un papel importante en la recaída a la búsqueda de cocaína inducida por estrés en ratas
que han sido entrenadas en el paradigma de CPP.
La metodología utilizada para inactivar las neuronas del LHA se ha usado de manera
exitosa por otros investigadores para determinar el papel del LHA en el restablecimiento de la
búsqueda de recompensantes en una conducta que había sido previamente extinguida. Es así
como Marchant y cols. (2009), demostraron que la inactivación reversible del LHA por la
67
infusión de B/M, previene el restablecimiento de la búsqueda de alcohol y sacarosa en CPP
inducida por contexto asociado a la administración previa. Si bien, los resultados de liberación
de glutamato en ratas administradas con cocaína de manera forzada y perfundidas a través de
la sonda de microdiálisis con B/M en LHA, son preliminares, sugieren que CRH induce la
liberación de glutamato de la vía glutamatérgica desde el LHA al VTA.
La inactivación de las neuronas del LHA por inyección de B/M, no determina qué tipo
neuronal es el que está participando en la recaída a la búsqueda de cocaína por estrés, pero por
los resultados de ésta tesis y lo señalado por Wang y cols. (2007 y 2009) se trataría de
neuronas glutamatérgicas que contienen el receptor CRH-R2. Estudios posteriores son
necesarios para determinar si dichas neuronas son además orexinérgicas. Se ha mostrado que
tanto la perfusión de OrxA intra VTA o la exposición a estrés por footshock reinstalan la
búsqueda de cocaína y liberación de glutamato y dopamina en VTA (Wang y cols. 2009). El
efecto observado se bloquea por un antagonista selectivo de OrxA, pero no por un antagonista
de CRH. Además el efecto neuroquímico y conductual de OrxA fue atenuado, pero no
bloqueado por un antagonista de receptores ionotrópicos de glutamato, que si bloquea el
restablecimiento a la búsqueda de cocaína por estrés y la liberación de glutamato (Wang y
cols. 2009).
4.7. Modelo de trabajo
Los resultados de esta tesis y la literatura examinada, respaldan el modelo de trabajo
presentado en la figura 19. En la condición sin experiencia a cocaína existe una liberación
tónica de glutamato, CRH y DA en el VTA. En ratas con experiencia a cocaína y que han
pasado por un periodo de extinción, tras un estímulo estresante, se activan las neuronas
68
glutamatérgicas que provienen del LHA y que tienen el receptor CRH-R2 en el terminal.
Luego de un estímulo estresante, aumenta la liberación de CRH en el espacio sináptico del
VTA, este CRH se une a su receptor CRH-R2, provocando la liberación de glutamato desde
las vesículas (Wang y cols. 2005 y 2007), éste aumento en la liberación de glutamato provoca
la activación de las neuronas DAérgicas del VTA y el aumento en la liberación
somatodendrítica de éste neurotransmisor. La activación de las neuronas DAérgicas
desencadena la respuesta de recaída a la búsqueda de cocaína, producto de la activación de la
PFC vía NAc core (McFarland y cols. 2004).
La administración intra VTA de CRH induce un aumento en la actividad locomotora
espontánea de ratas, indicando que existen compartimentos celulares dentro del VTA que
responden a CRH (Kalivas y cols. 1987). Se ha establecido mediante microscopía electrónica
que CRH se concentra en terminales axónicos en el VTA, formando sinapsis sobre neuronas
DAérgicas y no DAérgicas (Tagliaferro y Morales 2008). Además el hecho que la perfusión
intra VTA de ácido quinurénico (antagonista de receptores glutamatérgicos) evita la recaída a
la búsqueda de droga inducida por estímulos estresantes sugiere que CRH actúa directamente
sobre los terminales glutamatérgicos del VTA (Wang y cols. 2005). El CRH presente en VTA
proviene desde el BNST, desde el núcleo de la amígdala central (CeA) y el núcleo
paraventricular del hipotálamo (Rodaros y cols. 2007). Los resultados de esta tesis
documentan la presencia de receptores CRH-R2 en los terminales glutamatérgicos del VTA
originados en el LHA.
No se puede descartar que además del LHA existan otras aferencias glutamatérgicas
subcorticales que proyectan al VTA que podrían participar en la sensibilización a CRH/CRHR2 observada en las ratas con experiencia a cocaína. Entre las aferencias que podrían tener un
69
rol están las del BNST y del núcleo pedúnculopontino (PPT). Sin embargo, Geisler y cols.
(2007), mostraron que la aferencia glutamatérgica proveniente del BNST tiene baja incidencia
en el VTA. El PPT aun no ha sido evaluado si participa en la recaída a la búsqueda de cocaína
por estrés, pero a pesar de que expresa el mRNA para vGluT2, no hay evidencia que exprese
el mRNA para CRH-R2 (Chalmers y cols. 1995; Van Pett y cols. 2000).
Por otro lado y como complemento a nuestro modelo, en la tesis de doctorado de
Katherine Araya se mostró que la sensibilización de la liberación de glutamato en el VTA
inducida por la exposición repetida a cocaína, se debe a interacciones moleculares y
funcionales entre los receptores CRH-R2 y DA-D1 presentes en los terminales
glutamatérgicos.
70
Figura 19. Modelo del papel de las neuronas glutamatérgicas del LHA en la
recaída a cocaína inducida por estrés. En el esquema superior, se ve que en condiciones sin
experiencia a cocaína existe una liberación tónica de glutamato, CRH y DA en VTA. En el
esquema inferior, con experiencia a cocaína y luego de un periodo de extinción, tras un
estímulo estresante, se activan las neuronas glutamatérgicas que provienen del LHA y que
tienen el receptor CRH-R2 en el terminal. Luego de un estímulo estresante, aumenta la
liberación de CRH en el espacio sináptico del VTA, éste CRH se une a su receptor CRH-R2,
provocando la liberación de glutamato y la consecuente liberación de DA.
71
V.
CONCLUSIONES
La realización de ésta tesis, nos permite concluir:
La perfusión de K+110mM a través de una sonda de microdiálisis en LHA provoca un
aumento en los niveles extracelulares de glutamato en el VTA.
Se determinó que los terminales glutamatérgicos provenientes del LHA, expresan el
receptor CRH-R2. En sinaptosomas provenientes del VTA de ratas controles se realizó
inmunofluorescencia para CRH-R2, Orx como marcador de neuronas del LHA y vGluT2.
En el VTA existen terminales glutamatérgicos que expresan CRH-R2 y que provienen
del área del Hipotálamo Lateral.
Nuestros resultados de CPP, dan cuenta de que el paradigma de preferencia a lugar
condicionado es útil para estudiar recaída a la búsqueda de cocaína producida por un estímulo
estresante.
Se determinó la participación de las neuronas del LHA en la recaída al consumo de
cocaína por estrés. La activación de las neuronas del LHA es necesaria para la recaída a la
búsqueda de cocaína gatillada por estrés en CPP. Los resultados muestran que la inactivación
del LHA provoca el bloqueo de la liberación de glutamato en VTA inducida por la inyección
de CRH intra VTA en ratas con experiencia a cocaína.
72
VI. PROYECCIONES
Si bien se ha logrado determinar la importancia de las neuronas glutamatérgicas del
LHA en la recaída a cocaína inducida por estrés, aún queda por determinar si la recaída a la
búsqueda de cocaína por estrés depende de los receptores CRH-R2 expresados en las
aferencias glutamatérgicas provenientes del LHA hacia el VTA. Para llevar a cabo éste
objetivo en estudios futuros se hará un knockdown (KD) del receptor CRH-R2 inyectando un
lentivirus con un shRNA de CRH-R2 en el LHA de ratas entrenadas en CPP con cocaína y
sometidas a estrés para analizar la recaída.
Para el desarrollo de esta proyección, se realizó una estadía en el laboratorio de la Dra.
Ulrike Heberlein, en el Ernest Gallo Clinic & Research Center de la UCSF, San Francisco,
California, Estados Unidos. Durante esta estadía se logró generar el lentivirus con un shRNA
para CRH-R2 el que se probó en ensayos in vitro (los resultados se muestran en Anexo 7.2.)
73
VII.
ANEXOS
7.1. Condicionamiento en CPP de ratas canuladas versus ratas no canuladas
Cómo se mencionó en el punto 4.4 de la discusión, cuando las ratas fueron canuladas
antes del condicionamiento, no se condicionaron a cocaína en el CPP. Durante su recuperación
debieron mantenerse de manera aislada, de lo contrario, se comían las cánulas entre ellas. Este
aislamiento fue suficiente para impedir el desarrollo del condicionamiento a cocaína. Cuando
se condicionó un grupo de cuatro ratas que estaban juntas en su caja de mantención (sin
canulación), se observó que todas se condicionan (Fig. 20), por lo tanto la socialización es un
factor importante en el desarrollo de la preferencia al lugar asociada con cocaína.
7.2. Silenciamiento de CRH-R2 mediante shRNA
Un método efectivo para estudiar el papel particular de un gen o un set de genes en
procesos biológicos de interés, es estudiar las consecuencias funcionales de la perturbación o
silenciamiento del gen. Con el fin de evaluar el papel del receptor CRH-R2 en la recaída a
drogas por estrés de las aferencias glutamatérgicas provenientes de LHA, se manipulará su
expresión mediante un KD del receptor con un RNA de interferencia o RNAi.
El proceso de RNAi fue descrito en 1998 por Fire y cols., quienes demostraron que la
inyección de RNAs de doble hebra (dsRNA) en Caenorhabditis elegans, induce un
silenciamiento eficiente post transcripcional de genes. Desde su descubrimiento, el RNAi se
ha convertido rápidamente en una herramienta potente para suprimir o modular la expresión
74
de genes en sistemas mamíferos (Novina y Sharp. 2004). Para el silenciamiento de genes vía
RNAi, se pueden utilizar shRNAs (short hairpin RNA), una secuencia de RNA que forma una
horquilla estrecha. El shRNA es un RNAi artificial, cuya estructura de horquilla es cortada por
la maquinaria celular en pequeños RNAs de interferencia (small RNA, siRNA) por una
nucleasa denominada DICER (Ketting y cols. 2001), éstos siRNAs tienen 21-22 nucleótidos,
son doble hebra con extremos 5´Fosfato y 3´OH y son incorporados en un complejo
multiprotéico conocido como RISC (Complejo de silenciamiento inducido por RNA) con
actividad helicasa, exonucleasa y endonucleasa. La subunidad helicasa del complejo,
desenrolla el dúplex de siRNA y la hebra antisentido (AS) se aparea con el mRNA de la
célula, el cual es escindido. De ésta manera, el transcrito shRNA, procesado en la célula para
generar un siRNA, provocaría el silenciamiento de un gen blanco (Martinez y cols. 2002).
75
CPP Ratas Canuladas
v/s
Ratas No Canuladas
Tiempo (minutos)
15
A. Ratas Canuladas
B. Ratas No Canuladas
***
10
5
0
Pre Test A Test CPP A Pre Test B Test CPP B
Figura 20: Ratas canuladas antes del condicionamiento versus ratas no canuladas. En la
parte superior se observa que las ratas con cánula guía para sonda de microdiálisis que
permanecen solas en su caja de mantención, no se condicionan a cocaína, contrario a lo que
ocurre con las ratas no canuladas y que permanecen en grupos de 4 en su caja de mantención.
Cada columna representa el promedio ± SEM de 4 animales, ***p <0.05. En la parte inferior
izquierda se observa la cánula guía completa; en la parte inferior derecha, la cánula guía
mordida por otra rata que permanecía en la misma caja de mantención.
76
Ensayos in vitro:
Para la generación de lentivirus de segunda generación se usaron 3 vectores: Un vector
de transferencia, que contiene el shRNA de CRH-R2 o el shRNA scramble (SCR); el vector
de empaquetamiento y el vector de envoltura.
El vector de transferencia con el shRNA de CRH-R2 fue donado por el doctor Alon
Chen del Departamento de Neurobiología, Instituto Weizmann de Ciencia, Israel. La
secuencia target del shRNA del ORF (open reading frame) de CRH-R2 de rata, fue clonado en
un
cassette
de
expresión
con
un
promotor
H1
en
el
constructo
lentiviral
p156RRLsinPPTCMV-GFP-PREU3Nhe (Fig. 21). Los constructos con el shRNA fueron
generados por síntesis de oligonucleótidos compuestos de un único sitio de restricción XbaI
en el extremo 5´; una secuencia de 5 adenosinas como templado de la señal de término del
promotor de la Pol III; 19 nucleótidos de la hebra sentido y antisentido de CRH-R2, separados
por 9 nucleótidos que conforman el loop de la horquilla y 20 nucleótidos complementarios a el
extremo 3´ del promotor de la Pol III, H1. Los oligonucleótidos usados fueron los siguientes
(en verde se muestra la hebra sentido y antisentido de CRH-R2):
5´-CTGTCTAGACAAAAAAGGGTCAACTACTCACACTTCTCTTGAAAGTGAGTAGTTGACCCTGGGGATCTGTGGTCTATACA-3´
Loop
La generación de partículas virales fue realizado en células HEK 293FT (Invitrogen,
R700-07), usando como vector de empaquetamiento psPAX (Addgene Plasmid 12260) y
como vector de envoltura, pMD2.G (Addgene Plasmid 12259).
77
Figura 21. Mapa del Vector Lentiviral de CRH-R2. En la parte superior del vector, se
muestran los componentes principales del vector. H1: Promotor H1 Humano de la RNA
Polimerasa III para la generación de transcritos de shRNA; cPPT: Tracto central de
polipurinas que mejora la eficiencia de la transducción; ψ: Señal de empaque y dimerización;
RRE: Elemento de respuesta a Rev; WPRE: Elemento regulatorio post transcripcional
(Woodchuck Hepatitis Virus).
78
Luego de la obtención de los virus, se realizó la titulación de éstos. Para realizar la
titulación de virus se utilizó un kit de ELISA de la proteína p24 del virus HIV. Se logró
obtener un título viral del orden de los 107 pg/mL de virus para ambos shRNA, tanto el SCR,
como el de CRH-R2, cantidad suficiente para infectar el LHA de cerebros de ratas.
Para analizar el knockdown (KD) in vitro, se utilizaron células PC12, ya que ésta línea
celular derivada de rata, expresa de manera endógena el receptor CRH-R2 (Fig. 22).
En primer lugar, se evaluó el funcionamiento del lentivirus por la expresión de GFP, ya
que el vector de transferencia tiene dicha proteína como marcador de expresión. En la figura
23 es posible ver la infección de células PC12 (2pg de virus por célula) en un 78,4% para el
lentivirus SCR (Fig. 23b) y 95,16% para CRH-R2 (Fig. 23d), por lo tanto, ambos virus son
capaces de infectar las células PC12.
Posteriormente se infectaron células PC12 para analizar el KD del gen CRH-R2 a
través de PCR cuantitativo (Q-PCR). Se hizo una infección de 2pg de virus por célula y como
se observa en la figura 24., se logró obtener un silenciamiento de un 90%, respecto a la
expresión del control endógeno GAPDH.
Ensayos in vivo:
En primer lugar y con el fin de demostrar la infección a través de la expresión de GFP,
se inyectó 2uL de virus por lado en el área del LH (3.3 mm posterior a bregma; 1.6 mm lateral
y 7.0 ventral) y posterior a 2 semanas de infección con el lentivirus SCR y CRH-R2, las ratas
fueron perfundidas con una solución de paraformaldehido al 4% y posteriormente los cerebros
fueron deshidratados en sacarosa al 20%. Como se muestra en la figura 25, ambos lentivirus
infectan las células del área del LH.
79
Se realizaron esfuerzos para probar, en ratas expuestas a CPP, el bloqueo de la recaída
a la búsqueda de cocaína por un estímulo estresante, tras la inyección del lentivirus de CRHR2 en el LHA, pero los resultados no fueron concluyentes, por lo que se están realizando
pruebas para mejorar el KD del receptor, lo que incluye aumentar el título viral.
80
Figura 22. Expresión endógena de CRH-R2 en células PC12. En la figura se observa un
RT-PCR convencional para CRH-R2. +RT: con enzima Transcriptasa Reversa; -RT: sin
enzima Transcriptasa Reversa. bp: pares de bases.
81
a
b
c
d
Figura 23. Expresión de GFP en células PC12 infectadas con virus de shRNA CRH-R2 y
shRNA SCR. En (a) se observa el total de células PC12 infectadas con el lentivirus SCR y en
(b), el porcentaje de estas células que expresan GFP. En (c) se observa el total de células PC12
infectadas con el lentivirus CRH-R2 y en (d), el porcentaje de éstas células que expresan GFP.
82
Expresión, CRH-R2/Gadph
Knockdown de CRH-R2 en células PC12
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
SCR
CRH-R2
NT
Plásmido shRNA
Figura 24. Knockdown de CRH-R2 en células PC12 determinado por Q-PCR. En la figura
se observa una expresión del gen de CRH-R2 del 10% respecto a GADPH, por lo tanto, un
silenciamiento del gen de CRH-R2 en células PC12 de un 90%. Todos los valores fueron
normalizados respecto al shRNA de SCR. SCR: Scramble; NT: No Transfectado.
83
a
b
c
Figura 25. Inyección de Lentivirus en el LHA. En (a) y (b) se observa la expresión de GFP
luego de 14 días post inyección de lentivirus shRNA CRH-R2 y SCR respectivamente. La
figura (c), muestra el área de inyección en el LHA.
84
REFERENCIAS
Aguilar MA, Rodríguez-Arias M, Miñarro J. (2009). Neurobiological mechanisms of the
reinstatement of drug-conditioned place preference. Brain. Res. Rev.59: 253-277.
Ahmed SH, Koob GF. (1997). Cocaine- but not food-seeking behavior is reinstated by stress
after extinction. Psychopharmacology (Berl).132:289–295.
Ahmed SH, Lutjens R, van der Stap LD, Lekic D, Romano-Spica V, Morales M, Koob GF,
Repunte-Canonigo V, Sanna PP. (2005). Gene expression evidence for remodeling of lateral
hypothalamic circuitry in cocaine addiction. Proc Natl Acad Sci U S A. 102:11533-8.
Anand BK, Brobeck JR. (1951). Hypothalamic Control of Food Intake in Rats and Cats. Yale J
Biol Med 24(2):123–140.
Aono Y, Saigusa T, Mizoguchi N, Iwakami T, Takada K, Gionhaku N, Oi Y, Ueda K,
Koshikawa N, Cools AR. (2008). Role of GABAA receptors in the endomorphin-1-, but not
endomorphin-2-, induced dopamine efflux in the nucleus accumbens of freely moving rats. Eur
J Pharmacol. 580(1-2):87-94.
Araya KA, David Pessoa Mahana C, González LG. (2007). Role of cannabinoid CB1 receptors
and Gi/o protein activation in the modulation of synaptosomal Na+,K+-ATPase activity by
WIN55,212-2 and delta(9)-THC. Eur J Pharmacol. 572(1):32-9.
Aston-Jones G, Smith RJ, Moorman DE, Richardson KA. (2009) Role of lateral hypothalamic
orexin neurons in reward processing and addiction. Neuropharmacology.56:112-21
Bai L, Xu H, Collins JF, Ghishan FK. (2001). Molecular and functional analysis of a novel
neuronal vesicular glutamate transporter. J. Biol. Chem. 276: 36764–36769.
85
Balcita-Pedicino JJ, Sesack SR. (2007). Orexin axons in the rat ventral tegmental area synapse
infrequently onto dopamine and gamma-aminobutyric acid neurons. J Comp Neurol.
503(5):668-84.
Bale TL, Vale WW. (2004). CRF and CRF receptors: role in stress responsivity and other
behaviors. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 44:525-57.
Blanco E, Rojas R, Haeger P, Cuevas R, Perez C, Munita R, Quiroz G, Andrés ME, Forray MI,
Gysling K. (2006). Intron retention as an alternative splice variant of the rat urocortin 1 gene.
Neuroscience. 140(4):1245-52.
Blank T, Nijholt I, Grammatopoulos DK, Randeva HS, Hillhouse EW, Spiess J. (2003).
Corticotropin-releasing factor receptors couple to multiple G-proteins to activate diverse
intracellular signaling pathways in mouse hippocampus: role in neuronal excitability and
associative learning. J Neurosci. 23:700-7.
Boileau I, Dagher A, Leyton M, Gunn RN, Baker GB, Diksic M, Benkelfat C. (2006).
Modeling sensitization to stimulants in humans: An [11C] raclopride/ positron emissions
tomography study in healthy men. Archives of General Psychiatry, 63, 1386–1395.
Borgland SL, Malenka RC, Bonci A. (2004). Acute and chronic cocaine-Induced potentiation
of synaptic strength in the ventral tegmental area: electrophysiological and behavioral
correlates in individual rats. J. Neurosci. 24: 7482–7490.
Borgland SL, Taha SA, Sarti F, Fields HL, Bonci A. (2006). Orexin A in VTA is critical for
the induction of synaptic plasticity and behavioral sensitization to cocaine. Neuron 49: 589–
601.
Boutrel B, Kenny PJ, Specio SE, Martin-Fardon R, Markou A, Koob GF, de Lecea L. (2005).
Role for hypocretin in mediating stress-induced reinstatement of cocaine-seeking behavior.
Proc Natl Acad Sci USA 102(52):19168–19173.
86
Brain PF, Coward GA. (1989). A review of the history, actions, and legitimate uses of cocaine.
J Subst Abuse. 1(4):431-51.
Buffalari DM, See RE. (2009). Footshock stress potentiates cue-induced cocaine-seeking in an
animal model of relapse. Physiol Behav. 98:614-7.
Calcagnetti DJ, Keck BJ, Quatrella LA, Schechter MD. (1995). Blockade of cocaine-induced
conditioned place preference: relevance to cocaine abuse therapeutics. Life Sciences.56: 475483.
Chalmers DT, Lovenberg TW, De Souza EB. (1995). Localization of novel corticotropinreleasing factor receptor (CRF2) mRNA expression to specific subcortical nuclei in rat brain:
comparison with CRF1 receptor mRNA expression. J Neurosci. 15(10):6340-50.
Ciruela F, Casado V, Rodrigues RJ, Lujan R, Burgueno J, Canals M, Borycz J, Rebola N,
Goldberg SR, Mallol J, Cortes A, Canela EI, Lopez-Gimenez JF, Milligan G, Lluis C, Cunha
RA,
Ferre
S,
Franco
R.
(2006).
Presynaptic
Control
of
Striatal
Glutamatergic
Neurotransmission by Adenosine A1–A2A Receptor Heteromers. J Neurosci. 26(7):2080-7.
Coudereau JP, Debray M, Monier C, Bourre JM, Frances H. (1997). Isolation impairs place
preference conditioning to morphine but not aversive learning in mice. Psychopharmacology
(Berl). 130(2):117-23.
Dautzenberg FM, Hauger RL. (2002). The CRF peptide family and their receptors: yet more
partners discovered. Trends Pharmacol Sci. 23:71-7.
Dayas CV, McGranahan TM, Martin-Fardon R, Weiss F. (2008). Stimuli linked to ethanol
availability activate hypothalamic CART and orexin neurons in a reinstatement model of
relapse. Biol Psychiatry 63(2):152–157.
87
de Lecea L, Kilduff TS, Peyron C, Gao X, Foye PE, Danielson PE, Fukuhara C, Battenberg
EL, Gautvik VT, Bartlett FS 2nd, Frankel WN, van den Pol AN, Bloom FE, Gautvik KM,
Sutcliffe JG. (1998). The hypocretins: hypothalamus-specific peptides with neuroexcitatory
activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 95(1):322-7.
DiLeone RJ, Georgescu D, Nestler EJ. (2003). Lateral hypothalamic neuropeptides in reward
and drug addiction. Life Sci 73(6):759–768.
Erb S, Shaham Y, Stewart J. (1996). Stress reinstates cocaine-seeking behavior after prolonged
extinction and a drug-free period. Psychopharmacology (Berl). 128:408–412.
Erb S, Funk D, Lê AD. (2003). Prior, repeated exposure to cocaine potentiates locomotor
responsivity to central injections of corticotropin-releasing factor (CRF) in rats.
Psychopharmacology. 170:383-9.
Erecińska M, Nelson D, Silver IA. (1996). Metabolic and energetic properties of isolated
nerve ending particles (synaptosomes). Biochimica et Biophysica Acta.1277: 13-34.
Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC. (1998). Potent and specific
genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391: 806811.
Forray MI, Bustos G, Gysling K. (1999). Noradrenaline inhibits glutamate release in the rat
bed nucleus of the stria terminalis: in vivo microdialysis studies. J Neurosci Res. 55(3):311-20.
Fremeau RT Jr, Voglmaier S, Seal RP, Edwards RH. (2004). VGLUTs define subsets of
excitatory neurons and suggest novel roles for glutamate. TRENDS in Neurosciences. 27: 98103.
88
Fuchs RA, Ramirez DR, Bell GH. (2008). Nucleus accumbens shell and core involvement in
drug context induced reinstatement of cocaine seeking in rats. Psychopharmacology 200:545–
556.
Geisler S, Derst C, Veh RW, Zahm DS. (2007). Glutamatergic Afferents of the Ventral
Tegmental Area in the Rat. J Neurosci. 27:5730-43.
Grimm JW, See RE. (2000). Dissociation of primary and secondary rewardrelevant limbic
nuclei in an animal model of relapse. Neuropsychopharmacology. 22:473–479.
Hamlin AS, Blatchford KE, McNally GP. (2006). Renewal of an extinguished instrumental
response: neural correlates and the role of D1 dopamine receptors. Neuroscience 143(1):25–38.
Harris GC, Aston-Jones G. (2003). Critical role for ventral tegmental glutamate in preference
for a cocaine-conditioned environment. Neuropsychopharmacology. 28(1):73-6.
Harris GC, Wimmer M, Byrne R, Aston-Jones G. (2004). Glutamate-associated plasticity in
the ventral tegmental area is necessary for conditioning environmental stimuli with morphine.
Neuroscience.129(3):841-7.
Harris GC, Wimmer M, Aston-Jones G. (2005). A role for lateral hypothalamic orexin
neurons in reward seeking. Nature 437(7058):556–559.
Harris GC, Aston-Jones G. (2006). Arousal and reward: a dichotomy in orexin function.
Trends Neurosci. 29: 571–577.
Herman JP, Figueiredo H, Mueller NK, Ulrich-Lai Y, Ostrander MM, Choi DC, Cullinan WE.
(2003). Central mechanisms of stress integration: hierarchical circuitry controlling
hypothalamo–pituitary–adrenocortical responsiveness. Frontiers in Neuroendocrinology.
24:151–180.
89
Hervieu GJ, Cluderay JE, Harrison DC, Roberts JC, Leslie RA (2001) Gene expression and
protein distribution of the orexin-1 receptor in the rat brain and spinal cord. Neuroscience
103:777–797.
Herzog E, Bellenchi GC, Gras C, Bernard V, Ravassard P, Bedet C, Gasnier B, Giros B, El
Mestikawy S. (2001). The existence of a second vesicular glutamate transporter specifies
subpopulations of glutamatergic neurons. J. Neurosci. 21(22): RC181.
Hökfelt T, Broberger C, Xu ZQ, Sergeyev V, Ubink R, Diez M. (2000). Neuropeptides--an
overview. Neuropharmacology. 39(8):1337-56.
Huttner WB, Gerdes HH, Rosa P. (1991). The granin (chromogranin/secretogranin) family.
Trends Biochem Sci. 16(1):27-30.
Hyman SE, Malenka RC. (2001). Addiction and the brain: the neurobiology of compulsion and
its persistence. Nat. Rev. Neurosci. 2:695–703.
Jonakait GM, Gintzler AR, Gershon MD. (1979). Isolation of axonal varicosities (autonomic
synaptosomes) from the enteric nervous system. J Neurochem. 32(5):1387-400.
Kalivas PW, Duffy P, Latimer LG. (1987). Neurochemical and behavioral effects of
corticotropin-releasing factor in the ventral tegmental area of the rat. J Pharmacol Exp Ther.
242:757-63.
Kalivas PW, Volkow ND. (2005). The neural basis of addiction: pathology of motivation and
choice. Am J Psychiatry.162:1403–13.
Katzung BG. Masters SB. Trevor AJ. Drugs of Abuse. Basic and Clinical Pharmacology.
Chapter 32. Figure 32.5, 11th Edition. The McGraw-Hill Companies, Inc.
Kauer JA, Malenka RC. (2007). Synaptic plasticity and addiction. Nat Rev Neurosci. 8:84458.
90
Ketting R, Ketting RF, Fischer SE, Bernstein E, Sijen T, Hannon GJ, Plasterk RH. (2001).
Dicer functions in RNA interference and in synthesis of small RNA involved in developmental
timing in C. elegans. Genes Dev. 15: 2654–2659.
Koob GF, Le Moal M. (1997). Drug abuse: hedonic homeostatic dysregulation. Science.
278:52-8.
Koob GF, Roberts AJ, Schulteis G, Parsons LH, Heyser CJ, Hyytiä P, Merlo-Pich E,
Weiss F. (1998). Neurocircuitry targets in ethanol reward and dependence. Alcohol Clin. Exp.
Res. 22:3–9.
Koob GF, Le Moal M. (2005). Plasticity of reward neurocircuitry and the 'dark side' of drug
addiction. Nat Neurosci. 8(11):1442-4.
Kuhar MJ, Ritz M, Boja J. (1991). The dopamine hypothesis of the reinforcing properties of
cocaine. TINS, 14(7): 299-302.
Lammel S, Hetzel A, Häckel O, Jones I, Liss B, Roeper J. (2008). Unique Properties of
Mesoprefrontal Neurons within a Dual Mesocorticolimbic Dopamine System. Neuron.57:760–
73.
Le Moal M, Koob GF. (2007). Drug addiction: Pathways to the disease and pathophysiological
perspectives. Eur. Neuropsychopharmacology.17: 377–93.
Leyton M. (2007). Conditioned and sensitized responses to stimulant drugs in humans.
Progress in Neuropsychopharmacology and Biological Psychiatry, 31, 1601–1613.
Lindroth, P, Mopper, K. (1979). High performance liquid chromatographic determination of
subpicomole amounts of amino acids by precolumn flurescence derivatization with ophthaldialdehyde. Analyt. Chem. 51: 1667-1674.
Lüscher C, Malenka RC. (2011). Drug-evoked synaptic plasticity in addiction: from molecular
changes to circuit remodeling. Neuron. 69(4):650-63.
91
Marchant NJ, Hamlin AS, McNally GP. (2009). Lateral hypothalamus is required for contextinduced reinstatement of extinguished reward seeking. J Neurosci. 29(5):1331-42.
Martinez J, Patkaniowska A, Urlaub H, Lührmann R, Tuschl T. (2002). Single-stranded
antisense siRNAs guide target RNA cleavage in RNAi. Cell 110: 563–574.
Matteoli M, Haimann C, Torri-Tarelli F, Polak JM, Ceccarelli B, De Camilli P. (1988)
Differential effect of alpha-latrotoxin on exocytosis from small synaptic vesicles and from large
dense-core vesicles containing calcitonin gene-related peptide at the frog neuromuscular
junction. Proc Natl Acad Sci U S A. 85(19):7366-70.
McFarland K, Kalivas PW. (2001). The circuitry mediating cocaine-induced reinstatement of
drug-seeking behavior. J Neurosci. 21:8655–8663.
McFarland K, Davidge SB, Lapish CC, Kalivas PW. (2004). Limbic and motor circuitry
underlying footshock-induced reinstatement of cocaine-seeking behavior. J Neurosci.
24(7):1551-60.
Nagy A, Delgado-Escueta AV. (1984). Rapid preparation of synaptosomes from mammalian
brain using nontoxic isoosmotic gradient material (percoll). Journol of Neurochemistry. 43:
1114-23.
Nakamura K, Ono T. (1986). Lateral hypothalamus neuron involvement in integration of
natural and artificial rewards and cue signals. J Neurophysiol. 55:163-81.
Neisewander JL, O'Dell LE, Tran-Nguyen LT, Castañeda E, Fuchs RA. (1996). Dopamine
overflow in the nucleus accumbens during extinction and reinstatement of cocaine selfadministration behavior. Neuropsychopharmacology. 15:506–514.
Nestler EJ, Malenka RC. (2004). The addicted brain. Sci Am.290(3):78-85.
92
Nestler EJ. (2005). Is there a common molecular pathway for addiction?. Nature
Neuroscience. 8: 1445-9.
Novina CD, Sharp PA. (2004). The RNAi revolution. Nature. 430: 161–164.
Olds J, Milner P. (1954). Positive reinforcement produced by electrical stimulation of septal
area and other regions of rat brain. J Comp Physiol Psychol. 47:419-27.
Olds J, Travis RP, Schwing RC. (1960). Topographic organization of hypothalamic selfstimulation functions. J Comp Physiol Psychol 53:23–32.
Ozawa H, Takata K. (1995). The granin family--its role in sorting and secretory granule
formation. Cell Struct Funct. 20(6):415-20.
Paxinos, G, Watson C. (2007). The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates, Sixth Edition.
Peyron C, Tighe DK, van den Pol AN, de Lecea L, Heller HC, Sutcliffe JG, Kilduff TS.
(1998). Neurons containing hypocretin (orexin) project to multiple neuronal systems. J
Neurosci. 18(23):9996-10015.
Reul JM, Holsboer F. (2002). Corticotropin-releasing factor receptors 1 and 2 in anxiety and
depression. Curr Opin Pharmacol. 2(1):23-33.
Robinson TE., Berridge K. C. (1993). The neural basis of drug craving: An incentive-salience
theory of addiction. Brain Research Reviews, 18, 247–291.
Robinson TE, Berridge KC. (2003). Addiction. Annu Rev Psychol. 54:25-53.
Rodaros D, Caruana DA, Amir S, Stewart J. (2007). Corticotropin-releasing factor projections
from limbic forebrain and paraventricular nucleus of the hypothalamus to the region of the
ventral tegmental area. Neuroscience 150: 8–13.
93
Rodrigues RJ, Alfaro TM, Rebola N, Oliveira CR, Cunha RA. (2005). Co-localization and
functional interaction between adenosine A(2A) and metabotropic group 5 receptors in
glutamatergic nerve terminals of the rat striatum. J Neurochem. 92:433-41.
Rosin DL, Weston MC, Sevigny CP, Stornetta RL, Guyenet PG. (2003). Hypothalamic orexin
(hypocretin) neurons express vesicular glutamate transporters VGLUT1 or VGLUT2. J Comp
Neurol. 465(4):593-603.
Rothman RB, Baumann MH. (2003). Monoamine transporters and psychostimulant drugs.
European Journal of Pharmacology. 479: 23– 40.
Saigusa T, Aono Y, Mizoguchi N, Iwakami T, Takada K, Oi Y, Ueda K, Koshikawa N, Cools
AR. (2008). Role of GABA B receptors in the endomorphin-1-, but not endomorphin-2-,
induced dopamine efflux in the nucleus accumbens of freely moving rats. Eur J Pharmacol.
581(3):276-82.
Sakurai T, Amemiya A, Ishii M, Matsuzaki I, Chemelli RM, Tanaka H, Williams SC,
Richarson JA, Kozlowski GP, Wilson S, Arch JR, Buckingham RE, Haynes AC, Carr SA,
Annan RS, McNulty DE, Liu WS, Terrett JA, Elshourbagy NA, Bergsma DJ, Yanagisawa M.
(1998). Orexins and orexin receptors: a family of hypothalamic neuropeptides and G proteincoupled receptors that regulate feeding behavior. Cell. 92(5):1 page following 696.
Schenk S. Hunt T. CoUe L. Amit Z. (1983). Isolation vs.grouped housing in rats: differential
effects of low doses of heroinin the place preference paradigm. Life Sci 32: 1129-1134.
Schenk S, Hunt T, Malovechko R, Robertson A, Klukowski G, Amit Z. (1986). Differential
effects of isolation housing on the conditioned place preference produced by cocaine and
amphetamine. Pharmacol Biochem Behav. 24(6):1793-6.
Selye H. (1936). A syndrome produced by diverse nocuous agents. Nature 138, 32.
94
Shalev U, Grimm JW, Shaham Y. (2002). Neurobiology of relapse to heroin and cocaine
seeking: A Review. Pharmacol Rev. 54:1–42.
Sinha R. (2008). Chronic stress, drug use, and vulnerability to addiction. Ann N Y Acad Sci.
1141:105-30.
Smith MA, Bryant PA, McClean JM. (2003). Social and environmental enrichment enhances
sensitivity to the effects of kappa opioids: studies on antinociception, diuresis and conditioned
place preference. Pharmacol Biochem Behav. 76(1):93-101.
Smith RJ, Tahsili-Fahadan P, Aston-Jones G. (2010). Orexin/hypocretin is necessary for
context-driven cocaine-seeking. Neuropharmacology 58(1):179–184.
Sotomayor R, Forray MI, Gysling K. (2005). Acute morphine administration increases
extracellular DA levels in the rat lateral septum by decreasing the GABAergic inhibitory tone
in the ventral tegmental area. J Neurosci Res. 81(1):132-9.
Stellar E. (1954). The physiology of motivation. Psychol Rev 61(1):5–22.
Swanson LW. (2000). Cerebral hemisphere regulation of motivated behavior. Brain Res.
15;886(1-2):113-164.
Tagliaferro P, Morales M. (2008). Synapses between corticotropin-releasing factor-containing
axon terminals and dopaminergic neurons in the ventral tegmental area are predominantly
glutamatergic. J Comp Neurol. 506:616-26.
Takamori S, Rhee JS, Rosenmund C, Jahn R. (2000). Identification of a vesicular glutamate
transporter that defines a glutamatergic phenotype in neurons. Nature 407: 189–94.
95
Torrealba F, Yanagisawa M, Saper CB. (2003). Colocalization of orexin a and glutamate
immunoreactivity in axon terminals in the tuberomammillary nucleus in rats. Neuroscience.
119: 1033–1044.
Tzschentke TM. (2007). Measuring reward with the conditioned place preference (CPP)
paradigm: update of the last decade. Addict Biol. 12:227-462.
Uhart M, Wand GS. (2009). Stress, alcohol and drug interaction: an update of human research.
Addiction Biology, 14:43–64.
Ungless M, Whistler JL, Malenka RC, Bonci A. (2001). Single cocaine exposure in vivo
induces long-term potentiation in dopamine neurons. Nature. 411:583–587.
Ungless MA, Singh V, Crowder TL, Yaka R, Ron D, Bonci A. (2003). Corticotropin-Releasing
Factor Requires CRF Binding Protein to Potentiate NMDA Receptors via CRF Receptor 2 in
Dopamine Neurons. Neuron. 39, 401–407.
Vale W, Spiess J, Rivier C, Rivier J. (1981). Characterization of a 41-residue ovine
hypothalamic peptide that stimulates secretion of corticotropin and beta-endorphin. Science.
213:1394-7.
Van Pett K, Viau V, Bittencourt JC, Chan RK, Li HY, Arias C, Prins GS, Perrin M, Vale W,
Sawchenko PE. (2000). Distribution of mRNAs encoding CRF receptors in brain and pituitary
of rat and mouse. J Comp Neurol. 428:191-212.
Volkow ND, Fowler JS, Wang GJ. (2003). The addicted human brain: insights from imaging
studies. J Clin Invest. 111(10):1444-51.
Wang B, Shaham Y, Zitzman D, Azari S, Wise RA, You ZB. (2005). Cocaine experience
establishes control of midbrain glutamate and dopamine by corticotropin-releasing factor: a
role in stress-induced relapse to drug seeking. J Neurosci. 25:5389-96.
96
Wang B, You ZB, Rice KC, Wise RA. (2007). Stress-induced relapse to cocaine seeking: roles
for the CRF2 receptor and CRF-binding protein in the ventral tegmental area of the rat.
Psychopharmacology. 193:283–294.
Wang B, You ZB, Wise RA. (2009). Reinstatement of cocaine seeking by hypocretin (orexin)
in the ventral tegmental area: independence from the local corticotropin-releasing factor
network. Biol Psychiatry. 65(10):857-62.
Weiss F, Martin-Fardon R, Ciccocioppo R, Kerr TM, Smith DL, Ben-Shahar O. (2001).
Enduring resistance to extinction of cocaine-seeking behavior induced by drug-related cues.
Neuropsychopharmacology. 25:361–372.
Wise RA. (2004). Dopamine, learning and motivation. Nat Rev Neurosci. 5:483-94.
Wise RA, Wang B, You ZB. (2008). Cocaine serves as a peripheral interoceptive conditioned
stimulus for central glutamate and dopamine release. PLoS ONE 3: e2846.
Whittaker VP, Michaelson IA, Kirkland RJ. (1964). The separation of synaptic vesicles from
nerve-ending particles ('synaptosomes'). Biochem J. 90(2):293-303.
Wongwitdecha N, Marsden CA. (1996). Effect of social isolation on the reinforcing properties
of morphine in the conditioned place preference test. Pharmacol Biochem Behav. 53(3):531-4.
Yamaguchi T, Sheen W, Morales M. (2007). Glutamatergic neurons are present in the rat
ventral tegmental area. Eur J Neurosci. 25:106-18.