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Listeria monocytogenes Aspectos relevantes e implicación en la seguridad alimentaria Dr. David Rodríguez Lázaro Área de Microbiología. Facultad de Ciencias Listeria spp. • • • • Gram + Catalasa positiva Anaerobia facultativa Contenido bajo en G-C 10 especies: • L. monocytogenes • L. innocua • L. ivanovii • L. seeligeri • L. welshimeri • L. grayi Humanos, rumiantes Rumiantes 4 nuevas especies: L. rocourtiae, L.marthii, L.fleischmannii and L.weihenstephanensis ¿Por qué es una bacteria tan interesante? Bacterias Gram+ bajo % G+C Lactobacillus casei Streptococcus pyogenes Eneterococcus faecalis Listeria monocytogenes Bacillus subtilis Staphylococcus aureus Mycoplasma pneumoniae • Múltiples biotopos - suelo y materia vegetal descomposición • Patógeno de origen alimentario - alimentos procesados - intestino de los vertebrados - células animales • Crecimiento a 4ºC • Supervivencia en el ambiente • Modelo en investigación biomédica - análisis molecular del parasitismo intracelular - respuesta inmune de base celular - dinámica del citoesqueleto de actina Listeria es un modelo para … + estudios de biología celular de organismos superiores Para respuesta inmune de base celular dinámica del citoesqueleto de actina Conocimiento del metabolismo celular normal Listeria es un modelo para … + estudios evolutivos tanto meramente darwinianos como sobre patogenicidad orfXorfZ • L. monocytogenes • L. innocua • L. ivanovii • L. welshimeri • L. seeligeri • L. grayi prs prfAplcA hly actA plcB orfBorfA ldh L. monocytogenes L. innocua L. welshimeri L. ivanovii prs prs i-inlB2 mpl i-inlL i-inlK i-inlB orfXorf L orfC orfD i-inlJ orfE orfK i-inlH i-inlG smcL i-inlE i-inlF ORF6 ORF3 ORF5ORF7 LIPI-2 ORF6 L. monocytogenes ORF3 ORF5 ORF7 ORF8 ORF9 ORF10 ORF11 L. seeligeri ldh dplcB L. ivanovii i-inlI ldh ORF9 Listeria es un modelo para … + estudios sobre patogenecidad y regulación microbiana The PrfA virulence regulon Positive regulatory factor P P4 P3 P2 P1 inlA P P inlB hpt PrfA inlC P P2 P1 prfA (Positive Regulatory Factor) plcA PrfA orfZ P P2P1 P3 P2 P1 prs prfA plc A P hly P mpl ac tA plc B orfX orfB orfA TGTTTTCTGCATG aTAACAAGTGTTAA TGACGGAAAGAGAGTATCTGGTTTATATTTTTA... hpt TTATGTTGAGGCA CCCTTTATCGTCG TGGGGTTAACTGA AAATTTAGAAGAA TTTTCGATTATTA TAAAGGGTAGAGG TTAACATTTGTTAA TTAACAAATGTTAA TTAACAAATGTTAg TTAACAAATGTaAA TTAACgCTTGTTAA aTAACATAaGTTAA hly plcA actA mpl inlC inlA CGACGATAAAGGGACAGCAGGACTAGAATAAAGCTAT TGCCTCAACATAAAAGTCACTTTAAGATAGGAATA AGAAAAATTAATTCTCCAAGTGATATTCTTAAAT AGAATATCTGACTGTTTATCCATATAATATAAGCA TTTAAACATCTCTTATTTTTGCTAACATATAA TTCTTTTTTTTGGAAAAATAGTTATTATTATTTAA TTAACANNTGTTAA PrfA regula positivamente la expresión de los-41.5 factores de virulencia de LIPI-1 CONSENSUS Positive regulatory factor PrfA Ambiente Extracelular P P2 P1 prfA plcA Genes de virulencia no necesarios metabólico) Forma PrfA no activa y poca cantidad Genes PrfA dependientes no expresados (gasto Ingestión /inicio de invasión Genes de virulencia empiezan a ser necesarios Forma PrfA no activa y regulación sigmaB Genes PrfA dependientes ligeramente expresados Ambiente Intracelular Genes de virulencia necesarios Cambio conformación de PrfA y gran Gran cantidad de PrfA Genes PrfA dependientes activamente expresados Mecanismo de regulación de PrfA Ambiente extracelular INACTIVO prfA Ambiente extracelular COFACTOR plcA a PrfA inactivo PrfA Activo prfA b plcA c d ACTIVADO Valencia 1989 P14 Madrid 1999 P14-A Identificación de mutantes hiperhemolíticos de L. monocytogenes Espontáneo (Ripio et al. 1996) Inducido (Ermolaeva et al. 1997) Mutantes hiperhemolíticos portan mutaciones puntuales en prfA y sobre-expresan constitutivamente todos los genes PrfA-dependientes Mutantes Hly+++ portan una sustitución Gly145®Ser en PrfA (mutación PrfA*) 1 M N A Q A E E F K K Y L E T N G I K P K Q F H K K 25 26 E L I F N Q W D P Q E Y C I F L Y D G I T K L T S 50 51 S I S E N G T I M N L Q Y Y K G A F V I M S G F I D 75 76 T E T S V G Y Y N L E V I S E Q A T A Y V I K I N 100 101 E L K E L L S K N L T H F F Y V F Q T L Q K Q V S 125 126 Y S L A K F N D F S I N G K L G S I C G Q L L I L 150 151 F S T Y V Y G K E T P D G I K I T L D N L T M Q E L G 175 176 Y S S G I A H S S A V S R I I S K L K Q E K V I V 200 201 Y K N S C F Y V Q N L D Y L K R Y A P K L D E W F 225 226 Y L A C P A T W G K L N 237 Mutaciones PrfA* aumentan la capacidad de unión a DNA de PrfA a b CIII CIII Mutaciones PrfA* aumentan la capacidad de unión a DNA de PrfA PrfA* normalised gene expression 45 PrfA specific non-specific 42.42 30 24.82 15.89 15 0 0.93 PrfA* HeLa / PrfA-wt BHI 0.86 PrfA-wt HeLa / PrfA-wt BHI 0.71 PrfA* BHI / PrfA-wt BHI 2.67 1.31 1.71 1.08 1.58 1.21 PrfA* HeLa / PrfA* BHI PrfA* HeLa / PrfA-wt HeLa PrfA-wt HeLa / PrfA* BHI Listeria es un modelo para … + estudios de parasitismo intracelular Entrada Evasión de la vacuola fagocítica y replicación citosólica Movilidad intracelular y paso de célula a célula Movilidad intracelular de Listeria monocytogenes speed 150 ´ (0.3 m/s) Listeria es un modelo para … + Patógeno alimentario • Organismo ubicuo (=en todas partes) • Organismo piscrotrofo (capaz de crecer a temperaturas de refrigeración) • Amplio rango de pH (de pH próximos a 4 hasta 9) • Moderadamente resistente a concentraciones de sal • Ligeramente resistente a tratamientos de pasteurización baja • Capaz de producir BIOPELÍCULAS • Aislado en todas las sectores alimentarios (cárnico, lácteo, pesquero …) • Elevada mortalidad (superior al 25% y llegando hasta el 60%) • Capaz de pasar la barrera hematoencefálica ð LESIONES Y SÍNTOMAS NERVIOSOS • Capaz de pasar la barrera hematoplacentaria ð ABORTOS Y LESIONES EN EL FETO • Requiere más de 5 días para su detección Ecología de Listeria monocytogenes Suelo (vegetación en descomposición) ? ® ambiente rural (abono, etc) ® cadena alimentaria Patofisiología de la infección por Listeria (Listeriosis) - enfermedad severa, mortalidad media 20-50 % en humanos - Dos formas clínicas: perinatal (1/3) (mujeres embarazadas, fetos, y recién nacidos) pacientes adultos (2/3) (>40 años) placentitis, abortos y sepsis neonatal meningoencefalitis Epidemias de listeriosis de origen alimentario Location date cases strain food Boston Canada (N. Scotia) Massachussets California Switzerland (Vaud) United Kingdom Gran Canaria France 1979 1981 1983 1985 1983-87 1987-1989 1992 1992 23 41 49 142 122 >300 24 279 4b 4b 4b 4b 4b 4b 4b 4b vegetables? coleslaw milk? cheese cheese pâté cheese? pork tongue in aspic France Illinois France Italy France ………….. Canada Austria 1993 1994 1995 1996 1997 ………. 2008 2009-10 38 45* 35* 39 14 …. 43 (22 V) 34 (8V) 4b 1/2b 4b 1/2b 4b ….. “rillettes” chocolate milk cheese rice salad cheese ………… RTE delis Cheese * gastroenteritis Relevancia en la salud pública USA 9,388,075 casos Relevancia en la salud pública USA Casi 19% muertes 29% bacterianas Desde el punto de vista legislativo Tolerancia cero (AUSENCIA): EE.UU., Canadá, Japón En función de la capacidad del alimento de soportar el crecimiento de Listeria: EU ðAquellos que no lo soportan: 100 ufc/g ðAquellos que lo soportan: 100 ufc/g Cómo se analiza? Cómo se analiza? Dos apuntes finales de los dos últimos brotes serios … CASO ESTUDIO: Brote de Listeriosis en Canadá Verano 2.009 Patatas Meléndez S.L. Valladolid, 26 de Enero 2.009 Brote de Listeriosis en Canadá – verano 2.008 Brote de Listeriosis en Canadá – verano 2.008 Brote de Listeriosis en Canadá – verano 2.008 Reacciones: Brote de Listeriosis en Canadá – verano 2.008 Reacciones: Brote de Listeriosis en Canadá – verano 2.008 Reacciones: Brote de Listeriosis en Canadá – verano 2.008 Reacciones: Brote de Listeriosis en Canadá – verano 2.008 Lección aprendida por la empresa ð Actitud pro-activa y de liderazgo Brote de Listeriosis en Canadá – verano 2.008 Brote de Listeriosis en Canadá – verano 2.008 Brote de Listeriosis en Austria – verano 2.009 EMPRESA OFICIAL / UNIVERSIDAD Brote de Listeriosis en Austria – verano 2.009 Nivel de contaminación: < 5 cfu / 100g ò Probabilidad de detección 45-60% (usando 5 muestras de 25g) Probabilidad de detección <20% (usando 1 muestra de 25g) Probabilidad de detección usando ISO 11290-2 <1%
