DETECTORES PARA HPLC

DETECTORES PARA HPLC
DETECCIÓN ULTRAVIOLETA (UV)
- longitud de onda fija
- longitud de onda variable
- arreglo de fotodiodos
• DETECTOR ÍNDICE REFRACCIÓN
• DETECTOR FLUORESCENCIA
• DETECTOR ELECTROQUÍMICO
• MS/FTIR/Conductividad
HPLC 5 10/96
1
Señal del detector
LINEALIDAD DEL DETECTOR
Respuesta lineal máxima
.
Concentración mínima detectable
Concentración de la muestra
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2
RUIDO Y DERIVA DEL DETECTOR
Ruido de alta frecuencia
Ruido baja frecuencia
Deriva y ruido de baja frecuencia
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3
TIPOS DE FUENTES LUMÍNICAS
FUENTE DE LÍNEAS
E
253.7 nm
Lámpara de
Hg
Longitud de onda
FUENTE
CONTÍNUA
E
Lámpara de
Deuterio
Longitud de onda
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4
FACTOR DE RESPUESTA
Respuesta
D
PENDIENTE = BD / AB
.
C
PENDIENTE = BC / AB
A
Concentración
B
HPLC 5 10/96
5
USO DE DETECTORES DE HPLC
TIPO
PORCIENTO DE USO
Absorbancia
70.7
Ultravioleta,  fija
Ultravioleta, filtro
Espectrofotométrica
Fluorescencia
(28.0)
(8.7)
(34.0)
15.0
Índice de Refracción
5.5
Electroquímico
4.4
Otros
4.4
Analytical Chemistry, 54 (1982) 323R.
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6
DETECTOR UV DE  FIJA
Lente de Cuarzo
Filtro
Referencia
Muestra
Foto
Detectores
Fuente de
mercurio
Comparador LOG
Registrador
Filtro UV
Pre-Amps
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CELDA DE FLUJO: DOS CANALES
SALIDA
ENTRADA
MUESTRA
VENTANA DE
CUARZO
1 mm
DE LA
FUENTE
AL
DETECTOR
1 mm
10 mm
ENTRADA
REFERENCIA
SALIDA
HPLC 5 10/96
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LOS BENEFICIOS DE LA DETECCIÓN
CON  VARIABLE
Selectividad y
sensibilidad
mejoradas
 = 254 nm
Mantequilla hidrolizada
40 nanogramos de Estándar de
Vitamina A en Alcohol
Vitamina A
Alcohol
0
= 325 nm
5
0
5
Tiempo de Retención ( Minutos)
HPLC 5 10/96
9
MUESTRAS IMPOSIBLES A 254nm
• Azúcares
• Triglicéridos
• Esteroides
• Barbitúricos
• Ésteres Metílicos • Ácidos carboxílicos
• Hidrocarburos
• Polímeros
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10
DETECTOR DE UV DE  VARIABLE :
ESQUEMA
HPLC 5 10/96
11
HPLC 5 10/96
12
 DE ABSORCIÓN DE CROMÓFOROS
CHROMOPHORE FORMULA
 MAX (nm)
Amine
– NH2
195
Ethylene
– C C –
190
Ketone
> C= O
195
Ester
– COOR
205
Aldehyde
– CHO
210
Carboxyl
– COOH
200-210
Nitro
– NO2
310
Phenyl
202, 255
Naphthyl
220, 275
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13
DETECTOR DE ARREGLO DE DIODOS:
ESQUEMA
HPLC 5 10/96
14
SALIDA 3-D DE UN DETECTOR PDA
HPLC 5 10/96
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USO DEL MODO 3 - D DE PDA
•
Número de picos
•
 de máxima sensibilidad
•
 de mínima interferencia
•
 programación en f (tiempo)
HPLC 5 10/96
16
PDA: PROCESOS CUALITATIVOS
•
•
•
•
Pureza de pico
Confirmación del compuesto - ( max. y tR )
Identificación del compuesto (no es fácil)
Índice de pureza (relación de 1/2, 10 pts)
intervalo : <1.5 puro, > 1.5 impuro
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VERIFICACIÓN DE PUREZA DE PICO
El problema:
¿está este pico “puro”?
A
B
C
HPLC 5 10/96
18
SUPERPOSICIÓN ESPECTRAL
mAU
A
B
C
190
•
230
270
nm
310
No, el pico representa al menos dos compuestos coeluyendo.
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19
DETECTORES DE ARREGLO DE DIODOS
•
•
•
Ampliamente usados, aceptados
Principal uso – verificación de pureza de pico
Ahorra tiempo - no se requiere volver a analizar
cuando los picos no han sido bien detectados
A. Se pueden registrar distintas 's
B. Se puede re-graficar y re-integrar
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ABSORBANCIA AL UV DE SOLVENTES LC
UV CORTE
SOLVENTE
n-Hexano
Tetracloruro
Benceno
Clorofromo
254 nm Fuente Hg
Cloruro de metileno
Acetona
Acetonitrilo
Metanol
Agua
200
250
300
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DETECTOR UV : RESUMEN
•
•
•
•
•
Buena sensibilidad 10-6 a 10-10 g
Selectivo
Se puede eluir con gradiente
Costo variable
El más empleado
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DETECTOR ÍNDICE DE REFRACCIÓN :
ESQUEMA
EFLUENTE COLUMNA
SOLVENTE PURO
filtro
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DETECTOR IR : RESUMEN
•
•
•
•
•
•
Respuesta universal
Mala sensibilidad ~ 10-6 g
No se pueden gradientes
Se afecta por la temperatura
Básico para GPC
Empleado en escalas preparativas
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COMPARACIÓN DE IR Y UV
Inyección
IR
A
B
C
D
E
Inyección
UV
Tiempo
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DETECTOR DE FILTRO FLUOROMÉTRICO :
ESQUEMA
TUBO FOTOMULTIPLICADOR
FILTRO (EMISIÓN)
LENTE
LÁMPARA DE MERCURIO
CELDA DE MUESTRA
FILTRO (EXCITACIÓN)
LENTE
EFLUENTE DE
LA COKUMNA
SALIDA
HPLC 5 10/96
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DETECTOR DE FLUORESCENCIA:
CROMATOGRAMA DE EJEMPLO
CROMATOGRAMA DE
FLUORESCENCIA
5 picogramos
benzo(a)pireno
Inyección
Tiempo
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DETECTOR AMPEROMÉTRICO DE
PELÍCULA DELGADA PARA HPLC
MINIATURE
REFERENCE
ELECTRODE
LOCKING
COLLAR
DUAL
PARALLEL
MOBILE PHASE
PREHEATER
AUXILIARY
ELECTRODE
COLUMN
WORKING
ELECTRODE
BLOCK
OUTLET
TOP VIEW
GASKET
INLET
QUICK RELEASE
MECHANISM
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EXTRACTOS DE BUPRENORFINA
DE PLASMA Y ORINA (ECD)
(a)
BLANCO DE
PLASMA
(b)
40 ng/ml (STD)
(c)
(d)
BLANCO DE
ORINA
ORINA
1.5
40 ng/ml
0 4 8 12
0 4 8 12
0 4 8 12
0 4 8 12
min
HPLC 5 10/96
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DETECTOR ELECTROQUÍMICO
B. Fleet, C.T. Little,
J.Chrom.Sci, 12 (1974) 747
ENTRADA
SALIDA
SALIDA
Tapón de vidrio
poroso
Contra
electrodo
Electrodo de trabajo
de grafito
Electrodo de
Referencia Ag/AgCl
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DETECTOR ELECTROQUÍMICO
APLICACIONES
EN REDUCCIÓN
EN OXIDACIÓN
• Quinonas
• Hidrocarburos aromáticos
• Compuestos nitro,
nitroso y azo
• Aminas primarias,
secundarias y terciarias
• Compuestos
organometálicos
• Aminas aromáticas
• Metales pesados
• Compuestos heterocíclicos
• Compuestos fenólicos
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DERIVADOS SENSIBLES AL UV
Analyte
Reagent
RNH2
N-Succinimidyle
p-Nitrophenylacetate
RCOOH
O-p-Nitrobenzyl-N,N'Diisopropylisourea
ROH
3,5-Dinitrobenzoyl
Chloride
R2CO
p-NitrobenzyloxyamineHydrochloride
2,4-D.N.P.H.
HPLC 5 10/96
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DERIVADOS SENSIBLES FLUORESCENCIA
Analyte
Reagent
RNH2
Dansyl Chloride
Fluorescamine
RCOOH
4-Bromomethyl-7methoxycoumarin
R--OH
Dansyl Chloride
R2C = O
NH2
Dansyl Hydrazine
RCH-COOH
Phthaldehyde
HPLC 5 10/96
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DERIVADOS CON PROPIEDADES
ELECTROQUÍMICAS
Analyte
Reagent
ROH, R2NH, 2,4-Dinitrobenzoyl
RNH2
Chloride
R-CH-COOH 2,4-Dinitrofluorobenzene
RCOOH
O-p-Nitrobenzyl-N,N'Diisopropylisourea
R2C = O
2, 4-DinitrophenylHydrazine
HPLC 5 10/96
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ESPECTROMETRÍA DE MASAS / LC
Efluente LC
Espectrómetro de masas
Solvente
Muestra
Sistema de datos
Al
Vacío
Espectro de masas
Muestra concentrada
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